CN110157711B - 一种人的srebp1基因编码区全长分段克隆的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人的srebp1基因编码区全长分段克隆的方法，该方法包括以下步骤：A1步骤，srebp1基因CDS区分段扩增PCR引物的设计；A2步骤，srebp1基因片段S1与S2的PCR扩增；A3步骤，S1与S2片段的克隆；A4步骤，T‑S1和T‑S2的双酶切与纯化；A5步骤，E‑S1与ET‑S2的片段的连接；本发明为srebp1基因的过表达、干扰序列筛选等以srebp1基因CDS区基因序列为基础的研究与应用提供一种有效的方法。

Description

一种人的srebp1基因编码区全长分段克隆的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人的srebp1基因编码区全长分段克隆的方法。
背景技术
固醇调节元件结合蛋白-1c(Sterol regμlatory element binding protein-1c：SREBP-1c)是SREBPs家族中的一员，在人的肝脏、白色脂肪组织等组织中高表达，具有典型的碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链结构域，主要负责激活脂肪酸和甘油三酯的从头合成(Eberle et al.,2004；Muller-Wieland et al.,2012；Shimomura etal.,1997；Wang etal.,1994)，研究表明，SREBP-1c调节的脂肪酸与甘油三酯的从头合成，主要是通过与下游靶基因启动子中的SRE(5’-TCACNCCAC-3’)序列的结合，从而调控靶基因的转录(Shimano,2001)。其靶基因包括脂肪酸合酶(FASN)、乙酰辅酶A羧化酶α(ACCα)、硬酯酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)、脂肪酸结合蛋白3(FABP3)在内的负责脂肪酸从头合成的关键限速酶基因、脂肪酸转运的关键蛋白基因等酶(Kim and Spiegelman,1996；Liang et al.,2002；Muller-Wieland et al.,2012；Shao and Espenshade,2012；Xiao and Song,2013)。此外，SREBP-1c还能与PPARγ以及CCAAT增强子结合蛋白家族(CCAAT enhancer binding proteins，C/EBPs)共同调控脂肪细胞的分化(Kim et al.,1998)。大量研究发现，srebp-1c异常表达导致的脂代谢紊乱与非酒精性脂肪肝、肥胖、血脂异常、动脉粥样硬化、糖尿病、癌症等诸多疾病具有显著的相关性，甚至是疾病发生的主要诱因(Shimano and Sato,2017；Tao et al.,2019；Varghese et al.,2018；Wang etal.,2018；Zhang et al.,2017)。
人的srebp-1c基因定位于17号染色体上，其CDS区全长3525nt，编码1174个氨基酸残基，G/C含量为65.3％，PCR扩增得到srebp-1c mRNA CDS区全长是对其功能研究的基础，由于其CDS区较长，并且GC含量相对较高，扩增起来具有一定的难度，即使更换多种高保真扩增酶均未成功，然而一些普通酶扩增虽然能够实现扩增，但是连接载体后，经测序发现有碱基的突变，不能使用，因此，使用直接扩增法未能得到有效的srebp1基因序列，很难实现对CDS区全长的一次性扩增。
发明内容
为弥补现有技术的不足，本发明通过降低单次扩增长度以提高扩增成功率，应用分段克隆法得到人的srebp1基因编码区(CDS)序列全长，并构建到克隆载体上，为srebp1基因的过表达、干扰序列筛选等以srebp1基因CDS区序列为基础的研究与应用提供一种有效的方法。
为了实现上述目的，本发明采取如下的技术解决方案：
一种人的srebp1基因CDS区分段克隆的方法，包括以下步骤：
A1步骤，srebp1基因CDS区分段扩增PCR引物的设计；
A2步骤，srebp1基因片段S1与S2的PCR扩增；
A3步骤，S1与S2片段的克隆；
A4步骤，T-S1和T-S2的双酶切与纯化；
A5步骤，E-S1与ET-S2的片段的连接；
所述A1步骤，srebp1基因CDS区分段扩增PCR引物的设计的具体步骤为：
