CN110184299B - 诱导体细胞重编程的因子以及使用该因子诱导体细胞重编程的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种诱导体细胞重编程至多能性干细胞的因子，该因子含有下述四种基因：Jdp2，Nanog，Esrrb和Sall4。本发明还提供一种诱导体细胞重编程制备多能性干细胞的方法，该方法包括：将上述诱导体细胞重编程至多能性干细胞的因子导入体细胞。进一步地，本发明提供由上述方法培养得到的多能性干细胞以及该多能性干细胞在中的应用。

Description

诱导体细胞重编程的因子以及使用该因子诱导体细胞重编程 的方法
技术领域
本发明涉及诱导体细胞重编程至多能性干细胞的因子以及使用该因子诱导体细胞重编程至多能性干细胞的方法。
背景技术
干细胞是一类能够通过细胞有丝***进行自我更新的细胞，并且能够在特定条件下分化为各种特化细胞。干细胞的这种自我更新能力是器官和组织发育所需的细胞分化和特化的基础。最近的证据显示干细胞可用于组织重建并且使生理功能和组织功能恢复。因此，干细胞具有用于治疗多种疾病和损伤(包括神经***创伤，恶性肿瘤，遗传性疾病，血红蛋白病和免疫缺陷)的潜力。干细胞移植疗法是再生医学研究的一个重要方向，干细胞移植可被用来治疗心脏损伤，神经***退行性疾病，脊髓损伤，肾衰竭、血液***疾病等等。然而，干细胞移植疗法面临着异体排斥、细胞来源有限等很多难以解决的问题。
诱导多能性干细胞(iPSC，induced pluripotent stem cell)是一种类似于胚胎干细胞且具有发育全能性的细胞，通过将特定的基因导入体细胞，能够诱导体细胞重编程而获得干细胞特性。
2006年，日本京都大学教授Yamanaka(山中伸弥)实验室首次宣布在小鼠的成纤维细胞中导入4个基因(Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4)成功地将小鼠的成纤维细胞诱导重编程为全能性干细胞，得到的干细胞的性质和胚胎干细胞类似。通过使用经典的Yamanaka因子(即，Oct4，Sox2，Klf4和Myc，也称为OSKM因子)使体细胞重编程至诱导多能性干细胞(iPSC)已在决定细胞命运以及再生医学方面取得了很多有价值的研究结果。目前已报道了不同于OSKM因子的重编程因子，其能够诱导小鼠胚胎成纤维细胞重编程至诱导多能性干细胞，但是其诱导效率低，可重复性低。迄今为止，尚未发现任何与Yamanaka因子具有相同的诱导效率或更好的诱导效率的其他可替代Yamanaka因子的用于诱导体细胞重编程的因子。
发明内容
一方面，本发明提供一种诱导体细胞重编程至多能性干细胞的因子，该因子包含下述基因：Jdp2，Glis1，Esrrb和Sall4。
另一方面，本发明提供一种诱导体细胞重编程制备多能性干细胞的方法，该方法包括：将上文所述的诱导体细胞重编程至多能性干细胞的因子导入体细胞。
在一种实施方式中，所述导入是通过将上文所述的诱导体细胞重编程至多能性干细胞的因子克隆至病毒载体，随后将所述病毒载体转染进病毒包装细胞并由该病毒包装细胞感染所述体细胞而进行的。
在一种实施方式中，所述感染进行两次，在首次感染体细胞之后，将感染后的体细胞在含有10％胎牛血清的高糖DMEM培养基中进行培养；在二次感染体细胞之后，在培养基中培养感染后的体细胞，持续足以获得多能性的时间段。其中，所述病毒载体是逆转录病毒载体，所述病毒包装细胞是PlatE细胞。所述使体细胞能够获得多能性的时间段为5天至7天。
本发明中的体细胞选自：成纤维细胞、尾尖成纤维细胞、骨髓衍生的单核细胞、骨骼肌细胞、脂肪细胞、外周血单核细胞、巨噬细胞、肝细胞、角质细胞、口腔角质细胞、头发毛囊真皮细胞、胃上皮细胞、肺上皮细胞、滑膜细胞、肾细胞、皮肤上皮细胞、成骨细胞、神经干细胞和真皮细胞。
再一方面，本发明还提供由上文所述的方法培养得到的多能性干细胞，以及该多能性干细胞在药物筛选、器官移植等再生医学方面的应用。
又一方面，本发明提供在上述诱导体细胞重编程制备多能性干细胞的方法中用于培养二次感染后的体细胞的培养基，其包含：基础培养基和下述成分：胰岛素、转铁蛋白、清蛋白水解物、过氧化氢酶、还原型谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、单碘代甲状腺原氨酸、肾上腺酮、孕酮、硒、***钠、丙酮酸、半乳糖、腐胺、左旋肉碱、乙醇胺、2磷酸维生素C、维生素E、乙酰维生素E、生物素、维生素A、维生素B12、亚油酸、亚麻酸、碱性成纤维生长因子、糖原合成激酶抑制剂CHIR99021、GSK-LSD1二盐酸盐以及SGC0946。其中，所述基础培养基选自：DMEM培养基，MEM培养基，BME培养基，RPMI1640培养基和IMDM培养基。
