CN110152571A - 一种用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球及其制备方法和应用 - Google Patents

一种用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110152571A
CN110152571A CN201910394835.2A CN201910394835A CN110152571A CN 110152571 A CN110152571 A CN 110152571A CN 201910394835 A CN201910394835 A CN 201910394835A CN 110152571 A CN110152571 A CN 110152571A
Authority
CN
China
Prior art keywords
group
click
reaction
magnetic microsphere
labelled protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910394835.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110152571B (zh
Inventor
程度
黄思聪
袁建明
邓少辉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Sun Yat Sen University
Original Assignee
National Sun Yat Sen University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Sun Yat Sen University filed Critical National Sun Yat Sen University
Priority to CN201910394835.2A priority Critical patent/CN110152571B/zh
Publication of CN110152571A publication Critical patent/CN110152571A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110152571B publication Critical patent/CN110152571B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球及其制备方法和应用。所述磁性微球以磁性纳米颗粒为内核，在其表层形成巯基化壳层，然后在巯基化壳层上连接环境敏感基团，并通过环境敏感基团偶联点击反应基团，即为所述磁性微球。本发明磁性微球可通过高效的点击反应迅速地与标记蛋白进行结合，并在外源磁场的作用下，从检测样溶液中分离出来，然后在一定环境刺激下释放被标记的蛋白，使得被标记的蛋白可快速、简单地分离出来，且纯度较高，后续检测结果更准确；同时标记蛋白被分离后，待检测样中未被标记的蛋白还可回收并重复进行应用，用于回收修饰/未修饰的蛋白，尤其是抗体类的蛋白质，可大幅度减少蛋白的浪费，降低成本。

Description

一种用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球及其制备 方法和应用
技术领域
本发明涉及高分子化学与生物医学工程技术领域，更具体地，涉及一种用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球及其制备方法和应用。
背景技术
基于免疫侧向层析技术的快检技术具有操作方便、即时快捷和成本较低的优点，在早孕检测、心梗早期诊断和病毒检测等方面得到了广泛应用，实现了床旁快检，对于提高疾病诊断效率起到了积极作用，具有广阔的应用前景和市场价值。
然而，在基于免疫侧向层析技术的快检试纸条的工业化生产仍存在问题。在该项技术中，不可避免地要将荧光微球、量子点、荧光染料等标记到抗体表面，在检测中发出信号指示样本中是否含有目标检测物。目前，抗体与信号分子的标记反应通常基于N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和氨基、马来酰亚胺(Mal)和巯基的反应。自点击化学反应提出和发展以来，因为其高效的反应效率及其绿色环保的优势，越来越多地被应用于生物化学反应中，在蛋白及抗体的标记中也有广泛的应用。但是，反应过后，溶液中仍存在许多未被标记的抗体蛋白难以分离、回收，不仅使得生产成本高昂，还会对检测灵敏度造成了很大的影响。
而传统的蛋白纯化方法大多为层析法，如亲和层析法、羟基磷灰石柱层析法、纤维柱层析法、离子交换色谱等；其纯化过程需要选择合适的填料粒径、配比合适的洗脱液，且填料价格较高、洗脱溶剂用量较大，导致成本较高；另外，层析法还具有用时较长、操作不便等问题。
另外，胰岛素等蛋白类药物在体内输送时易被体液中的酶降解，无法达到治疗效果。因此，需将蛋白类药物表面PEG化，即将活化的PEG通过化学方法偶联到药物上,以保护蛋白类药物不被酶解。然而，蛋白类药物PEG化后溶液中还可能存在聚乙二醇单甲醚、交叉连接或聚合的PEG二醇等物质，难以分离纯化，限制了蛋白类药物PEG修饰技术的应用。
因此，有必要提供一种易于快速、准确分离纯化标记蛋白，同时未被标记的蛋白还能有效回收的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有标记蛋白的检测过程中标记蛋白纯化方法的不足，以及未被标记的蛋白无法有效回收的缺陷，提供一种用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球。本发明所述环境敏感型磁性微球表面修饰点击反应基团，待检测蛋白采用与磁性微球上相同的点击反应基团标记，然后将信号分子连接与蛋白标记的点击反应基团相对应的点击反应基团，则信号分子可分别与标记蛋白和磁性微球高效点击反应，将标记蛋白与磁性微球偶联，再结合磁珠自身的超顺磁性，在外源磁铁的作用下，与标记蛋白偶联后磁性微球由于磁性的吸引，被分离出反应体系，其后在一定的环境刺激下，标记蛋白与磁性微球之间的偶联被断开，标记蛋白被释放。通过上述方法，得到的标记蛋白的纯度高，纯化过程简单，纯化效率高；同时，反应体系中剩余未标记的蛋白(尤其是抗体)还可回收并再次利用，降低了生产成本。
