CN110160987A - 一种柴胡药材的质量快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药检测技术领域，具体涉及一种柴胡药材的质量快速检测方法，包括以下步骤：(1)采集若干批柴胡药材并粉碎；(2)通过传统方法得出柴胡粉末样品中的浸出物含量、柴胡皂苷a含量和柴胡皂苷d含量；(3)采集柴胡药材的近红外原始光谱；(4)采用KS算法划分校正集和验证集；本发明采用近红外光谱技术检测柴胡药材的质控指标，该方法具有操作简单、快速无损和精度高的优势，可节约生产成本，提高经济效益，能够在中药生产源头上实现高效质量控制的目的。
Description
技术领域
本发明属于医药检测技术领域，具体涉及一种柴胡药材的质量快速检测方法。
背景技术
柴胡为伞形科植物柴胡Bupleurum chinenseDC.或狭叶柴胡Bupleurumscorzonerifolium Willd.的干燥根，是一味应用历史十分悠久的传统中药，具有疏散退热，疏肝解郁，升举阳气的功效，临床常用于治疗感冒发热，寒热往来，胸胁胀痛，***，子宫脱垂，脱肛等疾病。中国的柴胡资源十分丰富，柴胡属植物在各省区均有分布，有“神州处处有柴胡”之说。柴胡属作为伞形科最大的属，品种繁多，市场流通的柴胡就有12种之多。由于产地、品种、采收季节及加工方式的不同，导致柴胡原药材及其中成药的质量存在较大的差异，按照《2015版药典》中对柴胡的主要成分有明确的规定，照醇溶性浸出物测定法项下的热浸法测定，用乙醇作溶剂，不得少于11.0％，含柴胡皂苷a(C42H68O13)和柴胡皂苷d(C42H68O13)的总量不得少于0.30％，因而为保证最终产品的质量稳定性和有效性，原药材的质量检测过程重要性更加凸显。传统的药材质量检测方法费时、费力，难以满足中药现代化发展的要求，并且往往采用单一指标成分控制药材质量，忽略了中药成分的复杂性。因此亟需一种能全面高效地对中药材进行质量评价的新方法，从生产源头保证其质量，达到快速高效质量控制的目的。
近红外光谱技术(Near infraredspectroscopy,NIRS)作为一种高新分析技术，由于具有分析速度快、测量重复性好、分析效率高、分析成本低、不破坏样本、样本无需预处理的特点而使得上述问题得以解决。由于近红外光谱存在谱带宽、谱峰重叠严重、吸收强度弱、信噪比低等问题，无法使用NIRS对样品直接进行定性或定量的分析，需要借助偏最小二乘法(PLS)等化学计量学方法建立起关联丰富光谱信息和目标变量的定量或定性校正模型之后才可预测样品的组成和性质。柴胡等中药材是一个包含许多组分的复杂体系，柴胡中的近红外光谱与质控指标的关系趋向于非线性。常用的PLS方法的缺陷在于其构建“光谱-性质”之间的关系是线性的，不适合复杂体系的建模，而SVM方法在构建非线性关系时具有显著优势。SVM的基本原理是将原始数据映射到高维空间，建立一个最优分类面，要求分类面不但能将两类样本无错误地分开，而且要使分类空隙和分类间隔最大。基于其原理，它还具备以下特点(1)可处理小样本数据集；(2)基于结构风险最小化原则，可规避过拟合问题；(4)通过引进核函数，可同时降低模型的复杂程度和预测误差。在SVM算法中，惩罚参数C和核参数g的设置会对预测结果产生较大的影响，参数的选取具有一定的盲目性，费时费力。
发明内容
本发明的目的是结合近红外光谱技术与网格寻优支持向量机算法，可以快速无损地检测柴胡各质控指标的含量，而提供一种柴胡药材的质量快速检测方法。
本发明所采取的技术方案如下：一种柴胡药材的质量快速检测方法，其特征在于基于网格寻优支持向量机算法快速检测，包括浸出物、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量测定：
A、浸出物含量测定包括如下步骤：
(1)采集多批次的柴胡药材，粉碎过筛，得到若干柴胡粉末样品；
(2)测定多批次柴胡粉末样品中的浸出物含量；
(3)采集步骤(2)中每个柴胡粉末样品的近红外原始光谱；
(4)依据步骤(3)中采集的近红外原始光谱，采用KS算法将柴胡粉末样品划分为校正集和验证集；
