CN105524928A - 桃PpeAMT1;1基因、转运蛋白、表达载体及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种桃PpeAMT1；1基因，其碱基序列如SEQ？ID？NO：1所示。还公开了上述桃PpeAMT1；1基因编码的转运蛋白、表达载体pYES2-PpeAMT1；1，以及表达载体pYES2-PpeAMT1；1的构建方法。本发明通过同源克隆方法从桃果实中克隆得到一个1515bp的片段，与其他作物的AMT1家族成员具有较高的同源性，氨基酸序列具有1个典型的ammonium？transporter功能域，包括12个跨膜区，可推断其为一个新的桃铵转运体PpeAMT1；1基因。该基因在幼果形成及果实发育初期的表达水平最高，显著高于一年生叶、韧皮部、花和根部的表达水平，而在果实成熟时期的表达水平较低。该基因具有吸收外界NH₄ ⁺的能力，推测其在桃果实发育初期NH₄ ⁺的动态平衡中起重要作用。

Description

桃PpeAMT1;1基因、转运蛋白、表达载体及其构建方法

技术领域

本发明涉及桃PpeAMT1；1基因、转运蛋白、表达载体及其构建方法，属于分子生物学和生物技术领域。

背景技术

铵离子(NH₄ ⁺)是最主要的无机氮存在形式，是植物优先吸收的氮素营养，与植物的生长、发育和果实品质密切相关。铵肥在促进果实品质与产量等生理方面起重要作用，施用适量铵肥不仅可以显著地增强果实的内在品质，也可以改善了果实的外观品质。然而，相关报道主要集中在生理生化层面，有关果实品质、产量与NH₄ ⁺的吸收、转运及其代谢的分子机理的报道鲜少。

植物对NH₄ ⁺的吸收是依赖定位于细胞质膜上的AMT转运体来实现完成的，分为AMT1和AMT2两个基因亚族。Ninnemann等从拟南芥中克隆并鉴定了第一个植物AMT1成员基因，迄今为止，关于该类基因结构与功能的报道主要集中在一年生草本植物拟南芥、番茄、百脉根、油菜和水稻等为研究材料。报道显示AMT1基因主要在一年生植物体的根部表现出高表达，主导根部NH₄ ⁺的吸收(Preferentialexpressionofanammoniumtransporterandoftwoputativenitratetransportersinroothairsoftomato,LauterFR,NinnemannO,BucherM,RiesmeierJW,FrommerWB,Proc.Natl.Acad.Sci.USA；Threefunctionaltransportersforconstitutive,diurnallyregulated,andstarvation-induceduptakeofammoniumintoArabidopsisroots,GazzarriniS,LejayL,GojonA,NinnemannO,FrommerWB,PlantCell；Differentialregulationofthreefunctionalammoniumtransportergenesbynitrogeninroothairsandbylightinleavesoftomato,vonWirénN,LauterFR,NinnemannO,GillissenB,Walch-LiuP,EngelsC,JostW,FormmerWB,PlantJournal；FunctionalcharacterizationofanammoniumtransportergenefromLotusjaponicas,SalveminiF,MariniAM,RiccioA,PatriarcaEJ,ChiurazziM,Gene；Distinctexpressionandfunctionofthreeammoniumtransportergenes(OsAMT1；1–1；3)inrice,SonodaY,IkedaA,SaikiS,vonWirénN,YamayaT,YamaguchiJ,PlantCellPhysiol)，或主要在叶片表达，主导地上部的转运(FunctionalcharacterizationofanammoniumtransportergenefromLotusjaponicas,SalveminiF,MariniAM,RiccioA,PatriarcaEJ,ChiurazziM,Gene；Characterizationofthreefunctionalhigh-affinityammoniumtransportersinLotusjaponicuswithdifferentialtranscriptionalregulationandspatialexpression,D'ApuzzoE,RogatoA,Simon-RosinU,ElAlaouiH,BarbulovaA,BettiM,DimouM,KatinakisP,MarquezA,MariniAM,UdvardiMK,ChiurazziM,PlantPhysiology)。然而，植物AMT1家族基因成员的功能尚未完全清楚，AMT家族基因在果实发育及品质形成的具体功能及其调控机制更是未知的。由于木本植物具有多年生长的特性，具有与草本植物截然不同的氮素吸收转运特点，它们的AMT同源基因调控方式与生理功能亦有所差别，因此，从木本植物果实中分离并鉴定新的AMT同源基因具有重要意义。

