CN110179750A - 一种绿原酸自乳化组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

一种绿原酸自乳化组合物及其用途。本发明属于医药技术领域，具体涉及一种绿原酸纳米级给药***的自乳化组合物及其用途。本发明的纳米级给药***的自乳化组合物，含有绿原酸‑脂质材料形成的复合率>70％的复合物，特定的油相、乳化剂和助乳化剂，但不含水相。本发明的自乳化组合物及其制剂，可用于抗肿瘤、抗炎免疫和抗病毒的治疗。

Description

一种绿原酸自乳化组合物及其用途

技术领域

本发明涉及一种绿原酸自乳化组合物及其制备方法与用途，属于医药制备的技术领域。

背景技术

绿原酸又名咖啡鞣酸(Chlorogenic acid，简称CA)，是广泛存在于金银花、杜仲科植物杜仲的叶、葵花籽、茵陈和蓝盆花等植物中的一种有机酸，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、降糖、降脂、降血压和免疫调节等多种药理作用。在多种生理活性中，绿原酸所具有的免疫调节作用使得其在肿瘤免疫治疗方面成为近年来研究热门的天然产物之一。Xue等研究发现，绿原酸可以逆转肿瘤相关巨噬细胞中的M2型向M1型转变，从而起到抗肿瘤的效果。

目前临床上使用的为注射用绿原酸冰干粉针，长期肌肉注射顺应性差。由于绿原酸口服给药的药理活性较差，至今未见绿原酸口服制剂用于临床治疗。

对于免疫调节类药物，并非是药物浓度越高药效越好，因此，单纯提高生物利用度不一定能获得理想的口服治疗效果。什么样的组合物能够突破绿原酸口服给药用于临床治疗的限制，无法预测。

为了开发适用于口服给药的制剂，专利CN 1048566954 B公开了一种绿原酸微乳及其制备工艺和应用，其核心内容，是利用绿原酸亲水性强而亲脂性差的特点，制备了由水相、油相、乳化剂和助乳化剂形成的油包水(W/O)微乳，其目的是为了提高生物利用度、改善口服治疗效果，但由于绿原酸为多酚类化学结构，在水溶液中贮存极易发生化学降解，因此，制备含有水相的微乳存在缺陷。

自乳化给药***(SEDDS)是由油相、乳化剂和助乳化剂形成的均一液体、半固体或固体，可用于药物的包载。与微乳相比，SEDDS组合物不含水相，因此组成上有着本质的区别，这对于化学性质不稳定药物的包载，更具优势。但SEDDS的制备对药物理化性质有着极高要求，亲脂性药物更适用于包载，而对于亲水性的绿原酸则受到限制。

影响载药SEDDS特性的两大因素：1)被包载药物的性质。脂溶性药物更有利于SEDDS的包载，而对于极性较大的亲水性药物，通常载药困难，或放置后易发生分层甚至沉淀。2)油相、乳化剂和助乳化剂的类别及组成比例：三者是一个整体，其中任一成分发生改变，或者三者的组成比例发生变化，都会直接影响SEDDS的外观性状(如可以是液体，也可能是半固体或固体)、物理稳定性(如可表现为均一溶液，也可能分层甚至沉淀)、化学稳定性(药物降解程度的不同)以及乳化后粒径(遇水形成纳米级或微米级乳滴)。理想的载药自乳化组合物，应满足以下条件：1)在冷藏或室温条件下长期贮存，应为外观均一的澄清透明液体，不应发生分层；2)在冷藏或室温条件下长期贮存，应为外观均一的澄清透明液体，不应发生凝固或沉淀，避免使用前“将药物混合物加热融化”的处理环节，便于服用，且减少药物降解；3)自乳化效率高，模拟胃肠环境，加一定量的水稀释后，可快速自发乳化，形成纳米级的乳滴；4)自乳化混合物直接口服后，在胃肠中自发乳化形成的乳滴，应为纳米级(即1-1000nm，药剂学上认为，1-1000nm均属于纳米范筹),而不应为微米级(即>1μm，药剂学上认为，超过1μm则属于微米级)。

但现有的关于绿原酸自乳化***的研究文献，均存在明显的缺陷。

陈莉等，在《绿原酸自微乳给药***的处方设计与体外评价》中以油酸乙酯为油相，吐温80为乳化剂，甘油为助化剂，制备了包载绿原酸的自微乳，载药量可达60mg/g，加100倍水稀释，在37度和50rpm条件下搅拌，可乳化为粒径约16nm的乳滴。但参照文献方法，以油酸乙酯为油相，吐温80为乳化剂，甘油为助化剂，按照油相：乳化剂：助乳化剂＝1:3:6的质量比，制备了载药量为60mg/g的自微乳溶液，结果显示，所制备的绿原酸自微乳浓缩液显示明显的分层现象。在室温以及4℃放置，分层状态加重。

专利CN104826118A公开了一种绿原酸及其衍生物的磷脂修饰物及其制备方法，其将磷脂修饰物应用于“纳米给药***或微米给药***”的制备。但该专利同样存在明显缺陷；1)用于微乳或/自微乳给药***制备时，得到的为微米给药***而不是纳米给药***；2)用于微乳或/自微乳给药***制备时，采用的乳化剂为聚山梨酯80、聚氧乙烯油酸酯、液体卵磷脂和聚氧乙烯蓖麻油中的一种或一种以上混合物，经验证，表明制得的自微乳混合物明显分层，且上层为无流动性的固态凝胶。

发明内容

鉴于现有研究存在的缺陷，本发明专利在***研究基础上，公开了一种绿原酸纳米给药***的自乳化组合物及其制备方法和用途。

本发明提供了一种绿原酸纳米给药***的自乳化组合物，它是由绿原酸脂质材料复合物、油相、乳化剂和助乳化剂组成；所述乳化剂为聚乙二醇甘油酯及其衍生物的任意一种或几种；所述绿原酸脂质材料复合物是绿原酸与脂质材料复合制成。