本发明的另一目的在于提供所述用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球的制备方法。
本发明的再一目的在于提供所述用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球的应用。
本发明的还一目的在于提供所述用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球的应用方法。
本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：
一种用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球，以磁性纳米颗粒为内核，在其表层形成巯基化壳层，然后在巯基化壳层上连接环境敏感基团，并通过环境敏感基团偶联点击反应基团，即为所述用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球。
本发明所述磁性微球为在纳米磁珠颗粒的表面修饰连接环境敏感键的点击反应基团，通过高效的点击反应结合反应体系中需要被分离的蛋白，利用磁珠的超顺磁性，在外源磁场下即可快速富集，操作简便快捷；受一定环境刺激后，目标蛋白可快速释放，纯度高；所述环境敏感型磁性微球不仅可以代替传统的柱层析等方法达到纯化目的蛋白、回收未反应蛋白的目的，还可以提高纯化效率，简化操作过程，具有很大的优势。
优选地，所述磁性纳米颗粒为四氧化三铁纳米颗粒、掺杂锰元素的四氧化三铁纳米颗粒或γ-三氧化二铁纳米颗粒中的一种或多种。
优选地，所述环境敏感基团为酰腙键、腙键、亚胺键、原酸酯键或缩醛键中的一种或多种。
优选地，所述点击反应基团为氮杂二苯并环辛炔(DBCO)、叠氮(N3)、端基炔、马来酰亚胺(Mal)、巯基或呋喃的一种或多种。
优选地，所述磁性纳米颗粒为四氧化三铁纳米颗粒；所述环境敏感基团为酰腙键；所述点击反应基团为氮杂二苯并环辛炔(DBCO)或叠氮(N3)。
本发明同时还保护所述用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球的制备方法，包括以下步骤：
S1.将磁性纳米颗粒经巯基硅烷化试剂获得巯基化的磁性纳米颗粒(Fe3O4@SiO2-SH)；
S2.将含有环境敏感基团的物质与含有点击反应基团的物质反应，制备同时含有环境敏感基团和点击反应基团的物质；
S3.将步骤S1制备的巯基化的磁性纳米颗粒和步骤S2制备的含有环境敏感基团和点击反应基团的物质在光引发剂的作用下，经365nm紫外光照射，反应制备得到表面修饰有点击反应基团的环境敏感磁性微球。
优选地，步骤S1中所述磁性纳米颗粒为四氧化三铁纳米颗粒。
优选地，步骤S2中含有环境敏感基团的物质为烯丙基醛基聚乙二醇或烯丁基醛基聚乙烯醇；所述含有点击反应基团的物质为叠氮丙酰肼、叠氮乙酰肼或氮杂二苯并环辛炔乙酰肼。
优选地，步骤S3中所述光引发剂为2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮、2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮、2,4,6-三甲基苯甲酰基-二苯基氧化膦或2-二甲氨基-2-苄基-1-[4-(4-吗啉基)苯基]-1-丁酮中的一种。
更优选地，步骤S3中所述光引发剂为2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮。
更优选地，步骤S2的具体过程为：
S21.含有环境敏感基团的物质的制备：
以水合肼、溴丙酸甲酯、叠氮化钠等为原料合成小分子的叠氮丙酰肼；
或，以水合肼、DBCO-NHS为原料合成氮杂二苯并环辛炔丙酰肼(DBCO)；
S22.含有点击反应基团的物质的制备：
以烯丙基聚乙二醇(APEG3k-OH)为原料，通过TEMPO选择性氧化，合成烯丙基醛基聚乙二醇(APEG3k-CHO)；
S23.同时含有环境敏感基团和点击反应基团的物质的制备：
APEG3k-CHO和叠氮丙酰肼为原料，发生席夫碱反应，合成酸敏感的叠氮烯丙基聚乙二醇(APEG3k-pH-N3)，即为同时含有环境敏感基团和点击反应基团的物质；
或，APEG3k-CHO和氮杂二苯并环辛炔丙酰肼，发生席夫碱反应，合成氮杂二苯并环辛炔烯丙基聚乙二醇(APEG3k-pH-DBCO)，即为同时含有环境敏感基团和点击反应基团的物质。
优选地，步骤S22中，所述烯丙基聚乙二醇氧化的催化剂为以下体系之一：①四甲基哌啶氮氧化物(TEMPO)、溴化钠、次氯酸钠；②四丙基铵·过铑酸盐(TPAP)、碳酸钾；③醋酸钯、吡啶、分子筛。
更优选地，步骤S3的具体过程为：
Fe3O4@SiO2-SH、APEG3k-pH-N3或APEG3k-pH-DBCO在光引发剂I2959存在条件下，经365nm紫外光照射，发生反应，即可分别制备得到Fe3O4@SiO2-PEG-pH-N3或Fe3O4@SiO2-PEG-pH-DBCO。
所述用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球在分离、纯化标记蛋白，回收为标记蛋白的检测过程用的应用也在本发明的保护范围之内。
优选地，适用的蛋白包括：抗体，如肌钙蛋白I抗体、肌红蛋白抗体、乙肝核心抗体IgM等；和蛋白类药物，如胰岛素、凋亡素、天花粉蛋白等。
本发明同时还保护所述用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球的应用方法，包括如下过程：