发明内容

本发明首次公开了从桃果实中分离出的铵转运体PpeAMT1；1基因的全长cDNA，并提供一种高效表达桃AMT基因的酵母表达载体构建方法。

本发明公开了一种桃PpeAMT1；1基因，其碱基序列如SEQIDNO：1所示。

本发明还公开了上述桃PpeAMT1；1基因编码的转运蛋白，其序列如SEQIDNO：2所示。

本发明还公开了上述桃PpeAMT1；1基因表达载体pYES2-PpeAMT1；1，其特征在于载体为pYES2质粒，基因为SEQIDNO：1所示的基因。

本发明还公开了上述桃PpeAMT1；1基因表达载体PpeAMT1；1的构建方法，其步骤包括：

A、通过PCR方法扩增目的基因片段，并回收PCR产物，其中PpeAMT1；1基因5’端引物的碱基序列如SEQIDNO：3所示，PpeAMT1；1基因3’端引物的碱基序列如SEQIDNO：4所示；

B、分别用KpnI和NotI双酶切PCR回收产物和pYES2质粒，然后用T4DNAligase连接，获得表达载体pYES2-PpeAMT1；1。

本发明通过同源克隆方法从桃中克隆得到一个1515bp的片段，BLAST显示与其他作物的AMT1家族成员具有较高的同源性，氨基酸序列具有1个典型的ammoniumtransporter功能域，包括12个跨膜区，可推断其为一个新的桃铵转运体PpeAMT1；1基因。实时定量PCR结果表明，该基因在幼果形成及果实发育初期的表达水平最高，显著高于一年生叶、韧皮部、花和根部的表达水平，而在果实成熟时期的表达水平较低，推测其主要在果实发育过程中起作用。为了进一步了解AMT1；1基因功能，将其连接到酵母表达载体pYES2上，构建成重组质粒pYES2-PpeAMT1；1，并转化酵母菌31019b突变体(MATamepl△mep2△::LEU2mep3△::KanMX2ura3，由于缺失了吸收和转运NH₄ ⁺的位点，在外界NH₄ ⁺作为唯一氮源且浓度低于5mmolL^-1时不能生长)。结果发现，该重组质粒能恢复酵母突变体的生长，表明PpeAMT1；1基因具有吸收外界NH₄ ⁺的能力，为进一步探讨AMT1家族基因在桃果实发育中NH₄ ⁺的吸收、转运和调控机制提供了方便和可能。

附图说明

图1为实施例1中桃、水稻、拟南芥、番茄和百脉根的AMT1；1蛋白氨基酸同源性比对图。图注：PpeAMT1；1：桃AMT1；1；OsAMT1；1：水稻AMT1；1；AtAMT1；1：拟南芥AMT1；1；LeAMT1；1：番茄AMT1；1；LjAMT1；1：百脉根AMT1；1；Consensus：氨基酸序列一致性。

图2为实施例2中桃PpeAMT1；1基因在不同组织或器官的实时荧光定量RT-PCR表达图。图注：S1，发育时期1(第一次果实快速发育期)；S2，发育时期2(硬核期)；S3，发育时期3(果实膨大期)；S4，发育时期4(果实成熟期)。

图3为pYES2-PpeAMT1；1表达载体的构建方法示意图。

图4为实施例3中pYES2-PpeAMT1；1重组表达载体的酶切验证图。

图5为实施例4中酵母在不同N源条件下的生长状态图。

具体实施方式

下面对本发明作进一步说明。

实施例1：桃果实基因的克隆方法

1、果实总RNA的提取：

(1)取1mLCTAB提取液分装到2mL离心管中，65℃预热；

(2)称取0.5g桃果实材料，在液氮中研磨后立即转入含有CTAB提取液的离心管中，涡旋混合，65℃温浴5min；

(3)立即加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，涡旋混合，室温，12000rpm离心10min；