从GenBank中下载人srebp1(Accession NO.NM_004176)mRNA序列，对CDS区序列中限制酶酶切位点分析发现，在CDS区的第2149-2154位为BglII酶切位点，以此酶切位点为分界点，设计分段扩增引物，引物序列如下：
①S1片段引物
S1-F：TAT gcggcc gc CACC ATGGACGAGCCACCCTTCAGC
NotI Kozak
S1-R：CAAGGCCCGTGGGAGACTGGTC
②S2片段引物
S2-F：AAGGAAAAAA gcggccgc AGGGGATGCCGTGTCTGTG
NotI
S2-R：GC tctaga GGGGACACGGGGTCTACCTG
XbaI
进一步的，所述的步骤A2具体为：
A2.1步骤，HepG2细胞总RNA的提取及反转录；
A2.2步骤，S1片段的PCR扩增；
A2.3步骤，S2片段的PCR扩增；
其中：A2.1步骤，HepG2细胞总RNA的提取及反转录；
用TRIZOL方法提取HepG2细胞的总RNA，然后反转成cDNA，反转录的体系与条件为：5×g DNA Eraser Buffer 2μl，gDNA Eraser 1μl，Toral RNA 1μg，补RNase Free dH2O至10μl，轻轻吹打混匀，PCR仪上42℃保温2min，然后向上述反应液中加入PrimeScriptRTEnzyme Mix I 1μl，RT Primer Mix 1μl，5×PrimeScript Buffer 2 4μl，RNase FreedH2O 4μl，共20μl，PCR仪上37℃保温15min，85℃保温5s，待温度降至4℃取出cDNA液-20℃保存备用。
A2.2步骤，S1片段的PCR扩增；
用KOD-Plus-Ver.2试剂盒PCR扩增srebp1基因的S1片段，PCR反应体系为：cDNA(50-100ng/μl)1.2μl，引物S1-F和S1-R各0.6μl，10×PCR Buffer 2μl，25mM MgSO4 1.2μl，2mM dNTPs 2μl，KOD-Plus-(1U/μl)1μl，补充ddH2O至20μl；PCR扩增条件为：95℃预变性3min，33个循环反应(95℃30s，66℃30s，72℃90s)，72℃10min，取3μl的反应液琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶回收纯化S1片段，-20℃保存备用。
A2.3步骤，S2片段的PCR扩增；
PCR反应条件为95℃预变性3min，33个循环反应(95℃30s，65℃30s，72℃90s)，72℃10min，其他操作步骤同A2.2。
进一步的，所述A3步骤，S1与S2片段的克隆包括：
A3.1步骤，S1片段的T-A克隆；
A3.2步骤，S2片段的T-A克隆；
其中，A3.1步骤，S1片段的T-A克隆；
取胶回收的S1片段5μl(100-500ng/μl)，加入2×Taq PCR Mix 5μl，72℃反应10min，结束后取2μl加入到连接体系中(19-T Simple Vector 1μl，Solution I 5μl，ddH2O 2μl)，16℃连接过夜，热激法转化DH5α感受态细胞，涂布到含有氨苄霉素(100ng/μl)的固体LB平板上，12-16h后挑取单克隆菌落，过夜摇菌，提取质粒后用BglII和NotI双酶酶切质粒，电泳检测，并送测序公司测序进一步鉴定，得到S1片段的T-A克隆载体T-S1。
A3.2步骤，S2片段的T-A克隆；
取胶回收的S2片段5μl，加入2×Taq PCR Mix 5μl，72℃反应10min，结束后取2μl加入到连接体系中(19-T Simple Vector 1μl，Solution I 5μl，ddH2O 2μl)，16℃连接过夜，热激法转化DH5α感受态细胞，涂布到含有氨苄霉素(100ng/μl)的固体LB平板上，12-16h后挑取单克隆菌落过夜摇菌，提取质粒后用NotI和XbaI双酶酶切质粒，电泳检测，并送测序公司测序进一步鉴定得到S2片段的T-A克隆载体T-S2。
进一步的，所述A4步骤，T-S1和T-S2的双酶切与纯化包括；
A4.1步骤，T-S1的双酶切与纯化；
A4.2步骤，T-S2的双酶切与纯化；
其中，A4.1步骤，T-S1的双酶切与纯化；具体操作如下：
取10μg T-S1质粒，用BglII和NotI限制酶过夜酶切，胶回收一条约2200bp的DNA片段，即T-S1的双酶切后的目的产物，命名为E-S1，-20℃保存备用。