S4.将待检测样品中加入含有点击反应基团的物质，进行标记，得到含有标记蛋白的检测样；
S5.将信号分子表面修饰上相对应的点击反应基团物质，制备得到修饰相对应点击反应基团的信号分子；
S6.将步骤S5制备的信号分子加入到步骤S4的检测样中，然后加入权利要求1至3任一所述磁性微球，混匀反应；
S7.待反应结束后即可在外加磁场的作用下，将磁性微球从检测样中分离出来；然后置于酸性条件下释放蛋白，即可得到纯化后的蛋白。
优选地，步骤S4中所述含有点击反应基团的物质中的点击反应基团与磁性微球表面修饰的点击反应基团相同。
优选地，步骤S5中所述相对应的点击反应基团物质的点击反应基团与步骤S4中所述标记蛋白表面修饰的点击反应基团为一对点击反应基团。
优选地，步骤S4～S6在pH 7.3～7.5条件下进行；步骤S7中所述酸性条件为pH5.0～6.5。
更优选地，步骤S4～S6在pH为7.4条件下进行；步骤S7中所述酸性条件为pH为6.0。
优选地，所述点击反应基团为氮杂二苯并环辛炔(DBCO)、叠氮(N3)、端基炔、马来酰亚胺(Mal)、巯基或呋喃。
其中点击反应基团对为氮杂二苯并环辛炔(DBCO)/叠氮(N3)、端基炔/叠氮、马来酰亚胺(Mal)/巯基、狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)反应对(如呋喃和马来酰亚胺)。一对点击反应基团对中的两个基团可高效率地发生点击反应进行结合。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的磁性微球可通过高效的点击反应迅速地与标记蛋白进行结合，并在外源磁场的作用下，从检测样溶液中分离出来，然后在酸性条件下释放被标记的蛋白，使得被标记的蛋白可快速、简单的分离出来，且纯度较高，后续检测结果更准确；
同时标记蛋白被分离后，待检测样中未被标记的蛋白还可回收并重复进行应用，用于回收修饰/未修饰的蛋白，尤其是抗体类的蛋白质，可大幅度减少蛋白的浪费，降低成本。
本发明所述磁性微球在应用过程中，与标记蛋白的结合率高，标记蛋白的收集和纯化效果好，使用方法简单、快速，便于应用在在临床上相关检测。
附图说明
图1为溴代丙酰肼、叠氮丙酰肼和氮杂二苯并环辛炔丙酰肼的核磁谱图。
图2为烯丙基醛基聚乙二醇(APEG3k-CHO)、酸敏感的烯丙基叠氮聚乙二醇(APEG3k-pH-N3)和酸敏感的烯丙基叠氮聚乙二醇(APEG3k-pH-DBCO)的核磁谱图。
图3为四氧化三铁(Fe3O4)、巯基化的四氧化三铁(Fe3O4@SiO2-SH)、酸敏感的叠氮磁性四氧化三铁(Fe3O4@SiO2-pH-N3)、酸敏感的DBCO磁性四氧化三铁(Fe3O4@SiO2-pH-DBCO)的红外谱图。
图4为磁性微球的TEM图，未用染色剂染色，(A)Fe3O4，(B)Fe3O4@SiO2-SH，(C)Fe3O4@SiO2-pH-N3，(D)Fe3O4@SiO2-pH-DBCO。
图5为磁性微球的磁滞回线图，测量温度为300K。
图6为磁性微球在外源磁场作用与重力作用下的富集能力对比图。
图7为磁性微球发挥作用的原理示意图。
图8为两种酸敏感磁性微球(表面修饰叠氮和表面修饰DBCO)在pH 7.4、pH 6.0条件下与荧光分子结合后的酸敏释放图。
图9为表面修饰叠氮的磁性微球(Fe3O4@SiO2-pH-N3)对表面修饰DBCO的两种蛋白(Cas9和BSA)的结合释放图。
图10为表面修饰DBCO的磁性微球(Fe3O4@SiO2-pH-DBCO)对叠氮荧光微球结合的两种蛋白(Cas9和BSA)的释放图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
一种用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球Fe3O4@SiO2-PEG-pH-N3，具体的制备过程如下：
S1.巯基化磁性四氧化三铁微球的制备：
S11.磁性四氧化三铁微球的制备：
将4.8-5.2g氢氧化钠(NaOH)溶于250mL去离子水中，将上述氢氧化钠溶液置于500mL三口烧瓶中，室温下抽真空除氧半小时，置换为氮气氛围。将6.4-6.6g六水合氯化铁(FeCl3·6H2O)和2.4-2.6g四水合氯化亚铁(FeCl2·4H2O)溶解于12mL 0.4mol·L-1HCl溶液中，抽真空除氧，置换为氮气氛围。将上述氢氧化钠溶液加热到40℃，将上述含亚铁(Fe2+)、铁(Fe3+)离子溶液缓慢滴加到氢氧化钠溶液中。滴加完毕后，将反应温度提高至80℃，继续反应一小时。反应完全后，恢复至室温，通过磁铁磁吸附将黑色固体收集至瓶底，除去上清液。继续加入300mL无水乙醇，于超声下洗涤十分钟，继续磁吸分离。如此重复四次，最后将产物于60℃下真空干燥，得到产物四氧化三铁2.52-2.54g，产率约87％-92％。
S12.表面巯基修饰的四氧化三铁磁性微球的制备：
将0.9-1.1g四氧化三铁超声分散在300mL乙醇中，氮气保护下，继续缓慢滴加0.8-1.2mL巯丙基三乙氧基硅烷和45-50μL氨水，室温下继续超声反应3小时。用磁铁磁吸分离，弃去上层清液继续加入50mL无水乙醇，于超声下洗涤十分钟，继续磁吸分离。如此重复四次，最后将产物于60℃下真空干燥，得到产物巯基硅氧烷修饰的四氧化三铁(Fe3O4@SiO2-SH)0.7-0.9g，产率约78％-82％。
S2.含有环境敏感基团的物质的制备：
S21.叠氮丙酰肼的制备：
反应路线如下：
首先合成溴代丙酰肼：称取0.8-1.0g水合肼于250mL二口瓶中，加入100mL乙醇，80℃加热回流后，滴入溶有1.4-1.6g溴丙酸甲酯的50mL乙醇，搅拌，加热回流约4h至溶液呈淡黄色澄清溶液；恢复到室温后，-40℃冷冻0.5h，析出淡黄色至无色絮状沉淀。抽滤，固体用乙醇重结晶，抽滤，真空干燥得白色粉末状的溴代丙酰肼1.24-1.26g，产率约80％-83％。