(5)利用校正集构建网格寻优支持向量机模型，利用验证集验证网格寻优支持向量机模型的准确性；网格寻优支持向量机模型建立的具体步骤为：采用网格寻优算法获取惩罚参数C和核参数g的最优值，然后将最优C和g代入网格寻优支持向量机模型建立全部光谱与各组分含量的预测值之间的定量校正模型；网格寻优支持向量机模型的预测性能进行评价的步骤为：评价指标包括校正集相关系数(RC)、预测集相关系数(RP)、校正集均方根误差(RMSEC)、验证集均方根误差(RMSEP)、预测相对偏差(RSEP)，R值接近于1，表明模型的预测性能越好；RMSEC和RMSEP的大小与样品化学值相关，这两个参数越小且越接近，则表明模型性能越佳，预测精度越高；当RSEP值小于10％时，认为定量校正模型适用于柴胡药材的检测。
(6)按照上述步骤(3)的方法获取另外一批柴胡粉末样品的近红外光谱，导入步骤(5)建立的定量校正模型获得另外一批柴胡药材样品的浸出物含量值；
B、柴胡皂苷a含量测定包括如下步骤：
(1)采集多批次的柴胡药材，粉碎过筛，得到若干柴胡粉末样品；
(2)测定多批次柴胡粉末样品中的柴胡皂苷a含量；
(3)采集步骤(2)中每个柴胡粉末样品的近红外原始光谱；
(4)依据步骤(3)中采集的近红外原始光谱，采用KS算法将柴胡粉末样品划分为校正集和验证集；
(5)利用校正集构建网格寻优支持向量机模型，利用验证集验证网格寻优支持向量机模型的准确性；网格寻优支持向量机模型建立的具体步骤为：采用网格寻优算法获取惩罚参数C和核参数g的最优值，然后将最优C和g代入网格寻优支持向量机模型建立全部光谱与各组分含量的预测值之间的定量校正模型；网格寻优支持向量机模型的预测性能进行评价的步骤为：评价指标包括校正集相关系数(RC)、预测集相关系数(RP)、校正集均方根误差(RMSEC)、验证集均方根误差(RMSEP)、预测相对偏差(RSEP)，R值接近于1，表明模型的预测性能越好；RMSEC和RMSEP的大小与样品化学值相关，这两个参数越小且越接近，则表明模型性能越佳，预测精度越高；当RSEP值小于10％时，认为定量校正模型适用于柴胡药材的检测。
(6)按照上述步骤(3)的方法获取另外一批柴胡粉末样品的近红外光谱，导入步骤(5)建立的定量校正模型获得另外一批柴胡药材样品的柴胡皂苷a含量值；
C、柴胡皂苷d含量测定包括如下步骤：
(1)采集多批次的柴胡药材，粉碎过筛，得到若干柴胡粉末样品；
(2)测定多批次柴胡粉末样品中的柴胡皂苷d含量；
(3)采集步骤(2)中每个柴胡粉末样品的近红外原始光谱；
(4)依据步骤(3)中采集的近红外原始光谱，采用KS算法将柴胡粉末样品划分为校正集和验证集；
(5)利用校正集构建网格寻优支持向量机模型，利用验证集验证网格寻优支持向量机模型的准确性；网格寻优支持向量机模型建立的具体步骤为：采用网格寻优算法获取惩罚参数C和核参数g的最优值，然后将最优C和g代入网格寻优支持向量机模型建立全部光谱与各组分含量的预测值之间的定量校正模型；网格寻优支持向量机模型的预测性能进行评价的步骤为：评价指标包括校正集相关系数(RC)、预测集相关系数(RP)、校正集均方根误差(RMSEC)、验证集均方根误差(RMSEP)、预测相对偏差(RSEP)，R值接近于1，表明模型的预测性能越好；RMSEC和RMSEP的大小与样品化学值相关，这两个参数越小且越接近，则表明模型性能越佳，预测精度越高；当RSEP值小于10％时，认为定量校正模型适用于柴胡药材的检测。
作为本发明的进一步设置，所述浸出物含量测定的步骤(2)中，采用热浸法测定所述柴胡药材中的浸出物含量，所述柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量测定的步骤(2)中，采用高效液相色谱法测定所述柴胡药材中的柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量。
作为本发明的进一步设置，所述浸出物含量测定、所述柴胡皂苷a含量测定和柴胡皂苷d含量测定的所述步骤(3)中，采集柴胡样本的近红外原始光谱具体过程如下：精密称取柴胡药材粉末，置于称量瓶中，采用漫反射法采集近红外原始光谱，以空气为参比；光谱采集条件：扫描范围为4000-12000cm-1，扫描次数为32次，分辨率为8cm-1。每个样品采集3张光谱，计算平均光谱。