进一步地，所述绿原酸脂质材料复合物的复合率大于70％，优选大于80％，更优选大于90％。

进一步地，所述组合物中绿原酸含量为5－200mg/g。

更进一步地，所述组合物中绿原酸含量为10－150mg/g。

进一步地，所述绿原酸脂质材料复合物中绿原酸与脂质材料的摩尔比为1:0.25～1:8，优选1:0.25～1:4。

进一步地，所述脂质材料选自胆固醇、磷脂类或胆酸盐类；优选，磷脂类。

更进一步地，所述磷脂类为大豆磷脂、蛋黄磷脂、磷脂酰甘油酯、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二肉蔻酰磷脂酰胆碱、神经酰胺中的任意一种或几种；优选，大豆磷脂和/或蛋黄磷脂。

进一步地，所述油相、乳化剂与助乳化剂质量百分比，按三者总和100％计，油相为10-50％，乳化剂为30-60％，助乳化剂为20-60％。

进一步地，所述聚乙二醇甘油酯衍生物为辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、油酸聚乙二醇甘油酯或亚油酸聚乙二醇甘油酯。

进一步地，所述油相为大豆油、玉米油、橄榄油、椰子油、花生油、山茶油、蓖麻油、油酸山梨醇酯、油酸甘油酯，亚油酸甘油酯、labrafil1944cs、Maisine35-1、油酸乙酯、亚油酸乙酯、C₈/C₁₀甘油单酯、椰子油C₈/C₁₀甘油双酯、椰子油C₈/C₁₀甘油三酯、辛酸甘油三酯、辛酸甘油二酯、辛酸甘油单酯、癸酸甘油单酯、癸酸甘油二酯、癸酸甘油三酯、辛癸酸甘油单酯、辛癸酸甘油酯、辛癸酸甘油三酯、肉豆蔻酸异丙酯、亚油酸聚乙二醇甘油酯、Gelucire、Capryol 90中的任意一种或几种；优选，油酸乙酯、油酸山梨醇酯、油酸甘油酯，亚油酸甘油酯、labrafil1944cs、Maisine35-1、亚油酸乙酯、C₈/C₁₀甘油单酯、椰子油C₈/C₁₀甘油双酯、椰子油C₈/C₁₀甘油三酯、辛酸甘油三酯、辛酸甘油二酯、辛酸甘油单酯、癸酸甘油单酯、癸酸甘油二酯、癸酸甘油三酯、辛癸酸甘油单酯、辛癸酸甘油酯、辛癸酸甘油三酯、肉豆蔻酸异丙酯、亚油酸聚乙二醇甘油酯、Gelucire、Capryol 90中的任意一种或几种。

进一步地，所述助乳化剂为碳酸丙二酯、乙二醇单乙基醚、甘油糠醛、二甲基异山梨酯、二乙二醇单乙基醚、PEG400、甘油、labraosol、苯甲醇中的任意一种或几种；优选，二甲基异山梨酯、二乙二醇单乙基醚、甘油、labraosol中的任意一种或几种。

进一步地，它还包括抗氧剂；所述抗氧剂为维生素E、维生素E酯类衍生物或二丁基羟基甲苯任意一种或几种。

本发明还提供了一种制备绿原酸纳米给药***的自乳化组合物方法，它包括如下步骤：

(1)制备绿原酸与脂质材料的复合物：按配比称取绿原酸与脂质材料，溶于有机溶剂中，混匀，静置15-30min，旋转蒸发或喷雾干燥去除有机溶剂，再减压干燥，即得；

(2)制备空白自乳化浓缩液：按配比称取油相、乳化剂和助乳化剂，混合均匀，即得；

(3)制备绿原酸自乳化组合物：将步骤(1)复合物加入步骤(2)浓缩液中，溶解完全，即得；

或：

按配比将步骤(1)复合物与油相、乳化剂和助乳化剂一同加入，搅拌混合均匀，即得；

或：

按配比先将步骤(1)复合物与油相、乳化剂或助乳化剂中任意一种溶解混匀，再加入另外两种成分混匀，即得。

进一步地，步骤(1)所述有机溶剂为低分子醇类；所述低分子醇类为乙醇、无水乙醇、叔丁醇中的任意一种或几种；优选，无水乙醇。

进一步地，步骤(3)所述溶解为振摇溶解，振摇速度210rpm，温度25℃。

本发明还提供了一种绿原酸制剂，它是由前述绿原酸自乳化组合物，加上药学上可接受的载体组成的制剂。

进一步地，所述制剂为口服制剂、粘膜给药制剂、经皮给药制剂、肠道给药制剂或雾化吸入用制剂。

更进一步地，所述口服制剂为片剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、滴剂或喷剂；所述粘膜给药制剂或经皮给药制剂为涂剂、喷剂或其它适宜剂型；所述肠道给药制剂为液体制剂或溶于油性基质制成栓剂。

更进一步地，所述片剂、颗粒剂或胶囊剂是将绿原酸自乳化组合物分散在微粉硅胶或其他吸附性固体材料上，再加上药剂上可接受的辅料制成。

更进一步地，所述雾化吸入用制剂是将绿原酸自乳化组合物分装制成供雾化吸入用的浓溶液，临用时用雾化装置或加水、生理盐水或葡萄糖注射液稀释后用雾化吸入装置进行雾化吸入。