A4.2步骤，T-S2的双酶切与纯化；具体操作如下：
取10μg T-S2质粒，用BglII和NotI限制酶过夜酶切，胶回收一条包含T载体和S2片段的总长度约4000bp的DNA片段，即T-S2的双酶切后的目的产物，命名为ET-S2，-20℃保存备用。
所述A5步骤，E-S1与ET-S2片段的连接；具体操作步骤如下：
E-S1和ET-S2各取50ng，然后加入T4 DNA Ligase 1μl，10×T4 DNA LigaseBuffer 1μl，补充ddH2O至10μl，16℃过夜连接，热激法转化DH5α感受态细胞，涂布至含有氨苄霉素(100ng/μl)的固体LB平板上，12-16h后挑取单克隆菌落过夜摇菌，提取质粒后用XbaI和NotI限制酶酶切质粒，电泳检测，将酶切鉴定正确的质粒送测序公司测序。鉴定正确后即得含有srebp1基因CDS区全长的T克隆载体(T-srebp1)。
有益效果：为克服现有技术中人的SREBP-1c基因CDS区较长，并且GC含量相对较高，一般情况下很难实现对CDS区全长的一次性扩增的缺陷，本发明通过设计酶切位点，应用分段克隆法得到人的srebp1基因CDS区序列全长，并构建到克隆载体上，为srebp1基因的过表达、干扰序列筛选等以srebp1基因CDS区序列为基础的研究与应用提供一种有效的方法。
附图说明
图1是HepG2细胞总RNA的电泳检测。
图2是PCR扩增技术流程示意图。
图3是S1和S2片段PCR扩增产物电泳检测。
图4是T-S1和T-S2质粒双酶切鉴定。
图5是T-S1和T-S2双酶切胶回收鉴定。
图6是T-srebp1双酶切鉴定。
图7是部分测序图。
图8是部分测序结果与NCBI公布序列的比对图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行详细描述，在以下的实施例中，如无特殊说明，采用的材料均为本领域公知的材料。
实施例
A1步骤，srebp1基因CDS区分段扩增PCR引物的设计；
A2步骤，srebp1基因片段S1与S2的PCR扩增；
A3步骤，S1与S2片段的克隆；
A4步骤，T-S1和T-S2的双酶切与纯化；
A5步骤，E-S1与ET-S2的片段的连接。
第一步：srebp1基因CDS区分段扩增PCR引物的设计
从GenBank中下载人srebp1(Accession NO.NM_004176)mRNA序列，对CDS区序列中限制酶酶切位点分析发现，在CDS区的第2149-2154位为BglII酶切位点，以此酶切位点为分界点，设计分段PCR扩增引物，引物序列如下：
①S1片段引物
S1-F：TAT gcggcc gc CACC ATGGACGAGCCACCCTTCAGC
NotI Kozak
S1-R：CAAGGCCCGTGGGAGACTGGTC
②S2片段引物
S2-F：AAGGAAAAAA gcggccgc AGGGGATGCCGTGTCTGTG
NotI
S2-R：GC tctaga GGGGACACGGGGTCTACCTG
XbaI
由于分段法扩增的技术难题在于如何分段及分段数量，因此，本发明首先将srebp1分成两段，然后再连接成一条完整的srebp1序列，在此过程需要借助限制酶，对于限制酶的选择起到关键作用，BglII对srebp1来说是单酶切位点并且在中间或者靠近中间位置，因此选择BglII作为分界点。
第二步：srebp1基因片段S1与S2的PCR扩增
2.1HepG2细胞总RNA的提取及反转录；
用TRIZOL方法提取HepG2细胞的总RNA，具体操作步骤如下：
1)取35mm培养皿中生长状态良好的HepG2细胞，去除培养液，用1×PBS清洗一次；
2)向皿中加入1ml的RNAiso Plus，轻微晃动，使RNAiso Plus均匀分布于细胞表面，室温静置2min，用移液枪反复吹打细胞2min；
3)转移裂解液至离心管中；室温静置5min；
4)加入氯仿200μl，震荡混匀至乳白色；
5)12000×g 4℃离心15min；
6)转移上清液至另一新的离心管中；
7)向上清液中加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min；
8)12000×g 4℃离心10min，白色沉淀即为RNA；
9)小心弃上清，加入1ml 75％乙醇，上下颠倒数次，7500×g 4℃离心5min，弃去上清，重复此步骤1次；
10)打开离心管盖，室温干燥沉淀几分钟，加入50μl RNase-free ddH2O溶解RNA；
