CN110172481A - 一种小片段stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼 - Google Patents
一种小片段stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼 Download PDFInfo
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Abstract
一种小片段stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼，该斑马鱼获得方法包括如下步骤：CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计构建表达载体以及体外合成；斑马鱼胚胎的显微注射；T7E1法和Sanger测序检测靶位点的有效性；注射两个月之后，进行剪尾鉴定；目的序列的TA克隆；质粒的Sanger测序；获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代；获得斑马鱼突变体的F2代纯合子；依据步骤九方法进行stat1a基因缺失型斑马鱼的F3代纯系遗传，得到stat1a‑17的斑马鱼纯合品系；筛选stat1b基因突变缺失型斑马鱼；筛选stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼。
Description
技术领域
本发明涉及CRISPR/Cas9基因打靶领域，特别涉及一种小片段 stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼。
背景技术
STAT1(signal transducer and activator of transcription 1)基因位于人类2q32.3，是编码750个氨基酸的转录因子。一般认为该基因介导干扰素信号通路，可直接调控靶基因的转录，并参与细胞增殖与分化等过程。通过基因差异表达谱分析和基因组关联分析等，发现STAT1 基因与骨质疏松密切相关。
斑马鱼与人类在骨骼发育过程中的基因、信号通路有高度同源性，且STAT1基因进化上较为保守，人类STAT1基因的两个不同剪接体 STAT1-alpha和STAT1-beta对应于斑马鱼两个不同基因stat1a和 stat1b，研究发现stat1b和stat1b在斑马鱼胚胎早期表达量特别高。而且，与其他动物模型相比，斑马鱼个体小、幼鱼通体透明，利于骨骼发育的观察。
通过CRISPR/Cas9基因打靶技术，分别在斑马鱼stat1a和stat1b 基因上设计合适的打靶位点，将体外合成的特异性sgRNA(终浓度 20ng/μL)和Cas9-mRNA(终浓度300ng/μL)显微共注射进斑马鱼一细胞内，并通过活性检测证实了所选位点的有效性。
发明内容
为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种小片段stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼。
为达到上述目的，本发明的技术方案为：
一种小片段stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼，该斑马鱼获得方法包括如下步骤：
步骤一、CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计
在NCBI上查询斑马鱼stat1a基因的基因组DNA序列及其功能结构域,根据CRISPR/Cas9敲除原理，设计一对stat1a基因的靶位点，靶点的选择遵循此标准：5'-GG-(N)18-NGG-3'：其中5'端的二核普酸是T7启动子的一部分,靶位点的3'端是NGG；
步骤二、构建表达载体以及体外合成
步骤三、斑马鱼胚胎的显微注射
在受精30min后之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中；在进行显微注射之前,将Cas9 mRNA和gRNA 配成混合液,充分混匀,使Cas9 mRNA的终浓度为300ng/μL，gRNA 的终浓度为20ng/μL，注射1.8nLCas9 mRNA和gRNA混合液于一细胞期的受精卵内,注射过的受精卵放置于置于5mmol/L NaCl、 0.33mmol/L CaCl2、0.33mmol/L MgSO4、0.17mmol/L KCl的E3水中,28℃孵化，在体视显微镜下观察胚胎表型，筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析；
步骤四、T7E1法和Sanger测序检测靶位点的有效性
对斑马鱼胚胎进行显微注射之后,挑选部分发育正常的早期胚胎, 使用T7E1对纯化回收DNA目的片段按一定的比例进行酶切实验，检测目的DNA片段是否被切开；如若目的DNA片段下面有被切开的条带，则使用ImageJ软件，通过酶切后条带的亮度来估计非同源末端连接的频率；这样可以检测其stat1a基因是否存在突变，提前确认此次选择的靶位点是否有效果，显微注射操作是否规范；另外，送部分纯化之后的目的DNA片段进行Sanger测序，由测序的峰图来初步获得***或缺失的信息；若测序峰图有双峰，并且测序结果显示有***或缺失现象的目的序列，则说明注射F0代的斑马鱼有突变的情况出现，进一步确认了靶位点及此次注射的有效性，接下来将剩余的斑马鱼胚胎养大成成鱼即可进行F0代突变体筛选工作；
步骤五、注射两个月之后，进行剪尾鉴定；
步骤六、目的序列的TA克隆
T7E1酶切初步鉴定有突变可能的目的序列再进行Sanger测序：若测序峰图有双峰，并且测序结果显示有***或缺失现象的目的序列，接下来进行克隆之后挑取单克隆作进一步检测；
步骤七、质粒的Sanger测序
将双酶切检测结果显示条带中目的条带有被切开的质粒送往测序，根据测序之后给出的峰图和序列，在NCBI上与标准目的序列进行对比，根据比对结果，分析出每个单克隆的突变类型；
步骤八、获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代
通过前面一系列筛选确定了斑马鱼突变体F0代，紧接着将F0 代突变体分别与野生型斑马鱼杂交得到F1代胚胎,置于28℃培养，在初期观察F1代的存活率；受精两天后，每个突变体F1代分别取10 个胚胎进行突变遗传性鉴定；将每个胚胎单独提取基因组,然后PCR 扩增出700bp的靶位点附近区域，再进行T7E1酶切分析并送部分去测序，确定此突变是否可以遗传到后代；
步骤九、获得斑马鱼突变体的F2代纯合子