在一种实施方式中，所述基础培养基是DMEM培养基。
在一种实施方式中，本发明的培养基中所包含的上述各个成分的终浓度为：
在一种实施方式中，所述胰岛素为人源化胰岛素或重组胰岛素。
采用本发明的诱导体细胞重编程的因子(下文也称为4F因子，即，Jdp2，Glis1，Esrrb，Sall4)，通过本发明的诱导体细胞重编程制备多能性干细胞的方法，能够诱导体细胞重编程至多能性干细胞，这提供了可替代经典的Yamanaka因子(Oct4，Sox2，Klf4和Myc)的用于诱导体细胞重编程的因子和方法。
附图说明
图1是由本发明的诱导体细胞重编程至多能性干细胞的因子(本文也称为4F因子)诱导得到多能性干细胞的细胞克隆照片。
图2显示了由本发明的4F因子诱导得到的多能性干细胞中内源性细胞多能性标志物的表达水平与小鼠胚胎干细胞中内源性细胞多能性标志物的表达水平的比较。
图3显示了由本发明的4F因子诱导得到的多能性干细胞中内源性细胞多能性标志物的表达。
图4显示了将由本发明的4F因子诱导得到的多能性干细胞注射到供体小鼠的囊胚腔中，再将注射后的囊胚移植到假孕雌鼠的子宫中得到的嵌合体小鼠的照片。
图5显示了分别在现有技术的iCD1培养基和本发明的iCD3培养基中采用4F因子诱导体细胞重编程得到的多能性干细胞的细胞克隆数的比较。
具体实施方式
下文将结合附图以示例性的方式对本发明进行详细描述，但是本发明并不限于此，本发明的范围仅由所附的权利要求限定。
诱导体细胞重编程的因子
一方面，本发明提供能够诱导体细胞重编程至多能性干细胞的因子，该因子包括下述四种基因：Jdp2，Glis1，Esrrb和Sall4。其中，Jdp2的序列如SEQ ID NO.1所示，Glis1的序列如SEQ ID NO.2所示，Esrrb的序列如SEQ ID NO.3所示，Sall4的序列如SEQ ID NO.4所示。
用于诱导体细胞重编程的培养基
另一方面，本发明提供一种用于培养多能性干细胞的培养基，其包含：基础培养基和下述成分：胰岛素、转铁蛋白、清蛋白水解物、过氧化氢酶、还原型谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、单碘代甲状腺原氨酸、肾上腺酮、孕酮、硒、***钠、丙酮酸、半乳糖、腐胺、左旋肉碱、乙醇胺、2磷酸维生素C、维生素E、乙酰维生素E、生物素、维生素A、维生素B12、亚油酸、亚麻酸、碱性成纤维生长因子、糖原合成激酶抑制剂CHIR99021、GSK-LSD1二盐酸盐以及SGC0946。
本发明使用的基础培养基是指人工制备的含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素等细胞生长所需的营养物质的培养基。本发明的基础培养基选自：DMEM培养基，MEM培养基，BME培养基，RPMI1640培养基和IMDM培养基。在一种实施方式中，所述基础培养基为DMEM培养基。
本文中使用的“糖原合成激酶抑制剂CHIR99021”具有如下化学结构：
本文中使用的“GSK-LSD1二盐酸盐”具有如下化学结构：
本文中使用的“SGC0946”具有如下化学结构：
在一种实施方式中，本文所述的用于培养多能性干细胞的培养基是添加有具有如下列出的终浓度的成分的DMEM培养基(简称为iCD3培养基)：
诱导体细胞重编程的方法
又一方面，本发明提供一种采用上文所述的能够诱导体细胞重编程至多能性干细胞的因子诱导体细胞重编程的方法，其包括将上述诱导体细胞重编程的因子导入体细胞。
在本发明的方法中，所述导入通常是通过整合病毒载体感染体细胞而进行的。在本发明的一些实施方式中，所述导入是通过将本发明的诱导体细胞重编程的因子克隆至病毒载体，随后将所述病毒载体转染进病毒包装细胞并由该病毒包装细胞感染所述体细胞而进行的。所述病毒载体可以是逆转录病毒载体、腺病毒载体或慢病毒载体。在本发明的一种实施方式中，所述病毒载体是逆转录病毒。
在本发明的一些实施方式中，所述感染进行两次。在首次感染体细胞之后，将感染后的体细胞在含有10％胎牛血清的高糖DMEM培养基(其含有4500mg/L葡萄糖)中进行培养；在二次感染体细胞之后，在上文所述的iCD3培养基中培养感染后的体细胞，持续使体细胞能够获得多能性的时间段。在一种实施方式中，所述使体细胞能够获得多能性的时间段为5天至7天。
本发明使用的体细胞选自：成纤维细胞、尾尖成纤维细胞、骨髓衍生的单核细胞、骨骼肌细胞、脂肪细胞、外周血单核细胞、巨噬细胞、肝细胞、角质细胞、口腔角质细胞、头发毛囊真皮细胞、胃上皮细胞、肺上皮细胞、滑膜细胞、肾细胞、皮肤上皮细胞、成骨细胞、神经干细胞和真皮细胞。