本发明最后提供了一种绿原酸自乳化组合物或者绿原酸制剂在制备治疗和/或预防恶性肿瘤、免疫低下、细菌病毒感染和/或抗氧化的药物中的用途。

本发明在公开报道的绿原酸自微乳的基础上，尝试将绿原酸制成绿原酸/磷脂复合物后再与其油相、乳化剂和/或助乳剂混合制成自微乳，质量情况具体如下：

在陈莉等《绿原酸自微乳给药***的处方设计与体外评价》研究基础上，尝试先将绿原酸制成绿原酸/磷脂复合物(摩尔比为1:1,质量比为1:2.2)，以改善药物亲脂性，并以复合物为中间载体，再按同样的油相、乳化剂和助化剂处方制备60mg/ml(以绿原酸计)自微乳，但制备过程中发现，所得到的绿原酸自乳化组合物仍显示分层，且上层为固态凝胶，无流动性。于37℃放置1天后，仍呈现上层为固体凝胶状态的分层状态，无明显改善。进一步，采用“聚氧乙烯蓖麻油”代替“吐温80”进行自微乳制备，结果发现，所制备的绿原酸自乳化组合物初始性状仍呈现分层状态。由此提示，当采用绿原酸/磷脂复合物为中间载体制备自微乳时，无论采用“吐温80”为乳化剂还是采用“聚氧乙烯蓖麻油”为乳化剂，均无法获得外观为均一液体的自乳化混合物。

参照专利CN104826118A公开的一种绿原酸及其衍生物的磷脂修饰物及其制备方法、以油酸乙酯为油相，吐温80、聚氧乙烯蓖麻油和RH40氢化聚氧乙烯蓖麻油为乳化剂，二乙二醇单乙基醚、丙二醇和聚乙二醇为助乳化剂，绿原酸磷脂复合物为中间载体，按照油相：乳化剂：助乳化剂质量比为2:5:3制备了绿原酸磷脂复合物自微乳(载药量60mg/g)。结果显示，所制备的自微乳***呈现分层、半凝胶状和凝固三个状态，且室温或4℃放置的情况下仍然呈现上述三种状态，具体结果描述请见表1。

表1参照公开专利的绿原酸磷脂复合物自微乳制备情况

参考目前常用的油相、乳化剂和助乳化剂，并将其用于绿原酸自乳化组合物的制备与粒径检测。具体步骤：以油酸乙酯为油相，吐温80为乳化剂，甘油为助乳化剂，三者比例按1:3:6混合(质量比)，得空白自微乳溶液；

另分别取绿原酸原料药及绿原酸的磷脂复合物(绿原酸与大豆卵磷脂1：1混合后，用无水乙醇溶解，干燥制得)加入到上述空白自微乳中，溶解，使绿原酸载药浓度为60mg/ml，放置一周，观察是否分层；取两种载药自微乳，加入100倍的水稀释，振摇，在2min内，激光粒度仪测定乳滴粒径。

结果如下表2：

表2:吐温80为乳化剂的自乳化组合物考察结果

结果表明，油酸乙酯为油相，吐温80为乳化剂，甘油为助乳化剂，制得的包载绿原酸的自微乳，稀释后粒径小，但冷藏或室温放置3天即出现分层现象；制得的包载绿原酸磷脂复合物的自微乳，稀释后粒径为微米级，且冷藏出现凝固现象，室温贮存出现明显的分层。

综上，现有报道的绿原酸自微乳本身并不稳定，放置后出现不稳定状态或粒径大的缺陷。将绿原酸与脂质材料复合后，再按照其油相、乳化剂和助乳剂组成制备的自微乳仍然不稳定，放置后自微乳***不同程度的呈现分层、半凝胶状和凝固三个状态。

而本发明绿原酸纳米给药***的自乳化组合物以绿原酸/脂质复合物为中间载体，乳化剂采用聚乙二醇甘油酯及其衍生物一种或一种以上的混合，制成的自乳化组合物，在室温及2-8℃条件下放置至少6个月，均不会出现凝固或分层现象，表现为均一的液体性状，加水稀释后可快速乳化形成纳米级乳滴，乳滴粒径<500nm。

本发明具体实验如下：

1、关于绿原酸/脂质复合物CHAPC为中间载体的制备与检测

以大豆卵磷脂为脂质材料，将绿原酸和大豆卵磷脂按照下表的药脂比进行投料，一同加入至1L的圆底烧瓶中，以无水乙醇为溶剂，使药物浓度控制在60mg/ml,待绿原酸和大豆卵磷脂全部溶解后,室温放置15min，随后于旋转蒸发仪100rpm、40℃旋蒸减压干燥除去无水乙醇，待乙醇蒸干后，于室温继续100rpm减压干燥1h将乙醇除干净。

取制备的系列复合物粉末，照如下方法测定复合率，结果见表3。

(1)对照品溶液：称取绿原酸标准品25mg至25ml容量瓶中，用乙醇溶液定容，精密量取1ml至50ml容量瓶中，用30％乙醇水定容，作为对照品溶液；

(2)W_总：称取80mg绿原酸复合物至25ml容量瓶中，用无水乙醇定容摇匀，精密量取1ml至50ml容量瓶中，用30％乙醇水溶液定容摇匀，作为供试品W_总溶液；

(3)W_复合：称取80mg绿原酸复合物至25ml容量瓶中，用氯仿溶解后定容，用0.22um滤膜过滤，精密量取续滤液1ml，氮吹挥干溶剂(氯仿)后，用30％乙醇水准确稀释至50mL，作为供试品W_复合溶液。

在制得以上样品的基础上，采用以下HPLC条件进行测定。

流动相：0.4％磷酸：乙腈＝82:18

检测波长：328nm

流速：1.0mL/min

柱温：25℃

进样量：10uL

Stop Time：8min

表3无水乙醇为溶剂，不同药脂比复合物(CHAPC)及复合率

结果表明，药脂比(摩尔比)为1:0.25至1:8，制得的复合物均复合完全，复合率在99％以上。

按绿原酸/大豆卵磷脂的药脂比(摩尔比)为1:1投料，采用不同溶剂制备复合物，并考察复合率，结果如下表4。

表4不同溶剂对复合物(CHAPC)制备结果的影响

结果表明，药脂比(摩尔比)为1:1时，甲醇、四氢呋喃、氯仿、二氯甲烷中的复合率均较低，叔丁醇、乙酸乙酯中的复合率在70％以上，乙醇(95％浓度)的复合率在80％以上。