从F1代突变体中挑选相同突变的雌鱼和雄鱼，杂交得到F2代, 放置于28℃培养，受精四天后取部分胚胎进行鉴定；将每个胚胎单独提取基因组,PCR扩增出700bp靶位点附近区域，通过BalI限制性酶切分析并测序，初步检验是否可以得到stat1a突变体纯合子；如检验结果证明存在纯合子，则养大后再单条剪尾鉴定；
步骤十、依据步骤九方法进行stat1a基因缺失型斑马鱼的F3代纯系遗传，得到stat1a-17的斑马鱼纯合品系；
步骤十一、筛选stat1b基因突变缺失型斑马鱼
根据筛选stat1a基因突变缺失型斑马鱼同样的步骤，同样对stat1b 基因进行CRISPR/Cas9基因敲除，通过筛选，获得stat1b基因缺失型斑马鱼的F3代纯系遗传，得到stat1b-S2的斑马鱼纯合品系；
步骤十二、筛选stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼
将stat1a-17F5代突变纯合体斑马鱼与stat1b-S2F3代突变纯合体斑马鱼进行杂交，依据步骤八、步骤九的方法最终获得stat1a/stat1b 基因双突变缺失型斑马鱼的F3代纯系遗传，得到stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼纯合品系。
进一步的，所述步骤一中：
靶位点1：5’-GAGCTCATGGAAGCGAACGATGG-3’
靶位点2：5’-GCAAGAGAATCCTGTTTACATGG-3’。
进一步的，所述步骤四中：酶切实验的具体比例为：酶切反应体系为10μL体系。
进一步的，所述步骤五具体为：待F0代斑马鱼养大成鱼之后将斑马鱼单条成鱼进行剪尾，剪取的长度大约为斑马鱼尾鳍的1/3到 1/2，然后进行基因组提取、PCR扩增、DNA纯化回收、T7E1酶切、Sanger测序一系列的检测实验，根据T7E1酶切和Sanger测序结果初步筛选出具有基因突变的F0代斑马鱼；
进一步的，所述步骤八中，如果从F1代胚胎中检测到存在突变，则将斑马鱼突变体的F1代养大至2一3个月；再分别对每条F1代斑马鱼成鱼进行剪尾,筛选F1代突变体；
上述任一所述小片段stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼在研究stat1a基因与stat1b基因存在相互影响方面的应用。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明提供了一种小片段stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼，公开了小片段stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼的获得方法，通过stat1a基因缺失型纯合突变体斑马鱼与stat1b基因缺失型纯合突变体斑马鱼交配其stat1a突变基因与stat1b突变基因发生基因重组得到的新的斑马鱼品系——stat1a/stat1b双基因缺失型斑马鱼。之前筛选到的部分stat1b-S2缺失型纯合突变体斑马鱼嘴唇下颌骨明显变长往前突出，而整体的脊柱形状也发生了一些变化，脊柱弯曲的弧度有稍微的增加。而stat1a/stat1b双基因缺失型斑马鱼的表型并没有出现嘴唇的下颌骨明显前突的现象，且在stat1a/stat1b双基因缺失型斑马鱼杂合突变体基因序列与野生型基因序列多出碱基匹配不上但缺失片段符合，为后期研究stat1a基因与stat1b基因的相互影响提供了方向和依据。
附图说明
图1为stat1a基因上靶位点的结构图；
图2为stat1b基因上靶位点的结构图；
图3为stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼F2代纯合突变品系 stat1a基因序列和野生型基因序列反向对比图。
图4为靶位点附近缺失对比图，
图5为stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼F2代纯合突变品系stat1a基因二级结构改变的预测结果图；
图6为stat1a/stat1b双基因缺失型斑马鱼F2代纯合突变品系和野生型斑马鱼蛋白质三级结构对比图。
图7为stat1a/stat1b双基因缺失型斑马鱼F2代纯合突变品系 stat1b基因序列和野生型基因序列反向对比图。
图8为靶位点附近缺失对比图。
图9为stat1a/stat1b双基因缺失型斑马鱼F2代纯合突变品系和野生型斑马鱼二级结构图，其中：
A：突变品系和野生型斑马鱼二级结构一部分对比图
B：突变品系和野生型斑马鱼二级结构整体情况对比图。
图10为stat1a/stat1b双基因缺失型斑马鱼F2代纯合突变品系和野生型斑马鱼三级结构对比图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：
如图1所示，步骤一、CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计
在NCBI上查询斑马鱼stat1a基因的基因组DNA序列及其功能结构域,根据CRISPR/Cas9敲除原理，设计一对stat1a基因的靶位点，靶点的选择遵循此标准：5'-GG-(N)18-NGG-3'：其中5'端的二核普酸是T7启动子的一部分,靶位点的3'端是NGG；
步骤二、构建表达载体以及体外合成
步骤三、斑马鱼胚胎的显微注射
在受精30min后之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中；在进行显微注射之前,将Cas9 mRNA和gRNA 配成混合液,充分混匀,使Cas9 mRNA的终浓度为300ng/μL，gRNA 的终浓度为20ng/μL，注射1.8nLCas9 mRNA和gRNA混合液于一细胞期的受精卵内,注射过的受精卵放置于置于5mmol/L NaCl、 0.33mmol/L CaCl2、0.33mmol/L MgSO4、0.17mmol/L KCl的E3水中,28℃孵化，在体式显微镜下观察胚胎表型，筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析；
步骤四、T7E1法和Sanger测序检测靶位点的有效性
对斑马鱼胚胎进行显微注射之后,挑选部分发育正常的早期胚胎, 检测其stat1a基因是否存在突变，提前确认此次选择的靶位点是否有效果，显微注射操作是否规范；
步骤五、注射两个月之后，进行剪尾鉴定
步骤六、目的序列的TA克隆
T7E1酶切初步鉴定有突变可能的目的序列再进行Sanger测序：若测序峰图有双峰，并且测序结果显示有***或缺失现象的目的序列，接下来进行克隆之后挑取单克隆作进一步检测；
步骤七、质粒的Sanger测序