然后合成叠氮丙酰肼：称取0.8-1.0g溴代丙酰肼于100mL的两口瓶中，加入30mL蒸馏水溶解；将1.2-1.4g叠氮化钠(NaN3)溶于3mL蒸馏水后，加入到上述含有溴代丙酰肼的溶液中，搅拌，于80℃下加热回流过夜，至溶液呈淡紫色澄清溶液。反应结束后，将溶液冷却至室温，用乙酸乙酯萃取水相，重复三次。合并有机相，用无水硫酸镁(MgSO4)干燥，滤去干燥剂，有机相经旋蒸浓缩。粗产物用二氯甲烷(CH2Cl2):甲醇(CH3OH)＝9:1过柱，得到无色油状液体0.42-0.43g，产率约57％-68％。
S22.酸敏感的烯丙基聚乙二醇的合成：
醛基烯丙基聚乙二醇(APEG3k-CHO)的制备，反应路线如下：
取2.9-3.1g烯丙基聚乙二醇于100mL史莱克瓶中，加入50mL二氯甲烷溶解。将90-100μL次氯酸钠水溶液加入5mL饱和碳酸氢钠水溶液中，1.9-2.1mg四甲基哌啶氮氧化物(TEMPO)、9-11mg溴化钠溶于含有次氯酸钠的碳酸氢钠水溶液中。将溶有烯丙基聚乙二醇的史莱克瓶置于冰水浴中，剧烈搅拌下缓慢滴加上述溶液，保持在-4℃下一小时内滴加完，继续反应4h。反应结束后，分液除去水相，有机相用无水硫酸镁干燥，滤去干燥剂后，旋蒸浓缩，沉淀在无水***中，抽滤得到白色固体粉末状粗产物。粉末用无水二氯甲烷重新溶解，继续沉淀在无水***中，反复沉淀，抽滤，抽干，得到白色粉末状固体1.9-2.1g，产率约65％-67％。
S23.烯丙基酸敏叠氮聚乙二醇(APEG3k-pH-N3)的制备：
反应路线如下：
取0.9-1.0g烯丙基醛基聚乙二醇(APEG3k-CHO)，溶于30mL无水二氯甲烷中，加入48-52mg叠氮丙酰肼，室温下反应过夜。反应结束后，旋蒸浓缩，沉淀在无水***中，得到白色粉末。粗产物继续溶于二氯甲烷中，继续沉淀在无水***中，如此重复四五次，得到白色粉末0.74-0.76g，产率约73％-79％。
S3.用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球的制备：
取0.49-0.51g上述巯基硅氧烷修饰的四氧化三铁(Fe3O4@SiO2-SH)超声分散于200mL无水乙醇中，加入上述合成的烯丙基酸敏叠氮聚乙二醇(APEG3k-pH-N3)0.24-0.26g，加入4.8-5.2mg光引发剂I2959，于紫外光(365nm)下，搅拌，光照反应2小时。反应结束后，用磁铁磁吸分离，弃去上层清液。继续加入50mL无水乙醇，于超声下洗涤十分钟，继续磁吸分离。如此重复四次。最后将产物于60℃下真空干燥，得到表面叠氮基团修饰的酸敏感磁性微球产物(Fe3O4@SiO2-PEG-pH-N3)0.48-0.52g，产率约90％。
上述过程中制备的溴代丙酰肼、叠氮丙酰肼和氮杂二苯并环辛炔丙酰肼的核磁谱图如图1所示。
实施例2
一种用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球Fe3O4@SiO2-PEG-pH-DBCO的制备，其中步骤S1同实施例1，步骤S2～S3如下所示：
S21氮杂二苯并环辛炔(DBCO)酰肼的制备：
反应路线如下：
取0.098-0.102g氮杂二苯并环辛炔丙酰-N-琥珀酰亚胺酯于100mL史莱克瓶中，加入30mL二氯甲烷，同时加入0.04-0.06g水合肼，于室温下搅拌过夜。反应结束后，旋蒸除去溶剂，粗产物用二氯甲烷:甲醇＝1:1过柱提纯，得到白色粉末73-76mg，产率约91％-95％。
S22烯丙基酸敏氮杂二苯并环辛炔聚乙二醇(APEG3k-pH-DBCO)的合成
反应路线如下：
取0.98-1.02g烯丙基醛基聚乙二醇(APEG3k-CHO)，溶于30mL无水二氯甲烷中，加入98-100mg氮杂二苯并环辛炔丙酰肼(DBCO)，室温下反应过夜。反应结束后，旋蒸浓缩，沉淀在无水***中，得到白色粉末，粗产物继续溶于二氯甲烷中，沉淀在无水***中，如此重复四五次，得到白色粉末0.75-0.85g，产率约77％-85％。
步骤S3同实施例1，不同之处在于将烯丙基酸敏叠氮聚乙二醇(APEG3k-pH-N3)采用烯丙基酸敏氮杂二苯并环辛炔聚乙二醇(APEG3k-pH-DBCO)替代，制备得到Fe3O4@SiO2-PEG-pH-DBCO，具体过程为：
取0.49-0.51g上述巯基硅氧烷修饰的四氧化三铁(Fe3O4@SiO2-SH)超声分散于200mL无水乙醇中，加入上述合成的烯丙基酸敏氮杂二苯并环辛炔聚乙二醇(APEG3k-pH-DBCO)0.24-0.26g，加入4.8-5.2mg光引发剂I2959，于紫外光(365nm)下，搅拌，光照反应2小时。反应结束后，用磁铁磁吸分离，弃去上层清液。继续加入50mL无水乙醇，于超声下洗涤十分钟，继续磁吸分离，如此重复四次。最后将产物于60℃下真空干燥，得到表面氮杂二苯并环辛炔(DBCO)基团修饰的酸敏感磁性微球产物(Fe3O4@SiO2-PEG-pH-DBCO)0.48-0.52g，产率约90％。
实施例1和2的制备过程中，制备的烯丙基醛基聚乙二醇(APEG3k-CHO)、APEG3k-pH-N3和APEG3k-pH-DBCO的核磁谱图如图2所示。
实施例3磁性微球的形貌表征
用傅里叶-红外光谱仪对实施例1和2制备的磁性微球进行表征，分别取两种磁性微球约1mg于0.18-0.22g溴化钾(KBr)中研磨混合均匀，取少许压片，置于Nexus 670傅里叶-红外光谱仪中进行测试，检测反应前后四氧化三铁表面基团的变化，如图3。
用透射电镜(TEM)观察磁性微球的形貌，简要操作如下：取2μL样品(0.2mg/mL)滴在纯碳膜铜网上，在室温下晾干。用透射电镜在120kV下观察(所述操作采用本领域常规技术进行检测)；检测结果如图4所示，其中，图4(A)为磁性四氧化三铁，可以看出粒径大约为250nm；图4(B)为表面巯基的四氧化三铁，可以看出粒径大约在500nm；图4(C)为酸敏感的叠氮基团修饰的磁性微球(Fe3O4@SiO2-PEG-pH-N3)，可以看出粒径大约在500nm；图4(D)为表面氮杂二苯并环辛炔(DBCO)基团修饰的酸敏感磁性微球产物(Fe3O4@SiO2-PEG-pH-DBCO)，可以看出粒径大约在1μm。
实施例4磁性微球的磁性行为和在外源磁场作用下的聚集行为
