CN110179827A - 牙源性间充质干细胞的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种牙源性间充质干细胞的应用，具体为牙源性间充质干细胞在制备治疗缺血性疾病药物中的应用。牙髓间充质干细胞具有更强的免疫抑制活性和抗炎活性，同时可促进缺血部位血管新生和血管旁路建立效果最强。且牙髓间充质干细胞可通过抑制缺血局部炎症反应、促进血管和组织再生等机制促进间充质干细胞的存活和侧枝循环的建立，进而达到修复损伤组织的目的。
Description
技术领域
本发明涉及药物应用领域，具体而言，涉及一种牙源性间充质干细胞的应用。
背景技术
下肢外周动脉疾病(Peripheral Arterial Diseases,PAD)一种最为常见的血管外科疾病之一，发病率极高。据统计，PAD威胁着全球约2亿人的生活质量和预期寿命。外周动脉病包括血栓闭塞性脉管炎、动脉硬化性闭塞症及糖尿病足等。在糖尿病、高血压、高血脂症、吸烟、慢性动脉粥样硬化等危险因素作用下，约1％—2％的外周动脉病患者会进展到终末阶段，即重症肢体缺血(Critical limb ischemia,CLI)，导致行走时疼痛(跛行)，静息痛，溃疡，甚至导致组织坏疽。血管重建，包括经典血管转流术和介入治疗，是目前CLI治疗的主要手段。然而，部分患者因身体状况差、流入道和流出道差等不良因素影响，不适合手术治疗。因此，研发更加有效的治疗药物或治疗手段显得十分必要和迫切。
大量研究表明，局部注射或采用基因载体导入生长因子，如成纤维生长因子(Fibroblast Growth Factor，FGF)、血管内皮生长因子(Vascular Endothelial GrowthFactor，VEGF)和肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)等，均可在动物模型中有效促进血管新生。然而，大量临床研究表明，生长因子治疗无法持续减轻患者静息痛和治愈溃疡。干细胞具有自我更新和定向分化潜能，已证实可促进多种组织损伤的修复，如放射性肺损伤、慢性肝损伤、溃疡性结肠炎等。但是在治疗缺血性疾病上并没有记载。
发明内容
本发明提供了一种牙源性间充质干细胞在制备治疗缺血性疾病药物应用，旨在提供牙源性间充质干细胞的新的应用，扩大其使用范围。
本发明是这样实现的：
一种牙源性间充质干细胞在制备治疗缺血性疾病药物应用。
本发明的有益效果是：本发明的牙髓间充质干细胞在促进血管新生和血管旁路建立，以及促进肢体活动功能恢复等方面均具有较大的优势，其可用于重症肢体缺血治疗。
本发明明确牙髓间充质干细胞在抑制Th1型细胞、Th17型细胞和TNF-α表达等方便具有更强的活性，且牙髓间充质干细胞可显著促进Tregs的扩增。总之，牙髓间充质干细胞较脐带间充质干细胞具有更强的免疫抑制活性和抗炎活性。
本发明明确间充质干细胞对重症肢体缺血具有显著治疗效果，而牙髓间充质干细胞具有优效性，有望扩展牙髓间充质干细胞的临床应用，提升重症下肢缺血的治疗水平。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例2牙髓间充质干细胞表型的流式细胞术检测结果；
图2为本发明实施例2骨髓间充质干细胞表型的流式细胞术检测结果；
图3为本发明实施例2脐带间充质干细胞表型的流式细胞术检测结果；
图4为本发明实施例2脂肪间充质干细胞表型的流式细胞术检测结果；
图5为本发明实施例2牙髓间充质干细胞成骨(左)分化和成脂分化(右)能力检测结果；
图6为本发明实施例2脐带间充质干细胞成骨(左)分化和成脂分化(右)能力检测结果；
图7为本发明实施例3牙髓和脐带间充质干细胞对Th1/Th2/Th17细胞抑制效应的比较；
图8为本发明实施例3牙髓和脐带间充质干细胞对调节性T淋巴细胞(Tregs)促进效应的比较；
图9为本发明实施例3牙髓和脐带间充质干细胞对外周血淋巴细胞TNFα表达抑制效应的比较；
图10为本发明实施例4不同来源MSCs局部肌肉给药治疗股动脉结扎致大鼠重症下肢缺血后，大鼠下肢活动能力评分结果；
图11为本发明实施例4不同来源MSCs局部肌肉给药治疗股动脉结扎致大鼠重症下肢缺血后，血管造影检测大鼠下肢血管新生结果；
图12为本发明实施例4不同来源MSCs局部肌肉给药治疗股动脉结扎致大鼠重症下肢缺血后，免疫荧光检测血管内皮标志CD31表达结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例提供一种牙源性间充质干细胞在制备治疗缺血性疾病药物应用具体说明。
具体地，本发明实施例提供一种牙源性间充质干细胞在制备治疗缺血性疾病药物应用。