将双酶切检测结果显示条带大小符合预期结果的质粒送往测序，根据测序之后给出的峰图和序列，在NCBI上与标准目的序列进行对比，根据比对结果，分析出每个单克隆的突变类型；
步骤八、获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代
通过前面一系列筛选确定了斑马鱼突变体F0代，紧接着将F0 代突变体分别与野生型斑马鱼杂交得到F1代胚胎,置于28℃培养，在初期观察F1代的存活率；受精两天后，每个突变体F1代分别取10 个胚胎进行突变遗传性鉴定；将每个胚胎单独提取基因组,然后PCR 扩增出700bp的靶位点附近区域，再进行T7E1酶切分析并送部分去测序，确定此突变是否可以遗传到代；
如果从F1代胚胎中检测到存在突变，则将斑马鱼突变体的F1 代养大至2一3个月；再分别对每条F1代斑马鱼成鱼进行剪尾,筛选 F1代突变体；
步骤九、获得斑马鱼突变体的F2代纯合子
从F1代突变体中挑选相同突变的雌鱼和雄鱼，杂交得到F2代, 放置于28℃培养，受精四天后取部分胚胎进行鉴定。将每个胚胎单独提取基因组,PCR扩增出700bp靶位点附近区域，通过BalI限制性酶切分析并测序，初步检验是否可以得到stat1a突变体纯合子。如检验结果证明存在纯合子，则养大后再单条剪尾鉴定；
步骤十、依据步骤九方法进行stat1a基因缺失型斑马鱼的F3代纯系遗传，得到stat1a-17的斑马鱼纯合品系。
步骤十一、筛选stat1b基因突变缺失型斑马鱼
根据筛选stat1a基因突变缺失型斑马鱼同样的步骤，同样对stat1b 基因进行CRISPR/Cas9基因敲除，通过筛选，获得stat1b基因缺失型斑马鱼的F3代纯系遗传，得到stat1b-S2的斑马鱼纯合品系。
步骤十二、筛选stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼
将stat1a-17F5代突变纯合体斑马鱼与stat1b-S2F3代突变纯合体斑马鱼进行杂交，依据步骤八、步骤九的方法最终获得stat1a/stat1b 基因双突变缺失型斑马鱼的F3代纯系遗传，得到stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼纯合品系。
实验例：
如图1-10所示，一种小片段stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼，其获得方法包括如下步骤：图1为stat1a基因上靶位点的结构图；
图2为stat1b基因上靶位点的结构图；
靶位点1：5’-GAGCTCATGGAAGCGAACGATGG-3’
靶位点2：5’-GCAAGAGAATCCTGTTTACATGG-3’
双线表示DNA两条链，靶位点1和靶位点2用深色线条表示，
步骤一、CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计
在NCBI上查询斑马鱼stat1a基因的基因组DNA序列及其功能结构域,根据CRISPR/Cas9敲除原理，设计一对stat1a基因的靶位点，靶点的选择遵循此标准：5'-GG-(N)18-NGG-3'：其中5'端的二核普酸是T7启动子的一部分,靶位点的3'端是NGG；
步骤二、构建表达载体以及体外合成
步骤三、斑马鱼胚胎的显微注射
在受精30min后之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中；在进行显微注射之前,将Cas9 mRNA和gRNA 配成混合液,充分混匀,使Cas9 mRNA的终浓度为300ng/μL，gRNA 的终浓度为20ng/μL，注射1.8nLCas9 mRNA和gRNA混合液于一细胞期的受精卵内,注射过的受精卵放置于置于5mmol/L NaCl、 0.33mmol/L CaCl2、0.33mmol/L MgSO4、0.17mmol/L KCl的E3水中,28℃孵化，在体式显微镜下观察胚胎表型，筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析；
步骤四、T7E1法和Sanger测序检测靶位点的有效性
对斑马鱼胚胎进行显微注射之后,挑选部分发育正常的早期胚胎, 检测其stat1a基因是否存在突变，提前确认此次选择的靶位点是否有效果，显微注射操作是否规范；
步骤五、注射两个月之后，进行剪尾鉴定
步骤六、目的序列的TA克隆
T7E1酶切初步鉴定有突变可能的目的序列再进行Sanger测序：若测序峰图有双峰，并且测序结果显示有***或缺失现象的目的序列，接下来进行克隆之后挑取单克隆作进一步检测；
步骤七、质粒的Sanger测序
将双酶切检测结果显示条带大小符合预期结果的质粒送往测序，根据测序之后给出的峰图和序列，在NCBI上与标准目的序列进行对比，根据比对结果，分析出每个单克隆的突变类型；
步骤八、获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代
通过前面一系列筛选确定了斑马鱼突变体F0代，紧接着将F0 代突变体分别与野生型斑马鱼杂交得到F1代胚胎,置于28℃培养，在初期观察F1代的存活率；受精两天后，每个突变体F1代分别取10 个胚胎进行突变遗传性鉴定；将每个胚胎单独提取基因组,然后PCR 扩增出700bp的靶位点附近区域，再进行T7E1酶切分析并送部分去测序，确定此突变是否可以遗传到代；
如果从F1代胚胎中检测到存在突变，则将斑马鱼突变体的F1 代养大至2一3个月；再分别对每条F1代斑马鱼成鱼进行剪尾,筛选 F1代突变体；
步骤九、获得斑马鱼突变体的F2代纯合子
从F1代突变体中挑选相同突变的雌鱼和雄鱼，杂交得到F2代, 放置于28℃培养，受精四天后取部分胚胎进行鉴定。将每个胚胎单独提取基因组,PCR扩增出700bp靶位点附近区域，通过BalI限制性酶切分析并测序，初步检验是否可以得到stat1a突变体纯合子。如检验结果证明存在纯合子，则养大后再单条剪尾鉴定；
如图4所示，stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼F2代纯合突变体stat1a基因缺失测序结果与野生型序列(700bp)进行反向对比，发现stat1a两个靶位点处(粗体表示，下划线)都有碱基缺失，靶位点a处有6个碱基的缺失(缺失2个氨基酸)，靶位点b处有18个碱基的缺失(缺失6个氨基酸)。