在本发明中，使用报告基因以指示体细胞向多能性干细胞的转化。例如，报告基因可以位于表达盒内并且在通常与编码重编程基因的编码区结合的调节元件的控制之下进行表达。导入了本发明的诱导体细胞重编程的因子的体细胞可以同时表达报告基因和重编程因子，并且可以在不同的时间点根据报告基因表达的存在或不存在来进行选择。例如，可以各根据报告基因的存在来选择细胞，并且可以通过使用报告基因优化转染。可以根据报告基因的丧失来筛选诱导的多能性干细胞，因为在重编程过程中转基因会被沉默。这种选择或筛选是基于由报告基因的表达产生的可检测信号，其作为转基因表达的指示。
可以通过多种方式中的任一种来产生可检测信号，这取决于本发明的方法中所使用的报告基因的性质。例如，可检测信号可以是发光的，例如荧光信号，例如GFP。GFP是一种荧光多肽，其产生荧光信号而无需底物或辅因子。GFP的表达和检测技术是本领域熟知的，可以从商业上获得试剂盒，例如从Clontech获得。可以在完整细胞中测定GFP的表达，无需将其裂解或添加另外的试剂。
多能性干细胞的用途
多能性干细胞具有很多用途。它们可进一步分化产生不同类型的细胞，例如，神经细胞、肝细胞或心肌细胞。它们还可产生其他类型的干细胞，例如，神经干细胞，肝干细胞或心脏干细胞。它们能够分化为特定细胞系中的细胞。被诱导的细胞以及从其中分化得到的细胞可用于细胞移植疗法。因为被诱导的细胞可从非胚胎细胞诱导产生，所以细胞移植疗法包括向受治者提供从他或她自身组织衍生得到的细胞，从而降低可能的排异反应。
多能性干细胞还可用于化疗药物的筛选，将通过本发明的方法制备得到的iPSC进一步分化为特定的细胞系的细胞，例如神经细胞、肝细胞、心肌细胞、上皮细胞，等等，然后将待筛选的药物作用于各种类型的细胞上，测定待筛选的药物的细胞毒性和有效性，等等，从而筛选出具有最低的细胞毒性和最高的疗效的药物。
实施例1.多能性干细胞的制备
本实施例以小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)为例来举例说明采用本发明的诱导体细胞重编程至多能性干细胞的因子制备诱导多能性干细胞的方法，该方法包括如下步骤：
a)体细胞的准备：
将OG2-小鼠胚胎成纤维细胞分别接种到0.1％明胶包被的培养平板中并在10％胎牛血清培养基中培养过夜，每天更换培养基，待细胞生长至密度为90％时用0.25％的胰酶，37℃消化1min，250g离心5min，用培养基重悬计数，待用。本发明使用的OG2小鼠胚胎成纤维细胞的一个特点是在干细胞特异表达的Oct4基因的启动子后连有绿色荧光蛋白(GFP)。在重编程过程中，当OG2小鼠胚胎成纤维细胞内源Oct4被激活时，绿色荧光蛋白伴随表达，在荧光显微镜下，可见成功重编程的细胞或克隆细胞团块呈现绿色，通过直接统计重编程克隆即绿色荧光克隆数可以容易地得到重编程得到的多能性干细胞的克隆数和重编程效率。
b)病毒的制备：
本实施例中用于诱导体细胞重编程的因子(下文也称为4F因子)包括小鼠Jdp2基因(SEQ ID NO.1)，小鼠Glis1基因(SEQ ID NO.2)，小鼠Esrrb基因(SEQ ID NO.3)，小鼠Sall4基因(SEQ ID NO.4)，使用本领域常用的转染试剂(例如，磷酸钙转染试剂盒)将逆转录病毒载体pMXs上的小鼠Jdp2的cDNA的质粒，小鼠Glis1的cDNA的质粒，小鼠Esrrb的cDNA的质粒，小鼠Sall4的cDNA的质粒转染进病毒包装细胞(PlatE)，完成转染之后48小时收集病毒上清液，通过孔径为0.45μm的滤膜将该上清液过滤到合适的离心管中，将这样收集的病毒上清液用作第一轮感染用病毒。再向PlatE细胞中添加新鲜的含有10％胎牛血清的培养基置于5％CO2，37℃培养箱中继续培养。24小时后，再次收集病毒上清液用于第二轮感染。
c)病毒感染小鼠胚胎成纤维细胞：
感染分两轮进行。在病毒感染之前8-12小时将上述步骤a)准备的MEF细胞以每孔3x104个细胞的密度接种于培养平板上，待细胞在培养平板中铺展开即可使用。将上述步骤b)收集到的第一轮感染用病毒上清液与接种有MEF的细胞培养基以7:1的体积比混合并添加终浓度为8μg/ml的溴化己二甲铵(polybrene)，混合均匀。随后对MEF细胞进行第一轮感染，24小时后用上述步骤b)收集到的第二轮感染用病毒上清液再次感染MEF细胞。感染后24小时，将感染的MEF细胞放置在上文所述的iCD3培养基中进行培养，每天更换培养基并观察细胞形态变化和细胞的荧光变化情况。
在培养的第五天观察到较亮且形态较好的类似于小鼠胚胎干细胞的细胞克隆。在培养的第七天观察到大量类似于小鼠胚胎干细胞的细胞样克隆。在显微镜下对绿色荧光克隆进行计数，得到约800个多能性干细胞克隆。
图1是由本发明的4F因子诱导得到多能性干细胞的细胞克隆照片。如图1所示，在培养的第七天观察到较亮且形态较好的类似于小鼠胚胎干细胞的细胞克隆。