11)取2μl用于琼脂糖凝胶电泳检测，另取2μl用多功能酶标仪测量浓度，剩余冰置备用。
将提取的总RNA反转录成cDNA，具体操作步骤如下:
去除基因组DNA体系如表1.1-1，
表1.1-1去除基因组DNA反应
补RNase Free ddH2O至总体积10μL，轻轻吹打混匀，PCR仪上42℃保温2min，取出后冰上放置，随后在此该体系中加入10μL的反转录体系(表1.1-2)；
表1.1-2反转录体系
总体积20μL，PCR仪上37℃保温15min，85℃保温5s，待温度降至4℃取出，将cDNA放置-20℃保存备用。
2.2 S1片段的PCR扩增，具体操作步骤如下；
用KOD-Plus-Ver.2试剂盒PCR扩增srebp1基因的S1片段，PCR反应体系如表2.2-1；
表2.2-1 PCR反应体系
然后将PCR反应体系在PCR仪器上按照特定的反应条件(表2.2-2)进行扩增。
表2.2-2 PCR反应条件
取3μl的PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳检测，-20℃保存备用。
2.3S2片段的PCR扩增；
S2片段的PCR扩增反应体系与S1片段的PCR扩增反应体系相同，反应条件见表2.3-1；
取3μl的PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳检测，-20℃保存备用。
表2.3-1PCR反应条件
第三步，S1与S2片段的克隆包括：
3.1S1片段的T-A克隆；
胶回收的方法纯化S1片段，操作步骤如下
1)将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳，约40min，S1条带与杂带分开；
2)紫外灯下，切取含S1条带的琼脂糖并称重，捣碎后放入1.5mL离心管中，按琼脂糖胶质量:Binding Buffer(XP2)＝1g:1ml的比例加入适量Binding Buffer(XP2)；
3)混匀后，50-60℃水浴，每2-3min左右颠倒混匀一次，直至琼脂糖胶块完全溶化；
4)吸取步骤3中的混合液移至DNA吸附柱，10000×g离心1min；
5)加300μL Binding Buffer(XP2)，13000×g离心1min；
6)去除套管内液体，加入700μL SPW Wash Buffer，12000×g离心30s；
7)重复步骤6)一次；
8)吸附柱置于新套管，12000×g离心2min，弃去套管；
9)吸附柱置于新的1.5ml离心管中，加入65℃预热的ddH2O(30-50μL)室温静置2min，12000×g离心1min，1.5ml离心管中透明溶液即为纯化的S1片段。
取纯化的S1片段5μl(100 -500ng/μl)，加入2×Taq PCR Mix 5μl，72℃加“A”反应10min，然后进行连接，连接体系见表3.1-1；
表3.1-1连接体系
16℃过夜连接，热激法转化DH5α感受态细胞，然后涂布到含有氨苄霉素(100ng/μl)的固体LB平板上，12-16h后挑取单克隆菌落过夜摇菌，提取质粒，多功能酶标仪测定浓度后，取1μg用BglII和NotI双酶酶切鉴定，酶切反应体系见表3.1-2；
表3.1-2酶切体系
37℃保温2h，电泳检测，将酶切鉴定正确的质粒送测序公司测序。测序结果正确后即得到S1片段的克隆载体，命名为T-S1。
3.2S2片段的T-A克隆；
S2片段的T-A克隆方法与S1片段的T-A克隆方法相同，但在克隆载体鉴定时使用的限制酶是NotI和XbaI。
第四步，T-S1和T-S2的双酶切与纯化；
4.1T-S1的双酶切与纯化；
取T-S1质粒10μg，用BglII和NotI双酶酶切，酶切体系见表4.1-1，
表4.1-1T-S1双酶切反应体系
37℃保温2h，胶回收一条约2200bp的DNA片段，命名为E-S1，-20℃保存备用。
4.2T-S2的双酶切与纯化；
取T-S2质粒10μg，用BglII和NotI双酶酶切，酶切体系见表4.2-1，
表4.2-1T-S2双酶切反应体系
37℃酶切反应2h，胶回收一条约4000bp的DNA片段，命名为ET-S2，-20℃保存备用。
第五步E-S1与ET-S2的连接；
E-S1和ET-S2各取50-100ng，进行连接，连接体系见表5-1；
表5-1E-S1与ET-S2的连接体系