发明人发现，缺血损伤诱发的氧化应激和炎症反应等，大幅度降低了间充质干细胞的存活率，继而降低了其功效。发明人进一步发现牙源性间充质干细胞为牙髓间充质干细胞时，可以更高效地抑制炎症等，提升牙髓间充质干细胞的存活率，继而提升其治疗效果。采用牙髓间充质干细胞为特定的间充质干细胞，能够进一步保证牙源性间充质干细胞对于缺血性疾病有更好的治疗效果。
进一步地，牙髓间充质干细胞来自于脱落乳牙、青少年正畸牙和18-35岁成人智齿中的一种或多种。
进一步地，缺血性疾病为下肢缺血性疾病，缺血性疾病为重症肢体缺血疾病。
进一步地，药物中牙源性间充质干细胞的有效剂量为1x106至1.67x107个/毫升。
药物的剂型包括细胞悬浮液注射液、凝胶剂和喷剂中的任意一种。采用上述浓度的药物能够减少药物的副作用，并保证药物的治疗效果。
进一步地，发明人发现牙源性间充质干细胞在改善手术侧血流供以及改善手术侧肢体缺血程度中有显著的效果，继而本发明实施例提供一种牙源性间充质干细胞在制备改善手术侧血流供应以及改善手术侧肢体缺血程度的药物中的应用。其中，改善手术侧血流供应包括促进血管新生和新的侧支循环的建立。
以下结合具体实施例对本发明提供的一种牙源性间充质干细胞的应用进行具体说明。
本发明实施例采用牙髓间充质干细胞为实验例，以脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞为对比例进行检测。
实施例1间充质干细胞的分离和培养
(1)牙髓间充质干细胞的分离培养
牙齿经供者签署知情同意书后，在麻醉下无菌拔除无龋齿、无牙髓炎和牙髓坏死的第三磨牙。新鲜拔除的牙齿立即放入装有20ml无菌生理盐水的牙齿采集瓶中，24h内分离培养牙髓干细胞。具体方法为：剪碎牙冠后取牙髓组织，经生理盐水反复冲洗后剪碎；置于含3mg/ml I型胶原酶和4mg/ml Dispase的生理盐水中，37℃水浴消化40min；然后，过70μm细胞筛收集细胞，1000rpm离心10min，用适量MSC无血清培养基重悬成单细胞悬液，将细胞接种于10cm培养皿中，于37℃、5％CO2培养，3-5天换液一次。每天在倒置显微镜下观察细胞生长状况，10-14天后，将克隆性生长的细胞用0.25％胰蛋白酶消化收集，得到P0代牙髓间充质干细胞。
(2)脐带间充质干细胞的分离培养
经产妇同意并签署知情同意书后，将脐带存于装有含有300mlα-MEM培养基的500ml无菌玻璃瓶中，于4℃储存，并于收集后24小时内分离培养脐带干细胞。生物安全柜取出脐带后，用无菌生理盐水反复清洗，并剪切成2cm左右的片段，并剔脐静脉和脐动脉，取胶冻状的Wharton’s jelly部分；将其剪碎成5mm3大小组织块，用滴管依次摆放组织块于预先润湿的10cm培养皿中，加入少量无血清培养基后，于37℃、5％CO2培养48h；补液后继续培养，每3-4天换液一次；7-10天可见长梭形细胞爬出；10～14天，去除组织块，将克隆性生长的细胞用0.25％胰蛋白酶消化收集，得到P0代脐带间充质干细胞。
(3)骨髓间充质干细胞的分离培养
经捐献者同意并签署知情同意书后，采集捐献者骨髓组织并置于无菌采集管中。首先，采用Percoll分离法，分离骨髓单个核细胞；经生理盐水洗涤后，采用MSC无血清培养基重悬单个核细胞；将其按照2.0×105/cm2的密度接种到10cm培养皿中，于37℃、5％CO2培养；48h后换液，去除未贴壁细胞，而后每隔48h换液，待形成克隆后，用0.25％胰蛋白酶消化收集，得到P0代脐带间充质干细胞。
(4)脂肪间充质干细胞的分离培养
经供者同意并签署知情同意书后，采集供者脂肪组织，置于装有300mlα-MEM的500ml培养瓶中，4℃保存，并于24h内分离。具体为：将脂肪组织放入滤网中，经生理盐水反复冲洗后，剪成2mm3大小左右；过筛网并分至50ml离心管，100g离心3min，收集上层脂肪于50ml离心管；加入标准消化液20ml(I型胶原酶浓度0.2％，胰蛋白酶浓度0.05％,二者1:1)，37℃水浴摇床45min；3000rpm，离心10min收集细胞；将细胞悬液与红细胞裂解液1:2混合，轻轻吹打后1800rpm，8min，弃上清，将收集的细胞悬液经100μM细胞筛过滤，1800r/min离心8min，得到单个核细胞；加入培养基，将细胞浓度调整为104个细胞/ml，接种于10cm培养皿(10ml)，置于37℃5％CO2孵箱培养；接种24h后，可见到许多短梭状贴壁细胞；48小时后换液，以后每3天换液一次；7-10天细胞已基本铺满瓶壁形成致密单层，用0.25％胰蛋白酶消化收集，得到P0代脐带间充质干细胞。
实施例2间充质干细胞的免疫表型和多项分化潜能检测
收集获得的P0代间充质干细胞(牙髓、脐带、骨髓、脂肪)以6000-8000细胞/cm2的密度进行传代，培养4d后，用0.25％胰蛋白酶消化收集细胞，继续传代。传代至P5代，分别进行免疫表型和多项分化潜能检测。具体如下：
(1)免疫表型检测