为证明实施例1和2制备所得的两种磁性微球具有良好的超顺磁性及其响应外源磁场的聚集能力，取0.98-1.02mg各步磁性微球，于室温下，使用Quantum Design MPMS XL-7磁学性质测量***，测量实施例1和2制备所得的两种磁性微球以及四氧化三铁及巯基化的四氧化三铁的磁滞回线，测定结果如图5。
从图5中可以看出，所有的磁性微球都具有很好地超顺磁性，而且，随着四氧化三铁磁性微球表面的修饰，相同质量的微球磁性降低，原因是四氧化三铁的质量分数在降低。
同时，为验证所制备的磁性微球在外源磁场的作用下能够迅速有效地富集，选用实施例2制备所得的表面氮杂二苯并环辛炔(DBCO)基团修饰的酸敏感磁性微球Fe3O4@SiO2-PEG-pH-DBCO做验证，实验组施加一个磁场强度为0.1T外加磁场，对照组完全自然沉降。结果如图6所示。
从图6中可以看出，在外源磁场的作用下，Fe3O4@SiO2-PEG-pH-DBCO磁性微球能够在5s内迅速在磁铁一侧富集，富集后溶液澄清透明；相对地，自然沉降需要2min，而且富集后溶液中仍然存在微量的磁性微球粒子；实验表明所制备的磁性微球在外源磁场的作用下能够迅速有效地富集，可以起到迅速分离富集目的蛋白的作用。
实施例5 Fe3O4@SiO2-PEG-pH-DBCO磁性微球的酸敏释放行为
所述用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球发挥作用的原理如图7所示。
实施例制备的环境敏感型磁性微球表面修饰点击反应基团，待检测蛋白采用与磁性微球上相同的点击反应基团标记，然后将信号分子连接与蛋白标记的点击反应基团相对应的点击反应基团(信号分子上连接的点击反应基团与磁性微球上的点击反应基团为一对点击反应基团对，可以发生高效率的点击反应)，则信号分子可分别与标记蛋白和磁性微球高效点击反应，将标记蛋白与磁性微球偶联，再结合磁珠自身的超顺磁性，在外源磁铁的作用下，与标记蛋白偶联后磁性微球由于磁性的吸引，被分离出反应体系，其后在一定的环境刺激下，标记蛋白与磁性微球之间的偶联被断开，标记蛋白被释放，得到的标记蛋白的纯度高，纯化过程简单，纯化效率高；同时，反应体系中剩余未标记的蛋白(尤其是抗体)还可回收并再次利用，降低了生产成本。
1、为了验证酰腙键的酸敏感释放行为，分别将N3修饰的荧光分子FITC与DBCO修饰的磁性微球结合、将DBCO修饰的荧光分子FITC与N3修饰的磁性微球结合，在不同的pH条件下，检测出释放结合的荧光分子的浓度，得到酸敏释放图，检测结果如图8所示。
具体地检测过程为：取19-21mg实施例2制备所得的表面氮杂二苯并环辛炔(DBCO)基团修饰的酸敏感磁性微球Fe3O4@SiO2-PEG-pH-DBCO，分散于4mL pH7.4PBS溶液中，加入1mg叠氮异硫氰酸酯荧光素(N3-FITC)，磁吸分离除去未反应的N3-FITC，将所得的异硫氰酸酯荧光素结合的磁性微球分别分散在4mL pH 7.4PBS溶液和4mL pH 6.0PBS溶液中；同样地，表面叠氮基团修饰的酸敏感磁性微球Fe3O4@SiO2-PEG-pH-N3与DBCO修饰的酸敏感磁性微球Fe3O4@SiO2-PEG-pH-DBCO反应，分别分散在4mL pH 7.4PBS溶液和4mL pH 6.0PBS溶液中。0.5h，1h，2h，4h，8h，12h，24h，48h分别取1mL溶液，取完后补加1mL相对应的缓冲溶液，取得的释放后的含有FITC的溶液使用日立F-4500荧光分光光度计测量荧光含量并计算其浓度，做取样时间和累积释放浓度的曲线图，如图8。
从图8中可以看出，所合成的2种酸敏感磁性微球具有良好的酸敏释放能力，能够在12h内基本释放所结合的FITC。
2、为了验证合成的酸敏感磁性微球对蛋白的酸敏感释放行为，利用DBCO修饰荧光分子FITC标记的两种蛋白(DBCO-Cas9-FITC和DBCO-BSA-FITC)与相对应的基团修饰的磁性微球结合后在不同的pH条件下，检测出释放结合的荧光分子的浓度，得到酸敏释放图，如图9。
具体地检测过程为：取19-21mg实施例1制备所得的表面叠氮基团修饰的酸敏感磁性微球Fe3O4@SiO2-PEG-pH-N3，分散于4mL pH 7.4PBS溶液中，加入0.98-1.02mg DBCO修饰荧光分子FITC标记的两种蛋白(DBCO-Cas9-FITC和DBCO-BSA-FITC)，磁吸分离除去未反应的蛋白，将所得的异硫氰酸酯荧光素标记蛋白结合的磁性微球分别分散在4mL pH 7.4PBS溶液和4mL pH 6.0PBS溶液中。0.5h，1h，2h，4h，8h，12h，24h，48h，72h分别取1mL溶液，取完后补加1mL相对应的缓冲溶液，取得的释放后的含有FITC标记的蛋白的溶液使用日立F-4500荧光分光光度计测量其荧光含量并计算浓度，做取样时间和累积释放浓度的曲线图，如图9。
从图9中可以看出，所合成的酸敏感磁性微球具有良好与表面DBCO修饰蛋白结合的能力，而且能够在微酸条件下(pH 6.0)，有效释放结合的蛋白。另外，通过酶标仪测得结合的BSA蛋白浓度约为250μg/mL，所以，结合释放的蛋白浓度约为245μg/mL，因此所合成的酸敏感磁性微球对蛋白(BSA)分离效率约为98％，表明具有很高的分离效率。
3、为了验证合成的酸敏感磁性微球对荧光微球标记蛋白的酸敏感释放行为，利用DBCO修饰荧光微球标记的两种蛋白(DBCO-Cas9-MS和DBCO-BSA-MS)与相对应的基团(-N3)修饰的磁性微球结合后在不同的pH条件下，检测出释放结合的荧光微球的浓度，得到酸敏释放图，如图10。
具体地检测过程为：取19-21mg实施例4制备所得的表面叠氮基团修饰的酸敏感磁性微球，分散于4mL pH 7.4PBS溶液中，加入0.98-1.02mg DBCO修饰荧光微球标记的两种蛋白(DBCO-Cas9-MS和DBCO-BSA-MS)，磁吸分离除去未反应的蛋白，将所得的荧光微球标记蛋白结合的磁性微球分别分散在4mL pH 7.4PBS溶液和4mL pH 6.0PBS溶液中。0.5h，1h，2h，4h，8h，12h，24h，48h分别取1mL溶液，取完后补加1mL相对应的缓冲溶液，取得的释放后的含有荧光微球标记的蛋白的溶液使用日立F-4500荧光分光光度计测量其荧光含量并计算浓度，做取样时间和累积释放浓度的曲线图，如图10。