16℃过夜连接，热激法转化DH5α感受态细胞，涂布至含有氨苄霉素(100ng/μl)的固体LB平板上，12-16h后挑取单克隆菌落过夜摇菌，提取质粒后用XbaI和NotI双酶酶切，电泳检测，将酶切鉴定正确的质粒送测序公司测序。测序正确的质粒即含有srebp1基因CDS区全长的T克隆载体，命名为T-srebp1。
第六步 结果验证
6.1HepG2细胞总RNA的提取及反转录；
用TRIZOL方法提取HepG2细胞的总RNA，电泳检测可见明显的3条带，从下至上依次是5.8s，18s，28s(图1)。然后反转成cDNA，-20℃保存备用。
6.2S1和S2片段的PCR扩增；
PCR扩增srebp1基因的S1片段和S2片段，PCR扩增技术流程示意图如图2，PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测(图3)，图3的1和2孔为S1片段电泳结果，2200bp处为S1片段，下方1000bp处条带为杂带；图3的3和4孔为S2片段电泳结果，1300bp处为S2片段，与预期结果均相符。
6.3S1与S2片段的T-A克隆：
胶回收S1和S2片段，加“A”后分别与19-T Simple Vector连接，构建T-S1和T-S2克隆载体。T-S1用BglII/NotI双酶切鉴定，T-S2用BglII/XbaI双酶切鉴定，双酶切产物电泳结果见图4，图4中1和2号孔为T-S2双酶切产物电泳结果，显示在2692bp与1312bp处分别有一条条带，与预期结果相符；图4中3和4孔为T-S1双酶切产物电泳结果，显示在2692与2164bp分别有一条条带，与预期结果相符。
6.4T-S1和T-S2双酶切检测与纯化
T-S1和T-S2均用BglII和NotI双酶酶切，酶切产物琼脂糖凝胶电泳，结果见图5。图5中1和2孔为T-S2双酶切结果，可见一条约4000bp的条带，与预期相符，并胶回收纯化此条带，即ET-S2。图5中3和4孔为T-S1双酶酶切结果，可见一条约2700bp的条带与一条约2200bp的条带，与预期相符，胶回收纯化2200bp的条带，即E-S1；
6.5E-S1片段与ET-S2片段连接
E-S1和ET-S2连接后转化转化DH5α感受态细胞，经挑菌、摇菌提取质粒，用NotI和XbaI双酶酶切鉴定(图6)见，图6中1号和2号孔均为E-S1和ET-S2连接后的质粒，显示在约3500bp与2700bp分别有一条带，其中3500bp条带包含了srebp1基因CDS区全长，最终T-srebp1构建成功。
实验过程中，每步载体的构建，在提取质粒双酶切鉴定正确后需测序鉴定，以确保得到的srebp1基因CDS区序列与NCBI公布的一致。部分测序结果见图7，部分测序结果与NCBI公布序列的比对结果见图8。
以上所述，仅为本发明创造较佳的具体实施方式，但本发明创造的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明创造披露的技术范围内，根据本发明创造的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明创造的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种人的srebp1基因编码区分段克隆的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A1步骤，srebp1基因CDS区分段扩增PCR引物的设计；
A2步骤，srebp1基因片段S1与S2的PCR扩增；
A3步骤，S1与S2片段的克隆；
A4步骤，T-S1和T-S2的双酶切与纯化；
A5步骤，E-S1与ET-S2的片段的连接；
其中，A1步骤中，从GenBank中下载人srebp1 mRNA序列，在CDS区的第2149-2154位为BglII酶切位点，以此酶切位点为分界点，设计分段扩增引物，引物序列如下：
①S1片段引物
S1-F：TAT gcggcc gc CACC ATGGACGAGCCACCCTTCAGC
NotI Kozak
S1-R：CAAGGCCCGTGGGAGACTGGTC
②S2片段引物
S2-F：AAGGAAAAAA gcggccgc AGGGGATGCCGTGTCTGTG
NotI
S2-R：GC tctaga GGGGACACGGGGTCTACCTG
XbaI
所述A2步骤包括：
A2.1步骤，HepG2细胞总RNA的提取及反转录：