作为本发明的进一步设置，所述浸出物含量测定、所述柴胡皂苷a含量和柴胡皂苷d含量测定的所述步骤(4)中，校正集和验证集中样品数之比为4:1。
作为本发明的进一步设置，所述浸出物含量测定的所述步骤(5)中，采用网格寻优算法获取惩罚参数C和核参数g的最优值分别是11.3137和0.00097656，CVMSE值是0.078403；所述柴胡皂苷a含量测定的所述步骤(5)中，采用网格寻优算法获取惩罚参数C和核参数g的最优值分别是2和0.03125，CVMSE值是0.02234；柴胡皂苷d含量测定的所述步骤(5)中，采用网格寻优算法获取惩罚参数C和核参数g的最优值分别是5.6569和0.011049，CVMSE值是0.029307。
作为本发明的进一步设置，所述浸出物含量测定、柴胡皂苷a含量测定以及柴胡皂苷d含量测定的所述步骤(5)中，利用网格寻优方法寻找最优C值和g值时，参数C和g的搜索范围均设置为2-10～210，步长设置为20.5。利用MSECV值作为参数优化的标准，其值最小时的C和g被认为是最优参数值。
本发明的有益效果如下：
本发明所述的一种柴胡药材的质量快速检测方法，将近红外光谱技术和网格寻优支持向量机算法引入到柴胡药材的质量控制中，可以快速无损地测定各种质控指标(浸出物、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d)的含量，缩短检测时间，节约生产成本。所采用的网格寻优支持向量机算法可以获取最优参数值进而构建高性能校正模型，可明显提高检测结果的准确度。该发明方法操作简单，预测精度较高，可以快速判断柴胡药材质量是否合格，确定其能否进入后续生产环节，从而可以在生产源头上控制中药质量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1是网格寻优支持向量机模型建立的流程图；
图2是柴胡药材粉末近红外原始光谱图；
图3是网格寻优法对浸出物SVM模型参数C和g的寻优过程3D视图；
图4是柴胡粉末浸出物含量实测值与近红外预测值的相关图；
图5是柴胡药材粉末浸出物实测值与近红外预测值的比较图；
图6是网格寻优法对柴胡皂苷a SVM模型参数C和g的寻优过程3D视图；
图7是柴胡药材粉末柴胡皂苷a实测值与近红外预测值的相关图；
图8是柴胡药材粉末柴胡皂苷a实测值与近红外预测值的比较图；
图9是网格寻优法对柴胡皂苷d SVM模型参数C和g的寻优过程3D视图；
图10是柴胡药材粉末柴胡皂苷d实测值与近红外预测值的相关图；
图11是柴胡药材粉末柴胡皂苷d实测值与近红外预测值的比较图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
本发明下述实例提供了一种柴胡药材的质量快速检测方法，基于网格寻优支持向量机算法快速检测，包括浸出物、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量测定步骤中的至少两项：
A、浸出物含量测定包括如下步骤：
(1)采集86批次的柴胡药材，粉碎，过65目筛，得到粒度均匀柴胡药材粉末，装于自封袋中共得到86个样品；
(2)采用热浸法测定86个柴胡粉末样品中的浸出物的含量，具体步骤如下：取样品2g，精密称定(X1)，置100ml的圆底烧瓶中，精密加乙醇50ml，密塞，称定重量，静置1h后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1小时。放冷后，称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，置于15ml离心管中离心30min，转速为3800r/min，精密量取上清液10ml，置于干燥至恒重的扁形瓶中(X0)，在水浴锅上挥干溶剂后，于105℃干燥3小时，置干燥器中冷却30min，迅速精密称定重量(X2)。以干燥品计算供试品中浸出物的含量(％)。
浸出物的含量(％)＝(X2－X0)×5/X1×100