如图2至图3所示，得到的多能性干细胞表达内源性细胞多能性标志物，但未表达Yamanaka因子(即，Oct4，Sox2，Klf4和Myc)。
将由本发明的4F因子诱导得到的多能性干细胞注射到供体小鼠的囊胚腔中，再将注射后的囊胚移植到假孕雌鼠的子宫中得到的嵌合体小鼠的照片，如图4所示。从图中可以看出，小鼠毛色为杂色说明4F因子诱导得到的多能性干细胞能够形成嵌合体小鼠。
实施例2.iCD3培养基
本实施例进一步举例说明实施例1中使用的在诱导体细胞重编程至诱导多能性干细胞中使用的培养基iCD3，该培养基包括作为基础培养基的DMEM培养基以及具有如下列出的终浓度的成分：
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图5显示了本实施例在采用4F因子诱导体细胞重编程至多能性干细胞的过程中分别采用现有技术中的iCD1培养基(请参见中国专利CN102234627B)和本发明的iCD3培养基而得到的多能性干细胞的克隆数的对比，从图中可以看出，采用本发明的iCD3培养基得到的多能性干细胞的克隆数是采用iCD1培养基得到的多能性干细胞的克隆数的4倍，由此可见，采用本发明的iCD3培养基能够极大地提高诱导体细胞重编程至多能性干细胞的诱导效率。
虽然本文描述并显示了本发明的示例性的实施方式，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，这些实施方式仅仅是举例说明。本领域技术人员可对这些实施方式作出多种改变、修改和替换，而不背离本发明。通过所附的权利要求来限定本发明的范围，并且这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物也被所附的权利要求涵盖。
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<210> 1
<211> 489
<212> PRT
<213> 小鼠 Jdp2 cDNA序列
<400> 1
atgatgcctg ggcagatccc agacccttca gtgaccgcag gctctctgcc agggctcggc 60
cccctcaccg gacttcccag ctctgctctg accacagagg agctgaaata cgctgacatc 120
cgcaacattg gggcgatgat tgcgcccttg cacttcctgg aggtgaaact gggcaagagg 180
ccccaacccg tgaagagtga gctagacgag gaagaagagc gaaggaaaag gcgccgggaa 240
aagaacaaag tcgctgcagc cagatgccgg aacaagaaga aggaacgcac agagtttctg 300
cagagggagt cagagcggct ggagctcatg aacgcagagc tgaagacgca gatagaggag 360
ctgaagctgg agcggcaaca gcttatcctg atgctcaacc gccaccgccc cacctgcatc 420
gtgcgcacag atagcgtcag gacgcccgag tccgaaggca acccactgct ggagcagctg 480
gacaagaag
<210> 2
<211> 1860
<212> PRT
<213> 小鼠 Glis1 cDNA序列
<400> 2
atggcagagg cccgcacatc cctgtctgcc cactgtcggg gcccgctggc cactggcctg 60
cacccagacc tggacctccc gggccgaagc ctcgccaccc ctgcgccttc ctgctacctt 120
ctgggcagcg aacccagctc tggcctgggc ctccagcccg agacccacct ccccgagggc 180
agcctgaagc ggtgctgcgt cttgggccta ccccccacct ccccagcctc ctcctcaccc 240
tgtgcctcct ccgacgtcac ctccatcatc cgctcctccc agacgtctct ggtcacctgt 300
gtaaatggac tccggagccc ccctctgacg ggagatctgg ggggcccttc caagcgggcc 360
cggcctggcc ctgcatcgac ggacagccat gagggcagct tgcaacttga agcctgccgg 420