以蛋黄卵磷脂、磷脂酰甘油酯、二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、胆酸盐为脂质材料，无水乙醇为溶剂，按药脂比(摩尔比)为1:1，同上法制备复合物，编号依次为CHAPC 15、CHAPC 16、CHAPC 17、CHAPC 18、CHAPC 19,测定复合率，结果表明，复合率均在92％以上。

关于脂质材料的种类，天然磷脂、合成磷脂、胆固醇和胆酸盐均可满足要求，但优选天然磷脂。

2、本发明专利的自乳化组合物的组合比例研究结果

以油酸乙酯为油相，辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(labrasol)为乳化剂，transcutolHP为助乳化剂，三者质量比为2:3：5，混合均匀，制备空白自乳化溶液；另取绿原酸的磷脂复合物CHAPC 3，溶于上述空白自乳化溶液中，使绿原酸的载药量控制在10-200mg/ml，温度25℃，转速210rpm。待复合物溶解完全后即制得所述绿原酸自乳化组合物；取载药自乳化溶液适量，加水100倍进行稀释，考察自乳化效率及乳化后粒径(其中粒径检测方法：用移液枪精密移取20μL绿原酸自乳化组合物，加入装有2ml娃哈哈去离子水的5mlEP管中，轻轻摇匀，转移至比色皿，随后采用激光散射粒度仪测定其粒径)。结果如表5。

表5:辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯为乳化剂的自乳化考察结果

提示在10mg/g－150mg/g(药物/组合物)载药量范围内，均可获得良好的自乳化纳米给药***。

在表5的基础上，又开展了系列的研究，包括：

(1)使用不同编号的绿原酸/磷脂复合物进行自乳化组合物制备，发现CHAPC 1至CHAPC 5,CHAPC 15至CHAPC 19,均可获得良好的结果，外观为均一溶液，且乳化后粒径在200nm以下，其次为CHAPC 6、CHAPC 7、CHAPC 9、CHAPC 10，乳化后粒径在500nm以下。其他复合物效果较差，乳化粒径为微米级。

由此提示，对于本发明专利的绿原酸纳米给药***的自乳化组合物，其中的“绿原酸/脂质复合物”，绿原酸与脂质材料的摩尔比在1:0.25～1:8均可满足要求，但优选的是1:0.25～1:4；绿原酸与脂质材料的复合率在70％以上可满足要求，但优选90％以上。

(2)尝试采用不同的聚乙二醇甘油酯衍生物代替辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(labrasol)，制备自乳化组合物，发现油酸聚乙二醇甘油酯(1944cs)、亚油酸聚乙二醇甘油酯(M2125CS)的任何一种或一种以上任意比例的混合，均可满足要求。

(3)尝试采用不同的油相代替油酸乙酯，制备自乳化组合物，发现大豆油、玉米油、橄榄油、椰子油、花生油、山茶油、蓖麻油、油酸山梨醇酯、油酸甘油酯，亚油酸甘油酯、labrafil1944cs、Maisine35-1、亚油酸乙酯、C8/C10甘油单酯、椰子油C8/C10甘油双酯、椰子油C8/C10甘油三酯、辛酸甘油三酯、辛酸甘油二酯、辛酸甘油单酯、癸酸甘油单酯、癸酸甘油二酯、癸酸甘油三酯、辛癸酸甘油单酯、辛癸酸甘油酯、辛癸酸甘油三酯、肉豆蔻酸异丙酯、亚油酸聚乙二醇甘油酯(M2125CS)、Gelucire、Capryol 90均可用于油相，且基本满足自乳化组合物制备的要求，其中，以油酸乙酯、油酸山梨醇酯、油酸甘油酯，亚油酸甘油酯、labrafil1944cs、Maisine35-1、亚油酸乙酯、C8/C10甘油单酯、椰子油C8/C10甘油双酯、椰子油C8/C10甘油三酯、辛酸甘油三酯、辛酸甘油二酯、辛酸甘油单酯、癸酸甘油单酯、癸酸甘油二酯、癸酸甘油三酯、辛癸酸甘油单酯、辛癸酸甘油酯、辛癸酸甘油三酯、肉豆蔻酸异丙酯、亚油酸聚乙二醇甘油酯(M2125CS)、Gelucire、Capryol 90中的一种或一种以上任意比例的混合效果更好，制备的自乳化组合物，稀释后的乳滴粒径更小。

(4)尝试了用不同的助乳化剂代替二乙二醇单乙基醚(HP)，制备自乳化组合物，结果表明，碳酸丙二酯、甘油糠醛、二甲基异山梨酯、PEG400、甘油、labraosol、苯甲醇中的一种或两种以上任意比例的混合，均可用于乳化剂，其中，以二甲基异山梨酯、二乙二醇单乙基醚(HP)、甘油、labraosol中的一种或一种以上任意比例的混合，效果更好，而其中又以二乙二醇单乙基醚(HP)的效果最优。

(5)调整油相、乳化剂与助乳化剂三者的组成质量比，进行自乳化组合物制备。按三者总和为100％计，当油相为10-50％，乳化剂为30-60％，助乳化剂20-60％，可获得良好自乳化组合物。

(6)此外，为防止油脂类成分长期贮存的酸败，还偿试了在自乳化组合物中加入抗氧剂，维生素E及其酯类、BHT均可使用。

3、本发明专利的自乳化组合物的制备方法

(1)“绿原酸与脂质材料的复合物”的制备：称取绿原酸与脂质材料，溶于极性适中的有机溶剂中，混匀，放置一定时间(15-30min)，旋转蒸发或喷雾干燥去除有机溶剂，减压干燥，即得；

(2)“空白自乳化浓缩液”的制备：按比例称取油相、乳化剂和助乳化剂，搅拌混合均匀，即得；

(3)“绿原酸纳米给药***的自乳化组合物”的制备：将“绿原酸与脂质材料的复合物”加入至“空白自乳化浓缩液”中，并将其置于空气浴振荡器中，温度25℃，转速210rpm或相当条件振荡，待“绿原酸与脂质材料的复合物”溶解完全后，即制得所述绿原酸自乳化组合物。性状为均一澄清的液体。