(3)精密称取柴胡药材粉末1g，置于称量瓶中，保持粉末表面平整，采用漫反射法采集近红外光谱，以空气为参比，扫描次数为32，分辨率为8cm-1，扫描光谱范围为4000-12000cm-1，采集86个样品的光谱，每个样品扫描重复3次，取平均光谱。86批柴胡粉末样品的近红外原始光谱图如图2所示。
(4)采用KS算法划分校正集和验证集，最终校正集包含69个柴胡样本，验证集包含17个样本。
(5)采用网格寻优算法获取惩罚参数C和核参数g的最优值，参数C和g的搜索范围均设置为2-10～210，步长设置为20.5。利用MSECV值作为参数优化的标准，其值最小时的C和g被认为是最优参数值。图3网格寻优法对浸出物SVM模型参数C和g的寻优过程3D视图。
(6)采用网格寻优算法优化惩罚参数C和核参数g，最终，C＝11.3137,g＝0.00097656,CVMSE＝0.078403。
(7)将优化后的C和g带入SVM算法，建立校正集中全部光谱与所述浸出物含量之间的定量校正模型；采用所建网格寻优支持向量机模型预测验证集柴胡样本的浸出物含量，验证校正模型的预测精度。
(8)对所建校正模型的预测性能进行评价的步骤，所述评价指标包括校正集相关系数(RC)、预测集相关系数(RP)、校正集均方根误差(RMSEC)、验证集均方根误差(RMSEP)。R值接近于1，表明模型的预测性能越好；RMSEC和RMSEP的大小与样品化学值相关，这两个参数越小且越接近，则表明模型性能越佳，预测精度越高。如下表1所述为柴胡药材的浸出物定量校正模型参数。从表1可以看出校正集的RC值为0.9398，RMSEC值为1.8560，说明所建立的浸出物校正模型效果较好，可以满足柴胡药材浸出物定量检测的要求。所述柴胡浸出物含量实测值与近红外预测值的相关图如图4所示。采用所建网格寻优支持向量机模型用于预测验证集中柴胡样本的浸出物含量，RP值为0.9459，RMSEP值为1.3844，其与RMSEC值接近且均较小，说明所建立的柴胡浸出物网格寻优支持向量机模型具有良好的稳定性和预测能力。图5是验证集中柴胡浸出物实测值与近红外预测值的比较图。
表1柴胡药材浸出物含量校正模型参数
| 模型 | R<sub>C</sub> | RMSEC | R<sub>P</sub> | RMSEP |
| 浸出物含量模型 | 0.9398 | 1.8560 | 0.9459 | 1.3844 |
(8)将另外一批柴胡药材样品按所述步骤(3)的方法获取样品光谱，导入已建立的网格寻优支持向量机定量模型获得所述另外一批柴胡粉末样品的浸出物含量。采用所述的一种柴胡药材的质量快速检测方法计算得到的所述另外一批柴胡药材样品浸出物含量≥11.0％。
B、柴胡皂苷a含量测定包括如下步骤：
(1)采集86批次的柴胡药材，粉碎，过65目筛，得到粒度均匀柴胡药材粉末，装于自封袋中共得到86个样品；
(2)采用高效液相色谱法法测定86个柴胡粉末样品中的柴胡皂苷a的含量，具体步骤如下：预处理方法：取柴胡药材粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入含5％浓氨试液的甲醇溶液25ml，密塞，30℃水温超声处理30分钟，滤过，用甲醇20ml分2次洗涤容器及药液，洗液与滤液合并，回收溶剂至干。残渣加甲醇溶解，移至5ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。色谱条件：色谱柱为Waters XBridge C18(4.6*250mm,5μm)；流动相A相为纯水，B相为乙腈；设置为0-20min，50％B-58％B；检测波长为210nm，温度为25℃，流速为1ml/min，进样量为10μl。
(3)精密称取柴胡药材粉末1g，置于称量瓶中，保持粉末表面平整，采用漫反射法采集近红外光谱，以空气为参比，扫描次数为32，分辨率为8cm-1，扫描光谱范围为4000-12000cm-1，采集86个样品的光谱，每个样品扫描重复3次，取平均光谱。86批柴胡粉末样品的近红外原始光谱图如图2所示。
(4)采用KS算法划分校正集和验证集，最终校正集包含69个柴胡样本，验证集包含17个样本。