如图5所示，由于筛选到的stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼F2代纯合突变体的stat1a基因部分碱基缺失没有造成整个基因的移码突变，不能完全改变斑马鱼stat1a基因的表达。接下来，利用蛋白质空间结构预测软件Phyre2对筛选到的双突变缺失型斑马鱼F2代纯合突变体stat1a基因的结构进行预测，结果如图5所示，是野生型斑马鱼和双突变缺失型斑马鱼F2代纯合突变体的stat1a蛋白的二级结构的对比结果，显示STAT1的某些保守结构域处有改变(图中用圆圈标识)。STAT1蛋白的V638和S639处是同源二聚体界面，对应于 stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼F2代纯合突变体的stat1蛋白，这两个氨基酸位点，V630和S631却不再是同源二聚体接触面了。结果说明所筛选到的stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼纯合突变体的F2代虽然没有整个STAT1蛋白的改变，但由于某些保守结构域位点的变化，影响STAT1蛋白质二聚体的结合。从图6中也可以看出，虽然stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼F2代纯合突变体的 stat1a基因蛋白质三级结构与野生型相比较还是受到了影响。
如图8所示，stat1a/stat1b双基因缺失型斑马鱼F2代纯合突变体 stat1b基因序列在靶位点1和靶位点2上都发生了碱基缺失，靶位点 1附近缺失了11bp碱基，靶位点2附近缺失了6bp，共缺失了17bp 的碱基，碱基缺失的位置为靶位点1的第8bp开始往后11bp及靶位点2上的第12bp到第17bp，和野生型相比靶位点1处缺失的11bp 的碱基为-CTAGCCATCGTTCG-，靶位点2处缺失的6bp的碱基为 -CTGTTT-。另图5中除了靶位点附近出现了碱基缺失的情况外，在靶位点2前连续5个A碱基处也出现了1个A碱基的缺失，这是测序过程中常见的个别碱基偏差并不是打靶导致的突变情况，通常连续单个碱基重复序列在测序时容易导致测序结果出现个别缺失或者***；也有可能是因为本研究使用的野生型斑马鱼基因序列和NCBI库中的品系的基因序列不同，存在个别差异。
步骤十、依据步骤九方法进行stat1a基因缺失型斑马鱼的F3代纯系遗传，得到stat1a-17的斑马鱼纯合品系。
步骤十一、筛选stat1b基因突变缺失型斑马鱼
根据筛选stat1a基因突变缺失型斑马鱼同样的步骤，同样对stat1b 基因进行CRISPR/Cas9基因敲除，通过筛选，获得stat1b基因缺失型斑马鱼的F3代纯系遗传，得到stat1b-S2的斑马鱼纯合品系。
步骤十二、筛选stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼
将stat1a-17F5代突变纯合体斑马鱼与stat1b-S2F3代突变纯合体斑马鱼进行杂交，依据步骤八、步骤九的方法最终获得stat1a/stat1b 基因双突变缺失型斑马鱼的F3代纯系遗传，得到stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼纯合品系。
对stat1b-S2突变品系斑马鱼二级结构和整体的情况进行分析，见图9。通过图9A可以发现stat1b-S2突变品系斑马鱼和野生型的二级结构对比从2外显子突变的位置开始(大约第40几个氨基酸左右的位置)突变品系后面的α螺旋和β链都有较明显的变化，在第44个氨基酸的位置开始增加了一段α螺旋，从第50几个氨基酸的位置开始大片段的α螺旋结构丢失且有一部分变成了β链，混乱的区域明显增加，对比后面的整个二级结构情况可以发现很多位置的α螺旋出现了变化，β链的位置也发生了变化。突变型斑马鱼整体的α螺旋所占比率相比于野生型来说有了明显的降低，从49％降到了36％，而混乱区域所占的比率有了明显的上升，从26％升到了43％，β链的的比率基本上没有什么变化，α螺旋和混乱区域比例的明显变化可能会对突变品系斑马鱼编辑的stat1b蛋白有较为重要的影响，可能会导致其编辑的stat1b蛋白空间结构发生变化，从而影响stat1b蛋白质的功能。同样从图10可以看出stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼stat1b 蛋白质三级结构和野生型斑马鱼完全不一样，氨基酸链的长度，空间折叠方式都有明显的差异，综合前面氨基酸序列分析及二级结构的分析，α螺旋结构，β链，混乱区域及空间折叠方式的变化都可能导致 stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼突变品系斑马鱼编辑的stat1b 蛋白结构发生变化，进一步影响其蛋白质的功能。
stat1a基因缺失型纯合突变体斑马鱼与stat1b基因缺失型纯合突变体斑马鱼交配其stat1a突变基因与stat1b突变基因发生基因重组得到的新的斑马鱼品系——stat1a/stat1b双基因缺失型斑马鱼。之前筛选到的部分stat1b-S2缺失型纯合突变体斑马鱼嘴唇下颌骨明显变长往前突出，而整体的脊柱形状也发生了一些变化，脊柱弯曲的弧度有稍微的增加。而stat1a/stat1b双基因缺失型斑马鱼的表型并没有出现嘴唇的下颌骨明显前突的现象，且在stat1a/stat1b双基因缺失型斑马鱼杂合突变体基因序列与野生型基因序列多出碱基匹配不上但缺失片段符合，可能stat1a基因与stat1b基因存在相互影响的某种机制。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
序列表
<110> 湖南师范大学
<120> 一种小片段stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼
<130> 711
<160> 61
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cctcttgctc agagaccggt gcc 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggacaacgag tctctggcca cgg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtaacgacc ttacagtctc cag 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccattgctgg aatgtcagag gtc 23
<210> 5
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cagaaatcgg gggaaaaata tacagggggg cttgataaaa aaaaaaacag caattgta 58
<210> 6