aaggcgagct tcctgaagca ggaacccgcg gatgagtttt cagagctctt tgggcctcac 480
cagcagggcc tgccgccccc ctatcccctg tctcagttgc cgcctggccc aagccttgga 540
ggcctggggc tgggcctggc aggcagggtg gtggccgggc ggcaggcgtg ccgctgggtg 600
gactgctgtg cagcctatga gcagcaggag gagctggtgc ggcacatcga gaagagccac 660
atcgaccagc gcaagggcga ggacttcacc tgcttctggg ctggctgcgt gcgccgctac 720
aagcccttca acgcccgcta caagctgctc atccacatgc gagtgcactc gggcgagaag 780
cccaacaagt gcatgtttga aggctgcagc aaggccttct cacggctgga gaacctcaag 840
atccacctga ggagccacac gggcgagaag ccgtacctgt gccagcaccc gggttgccag 900
aaggccttca gcaactccag cgaccgcgcc aagcaccagc gcacccacct agacacgaag 960
ccgtacgcct gtcagatccc tggctgctcc aagcgctaca cagaccccag ctccctccgc 1020
aagcacgtca aggcccattc agccaaagag cagcaggtgc gtaagaagct gcatgcgggc 1080
cctgacaccg aggccgacgt cctgaccgag tgtctggtcc tgcagcagct ccacacgtcc 1140
acacagctgg ctgccagcga cggcaagggt ggctgtggcc tgggccagga gctgctccca 1200
ggtgtgtatc ctggctccat caccccccat aacggacttg catcgggcct cctgccccca 1260
gcgcacgacg taccttccag gcaccacccg ctggatgcca ccaccagttc ccaccaccat 1320
ctgtcccctc tgcccatggc tgagagcacc cgggatgggt tggggcccgg cctcctctca 1380
ccaatagtca gccccctgaa ggggctgggg ccaccgccgc tgcccccatc ctctcagagc 1440
cattctccgg ggggccagcc cttccccaca ctccccagca agccgtccta cccacccttc 1500
cagagccctc cacccccgcc tctgcccagc ccacaaggtt accagggcag tttccactcc 1560
atccagagtt gcttccccta tggcgactgc taccggatgg ctgaaccagc agccggtggg 1620
gacggactgg tcggggagac ccacggtttc aaccccctgc ggcccaatgg ctaccacagc 1680
ctcagcacgc ccttgcctgc cacaggctat gaggccctgg ctgaggcctc atgccccaca 1740
gcgctgccac agcagccatc tgaagatgtg gtgtccagcg gccccgagga ctgtggcttc 1800
ttccccaatg gagcctttga ccactgcctg ggccacatcc cctccatcta cacagacacc 1860
<210> 3
<211> 1362
<212> PRT
<213> 小鼠 Esrrb cDNA序列
<400> 3
atggacgtgt ccgaactctg catcccggac ccccttggct accacaacca gctgctgaac 60
cgaatgtcgt ccgaagacag gcacctgggc tctagttgcg gctccttcat caagacggag 120
ccatccagcc cgtcctcggg cattgatgcc ctcagccacc acagccccag cggctcgtcg 180
gacgccagtg gtggctttgg cattgccctg agcacccacg ccaacggtct ggactcgccg 240