用TRIZOL方法提取HepG2细胞的总RNA，然后反转成cDNA，反转录的体系与条件为：5×gDNA Eraser Buffer 2μl，gDNA Eraser 1μl，Toral RNA 1μg，补RNase Free dH2O至10μl；PCR仪上42℃保温2min，然后向上述反应液中加入PrimeScriptRT Enzyme Mix I 1μl，RTPrimer Mix 1μl，5×PrimeScript Buffer 24μl，RNase Free dH2O 4μl，共20μl，PCR仪上37℃保温15min，85℃保温5s，待温度降至4℃取出cDNA液-20℃保存备用；
A2.2步骤，S1片段的PCR扩增：
用KOD-Plus-Ver.2试剂盒PCR扩增srebp1基因的S1片段，PCR反应体系为：cDNA 1.2μl，引物S1-F和S1-R各0.6μl，10×PCRBuffer 2μl，25mM MgSO41.2μl，2mM dNTPs 2μl，KOD-Plus-(1U/μl)1μl，补充ddH2O至20μl；PCR扩增条件为：95℃预变性3min，依次以条件95℃30s，66℃30s，72℃90s进行33个循环反应，然后于72℃10min，取3μl的反应液琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶回收纯化S1片段，-20℃保存备用；
A2.3步骤，S2片段的PCR扩增：
用KOD-Plus-Ver.2试剂盒PCR扩增srebp1基因的S2片段，PCR反应体系为：cDNA1.2μl，引物S2-F和S2-R各0.6μl，10×PCR Buffer 2μl，25mM MgSO41.2μl，2mM dNTPs 2μl，KOD-Plus-(1U/μl)1μl，补充ddH2O至20μl；PCR扩增条件为：95℃预变性3min，33个循环反应(95℃30s，65℃30s，72℃90s)，72℃10min，取3μl的反应液琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶回收纯化S2片段，-20℃保存备用；
所述A3步骤包括：
A3.1步骤，S1片段的T-A克隆：
取胶回收的S1片段5μl，加入2×Taq PCR Mix 5μl，72℃反应10min，结束后取2μl加入到连接体系中，16℃连接过夜，热激法转化DH5α感受态细胞，涂布到含有氨苄霉素100ng/μl的固体LB平板上，12-16h后挑取单克隆菌落过夜摇菌，提取质粒后用BglII和NotI双酶酶切质粒，电泳检测，并送测序公司测序进一步鉴定，得到S1片段的T-A克隆载体T-S1；
A3.2步骤，S2片段的T-A克隆：
取胶回收的S2片段5μl，加入2×Taq PCR Mix 5μl，72℃反应10min，结束后取2μl加入到连接体系中，16℃连接过夜，热激法转化DH5α感受态细胞，涂布到含有氨苄霉素100ng/μl的固体LB平板上，12-16h后挑取单克隆菌落过夜摇菌，提取质粒后用NotI和XbaI双酶酶切质粒，电泳检测，并送测序公司测序进一步鉴定得到S2片段的T-A克隆载体T-S2；
所述A4步骤包括：
A4.1步骤，T-S1的双酶切与纯化：取10μg T-S1质粒，用BglII和NotI限制酶过夜酶切，胶回收一条约2200bp的DNA片段，即T-S1的双酶切后的目的产物，命名为E-S1，-20℃保存备用；
A4.2步骤，T-S2的双酶切与纯化：取10μg T-S2质粒，用BglII和NotI限制酶过夜酶切，胶回收一条包含T载体和S2片段约4000bp的DNA片段，即T-S2的双酶切后的目的产物，命名为ET-S2，-20℃保存备用；
所述A5步骤具体执行以下操作：
E-S1和ET-S2各取50ng，然后加入T4 DNA Ligase 1μl，10×T4 DNA Ligase Buffer 1μl，补充ddH2O至10μl，16℃过夜连接，热激法转化DH5α感受态细胞，涂布至含有氨苄霉素的固体LB平板上，12-16h后挑取单克隆菌落过夜摇菌，提取质粒后用XbaI和NotI限制酶酶切质粒，电泳检测，将酶切鉴定正确的质粒送测序公司测序，鉴定正确后即得含有srebp1基因CDS区全长的T克隆载体T-srebp1。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述A3.1步骤和A3.2步骤中，连接体系为19-T Simple Vector 1μl，Solution I 5μl，ddH2O 2μl。
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