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttcagaaaat cgggggaaaa atatacaggg gggcttgata aaaaaaaaaa cagcaattgt 60
<210> 7
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcaaaaatat tgtcgtaata tattgtctta acacttctcc gttccccaaa gggaccatgt 60
<210> 8
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcaaaaatat tgtcgtaata tattgtctta acacttctcc gttccccaaa gggaccatgt 60
<210> 9
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgcaaatgtg gagaacgagt ctctggccac ggtgaggttt catgatcttt tgactcagct 60
<210> 10
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgcaaatgtg gagaacgagt ctctcgtgag gtttcatgat cttttgactc agct 54
<210> 11
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggatcaccaa cacagtcgct tcgtgatgga gaaagacttc ctaaaccaac acaacatccg 60
<210> 12
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggatcaccaa cacagtcgct tcgtgatgga gaaagacttc ctaaaccaac acaacatccg 60
<210> 13
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
caagttcaag aggaacttgc aggtgcctgt tgaccacatg accattttct gttagcctct 60
<210> 14
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caagttcaag aggaacttgc aggtgcctgt tgaccacatg accattttct gttagcctct 60
<210> 15
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gagccactaa tgtcattaag caatgaacag atcagaaaaa cagcttgcca aatgcaaatg 60
<210> 16
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gagccactaa tgtcattaag caatgaacag atcagaaaaa cagcttgcca aatgcaaatg 60
<210> 17
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
acttatcaaa atcttatttt ccagaacctc ttccaagaca atcctgtttc aatggcgatg 60
<210> 18
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
acttatcaaa atcttatttt ccagaacctc ttccaagaca atcctgtttc aatggcgatg 60
<210> 19
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atcatcagca gaaaccttcg cgaggaaaga aagattatag ccattgctgg aatgtcagag 60
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<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 22
<211> 60
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<400> 22
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<210> 23
<211> 60
<212> DNA
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<400> 23
tggaaaatag gcacatttta caacaccttt agagttaaac agttgagttt gaccatttgt 60
<210> 24
<211> 60
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tggaaaatag gcacatttta caacaccttt agagttaaac agttgagttt gaccatttgt 60
<210> 25
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gaatccattc agccgatctt gtcagctgag cttagcatag gtcattgaaa tagattaggc 60
<210> 26
<211> 53
<212> DNA
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gaatccattc agccgatctt gtcagctgag cttagcatag gtcatgaaat aga 53
<210> 27
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tgttagcatc cagctcaaaa gtatagccat ggtacaacag ca 42
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<400> 28
catgtcgcaa atgtggagaa cgagtctctg gccacggtga ggtttcatga tcttt 55
<210> 29
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