(5)采用网格寻优算法获取惩罚参数C和核参数g的最优值，参数C和g的搜索范围均设置为2-10～210，步长设置为20.5。利用MSECV值作为参数优化的标准，其值最小时的C和g被认为是最优参数值。图5网格寻优法对柴胡皂苷a SVM模型参数C和g的寻优过程3D视图。
(6)采用网格寻优算法优化惩罚参数C和核参数g，最终，C＝2,g＝0.03125,CVMSE＝0.02234。
(7)将优化后的C和g带入SVM算法，建立校正集中全部光谱与所述浸出物含量之间的定量校正模型；采用所建网格寻优支持向量机模型预测验证集柴胡样本的柴胡皂苷a含量，验证校正模型的预测精度。
(8)对所建校正模型的预测性能进行评价的步骤，所述评价指标包括校正集相关系数(RC)、预测集相关系数(RP)、校正集均方根误差(RMSEC)、验证集均方根误差(RMSEP)、。R值接近于1，表明模型的预测性能越好；RMSEC和RMSEP的大小与样品化学值相关，这两个参数越小且越接近，则表明模型性能越佳，预测精度越高。如下表2所述为柴胡药材的柴胡皂苷a含量定量校正模型参数。从表2可以看出校正集的RC值为0.9655，RMSEC值为0.0956，说明所建立的柴胡皂苷a校正模型效果较好，可以满足柴胡皂苷a定量检测的要求。所述柴胡皂苷a含量实测值与近红外预测值的相关图如图7所示。采用所建网格寻优支持向量机模型用于预测验证集中柴胡样本的柴胡皂苷a含量，RP值为0.9407，RMSEP值为0.1167，与RMSEC值接近且均较小，说明所建立的柴胡柴胡皂苷a网格寻优支持向量机模型具有良好的稳定性和预测能力。图8是验证集中柴胡皂苷a实测值与近红外预测值的比较图。
表2柴胡药材柴胡皂苷a含量校正模型参数
| 模型 | R<sub>C</sub> | RMSEC | R<sub>P</sub> | RMSEP |
| 柴胡皂苷a含量模型 | 0.9655 | 0.0956 | 0.9407 | 0.1167 |
(8)将另外一批柴胡药材样品按所述步骤(3)的方法获取样品光谱，导入已建立的网格寻优支持向量机定量模型获得所述另外一批柴胡粉末样品的柴胡皂苷a含量。采用所述的一直能够基于网格寻优支持向量机算法的柴胡药材质量快速检测方法计算得到的所述另外一批柴胡药材样品柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的总量≥0.30％。
C、柴胡皂苷d含量测定包括如下步骤：
(1)采集86批次的柴胡药材，粉碎，过65目筛，得到粒度均匀柴胡药材粉末，装于自封袋中共得到86个样品；
(2)采用高效液相色谱法法测定86个柴胡粉末样品中的柴胡皂苷d的含量，具体步骤如下：预处理方法：取柴胡药材粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入含5％浓氨试液的甲醇溶液25ml，密塞，30℃水温超声处理30分钟，滤过，用甲醇20ml分2次洗涤容器及药液，洗液与滤液合并，回收溶剂至干。残渣加甲醇溶解，移至5ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。色谱条件：色谱柱为Waters XBridge C18(4.6*250mm,5μm)；流动相A相为纯水，B相为乙腈；设置为0-20min，50％B-58％B；检测波长为210nm，温度为25℃，流速为1ml/min，进样量为10μl。
(3)精密称取柴胡药材粉末1g，置于称量瓶中，保持粉末表面平整，采用漫反射法采集近红外光谱，以空气为参比，扫描次数为32，分辨率为8cm-1，扫描光谱范围为4000-12000cm-1，采集86个样品的光谱，每个样品扫描重复3次，取平均光谱。86批柴胡粉末样品的近红外原始光谱图如图2所示。
(4)剔除异常样本后采用KS算法划分校正集和验证集，最终校正集包含68个柴胡样本，验证集包含16个样本。
(5)采用网格寻优算法获取惩罚参数C和核参数g的最优值，参数C和g的搜索范围均设置为2-10～210，步长设置为20.5。利用MSECV值作为参数优化的标准，其值最小时的C和g被认为是最优参数值。图9网格寻优法对柴胡皂苷d SVM模型参数C和g的寻优过程3D视图。