间充质干细胞经0.25％胰蛋白酶消化后，采用FITC或PE标记的CD73、CD90、CD105、CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR等抗体及相应的同型对照抗体标记细胞，流式细胞仪检测。检测结果参见图1-图4，根据图1-图4显示可知，不同来源间充质干细胞(牙髓、脐带、骨髓、脂肪)均高表达间充质干细胞特异性抗原CD73、CD90及CD105，不表达造血及免疫细胞表面标志CD11b、CD19、CD34、CD45，几乎不表达移植免疫排斥相关的表面标志HLA-DR。这些结果提示，通过实施例1的方法成功获得牙髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞。
(2)多向分化潜能检测
成骨分化：将不同来源的P6代间充质干细胞(牙髓、脐带、骨髓、脂肪)分别按照1×104细胞/孔接种24孔培养板，置于37℃、5％CO2、湿度95％的培养箱中培养。24小时后，加入成骨诱导液，每4天换液。诱导3周后用茜素红染色进行鉴定。
成脂分化：将不同来源的P6代间充质干细胞(牙髓、脐带、骨髓、脂肪)分别按照1.5×104细胞/孔接种24孔培养板，置于37℃、5％CO2、湿度95％的培养箱中培养。24小时后，加入成脂诱导液，每4天换液。诱导2周后用油红O(Oil Red O)染色进行鉴定。
检测结果参见图5-图6，图5-图6表明，分离获得的牙髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞均具有成骨及成脂分化潜能。
实施例3牙髓和脐带间充质干细胞免疫抑制活性比较、
分别以P6代牙髓间充质干细胞或脐带间充质干细胞，与人外周血单个核细胞以1：1，1：5，1：10的细胞个数比例混合后共同孵育(孵育条件为：37℃，5％CO2，饱和湿度培养箱中)，孵育后48h，采用流式细胞术检测T淋巴细胞的不同亚型，如Th1、Th2、Th17和Tregs等，同时检测TNF-α的表达与分泌。
检测结果参见表1和图7-图9，根据表1和图7可知，在间充质干细胞与外周血单个核细胞以1：5比例共同孵育的条件下，牙髓间充质干细胞对Th1型和Th17型T淋巴细胞的抑制率为52.57±8％和61.37±3.53％，显著高于脐带间充质干细胞；二对Th2型细胞为44.53±13.52％，低于脐带间充质干细胞的67.98±12.25％。根据表1和图8可知，对Tregs的促进率为分别71.6±23.4，显著高于脐带间充质干细胞。根据表1和图9可知，与脐带间充质干细胞相比，牙髓间充质干细胞对淋巴细胞TNF-α表达具有更强的抑制效率。综上所述，牙髓间充质干细胞具有更强的免疫和炎症抑制效应，说明牙髓间充质干细胞能够在缺血损伤诱发的氧化应激和炎症反应等，提升牙髓间充质干细胞的存活率，继而提升其治疗效果。
表1牙髓和脐带间充质干细胞免疫抑制效应比较
实施例4牙髓间充质干细胞治疗股动脉结扎大鼠重症下肢缺血的疗效评价
Wistar大鼠60只，雌雄各半，体重(200-280)g，按体重随机分为6组，每组10只，分别为假手术组、模型对照组、BMMSC(骨髓)、ADMSC(脂肪)、DPMSC(牙髓)、UCMSC(脐带)6组。
(1)首先，进行股动脉结扎致大鼠下肢缺血模型的制备，具体为：大鼠腹腔注射40mg/kg戊巴比妥钠麻醉后，仰卧位固定，备皮，左下腹做纵向开口，结扎左髂动脉，及髂动脉的所有分支；左侧腹股沟纵向开口，分离结扎近腹股沟股动脉两分支。逐层关闭切口，缝合肌肉层和皮肤。假手术组仅分离但不结扎血管。
(2)于手术当天给药进行治疗(牙髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞的治疗方法相同，区别仅在于对细胞进行替换)，具体为：消化收集第六代间充质干细胞，1800rpm离心8min收集细胞，然后用生理盐水洗涤一次，按照1.7×107细胞/ml重悬获得干细胞悬液，受试药组单次肌肉注射干细胞悬液，剂量分别为5×106细胞/0.3ml/5点/只；模型对照组单次肌肉注射溶剂0.3ml/5点/只。
(3)观察四周，进行一下指标评价：
①肢体评分：给药后1w、2w、3w、4w进行肢体评分(0＝脚底/脚趾弯曲以抵抗尾巴的轻微牵引；1＝足底弯曲，脚趾不弯曲；2＝足底和脚趾均不弯曲；3＝不使用后肢)。并计算(1-4)w评分的AUC，比较各组分值与模型对照组的差异；
②多普勒测定血流：给药后1w、2w、3w、4w，腹腔注射40mg/kg戊巴比妥钠麻醉大鼠，左下肢脱毛备皮，测定手术侧近腹股沟股动脉血流速度，并计算(1-4)w血流速度的AUC，比较各给药组血流速度与模型对照组的差异；
③血管造影：给药后4w，大鼠腹腔注射40mg/kg戊巴比妥钠麻醉后仰卧位固定，从腹股沟到膝关节作纵向切口，分离股动脉，结扎近心端，远心端做动脉插管，注入造影剂碘普罗胺注射液(0.6-0.8)ml，推注后立即用X光机连续摄片。观察各给药组新生血管情况；