catgtcgcaa atgtggagaa cgagtctctg gtgaggtttc atgatcttt 49
<210> 30
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
aagaaagatt atagccattg ctggaatgtc agaggtcagt tgatctccag cagca 55
<210> 31
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
aagaaagatt atagaggtca gttgatctcc agca 34
<210> 32
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ttcgaaaagc aactcatgta aacatcctca tcctattact gtcttattca gatgaaggca 60
<210> 33
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ttcgaaaagc aactcatgta aacatcctca tcctattact gtcttattca gatgaaggca 60
<210> 34
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
aataattcaa tcactgatgt ccatgtaaac gtagtcagtg ttgtttgcag ggaatccatt 60
<210> 35
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
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<210> 36
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gcaagtaatg aatctctagc catcgttcgc ttccatgagc tcctgaacca actggatgag 60
<210> 37
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gcaagtaatg aatcttcgct tccatgagct cctgaaccaa ctggatgag 49
<210> 38
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
cactacagcc gtctcaatct gggaaacaac ttcctcttac agcataatat acgcaaaatt 60
<210> 39
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
cactacagcc gtctcaatct gggaaacaac ttcctcttac agcataatat acgcaaaatt 60
<210> 40
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
aagcgcaatc tacaggtaaa aattcttata ttgatttcta aataagattg cattcactgt 60
<210> 41
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
aagcgcaatc tacaggtaaa aattcttata ttgatttcta aataagattg cattcactat 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
cctaaaaaga tatctgacag ataatggaca tatctccaat aggagcactt ccaagagaat 60
<210> 43
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
cctaaaagat atctgacaga taatggacat atctccaata ggagcacttc caagagaat 59
<210> 44
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
cctgtttaca tggctatgat catatccagc actctgaacg aggagagaaa gatactgcaa 60
<210> 45
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
cacatggcta tgatcatatc cagcactctg aacgaggaga gaaagatact gcaa 54
<210> 46
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
gttgccctta gttctcaagt aaggctttta gtcttgcatc aaggcagcgt ttcgaagct 59
<210> 47
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
gttgcgctta gttctcaagt aaggctttta gtcttgcatc aaaggcagcg tttcgaagct 60
<210> 48
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
gtgcttgtgt aatcattcat cttggtcatt tatttttagg gtaaaggtga ctccatgcag 60
<210> 49
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
gtgcttgtgt aatcattcat cttggtcatt tatttttagg gtaaaggtga ctccatgcag 60
<210> 50
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
gggaacatca tgatggaaca tcaaaatgag ctggtcaata aagtgaacaa tttgaagatg 60
<210> 51
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
gggaacatca tgatggaaca tcaaaatgag ctggtcaata aagtcaacaa tttgaagatg 60
<210> 52
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