上述方法的3个步聚，任选地，还可将绿原酸与脂质材料的复合物与油相、乳化剂和助乳化剂一同加入，搅拌混合均匀，制得自乳化组合物；或将复合物与油相、乳化剂或助乳化剂的任一项中先溶解混匀，再加入另外两种成分，混匀，即得。

4、本发明专利的自乳化组合物的应用

本发明专利公开的一种绿原酸纳米给药***的自乳化组合物，可用于制成适于口服给药的制剂，如将自乳化浓缩液直接分装成软胶囊、硬胶囊、口服液、滴剂、喷剂等,其中，优选软胶囊和滴剂。此外，还可将自乳化组合物浓缩液分散在微粉硅胶或其他吸附性固体材料上，加上药剂上常用的辅料，制成口服用的片剂、胶囊剂、颗粒剂或冲剂等。

口服制剂直接服用，无需先用水稀释乳化后再服用。利用自乳化组合物的自乳化能力，可在胃肠液环境及胃肠蠕动条件下快速形成纳米级的乳滴。

除口服制剂外，本发明的自乳化组合物，还可分装制成供雾化吸入用的浓溶液，临用时加水、生理盐水或葡萄糖注射液稀释，采用雾化吸入装置进行雾化吸入。

将本发明专利的自乳化组合物先后用于lewis肺癌和胶质瘤治疗，采用灌胃给药，剂量在20-80mg/kg范围内，均显示了良好的治疗效果，与注射给药相比无明显差异。

综上，本发明在绿原酸与脂质材料摩尔比1:0.25～1:8，优选1:0.25～1:4；油相、乳化剂与助乳化剂三者按总和100％计，油相10-50％，乳化剂30-60％，助乳化剂20-60％，其中乳化剂采用聚乙二醇甘油酯及其衍生物一种或一种以上的混合；载药量10mg/g－150mg/g(药物/组合物)，制得的绿原酸纳米给药***的自乳化组合物，稳定性好且与水混合后粒径小。将该组合物制成不同制剂用于抗肿瘤、抗炎免疫和抗病毒治疗，有显著的效果，具备实际应用推广价值。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1:试验例1中色谱条件一的分离检测HPLC图谱

图2:试验例1中色谱条件二的分离检测HPLC图谱

图3：本专利的绿原酸自乳化组合物和绿原酸自微乳对lewis肺癌的抑瘤效果

图4:绿原酸自乳化组合物对皮下胶质瘤的抑瘤效果

图5：绿原酸自乳化组合物对原位脑胶质瘤的抑瘤效果

具体实施方式

实施例1以CHAPC 3为中间体采用不同的乳化剂制备绿原酸自乳化组合物

(1)“绿原酸与脂质材料的复合物”的制备：按照上述CHAPC 3的制备方法称取绿原酸与脂质材料，溶于无水乙醇中，混匀，放置15min，旋转蒸发去除有机溶剂，减压干燥，即得CHAPC 3；

(2)“空白自乳化浓缩液”的制备：按质量比2:5:3称取油酸乙酯、乳化剂(按照表6中乳化剂的种类进行变化)和transcutol HP，搅拌混合均匀，即得；

(3)“绿原酸纳米给药***的自乳化组合物”的制备：按照表6中载药量计算称取CHAPC3与空白乳，混合后置于空气浴振荡器中，温度25℃，转速210rpm。待CHAPC 3溶解完全后即制得所述绿原酸自乳化组合物。并考察其初始性状、加水100倍稀释后粒径、2-8℃放置6个月性状、室温放置6个月性状。

表6不同乳化剂制备的绿原酸自乳化组合物

实施例2以CHAPC 3为中间体采用不同的油相：乳化剂：助乳化剂制备的绿原酸自乳化组合物

(1)“绿原酸与脂质材料的复合物”的制备：按照上述CHAPC 3的制备方法称取绿原酸与脂质材料，溶于无水乙醇中，混匀，放置15min，旋转蒸发去除有机溶剂，减压干燥，即得CHAPC 3；

(2)“空白自乳化浓缩液”的制备：以油酸乙酯作为油相、labrasol为乳化剂、transcutol HP作为助乳化剂，按照表7中油相：乳化剂：助乳化剂的质量比称取一定量的油酸乙酯、labrasol和transcutol HP，搅拌混合均匀，即得空白自乳化浓缩液；

(3)“绿原酸纳米给药***的自乳化组合物”的制备：按照表7中载药量计算称取CHAPC3与空白乳，混合后置于空气浴振荡器中，温度25℃，转速210rpm。待CHAPC 3溶解完全后即制得所述绿原酸自乳化组合物。并考察其初始性状、加水100倍稀释后粒径、2-8℃放置6个月性状、室温放置6个月性状。

表7不同质量比的油相：乳化剂：助乳化剂制备的绿原酸自乳化组合物

实施例3以不同的CHAPC为中间体制备绿原酸自乳化组合物

1)“绿原酸与脂质材料的复合物”的制备：按照上述CHAPC的制备方法称取绿原酸与脂质材料，溶于无水乙醇中，混匀，放置15min，旋转蒸发去除有机溶剂，减压干燥，即得不同的绿原酸和磷脂复合物CHAPC(见表8)；

(2)“空白自乳化浓缩液”的制备：以油酸乙酯作为油相、labrasol为乳化剂、transcutol HP作为助乳化剂，按质量比2:5:3称取油酸乙酯、labrasol和transcutol HP，搅拌混合均匀，即得空白自乳化浓缩液；

(3)“绿原酸纳米给药***的自乳化组合物”的制备：按照表8中载药量计算称取CHAPC与空白乳，混合后置于空气浴振荡器中，温度25℃，转速210rpm。待CHAPC溶解完全后即制得所述绿原酸自乳化组合物。并考察其初始性状、加水100倍稀释后粒径、2-8℃放置6个月性状、室温放置6个月性状。