(4)吸取上清到一新的离心管中，重复步骤3；

(5)取上清到一新的离心管中，加入1/3体积的8MLiCl，4℃沉淀过夜；

(6)4℃，12000rpm离心20min；

(7)弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤，再用无水乙醇洗涤；

(8)将沉淀溶解在100μLSTE(65℃预热)中，立即用氯仿/异戊醇抽提一次；

(9)取上清，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀2h；

(10)4℃，12000rpm离心15min；

(11)沉淀分别用70％乙醇和无水乙醇洗涤一次，干燥后用20μLRNase-free水溶解，于-70℃冰箱长期保存

2、桃PpeAMT1；1基因的克隆及序列分析

(1)利用TaKaRa公司的PrimeScript^TMRTreagentKit反转录试剂盒将果实总RNA反转录为第一链cDNA，作为PCR模板。

(2)设计桃PpeAMT1；1基因全长CDS扩增引物：

PpeAMT1；1-FP1:5’-ATGGCGACGTGGGCTACCTTAGA-3’(SEQIDNO：5)

PpeAMT1；1-RP1:5’-CTAAACGGAAGTGGGTGTGGAAG-3’(SEQIDNO：6)

(3)PCR反应体系为：

反应程序为：95℃预变性，3min；95℃变性，30S，59℃退火，30S，72℃延伸，2min，三十五个循环；最后72℃，延伸10min，4℃保温。

获得全长的CDS序列为1515bp，包括起始密码子ATG至终止密码子TAG，编码505个氨基酸。将此氨基酸序列在NCBI的Genebank中进行比较，表明与已发表的拟南芥、番茄、百脉根和水稻的AMT1；1蛋白的氨基酸同源性分别为80％、79％、83％和69％，如图1所示。

实施例2：桃PpeAMT1；1基因在不同组织或器官的实时荧光定量RT-PCR表达检测：

提取桃树一年生叶片、韧皮部、根部、桃花及桃果实发育不同发育时期RNA，利用实时荧光定量PCR测定PpeAMT1；1基因在不同组织或器官及果实不同发育时期的表达水平，利用SYBRPremixExTaq(TaKaRa)荧光染料在ABI7500实时荧光定量PCR仪对不同组织或器官及果实不同发育时期的cDNA模板进实时荧光定量PCR分析。

PpeAMT1；1-FP2：5’-GTCGTCTCCCACTGGTTCTG-3’(SEQIDNO：7)，

PpeAMT1；1-RP2：5’-GAACGTGCCCAAGACTACCA-3’(SEQIDNO：8)。

PCR反应体系为：

反应程序为：95℃预变性，30sec；95℃变性，5sec，59℃退火，34sec，40个循环；最后72℃，延伸30sec。

图3显示，PpeAMT1；1基因在幼果形成及果实发育初期的表达水平最高，显著高于一年生叶、韧皮部、花和根部的表达水平，而在果实成熟时期的表达水平较低。这说明，PpeAMT1；1基因可能参与果实发育初期铵离子吸收和转运的过程。

实施例3：桃PpeAMT1；1基因酵母表达载体pYES2-AMT1；1的构建

1、根据分离出的桃PpeAMT1；1基因的核苷酸序列，设计引物:

PpeAMT1；1-FP3：5’-GAGAGGTACCATGGCGACGTGGGCTACCTTAGA-3’(SEQIDNO：3)(引入KpnI酶切位点)，

PpeAMT1；1-RP3：5’-GAGAGCGGCCGCCTAAACGGAAGTGGGTGTGG-3’(SEQIDNO：4)(引入NotI酶切位点)。

以总RNA反转录的第一链cDNA为模板，进行聚合酶链式反应。

2、取5μLPCR产物与pMD18-T载体进行连接，操作步骤按TakaRa公司产品pMD18-TVectorsystem说明书进行。然后转化大肠杆菌DH5α菌株，在表面涂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)和5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X－gal)的含氨苄青霉素(100μg/μL)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。利用TIANGEN快速质粒小提试剂盒进行质粒提取并进行序列测定。