agtgtgcagg tgaatcatct gccaataata aaaaggcttt ggagcatttt catagatata 60
<210> 53
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agtgtgcagg tgaatcatct gccgataata aaaaggcttt ggagcatttt catagatata 60
<210> 54
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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actttaattt attttaaacc ggctatattt atttgcttct aggaaatgga aaagcacgtt 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
ttttacttta ttttaatccg tctatattta tttgcttcta ggaaatggaa aagcacgtt 59
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<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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taatgaatct ctagccatcg ttcgttcgct tccatgagct cctgaaccaa ctggatg 57
<210> 57
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
taatgaatct tcgcttccat gagctcctga accaactgga tg 42
<210> 58
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
ctccaatagg agcacttcca agagaatcct gtttacatgg ctatgatcat atc 53
<210> 59
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
ctccaatagg agcacttcca agagaatcac atggctatga tcatatc 47
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
gagctcatgg aagcgaacga tgg 23
<210> 61
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
gcaagagaat cctgtttaca tgg 23
Claims (6)
1.一种小片段stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼，其特征在于，该斑马鱼获得方法包括如下步骤：
步骤一、CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计
在NCBI上查询斑马鱼stat1a基因的基因组DNA序列及其功能结构域,根据CRISPR/Cas9敲除原理，设计一对stat1a基因的靶位点，靶点的选择遵循此标准：5'-GG-(N)18-NGG-3'：其中5'端的二核普酸是T7启动子的一部分,靶位点的3'端是NGG；
步骤二、构建表达载体以及体外合成
步骤三、斑马鱼胚胎的显微注射
在受精30min后之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中；在进行显微注射之前,将Cas9 mRNA和gRNA配成混合液,充分混匀,使Cas9 mRNA的终浓度为300ng/μL，gRNA的终浓度为20ng/μL，注射1.8nLCas9 mRNA和gRNA混合液于一细胞期的受精卵内,注射过的受精卵放置于置于5mmol/L NaCl、0.33mmol/L CaCl2、0.33mmol/L MgSO4、0.17mmol/L KCl的E3水中,28℃孵化，在体视显微镜下观察胚胎表型，筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析；
步骤四、T7E1法和Sanger测序检测靶位点的有效性
对斑马鱼胚胎进行显微注射之后,挑选部分发育正常的早期胚胎,使用T7E1对纯化回收DNA目的片段按一定的比例进行酶切实验，检测目的DNA片段是否被切开；如若目的DNA片段下面有被切开的条带，则使用ImageJ软件，通过酶切后条带的亮度来估计非同源末端连接的频率；这样可以检测其stat1a基因是否存在突变，提前确认此次选择的靶位点是否有效果，显微注射操作是否规范；另外，送部分纯化之后的目的DNA片段进行Sanger测序，由测序的峰图来初步获得***或缺失的信息；若测序峰图有双峰，并且测序结果显示有***或缺失现象的目的序列，则说明注射F0代的斑马鱼有突变的情况出现，进一步确认了靶位点及此次注射的有效性，接下来将剩余的斑马鱼胚胎养大成成鱼即可进行F0代突变体筛选工作；
步骤五、注射两个月之后，进行剪尾鉴定；
步骤六、目的序列的TA克隆
T7E1酶切初步鉴定有突变可能的目的序列再进行Sanger测序：若测序峰图有双峰，并且测序结果显示有***或缺失现象的目的序列，接下来进行克隆之后挑取单克隆作进一步检测；
步骤七、质粒的Sanger测序
将双酶切检测结果显示条带中目的条带有被切开的质粒送往测序，根据测序之后给出的峰图和序列，在NCBI上与标准目的序列进行对比，根据比对结果，分析出每个单克隆的突变类型；
步骤八、获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代
通过前面一系列筛选确定了斑马鱼突变体F0代，紧接着将F0代突变体分别与野生型斑马鱼杂交得到F1代胚胎,置于28℃培养，在初期观察F1代的存活率；受精两天后，每个突变体F1代分别取10个胚胎进行突变遗传性鉴定；将每个胚胎单独提取基因组,然后PCR扩增出700bp的靶位点附近区域，再进行T7E1酶切分析并送部分去测序，确定此突变是否可以遗传到后代；
步骤九、获得斑马鱼突变体的F2代纯合子
从F1代突变体中挑选相同突变的雌鱼和雄鱼，杂交得到F2代, 放置于28℃培养，受精四天后取部分胚胎进行鉴定；将每个胚胎单独提取基因组,PCR扩增出700bp靶位点附近区域，通过BalI限制性酶切分析并测序，初步检验是否可以得到stat1a突变体纯合子；如检验结果证明存在纯合子，则养大后再单条剪尾鉴定；