表8不同CHAPC为中间体制备的绿原酸自乳化组合物

实施例4不同CHAPC：空白自微乳比例制备绿原酸自乳化组合物

(1)“绿原酸与脂质材料的复合物”的制备：按照上述CHAPC 3的制备方法称取绿原酸与脂质材料，溶于无水乙醇中，混匀，放置15min，旋转蒸发去除有机溶剂，减压干燥，即得CHAPC 3；

(2)“空白自乳化浓缩液”的制备：以油酸乙酯作为油相、labrasol为乳化剂、transcutol HP作为助乳化剂，按照油相：乳化剂：助乳化剂的质量比为2:5:3称取一定量的油酸乙酯、labrasol和transcutol HP，搅拌混合均匀，即得得空白自乳化浓缩液；

(3)“绿原酸纳米给药***的自乳化组合物”的制备：按照表9中CHAPC与空白乳的质量比称取CHAPC 3和空白乳剂，混合后得到不同载药量的混合物，并将其置于空气浴振荡器中，温度25℃，转速210rpm。待CHAPC 3溶解完全后即制得所述绿原酸自乳化组合物。并考察其初始性状、加水100倍稀释后粒径、2-8℃放置6个月性状、室温放置6个月性状。

表9不同CHAPC为中间体制备的绿原酸自乳化组合物

实施例5加入不同抗氧剂的绿原酸自乳化组合物的稳定性考察

(1)“绿原酸与脂质材料的复合物”的制备：按照上述CHAPC 3的制备方法称取绿原酸与脂质材料，溶于无水乙醇中，混匀，放置15min，旋转蒸发去除有机溶剂，减压干燥，即得CHAPC 3；

(2)“空白自乳化浓缩液”的制备：以油酸乙酯作为油相、labrasol为乳化剂、transcutol HP作为助乳化剂，按照油相：乳化剂：助乳化剂的质量比为2:5:3称取一定量的油酸乙酯、labrasol和transcutol HP，搅拌混合均匀，即得空白自乳化浓缩液。并在所得的空白自乳化浓缩液中加入抗氧剂(种类如表10所示)；

(3)“绿原酸纳米给药***的自乳化组合物”的制备：按照CHAPC与空白乳的质量比1.2:5称取“绿原酸与脂质材料的复合物CHAPC 3”加入至“空白自乳化浓缩液”中，并将其置于空气浴振荡器中，温度25℃，转速210rpm。待CHAPC 3溶解完全后即制得所述绿原酸自乳化组合物。并考察其初始性状、加水100倍稀释后粒径、2-8℃放置6个月性状和室温放置6个月性状。

表10加入不同抗氧剂的绿原酸自乳化组合物

实施例6绿原酸自乳化组合物用于口服用软胶囊制剂或雾化吸入给药

(1)“绿原酸与脂质材料的复合物”的制备：按照上述CHAPC 3的制备方法称取绿原酸与脂质材料，溶于无水乙醇中，混匀，放置15min，旋转蒸发去除有机溶剂，减压干燥，即得CHAPC 3；

(2)“空白自乳化浓缩液”的制备：以油酸乙酯作为油相、labrasol为乳化剂、transcutol HP作为助乳化剂，按照油相：乳化剂：助乳化剂的质量比为2:5:3称取一定量的油酸乙酯、labrasol和transcutol HP，搅拌混合均匀，即得空白自乳化浓缩液；

(3)“绿原酸纳米给药***的自乳化组合物”的制备：按照CHAPC与空白乳的质量比1.2:5称取“绿原酸与脂质材料的复合物CHAPC 3”加入至“空白自乳化浓缩液”中，并将其置于空气浴振荡器中，温度25℃，转速210rpm。待CHAPC 3溶解完全后即制得所述绿原酸自乳化组合物。

(4)将该绿原酸自乳化组合物装入软胶囊，制备口服用软胶囊制剂。此外还可以将该绿原酸自乳化组合物加水、生理盐水或葡萄糖注射液稀释，连接雾化吸入装置进行雾化吸入给药。

以下通过试验例进一步说明本发明的有益效果：

试验例1：HPLC含量测定方法研究

绿原酸为多酚类结构，在溶液状态下极易发生化学降解，若色谱条件不能使主峰与降解产物有效分离，则会直接影响稳定性考察结果的准确性。为此，采用高温加速破坏的自乳化样品，用无水乙醇破乳，加水稀释至绿原酸浓度约为0.1mg/ml的供试液，考察下述两种条件进行测定。

色谱条件一：等度洗脱，流动相为0.4％磷酸：乙腈＝82:18；流速：1mL/min；检测波长：328nm；柱温：25℃；进样体积：10μL。

色谱图见附图1。

色谱条件二：采用梯度洗脱，流动相条件如下。

柱温：25℃；流速：1.0mL/min；波长：328nm进样体积：10μL

色谱图见图2。

图1和图2比较发现，在设定的测定浓度条件下，两种色谱条件测得的绿原酸主峰面积差别不大，但对杂质的分离检测能力，色谱条件二明显优于色谱条件一。因此，后续采用色谱条件二进行自乳化样品的稳定性考察。

试验例2：绿原酸自乳化组合物的稳定性考察

取实施例1及实施例2的9组不同编号的自乳化组合物样品，于4℃和室温条件下放置7个月，取出，进行外观性状和化学稳定性考察。

外观性状：9组样品经4℃和室温条件下放置7个月，均为澄清透明的均一溶液，无沉淀，表明物理稳定性良好。

含量：取稳定性样品，精密称定，用无水乙醇破乳，加水稀释至绿原酸浓度约为0.1mg/ml的供试溶液，另取绿原酸原料药，配制相当浓度的对照溶液；取供试溶液与对照溶液各10μL注入液相色谱仪，照试验例1中的色谱条件二(梯度洗脱)依法检测，外标法计算药物浓度，并根据理化载药量计算标示含量。