④组织学评价：X光摄片后，取大鼠左肢膝关节至踝关节段肌肉，放入11％***溶液中固定，用于检测毛细血管密度、肌肉坏死及炎症反应情况。
4)实验结果：
如表2和图10所示，结扎手术后，模型动物出现不同程度跛行、紫绀、肢体坏疽，且术后(1-4)w，肢体评分维持在2以上，表明造型成功，模型较稳定。牙髓、脐带、脂肪、骨髓间充质干细胞治疗后，肢体评分有不同程度降低，综合肢体评分情况，DPMSC能显著减轻手术侧肢体缺血程度，AUC与模型对照组比较，有统计学差异。
表2受试药MSC对大鼠术侧肢体评分的影响(分值，n＝8-10)
注：与假手术组比较，***P<0.001；与模型对照组比较，▲P<0.05。n：动物数。
如表3所示，术后1-4周，模型动物术侧股动脉血流速度明显降低，与假手术组比较，有统计学差异，间充质干细胞治疗则有改善术侧血流供应的趋势。如图11所示，术后4w，大鼠术侧膝关节到踝关节段血管显影，模型对照组明显减少，而人牙髓、骨髓充质干细胞治疗后可见血管新生，新的侧支循环建立，尤其以牙髓间充质干细胞的治疗效果最佳。如图12所示，组织病理学检测结果显示，间充质干细胞治疗可改善缺血局部的组织结构，减少组织坏死，促进组织再生，其中可见大量血管内皮细胞的增殖，表明间充质干细胞可促进血管新生，对四种细胞的比较研究显示，牙髓间充质干细胞在促进血管新生中具有显著的优效性。
表3受试药MSC对股动脉血流速度的影响(n＝8-10)
注：与假手术组比较，***P<0.001。
总之，牙髓间充质干细胞在重症下肢缺血疾病治疗中具有优效性。
以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种牙源性间充质干细胞在制备治疗缺血性疾病药物应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，牙源性间充质干细胞为牙髓间充质干细胞。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述牙髓间充质干细胞来自于脱落乳牙、青少年正畸牙和18-35岁成人智齿中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述缺血性疾病为下肢缺血性疾病。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述缺血性疾病为重症肢体缺血疾病。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物中牙源性间充质干细胞的有效剂量为1x106至1.67x107个/毫升。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括细胞悬浮液注射液、凝胶剂和喷剂中的任意一种。
8.一种牙源性间充质干细胞在制备改善手术侧血流供应的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述改善手术侧血流供应包括促进血管新生和新的侧支循环的建立。
10.一种牙源性间充质干细胞在制备改善手术侧肢体缺血程度的药物中的应用。
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| Title |
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| 庄雪莹等: "牙源性干细胞促进血管生成研究进展", 《中国实用口腔科杂志》 * |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Yang Yuefeng Inventor after: Zhu Xiaona Inventor after: Xia Xia Inventor after: Meng Hongfang Inventor after: Liu Hongying Inventor after: Liu Dongmei Inventor before: Yang Yuefeng Inventor before: Wu Zuze Inventor before: Zhu Xiaona Inventor before: Xia Xia Inventor before: Wang Hua Inventor before: Meng Hongfang Inventor before: Liu Hongying Inventor before: Liu Dongmei |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190830 |