cctatgttcg caggtgcggg gctgggaggc aacccgtgcc gcaagagcta cgaggactgt 300
actagtggta tcatggagga ctccgccatc aaatgcgagt acatgcttaa cgccatcccc 360
aagcgcctgt gcctcgtgtg cggggacatt gcctctggct accactacgg agtggcctcc 420
tgcgaggctt gcaaggcgtt cttcaagaga accattcaag gcaacatcga gtacaactgc 480
ccggccacca atgaatgtga gatcaccaaa cggaggcgca agtcctgtca ggcctgccga 540
ttcatgaaat gcctcaaagt ggggatgctg aaggaaggtg tgcgccttga ccgagttcga 600
ggaggccgcc agaagtacaa gcgacggctg gattcggaga acagccccta cctgaacctg 660
ccgatttccc cacctgctaa aaagccattg actaagatcg tctcgaatct actaggggtt 720
gagcaggaca agctgtatgc tatgcctccc aacgatatcc ccgagggaga tatcaaggcc 780
ctgaccactc tctgtgaatt ggcagatcgg gagcttgtgt tcctcatcaa ctgggccaag 840
cacatcccag gcttccccag tctgacactt ggggaccaga tgagcctgct gcagagtgcc 900
tggatggaga ttctcatctt gggcatcgtg taccgctcgc tcccatacga tgacaagctg 960
gcatacgccg aggactatat catggatgag gaacactctc gcctggtagg gctgctggac 1020
ctttaccgag ccatcctgca gctggtgcgc aggtacaaga aactcaaggt agagaaggaa 1080
gagtttatga tcctcaaggc cctggccctc gccaactcag attcgatgta cattgagaac 1140
ctggaggcgg tgcagaagct ccaggacctg ctgcacgagg cgctgcagga ctatgagctg 1200
agtcagcgcc acgaggagcc gcggagggcc ggcaagctgc tgctgacgct gcccctgctg 1260
aggcagacag ccgccaaagc cgtgcaacac ttctacagtg tgaaactgca gggcaaggtg 1320
cccatgcaca aactcttcct ggagatgctg gaggccaagg tg
<210> 4
<211> 3201
<212> PRT
<213> 小鼠 Sall4 cDNA序列
<400> 4
atgtcgaggc gcaagcaggc gaagccccag cacatcaact gggaggaggg ccagggcgag 60
cagcctcagc agctaccgag ccccgacctc gccgaggcgc tggcggcgga ggaacccggt 120
gctccagtga actcccctgg gaactgcgat gaagcctcag aggactccat accggtgaag 180
cggccccggc gggaggacac tcacatctgc aacaaatgct gtgccgagtt ctttagtctc 240
tctgaattca tggaacacaa gaaaagttgc actaaaaccc ctcctgtcct catcatgaat 300
gacagcgagg ggccagtgcc ttcagaggac ttttccagag ctgccctgag ccaccagctg 360
ggcagcccaa gcaataaaga cagtctccag gagaacggca gcagctcggg ggacttgaag 420
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caggacataa gctatttacc caaaggcaaa gtagccaaca ccaatgtgac tctgcaggcg 540
ctccgcggca ccaaggtggc cgtgaaccaa cggggtgcag aggcacccat ggcgcccatg 600