结果表明，9组自乳化组合物样品，于4℃和室温条件下放置7个月，标示含量均稳定在95-105％范围内，与初始相比，含量及杂质无明显变化。

试验例3：绿原酸自乳化组合物对皮下荷lewis肺癌的ICR小鼠的抑制肿瘤效果考察

采用皮下接种lewis肺癌的C57BL/6小鼠进行绿原酸自乳化组合物的肿瘤抑制效果评价。在荷瘤后的第二天分别按照35mg/kg和30mg/kg的口服给药剂量对荷瘤小鼠灌胃给予绿原酸自微乳(制备方法同文献Li Chen,Chang-shun Liu,Qing-zhen Chen,SenWang,Yong-ai Xiong,Jing Jing,Jia-jia Lv.Characterization,pharmacokinetics andtissue distribution of chlorogenic acid-loaded self-microemulsifying drugdelivery system.European Journal of Pharmaceutical Sciences,2017,100:102–108，简称绿原酸自微乳)和绿原酸自乳化组合物(实施例中样品编号1)，灌胃口服生理盐水作为对照，连续灌胃给药13天，期间观察动物的状态及体重，给药结束后第二天断颈处死小鼠，剥取肿瘤组织进行称重，并与对照组的瘤重相比较，作为肿瘤抑制效率评价。结果见附图3。

结果显示，在整个给药期间，所有实验动物均状态良好，体重未出现明显下降。图3结果显示，本发明公开的绿原酸自乳化组合物对lewis肺癌的抑瘤率达到88.57±0.17％，而绿原酸自微乳的抑瘤率只有50.24±9.07％。在给药剂量小于绿原酸自微乳的情况下，绿原酸自乳化组合物的肿瘤抑制效率是绿原酸自微乳的1.76倍。

试验例4：绿原酸自乳化组合物对皮下荷脑胶质瘤的ICR小鼠的抑制肿瘤效果考察

采用皮下接种G422的ICR小鼠进行绿原酸自乳化组合物对脑胶质瘤的肿瘤抑制效果评价。在荷瘤后的第二天分别按照30mg/kg的口服给药剂量对荷瘤小鼠灌胃给予阳性对照药环磷酰胺(CTX，剂量)和绿原酸自乳化组合物(实施例中样品编号1，剂量分别为：20mg/kg,简称CHA SME 20；40mg/kg,简称CHA SME 40；60mg/kg,简称CHA SME 60)，灌胃口服生理盐水作为对照，连续灌胃给药13天。同时腹腔注射绿原酸原料药水溶液(剂量分别为：10mg/kg，简称CHA 10；20mg/kg，简称CHA 20；40mg/kg，简称CHA 40.)作为对比。期间观察动物的状态及体重，给药结束后第二天断颈处死小鼠，剥取肿瘤组织进行称重，并与对照组的瘤重相比较，作为肿瘤抑制效率评价。结果见附图4。

结果显示，在整个给药期间，所有实验动物均状态良好，体重未出现明显下降。图4结果显示，本发明公开的绿原酸自乳化组合物(CHA SME 20、CHA SME 40和CHA SME 60)对皮下接种G422的I CR小鼠的抑瘤率达到30.71±6.42％、20.17±8.94％和33.46±5.97％，效果与绿原酸原料药溶液的腹腔注射组相当(CHA 10:31.7±8.07％；CHA 20:27.82±9.0％；CHA 40:23.82±4.92％)。

试验例5：绿原酸自乳化组合物对原位脑胶质瘤的ICR小鼠的抑制肿瘤效果考察

采用原位接种G422的ICR小鼠进行绿原酸自乳化组合物对脑胶质瘤的肿瘤抑制效果评价。在荷瘤后的第二天分别对荷瘤小鼠灌胃给予阳性对照药替莫唑胺(TMZ,50mg/kg)和绿原酸自乳化组合物(实施例中样品编号1,剂量分别为20mg/kg和35mg/kg，简称：CHASME20mg/kg和CHA SME 35mg/kg)，灌胃口服生理盐水作为对照，连续灌胃给药13天。此外，同时采用腹腔给药绿原酸原料药溶液(剂量分别为10mg/kg和20mg/kg，简称：CHA10mg/kg和CHA 20mg/kg)作为对照。期间观察动物的状态及体重，给药结束后量动物的肿瘤体积大小，作为肿瘤抑制效率评价。结果见附图5。

结果显示，在整个给药期间，所有实验动物均状态良好，体重未出现明显下降。图5结果显示，本发明公开的绿原酸自乳化组合物(CHA SME 35mg/kg)对原位接种G422的ICR小鼠的抑瘤率达到54.8％，明显优于绿原酸原料药腹腔注射组(CHA 10mg/kg,27.1％；CHA20mg/kg,45.6％)。

综上，本发明绿原酸纳米给药***的自乳化组合物，在室温及2-8℃条件下放置不会出现凝固或分层现象，可用于口服给药、粘膜给药、经皮给药、肠道给药或雾化吸入用制剂的制备。模拟口服给药后的胃肠环境，组合物用10-1000倍体积的水、不同pH缓冲液、人工胃液或人工肠液进行稀释，经轻微振摇，均可快速形成平均粒径在500nm以下的纳米级给药***。本发明的自乳化组合物及其制剂，可用于抗肿瘤、抗炎免疫和抗病毒的治疗。

Claims (21)

1.一种绿原酸纳米给药***的自乳化组合物，其特征在于，它是由绿原酸与脂质材料形成的复合物、油相、乳化剂和助乳化剂组成；所述乳化剂为聚乙二醇甘油酯及其衍生物的任意一种或几种。