(6)采用网格寻优算法优化惩罚参数C和核参数g，最终，C＝5.6569,g＝0.011049,CVMSE＝0.029307。
(7)将优化后的C和g带入SVM算法，建立校正集中全部光谱与所述浸出物含量之间的定量校正模型；采用所建网格寻优支持向量机模型预测验证集柴胡样本的柴胡皂苷d含量，验证校正模型的预测精度。
(8)对所建校正模型的预测性能进行评价的步骤，所述评价指标包括校正集相关系数(RC)、预测集相关系数(RP)、校正集均方根误差(RMSEC)、验证集均方根误差(RMSEP)。R值接近于1，表明模型的预测性能越好；RMSEC和RMSEP的大小与样品化学值相关，这两个参数越小且越接近，则表明模型性能越佳，预测精度越高。如下表3所述为柴胡药材的柴胡皂苷d定量校正模型参数。从表3可以看出校正集的RC值为0.9532，RMSEC值为0.1192，说明所建立的柴胡皂苷d定量校正模型效果较好，用于定量分析的效果较理想。所述柴胡皂苷d含量实测值与近红外预测值的相关图如图10所示。采用所建网格寻优支持向量机模型用于预测验证集中柴胡样本的柴胡皂苷d含量，RP值为0.9444，RMSEP值为0.1535，与RMSEC值接近且均较小，说明所建立的柴胡皂苷d网格寻优支持向量机模型具有较好的稳定性和预测能力。图11是验证集中柴胡药材柴胡皂苷d实测值与近红外预测值的比较图。
表3柴胡药材柴胡皂苷d含量校正模型参数
| 模型 | R<sub>C</sub> | RMSEC | R<sub>P</sub> | RMSEP |
| 柴胡皂苷d含量模型 | 0.9532 | 0.1192 | 0.9444 | 0.1535 |
(9)将另外一批柴胡药材样品按所述步骤(3)方法获取样品光谱，导入已建立的网格寻优支持向量机定量模型获得所述另外一批柴胡粉末样品的柴胡皂苷d含量。采用所述的基于网格寻优支持向量机算法的柴胡药材质量快速检测方法计算得到的所述另外一批柴胡药材样品柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的总量≥0.30％。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
Claims (6)
1.一种柴胡药材的质量快速检测方法，其特征在于：基于网格寻优支持向量机算法快速检测，包括浸出物、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量测定：
A、浸出物含量测定包括如下步骤：
(1)采集多批次的柴胡药材，粉碎过筛，得到若干柴胡粉末样品；
(2)测定多批次柴胡粉末样品中的浸出物含量；
(3)采集步骤(2)中每个柴胡粉末样品的近红外原始光谱；
(4)依据步骤(3)中采集的近红外原始光谱，采用KS算法将柴胡粉末样品划分为校正集和验证集；
(5)利用校正集构建网格寻优支持向量机模型，利用验证集验证网格寻优支持向量机模型的准确性；网格寻优支持向量机模型建立的具体步骤为：采用网格寻优算法获取惩罚参数C和核参数g的最优值，然后将最优C和g代入网格寻优支持向量机模型建立全部光谱与各组分含量的预测值之间的定量校正模型；网格寻优支持向量机模型的预测性能进行评价的步骤为：评价指标包括校正集相关系数(RC)、预测集相关系数(RP)、校正集均方根误差(RMSEC)、验证集均方根误差(RMSEP)、预测相对偏差(RSEP)，R值接近于1，表明模型的预测性能越好；RMSEC和RMSEP的大小与样品化学值相关，这两个参数越小且越接近，则表明模型性能越佳，预测精度越高；当RSEP值小于10％时，认为定量校正模型适用于柴胡药材的检测；
(6)按照上述步骤(3)的方法获取另外一批柴胡粉末样品的近红外光谱，导入步骤(5)建立的定量校正模型获得另外一批柴胡药材样品的浸出物含量值；
B、柴胡皂苷a含量测定包括如下步骤：
(1)采集多批次的柴胡药材，粉碎过筛，得到若干柴胡粉末样品；
(2)测定多批次柴胡粉末样品中的柴胡皂苷a含量；
(3)采集步骤(2)中每个柴胡粉末样品的近红外原始光谱；
(4)依据步骤(3)中采集的近红外原始光谱，采用KS算法将柴胡粉末样品划分为校正集和验证集；