cctgctgccc aaggcatccc ttgggtcctg gagcagatcc tgtgcctgca gcagcagcaa 660
ctccagcaaa tccagcttac ggaacagatt cgcgtccagg tgaacatgtg ggcagcgcac 720
gcgctccact ctggagtggc gggggccgac acgctgaagg ccttaagcag ccatgtgtct 780
cagcaagtgt ccgtgtccca gcaggtgtcg gctgccgtgg ccctgctcag ccagaaagcc 840
tcaaacccag ctctgtcgct cgatgccttg aaacaagcca agctacctca tgccagcgtc 900
ccctccgcag ccagcccgtt gtcctcgggg ttaacgtcct tcaccttgaa gcctgacggg 960
acacgggttc tccccaactt cgtgtctcgc cttcccagtg ccctgctacc tcagactccg 1020
ggctctgtgc tcctgcagag tcccttctcc gctgtgacgc tcgaccagtc caagaaagga 1080
aaggggaaac cccagaacct ctccgcctct gcctcggtgt tagatgtcaa ggccaaggac 1140
gaagtcgtcc tcggtaagca caagtgtagg tactgtccca aggttttcgg gacagatagc 1200
tcccttcaga ttcaccttcg ctcccacacc ggagagagac cttacgtgtg ccctatctgt 1260
ggtcaccgct tcaccaccaa gggcaatctc aaggtccact tacaacgaca ccctgaggtg 1320
aaggcaaacc cccagctgtt ggccgaattc caggacaaag gggcagtgag tgccgcttct 1380
cactatgcac tccctgtccc cgtccctgcc gatgaatcga gtctctctgt agacgccgag 1440
cctgtcccgg tcacgggaac cccttctcta gggctacctc aaaagctcac gtcagggcct 1500
aattccaggg acctcatggg tggctccttg cccaatgaca tgcagccagg gccttctcca 1560
gaaagtgagg cgggccttcc actccttggg gtggggatga tacataatcc cccaaaggct 1620
gggggcttcc agggcactgg ggccccagag tcagggtccg agaccctgaa attgcagcaa 1680
ctagtggaga acatagacaa ggccactact gaccccaacg agtgtctcat ttgtcatcgg 1740
gtcctcagct gtcagagttc cctgaagatg cattaccgta cccacacagg ggagagacca 1800
ttccagtgca agatctgtgg ccgggccttc tccaccaaag gcaacctgaa gacacacctt 1860
ggggttcacc gaaccaacac gaccgtaaag acccaacatt cgtgccccat ctgccagaag 1920
aaattcacca acgccgtcat gttacagcag catatccgga tgcacatggg tggccagatc 1980
cccaacaccc ctctgccaga gagtccctgt gacttcacgg ctcccgagcc cgtggccgtc 2040
agtgagaatg gcagtgccag cggggtctgc caggacgacg cagcagaagg gatggaagcc 2100
gaggaggtct gttctcagga tgttcccagt ggcccctcaa ctgtctctct gccggttccc 2160
agtgcccacc tggcatcgcc ctctctgggc ttctctgtgt tggcctccct ggatacgcag 2220
gggaaagggg ctcttccggc gctggccctg cagaggcaga gcagtcgaga aaacagctcc 2280