2.根据权利要求1所述的自乳化组合物，其特征在于，所述绿原酸脂质材料复合物的复合率大于70％，优选大于80％，更优选大于90％。

3.根据权利要求1所述的自乳化组合物，其特征在于，所述组合物中绿原酸含量为5－200mg/g。

4.根据权利要求3所述的自乳化组合物，其特征在于，所述组合物中绿原酸含量为10－150mg/g。

5.根据权利要求1所述的绿原酸自乳化组合物，其特征在于，所述绿原酸脂质材料复合物中绿原酸与脂质材料的摩尔比为1:0.25～1:8，优选1:0.25～1:4。

6.根据权利要求1或5所述的绿原酸自乳化组合物，其特征在于，所述脂质材料选自胆固醇、磷脂类或胆酸盐类；优选，磷脂类。

7.根据权利要求6所述的绿原酸自乳化组合物，其特征在于，所述磷脂类为大豆磷脂、蛋黄磷脂、磷脂酰甘油酯、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二肉蔻酰磷脂酰胆碱、神经酰胺中的任意一种或几种；优选，大豆磷脂和/或蛋黄磷脂。

8.根据权利要求1所述的自乳化组合物，其特征在于，所述油相、乳化剂与助乳化剂质量百分比，按三者总和100％计，油相为10-50％，乳化剂为30-60％，助乳化剂为20-60％。

9.根据权利要求1所述的绿原酸自乳化组合物，其特征在于，所述聚乙二醇甘油酯衍生物为辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、油酸聚乙二醇甘油酯或亚油酸聚乙二醇甘油酯。

10.根据权利要求1或8所述的绿原酸自乳化组合物，其特征在于，所述油相为大豆油、玉米油、橄榄油、椰子油、花生油、山茶油、蓖麻油、油酸山梨醇酯、油酸甘油酯，亚油酸甘油酯、labrafil1944cs、Maisine35-1、油酸乙酯、亚油酸乙酯、C₈/C₁₀甘油单酯、椰子油C₈/C₁₀甘油双酯、椰子油C₈/C₁₀甘油三酯、辛酸甘油三酯、辛酸甘油二酯、辛酸甘油单酯、癸酸甘油单酯、癸酸甘油二酯、癸酸甘油三酯、辛癸酸甘油单酯、辛癸酸甘油酯、辛癸酸甘油三酯、肉豆蔻酸异丙酯、亚油酸聚乙二醇甘油酯、Gelucire、Capryol90中的任意一种或几种；优选，油酸乙酯、油酸山梨醇酯、油酸甘油酯，亚油酸甘油酯、labrafil1944cs、Maisine35-1、亚油酸乙酯、C₈/C₁₀甘油单酯、椰子油C₈/C₁₀甘油双酯、椰子油C₈/C₁₀甘油三酯、辛酸甘油三酯、辛酸甘油二酯、辛酸甘油单酯、癸酸甘油单酯、癸酸甘油二酯、癸酸甘油三酯、辛癸酸甘油单酯、辛癸酸甘油酯、辛癸酸甘油三酯、肉豆蔻酸异丙酯、亚油酸聚乙二醇甘油酯、Gelucire、Capryol90中的任意一种或几种。

11.根据权利要求1或8所述的绿原酸自乳化组合物，其特征在于，所述助乳化剂为碳酸丙二酯、乙二醇单乙基醚、甘油糠醛、二甲基异山梨酯、二乙二醇单乙基醚、PEG400、甘油、labraosol、苯甲醇中的任意一种或几种；优选，二甲基异山梨酯、二乙二醇单乙基醚、甘油、labraosol中的任意一种或几种。

12.根据权利要求1所述的绿原酸自乳化组合物，其特征在于，它还包括抗氧剂；所述抗氧剂为维生素E、维生素E酯类衍生物或二丁基羟基甲苯任意一种或几种。

13.一种制备权利要求1-12任一项所述的绿原酸纳米给药***的自乳化组合物方法，其特征在于，它包括如下步骤：

(1)制备绿原酸与脂质材料的复合物：按配比称取绿原酸与脂质材料，溶于有机溶剂中，混匀，静置15-30min，旋转蒸发或喷雾干燥去除有机溶剂，再减压干燥，即得；

(2)制备空白自乳化浓缩液：按配比称取油相、乳化剂和助乳化剂，混合均匀，即得；

(3)制备绿原酸自乳化组合物：将步骤(1)复合物加入步骤(2)浓缩液中，溶解完全，即得；

或：

按配比将步骤(1)复合物与油相、乳化剂和助乳化剂一同加入，搅拌混合均匀，即得；

或：

按配比先将步骤(1)复合物与油相、乳化剂或助乳化剂中任意一种溶解混匀，再加入另外两种成分混匀，即得。

14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述有机溶剂为低分子醇类；所述低分子醇类为乙醇、无水乙醇、叔丁醇中的任意一种或几种；优选，无水乙醇。

15.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述溶解为振摇溶解，振摇温度为室温，速度210rpm。

16.一种绿原酸制剂，其特征在于，它是由权利要求1-12任意一项所述的绿原酸自乳化组合物，加上药学上可接受的载体组成的制剂。

17.根据权利要求16所述的制剂，其特征在于，所述制剂为口服制剂、粘膜给药制剂、经皮给药制剂、肠道给药制剂或雾化吸入用制剂。

18.根据权利要求17所述的制剂，其特征在于，所述口服制剂为片剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、滴剂或喷剂；所述粘膜给药制剂或经皮给药制剂为涂剂、喷剂或其它适宜剂型；所述肠道给药制剂为液体制剂或溶于油性基质制成栓剂。

19.根据权利要求18所述的制剂，其特征在于，所述片剂、颗粒剂或胶囊剂是将绿原酸自乳化组合物分散在微粉硅胶或其他吸附性固体材料上，再加上药剂上可接受的辅料制成。

20.根据权利要求17所述的制剂，其特征在于，所述雾化吸入用制剂是将绿原酸自乳化组合物分装制成供雾化吸入用的浓溶液。

21.权利要求1-12任意一项所述的绿原酸自乳化组合物或者权利要求16-20任意一项所述的绿原酸制剂在制备治疗和/或预防恶性肿瘤、免疫低下、细菌病毒感染和/或抗氧化的药物中的用途。