从图10可以看出，所合成的酸敏感磁性微球具有良好回收荧光微球标记蛋白的结合能力，而且能够在低酸条件下(pH 6.0)，有效释放结合的蛋白，可以在生产过程中有效的结合与荧光微球标记的蛋白，起到分离纯化的作用。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球，其特征在于，以磁性纳米颗粒为内核，在其表层形成巯基化壳层，然后在巯基化壳层上连接环境敏感基团，并通过环境敏感基团偶联点击反应基团，即为所述用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球。
2.根据权利要求1所述用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球，其特征在于，所述磁性纳米颗粒为四氧化三铁纳米颗粒、掺杂锰元素的四氧化三铁纳米颗粒或γ-三氧化二铁纳米颗粒中的一种或多种；
所述环境敏感基团为酰腙键、腙键、亚胺键、原酸酯键或缩醛键中的一种或多种；
所述点击反应基团为氮杂二苯并环辛炔、叠氮、端基炔、马来酰亚胺、巯基或呋喃的一种或多种。
3.根据权利要求2所述用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球，其特征在于，所述磁性纳米颗粒为四氧化三铁纳米颗粒；所述环境敏感基团为酰腙键；所述点击反应基团为氮杂二苯并环辛炔或叠氮。
4.权利要求1～3所述用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将磁性纳米颗粒经巯基硅烷化试剂获得巯基化的磁性纳米颗粒；
S2.将含有环境敏感基团的物质与含有点击反应基团的物质反应，制备同时含有环境敏感基团和点击反应基团的物质；
S3.将步骤S1制备的巯基化的磁性纳米颗粒和步骤S2制备的含有环境敏感基团和点击反应基团的物质在光引发剂的作用下，经365nm紫外光照射，反应制备得到表面修饰有点击反应基团的环境敏感磁性微球。
5.根据权利要求4所述用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述磁性纳米颗粒为四氧化三铁纳米颗粒；
步骤S2中含有环境敏感基团的物质为烯丙基醛基聚乙二醇或烯丁基醛基聚乙烯醇；所述含有点击反应基团的物质为叠氮丙酰肼、叠氮乙酰肼或氮杂二苯并环辛炔乙酰肼；
步骤S3中所述光引发剂为2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮、2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮、2,4,6-三甲基苯甲酰基-二苯基氧化膦或2-二甲氨基-2-苄基-1-[4-(4-吗啉基)苯基]-1-丁酮中的一种。
6.权利要求1至3任一所述用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球在分离、纯化标记蛋白，回收为标记蛋白的检测过程用的应用。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，适用的蛋白包括抗体和蛋白类药物。
8.一种权利要求1至3任一所述用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球的应用方法，其特征在于，包括如下过程：
S4.将待检测样品中加入含有点击反应基团的物质，进行标记，得到含有标记蛋白的检测样；
S5.将信号分子表面修饰上相对应的点击反应基团物质，制备得到修饰相对应点击反应基团的信号分子；
S6.将步骤S5制备的信号分子加入到步骤S4的检测样中，然后加入权利要求1至3任一所述磁性微球，混匀反应；
S7.待反应结束后即可在外加磁场的作用下，将磁性微球从检测样中分离出来；然后置于酸性条件下释放蛋白，即可得到纯化后的蛋白。
9.根据权利要求8所述应用方法，其特征在于，步骤S4中所述含有点击反应基团的物质中的点击反应基团与磁性微球表面修饰的点击反应基团相同；
步骤S5中所述相对应的点击反应基团物质的点击反应基团与步骤S4中所述标记蛋白表面修饰的点击反应基团为一对点击反应基团。
10.根据权利要求8所述应用方法，其特征在于，步骤S4～S6在pH7.3～7.5条件下进行；步骤S7中所述酸性条件为pH5.0～6.5。
CN201910394835.2A 2019-05-13 2019-05-13 一种用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球及其制备方法和应用 Expired - Fee Related CN110152571B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910394835.2A CN110152571B (zh) 2019-05-13 2019-05-13 一种用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910394835.2A CN110152571B (zh) 2019-05-13 2019-05-13 一种用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110152571A true CN110152571A (zh) 2019-08-23
CN110152571B CN110152571B (zh) 2021-06-15

Family

ID=67634360