3、用KpnI和NotI两个限制性内切酶将该基因从pMD18-TVector载体上切下，与相同KpnI和NotI酶切的pYES-2载体连接。连接产物转化DH5α细胞，然后在含氨苄青霉素(100μg/μL)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜，经PCR鉴定和质粒DNA酶切验证正确的为阳性单菌落，如图4所示。将构建好的重组表达载体命名为pYES2-PpeAMT1；1。

实施例4：桃PpeAMT1；1基因的功能鉴定

1、酵母转化和培养

采用电转化仪MicroPulser(Bio-Rad公司)将pYES2-PpeAMT1；1和空载体pYES2分别转入酵母铵转运体缺失突变菌株31019b感受态细胞，电击后加入1mL预冷的1M山梨醇，30℃度温育2h，在酵母选择性培养基(0.17％YNB+2mM精氨酸+2％D-半乳糖+2％琼脂)固体平板上30℃黑暗培养3d。挑取单菌落，在液体酵母选择性培养基中30℃震荡培养36h，经PCR鉴定和质粒DNA酶切验证正确的为阳性单菌落。

2、酵母功能互补

分别将转化重组表达载体pYES2-PpeAMT1；1和空载体pYES2的31019b菌体接种在YNB液体选择性培养基，30℃震荡培养至OD₆₀₀至1.0，经10倍梯度稀释成10^-1、10^-2和10^-3三个浓度，分别取4个浓度梯度的菌液5μL点样于以2mM精氨酸或0.02、0.2和2mM不同浓度NH₄Cl(pH5.8)为唯一氮源的固体培养基(0.17％YNB+2％D-半乳糖+2％琼脂)上，于30℃黑暗培养，验证31019b突变体恢复转运NH₄ ⁺的生长情况，验证桃PpeAMT1；1基因吸收外界NH₄ ⁺能力。

如图5所示，酵母铵转运体缺失突变菌株31019b由于缺失了吸收和转运NH₄ ⁺的位点，在外界NH₄ ⁺作为唯一氮源且浓度低于5mmolL^-1时不能生长。在以2mM精氨酸为唯一氮源的固体培养基(0.17％YNB+2％D-半乳糖+2mM精氨酸+2％琼脂)中，转化了pYES2-PpeAMT1；1和空载体pYES2的菌株都能正常生长,在以0.02、0.2或2mMNH₄Cl为唯一氮源的培养基(0.17％YNB+2％D-半乳糖+不同浓度的铵+2％琼脂)上，转化空载体pYES2的酵母不能正常生长，而转化了重组表达载体pYES2-PpeAMT1；1的酵母能够正常生长，随着铵浓度的不断升高，酵母生长得越好，说明桃铵转运体PpeAMT1；1具有吸收NH₄ ⁺的功能，能够介导NH₄ ⁺的吸收。

Claims (4)

1.一种桃PpeAMT1；1基因，其碱基序列如SEQIDNO：1所示。

2.一种桃PpeAMT1；1转运蛋白，其序列如SEQIDNO：2所示。

3.一种桃PpeAMT1；1基因表达载体pYES2-PpeAMT1；1，其特征在于载体为pYES2质粒，基因为SEQIDNO：1所示的基因。

4.一种桃PpeAMT1；1基因表达载体pYES2-PpeAMT1；1的构建方法，其步骤包括：

A、通过PCR方法扩增目的基因片段，并回收PCR产物，其中PpeAMT1；1基因5’端引物的碱基序列如SEQIDNO：3所示，PpeAMT1；1基因3’端引物的碱基序列如SEQIDNO：4所示；

B、分别用KpnI和NotI双酶切PCR回收产物和pYES2质粒，然后用T4DNAligase连接，获得表达载体pYES2-PpeAMT1；1。