ctggagggcg gtgacactgg tccagccaat gactcttcct tgctcgtggg tgaccaggag 2340
tgtcagagcc gaagcccaga tgccacggag accatgtgct accaggcagt gtcacctgcc 2400
aatagccaag ccggaagtgt caagtcccgg tctcccgagg gtcacaaggc cgagggcgtg 2460
gagagctgcc gcgttgacac cgaaggtcgt accagcctcc ctccaacatt tatccgagca 2520
cagcccacct ttgtcaaagt tgaagtgcct ggcacctttg tgggaccccc cagcatgccc 2580
tcgggtatgc cgcctttgct agcatcgcag ccgcagccac gccgccaggc caagcagcac 2640
tgctgcacac ggtgtggaaa gaacttctcg tctgccagtg ccctgcagat ccacgagcga 2700
acacacacgg gagagaagcc tttcgtgtgt aacatatgcg ggcgggcctt caccacgaaa 2760
ggcaacctga aggtacacta catgactcat ggggccaaca ataactccgc ccgccgggga 2820
aggaagctgg ccatagagaa ccccatggcc gcgctgagtg ctgagggaaa gagagcgccc 2880
gaggtgtttt ccaaggagct cctgtccccc gcggtgagtg tggaccccgc ctcctggaac 2940
cagtacacca gcgtcctgaa tgggggtctg gccatgaaga ccaacgagat ctccgtgatc 3000
cagagcggag gcatccccac gctgcctgtg tcgctggggg ccagctctgt ggtgagcaat 3060
ggcacgattt ccaagcttga cggctctcag accggtgtga gcatgcccat gagcgggaac 3120
ggagaaaagc tcgctgttcc cgacggcatg gccaaacacc agttccctca cttcctggag 3180
gaaaataaga ttgctgtcag c

Claims (5)

1.一种诱导成纤维细胞重编程制备多能性干细胞的方法，该方法包括：将诱导成纤维细胞重编程至多能性干细胞的因子导入成纤维细胞，所述诱导成纤维细胞重编程至多能性干细胞的因子为下述基因：Jdp2，Glis1，Esrrb和Sall4，所述因子来源于小鼠；
其中：
所述导入是通过将所述诱导成纤维细胞重编程至多能性干细胞的因子克隆至病毒载体，随后将所述病毒载体转染进病毒包装细胞并由该病毒包装细胞感染所述成纤维细胞而进行的；
所述感染进行两次，在首次感染成纤维细胞之后，将感染后的成纤维细胞在含有10％胎牛血清的高糖DMEM培养基中进行培养；
在二次感染成纤维细胞之后，培养感染后的成纤维细胞，持续足以使成纤维细胞获得多能性的时间段；
二次感染后培养成纤维细胞的培养基包含：基础培养基和下述成分：胰岛素、转铁蛋白、清蛋白水解物、过氧化氢酶、还原型谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、三碘代甲状腺原氨酸、肾上腺酮、孕酮、硒、***钠、丙酮酸、半乳糖、腐胺、左旋肉碱、乙醇胺、2磷酸维生素C、维生素E、乙酰维生素E、生物素、维生素A、维生素B12、亚油酸、亚麻酸、碱性成纤维生长因子、糖原合成激酶抑制剂CHIR99021、GSK-LSD1二盐酸盐以及SGC0946，上述各个成分在基础培养基中的终浓度如下：
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述病毒载体是逆转录病毒载体，所述病毒包装细胞是PlatE细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述时间段为5天至7天。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述基础培养基选自：DMEM培养基，MEM培养基，BME培养基，RPMI1640培养基和IMDM培养基。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述基础培养基是DMEM培养基。
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