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910394835.2A Expired - Fee Related CN110152571B (zh) 2019-05-13 2019-05-13 一种用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110152571B (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112147335A (zh) * 2019-06-28 2020-12-29 深圳市帝迈生物技术有限公司 一种基于点击化学的标记配体组合物、试剂盒及***
CN112569878A (zh) * 2020-01-21 2021-03-30 苏州恒瑞宏远医疗科技有限公司 制备粒径均一的聚乙烯醇栓塞微球的设备及其生产工艺
CN113092784A (zh) * 2021-04-06 2021-07-09 中国科学院深圳先进技术研究院 功能化磁珠及采用其的生物正交化学的大分子一步捕获方法
CN117287191A (zh) * 2023-10-18 2023-12-26 江苏瑞石技术有限公司 一种石材矿探测装置及方法
CN117287191B (zh) * 2023-10-18 2024-06-04 江苏瑞石技术有限公司 一种石材矿探测装置及方法

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1380133A (zh) * 2002-03-13 2002-11-20 华东理工大学 一种二氧化硅磁性微球及其制备方法
US20040065969A1 (en) * 2002-10-02 2004-04-08 Jhunu Chatterjee Microencapsulation of magentic material using heat stabilization
CN1546520A (zh) * 2003-12-12 2004-11-17 上海交通大学 纳米磁性颗粒分离纯化链酶亲合素的方法
CN101279246A (zh) * 2007-12-28 2008-10-08 华侨大学 一种嗜硫性磁性复合微球的制备方法和用此复合微球分离免疫球蛋白g的方法
CN101613694A (zh) * 2009-05-31 2009-12-30 华东理工大学 一种磁性/功能化二氧化硅复合微球固定化酶及其制备方法
CN101628224A (zh) * 2009-08-14 2010-01-20 陕西北美基因股份有限公司 表面修饰二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球及其制备方法和用途
CN102049225A (zh) * 2009-10-30 2011-05-11 北京大学深圳研究生院 一种超顺磁性聚合物微球的制备方法
CN102091575A (zh) * 2009-12-14 2011-06-15 深圳先进技术研究院 四氧化三铁磁性纳米颗粒及其制备方法
CN104031201A (zh) * 2014-05-29 2014-09-10 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 一种用于生物蛋白分离的磁性微球的制备方法及其应用
CN108636305A (zh) * 2018-04-23 2018-10-12 贵州康钦承平生物科技有限公司 一种用于蛋白质分离的聚合物磁珠制备方法

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1380133A (zh) * 2002-03-13 2002-11-20 华东理工大学 一种二氧化硅磁性微球及其制备方法
US20040065969A1 (en) * 2002-10-02 2004-04-08 Jhunu Chatterjee Microencapsulation of magentic material using heat stabilization
CN1546520A (zh) * 2003-12-12 2004-11-17 上海交通大学 纳米磁性颗粒分离纯化链酶亲合素的方法
CN101279246A (zh) * 2007-12-28 2008-10-08 华侨大学 一种嗜硫性磁性复合微球的制备方法和用此复合微球分离免疫球蛋白g的方法
CN101613694A (zh) * 2009-05-31 2009-12-30 华东理工大学 一种磁性/功能化二氧化硅复合微球固定化酶及其制备方法
CN101628224A (zh) * 2009-08-14 2010-01-20 陕西北美基因股份有限公司 表面修饰二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球及其制备方法和用途
CN102049225A (zh) * 2009-10-30 2011-05-11 北京大学深圳研究生院 一种超顺磁性聚合物微球的制备方法
CN102091575A (zh) * 2009-12-14 2011-06-15 深圳先进技术研究院 四氧化三铁磁性纳米颗粒及其制备方法
CN104031201A (zh) * 2014-05-29 2014-09-10 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 一种用于生物蛋白分离的磁性微球的制备方法及其应用
CN108636305A (zh) * 2018-04-23 2018-10-12 贵州康钦承平生物科技有限公司 一种用于蛋白质分离的聚合物磁珠制备方法

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112147335A (zh) * 2019-06-28 2020-12-29 深圳市帝迈生物技术有限公司 一种基于点击化学的标记配体组合物、试剂盒及***
CN112569878A (zh) * 2020-01-21 2021-03-30 苏州恒瑞宏远医疗科技有限公司 制备粒径均一的聚乙烯醇栓塞微球的设备及其生产工艺
CN112569878B (zh) * 2020-01-21 2021-09-28 苏州恒瑞宏远医疗科技有限公司 制备粒径均一的聚乙烯醇栓塞微球的设备及其生产工艺