(5)利用校正集构建网格寻优支持向量机模型，利用验证集验证网格寻优支持向量机模型的准确性；网格寻优支持向量机模型建立的具体步骤为：采用网格寻优算法获取惩罚参数C和核参数g的最优值，然后将最优C和g代入网格寻优支持向量机模型建立全部光谱与各组分含量的预测值之间的定量校正模型；网格寻优支持向量机模型的预测性能进行评价的步骤为：评价指标包括校正集相关系数(RC)、预测集相关系数(RP)、校正集均方根误差(RMSEC)、验证集均方根误差(RMSEP)、预测相对偏差(RSEP)，R值接近于1，表明模型的预测性能越好；RMSEC和RMSEP的大小与样品化学值相关，这两个参数越小且越接近，则表明模型性能越佳，预测精度越高；当RSEP值小于10％时，认为定量校正模型适用于柴胡药材的检测；
(6)按照上述步骤(3)的方法获取另外一批柴胡粉末样品的近红外光谱，导入步骤(5)建立的定量校正模型获得另外一批柴胡药材样品的柴胡皂苷a含量值；
C、柴胡皂苷d含量测定包括如下步骤：
(1)采集多批次的柴胡药材，粉碎过筛，得到若干柴胡粉末样品；
(2)测定多批次柴胡粉末样品中的柴胡皂苷d含量；
(3)采集步骤(2)中每个柴胡粉末样品的近红外原始光谱；
(4)依据步骤(3)中采集的近红外原始光谱，采用KS算法将柴胡粉末样品划分为校正集和验证集；
(5)利用校正集构建网格寻优支持向量机模型，利用验证集验证网格寻优支持向量机模型的准确性；网格寻优支持向量机模型建立的具体步骤为：采用网格寻优算法获取惩罚参数C和核参数g的最优值，然后将最优C和g代入网格寻优支持向量机模型建立全部光谱与各组分含量的预测值之间的定量校正模型；网格寻优支持向量机模型的预测性能进行评价的步骤为：评价指标包括校正集相关系数(RC)、预测集相关系数(RP)、校正集均方根误差(RMSEC)、验证集均方根误差(RMSEP)、预测相对偏差(RSEP)，R值接近于1，表明模型的预测性能越好；RMSEC和RMSEP的大小与样品化学值相关，这两个参数越小且越接近，则表明模型性能越佳，预测精度越高；当RSEP值小于10％时，认为定量校正模型适用于柴胡药材的检测；
(6)按照上述步骤(3)的方法获取另外一批柴胡粉末样品的近红外光谱，导入步骤(5)建立的定量校正模型获得另外一批柴胡药材样品的柴胡皂苷d含量值。
2.根据权利要求1所述的一种柴胡药材的质量快速检测方法，其特征在于：所述浸出物含量测定的步骤(2)中，采用热浸法测定所述柴胡药材中的浸出物含量，所述柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量测定的步骤(2)中，采用高效液相色谱法测定所述柴胡药材中的柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量。
3.根据权利要求1所述的一种柴胡药材的质量快速检测方法，其特征在于，所述浸出物含量测定、所述柴胡皂苷a含量测定和柴胡皂苷d含量测定的所述步骤(3)中，采集柴胡样本的近红外原始光谱具体过程如下：精密称取柴胡药材粉末，置于称量瓶中，采用漫反射法采集近红外原始光谱，以空气为参比；光谱采集条件：扫描范围为4000-12000cm-1，扫描次数为32次，分辨率为8cm-1，每个样品采集3张光谱，计算平均光谱。
4.根据权利要求2所述的一种柴胡药材的质量快速检测方法，其特征在于，所述浸出物含量测定、所述柴胡皂苷a含量和柴胡皂苷d含量测定的所述步骤(4)中，校正集和验证集中样品数之比为4:1。
5.根据权利要求1所述的一种柴胡药材的质量快速检测方法，其特征在于，所述浸出物含量测定的所述步骤(5)中，采用网格寻优算法获取惩罚参数C和核参数g的最优值分别是11.3137和0.00097656，CVMSE值是0.078403；所述柴胡皂苷a含量测定的所述步骤(5)中，采用网格寻优算法获取惩罚参数C和核参数g的最优值分别是2和0.03125，CVMSE值是0.02234；柴胡皂苷d含量测定的所述步骤(5)中，采用网格寻优算法获取惩罚参数C和核参数g的最优值分别是5.6569和0.011049，CVMSE值是0.029307。
6.根据权利要求1所述的一种柴胡药材的质量快速检测方法，其特征在于，所述浸出物含量测定、柴胡皂苷a含量测定以及柴胡皂苷d含量测定的所述步骤(5)中，利用网格寻优方法寻找最优C值和g值时，参数C和g的搜索范围均设置为2-10～210，步长设置为20.5；利用MSECV值作为参数优化的标准，其值最小时的C和g被认为是最优参数值。
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|---|---|
| CN (1) | CN110160987A (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103063815A (zh) * | 2012-12-31 | 2013-04-24 | 广东工业大学 | 一种辛味中药材产地的快速鉴别方法 |
| CN104345045A (zh) * | 2014-11-04 | 2015-02-11 | 天津工业大学 | 一种基于化学模式识别和近红外光谱的相似药材鉴别方法 |
| CN104792722A (zh) * | 2015-04-30 | 2015-07-22 | 华南农业大学 | 一种沉香含油率近红外光谱预测模型的建立 |
| CN106138131A (zh) * | 2016-06-20 | 2016-11-23 | 广东方制药有限公司 | 一种柴胡颗粒及其中药制剂 |
| CN107036997A (zh) * | 2016-11-11 | 2017-08-11 | 辽宁华润本溪三药有限公司 | 利用近红外光谱法快速检测气滞胃痛颗粒的制备过程的方法及应用 |
| CN108572156A (zh) * | 2018-04-19 | 2018-09-25 | 深圳极致本草生物医药有限公司 | 一种快速测定板蓝根(r,s)-告依春含量的方法 |
| CN109374573A (zh) * | 2018-10-12 | 2019-02-22 | 乐山师范学院 | 基于近红外光谱分析的黄瓜表皮农药残留识别方法 |
-
2019
- 2019-07-03 CN CN201910594734.XA patent/CN110160987A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103063815A (zh) * | 2012-12-31 | 2013-04-24 | 广东工业大学 | 一种辛味中药材产地的快速鉴别方法 |
| CN104345045A (zh) * | 2014-11-04 | 2015-02-11 | 天津工业大学 | 一种基于化学模式识别和近红外光谱的相似药材鉴别方法 |
| CN104792722A (zh) * | 2015-04-30 | 2015-07-22 | 华南农业大学 | 一种沉香含油率近红外光谱预测模型的建立 |
| CN106138131A (zh) * | 2016-06-20 | 2016-11-23 | 广东方制药有限公司 | 一种柴胡颗粒及其中药制剂 |
| CN107036997A (zh) * | 2016-11-11 | 2017-08-11 | 辽宁华润本溪三药有限公司 | 利用近红外光谱法快速检测气滞胃痛颗粒的制备过程的方法及应用 |
| CN108572156A (zh) * | 2018-04-19 | 2018-09-25 | 深圳极致本草生物医药有限公司 | 一种快速测定板蓝根(r,s)-告依春含量的方法 |
| CN109374573A (zh) * | 2018-10-12 | 2019-02-22 | 乐山师范学院 | 基于近红外光谱分析的黄瓜表皮农药残留识别方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 曾晓璇: "鄂西北地区4种柴胡属植物分子鉴别及柴胡药材活性成分近红外定量方法研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》 * |
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