步骤十、依据步骤九方法进行stat1a基因缺失型斑马鱼的F3代纯系遗传，得到stat1a-17的斑马鱼纯合品系；
步骤十一、筛选stat1b基因突变缺失型斑马鱼
根据筛选stat1a基因突变缺失型斑马鱼同样的步骤，同样对stat1b基因进行CRISPR/Cas9基因敲除，通过筛选，获得stat1b基因缺失型斑马鱼的F3代纯系遗传，得到stat1b-S2的斑马鱼纯合品系；
步骤十二、筛选stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼
将stat1a-17 F5代突变纯合体斑马鱼与stat1b-S2 F3代突变纯合体斑马鱼进行杂交，依据步骤八、步骤九的方法最终获得stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼的F3代纯系遗传，得到stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼纯合品系。
2.根据权利要求1所述的斑马鱼，其特征在于，所述步骤一中：
靶位点1：5’-GAGCTCATGGAAGCGAACGATGG-3’
靶位点2：5’-GCAAGAGAATCCTGTTTACATGG-3’。
3.根据权利要求1所述的斑马鱼，其特征在于，所述步骤四中：酶切实验的具体比例为：酶切反应体系为10μL体系。
4.根据权利要求1所述的斑马鱼，其特征在于，所述步骤五具体为：待F0代斑马鱼养大成鱼之后将斑马鱼单条成鱼进行剪尾，剪取的长度大约为斑马鱼尾鳍的1/3到1/2，然后进行基因组提取、PCR扩增、DNA纯化回收、T7E1酶切、Sanger测序一系列的检测实验，根据T7E1酶切和Sanger测序结果初步筛选出具有基因突变的F0代斑马鱼。
5.根据权利要求1所述的斑马鱼，其特征在于，所述步骤八中，如果从F1代胚胎中检测到存在突变，则将斑马鱼突变体的F1代养大至2一3个月；再分别对每条F1代斑马鱼成鱼进行剪尾,筛选F1代突变体。
6.权利要求1-5任一所述小片段stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼在研究stat1a基因与stat1b基因存在相互影响方面的应用。
Priority Applications (1)
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| CN201910275901.4A CN110172481A (zh) | 2019-04-08 | 2019-04-08 | 一种小片段stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼 |
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110558279A (zh) * | 2019-09-16 | 2019-12-13 | 南方科技大学 | 一种药物筛选模型、药物筛选方法及其应用 |
| CN112176084A (zh) * | 2020-08-31 | 2021-01-05 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 一种快速鉴定二倍体t0代基因编辑作物双等位基因纯合突变的方法 |
| CN112243952A (zh) * | 2020-09-04 | 2021-01-22 | 华南理工大学 | 一种双突变斑马鱼在制备骨硬化症动物模型中的应用 |
| CN113005142A (zh) * | 2021-02-07 | 2021-06-22 | 南方医科大学南方医院 | doc2α和doc2β基因缺失斑马鱼突变体的制备及斑马鱼自闭症模型的构建方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105647969A (zh) * | 2016-02-16 | 2016-06-08 | 湖南师范大学 | 一种基因敲除选育stat1a基因缺失型斑马鱼的方法 |
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2019
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105647969A (zh) * | 2016-02-16 | 2016-06-08 | 湖南师范大学 | 一种基因敲除选育stat1a基因缺失型斑马鱼的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| HAO SONG 等: "The role of stat1b in zebrafish hematopoiesis", 《MECHANISMS OF DEVELOPMENT》 * |
| HUI WU 等: "STAT1a and STAT1b of black carp play important roles in the innate immune defense against GCRV", 《FISH AND SHELLFISH IMMUNOLOGY》 * |
| 熊玖玲: "stat1a基因CRISPR敲除对斑马鱼早期胚胎骨骼发育的影响研究", 《中国硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110558279A (zh) * | 2019-09-16 | 2019-12-13 | 南方科技大学 | 一种药物筛选模型、药物筛选方法及其应用 |
| CN112176084A (zh) * | 2020-08-31 | 2021-01-05 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 一种快速鉴定二倍体t0代基因编辑作物双等位基因纯合突变的方法 |
| CN112243952A (zh) * | 2020-09-04 | 2021-01-22 | 华南理工大学 | 一种双突变斑马鱼在制备骨硬化症动物模型中的应用 |
| CN112243952B (zh) * | 2020-09-04 | 2021-08-10 | 华南理工大学 | 一种双突变斑马鱼在制备骨硬化症动物模型中的应用 |
| CN113005142A (zh) * | 2021-02-07 | 2021-06-22 | 南方医科大学南方医院 | doc2α和doc2β基因缺失斑马鱼突变体的制备及斑马鱼自闭症模型的构建方法 |
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