CN113092784A (zh) * 2021-04-06 2021-07-09 中国科学院深圳先进技术研究院 功能化磁珠及采用其的生物正交化学的大分子一步捕获方法
CN113092784B (zh) * 2021-04-06 2023-09-08 中国科学院深圳先进技术研究院 采用功能化磁珠进行生物正交化学的大分子一步捕获方法及应用
CN117287191A (zh) * 2023-10-18 2023-12-26 江苏瑞石技术有限公司 一种石材矿探测装置及方法
CN117287191B (zh) * 2023-10-18 2024-06-04 江苏瑞石技术有限公司 一种石材矿探测装置及方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN110152571B (zh) 2021-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110152571A (zh) 一种用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球及其制备方法和应用
Yang et al. Fullerene‐derivatized amino acids: synthesis, characterization, antioxidant properties, and solid‐phase peptide synthesis
Liu et al. A novel polychloromethylstyrene coated superparamagnetic surface molecularly imprinted core–shell nanoparticle for bisphenol A
Park et al. Multicolor emitting block copolymer-integrated graphene quantum dots for colorimetric, simultaneous sensing of temperature, pH, and metal ions
Cai et al. Q-graphene-scaffolded covalent organic frameworks as fluorescent probes and sorbents for the fluorimetry and removal of copper ions
CN104140431B (zh) 一种可检测、分离重金属离子的罗丹明类荧光探针及其制备方法
CN103172941A (zh) 聚苯乙烯荧光纳米颗粒及其制备和应用
CN104745193B (zh) 一种荧光磁性纳米复合材料及其制备方法
WO2009098510A2 (en) Nanoparticle conjugates
CN102866139A (zh) 基于表面等离子体增强能量转移生物传感器的构建方法
CN109540991A (zh) 功能化金属有机骨架材料、其构建的fkn传感器及其制备方法
CN109758989A (zh) 一种用于纯化组氨酸标记蛋白质的纳米磁珠的制备方法
Fuertes‐Espinosa et al. A Copper‐based Supramolecular Nanocapsule that Enables Straightforward Purification of Sc3N‐based Endohedral Metallofullerene Soots
CN107543851A (zh) 一种基于草酸银桥联三联吡啶钌纳米复合物的电化学发光传感器的制备方法及应用
CN104634973A (zh) 一种纳米金复合材料免疫传感器的制备方法及应用
CN109507419A (zh) 一种检测四环素药物的磁性上转换荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用
CN109351335A (zh) 一种磁性三叠烯-三嗪共价骨架固相萃取剂及其制备方法和应用
Li et al. Detection of Lead (II) in living cells by inducing the transformation of a supramolecular system into quantum dots
Liu et al. Research advances in preparation and application of chitosan nanofluorescent probes
CN108997258B (zh) 用于合成苯并噻二唑丙二腈的中间体及其合成方法以及检测cn-的方法
Tian et al. Tetraphenylethene-modified colorimetric and fluorescent chemosensor for Hg2+ with aggregation-induced emission enhancement, solvatochromic, and mechanochromic fluorescence features
CN101221169A (zh) 均相时间分辨荧光免疫分析螯合剂及其制备方法
Peng et al. A novel dual emission ratiometric fluorescence sensor Eu3+/CDs@ UiO-66 to achieve Cu2+ detection in water environment
CN101091911A (zh) 苏丹红ⅰ号吸附功能材料的合成方法
CN106215905A (zh) 一种磁性富勒烯分子印迹纳米复合材料的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20210615

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee