CN110129287B - 一种猪伪狂犬病毒双重超滤***及纯化方法 - Google Patents

一种猪伪狂犬病毒双重超滤***及纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种猪伪狂犬病毒双重超滤***及纯化方法，属于病毒纯化技术领域。上述猪伪狂犬病毒双重超滤***包括顺次相连的抗原混合罐、第一浓缩罐和第二浓缩罐；所述抗原混合罐与所述第一浓缩罐之间设置有一级澄清过滤器和二级微滤器；所述第一浓缩罐和第二浓缩罐之间设置有一重超滤器；所述第二浓缩罐的出口设置有二重超滤器；所述猪伪狂犬病毒双重超滤***还包括与所述抗原混合罐、第一浓缩罐和第二浓缩罐连通的PBS储罐和碱罐，用于对***进行在线清洗和灭菌。本发明***能显著减少猪伪狂犬病毒液中的不可溶固形物及可溶性杂蛋白、内毒素等，降低免疫副反应，提高病毒抗原纯度及疫苗成品质量，工艺简洁，成本低廉。

Description

一种猪伪狂犬病毒双重超滤***及纯化方法
技术领域
本发明涉及病毒纯化技术领域，具体是提供一种猪伪狂犬病毒双重超滤***及纯化方法。
背景技术
伪狂犬病（Porcine Pseudorabies）是由伪狂犬病毒（Pseudorabies Virus，PRV）引起的发生在多种家畜和野生动物体内的一种急性传染病，以发热、奇痒、脑脊髓炎为主要发病症状。成年猪常表现为隐性感染，妊娠母猪感染后可引起流产、死胎以及呼吸***疾病症状。新生仔猪感染后除了出现神经症状外，还可侵害消化***。本病呈世界性分布，猪既是本病原的原发感染宿主，又是病毒的长期贮存者和排毒者，在伪狂犬病的传播上起着重要作用，伪狂犬病给猪养殖业造成的危害仅次于猪瘟。伪狂犬病的传播和蔓延，给养殖业造成了巨大损失，全世界每年因伪狂犬病造成的经济损失高达数十亿美元，因此该病引起了世界各国的高度重视。
目前，猪伪狂犬病毒液通常采用连续流离心、死端过滤、常规超滤及层析等方法。连续流离心及死端过滤对于不可溶固形物（例如细胞碎片、大分子蛋白聚合物等）去除效果较好，但是对于可溶性小分子杂蛋白去除效果一般；层析技术可以获得纯度极高的病毒液，但是相应的成本也是较高，生产效率不高。
发明内容
为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种猪伪狂犬病毒双重超滤***及纯化方法，本发明通过在线清洗和灭菌进行无菌控制，通过两种孔径的滤芯进行澄清过滤和微滤，通过两种孔径的切向流膜包进行双重超滤，实现猪伪狂犬病毒的纯化。
为解决上述技术问题，本发明提供技术方案如下：
一方面，本发明提供一种猪伪狂犬病毒双重超滤***，包括顺次相连的抗原混合罐、第一浓缩罐和第二浓缩罐；
所述抗原混合罐与所述第一浓缩罐之间设置有一级澄清过滤器和二级微滤器；
所述第一浓缩罐和第二浓缩罐之间设置有一重超滤器；所述第二浓缩罐的出口设置有二重超滤器；
所述猪伪狂犬病毒双重超滤***还包括与所述抗原混合罐、第一浓缩罐和第二浓缩罐连通的PBS储罐和碱罐，用于对***进行在线清洗和灭菌。
进一步的，所述PBS储罐的出口处设置有除菌滤芯，然后经过一级澄清过滤器和二级微滤器与所述第一浓缩罐、第二浓缩罐、一重超滤器、二重超滤器和碱罐管道连通。
优选的，所述一级澄清过滤器为50μm孔径的滤芯；
所述二级微滤器为0.45μm孔径的滤芯；
所述一重超滤器为0.2μm孔径的切向流超滤膜包；
所述二重超滤器为300kDa孔径的切向流超滤膜包。
进一步的，所述PBS储罐、抗原混合罐、第一浓缩罐、第二浓缩罐和碱罐顶部均设置有压缩空气通入口；
进一步的，所述第一浓缩罐还连通有第一蠕动泵；
所述第二浓缩罐还连通有第二蠕动泵。
另一方面，本发明还提供一种猪伪狂犬病毒双重超滤的纯化方法，，采用上述猪伪狂犬病毒双重超滤***。
进一步的，上述猪伪狂犬病毒双重超滤的纯化方法，包括：
步骤1：组装***，然后对***进行在线清洗和在线灭菌；
步骤2：将猪伪狂犬病毒加入到抗原混合罐中，然后通过压缩空气通入口通入洁净的压缩空气提供压力，使猪伪狂犬病毒依次通过一级澄清过滤器和二级微滤器，然后进入第一浓缩罐；
步骤3：使用第一蠕动泵将猪伪狂犬病毒泵入一重超滤器中，收集透过端液体至第二浓缩罐，直至第一浓缩罐中猪伪狂犬病毒液体全部透过一重超滤器；
步骤4：向第一浓缩罐加入与猪伪狂犬病毒液体等体积的PBS溶液，使用第一蠕动泵继续收集透过端的液体至第二浓缩罐中；
步骤5：开启第二蠕动泵，使第二浓缩罐中的液体经二重超滤器，待第二浓缩罐中的液体达到要求体积后，向第二浓缩罐中加入PBS溶液，使第二浓缩罐中的液体总体积与初始相同，然后继续浓缩；重复洗滤多次，直至达到工艺要求；透过端的液体为废液，灭活后弃去；
步骤6：对第二浓缩罐中的病毒液体使用PBS进行重悬，用于后续的配苗、分装及冻干。
进一步的，所述步骤1具体为：在百级环境下，安装***，然后通过通入洁净的压缩空气检验***的气密性；然后通过将碱罐中的碱液泵入***中，进行碱水冲洗，然后在PBS储罐中加入纯化水，将纯化水泵入***中进行纯化水脱碱，然后向PBS储罐中加入PBS溶液，使用PBS溶液进行冲洗，然后使用洁净的压缩空气吹扫实现***的在线清洗和灭菌；灭菌结束后通入洁净的压缩空气，使***压力保持0.1MPa，进行无菌保持。
进一步的，所述一重超滤器和二重超滤器使用碱液循环0.5-1h灭菌，然后再用纯化水冲洗至中性，最后使用PBS溶液循环平衡1-2h排出即可。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明通过在线清洗和灭菌进行无菌控制，通过两种孔径的滤芯进行澄清过滤和微滤，通过两种孔径的切向流膜包进行双重超滤，实现猪伪狂犬病毒的纯化，克服了现有病毒纯化离心、死端过滤以及层析技术的高昂成本等问题；
（2）本发明方法可以大量降低生产成本，做到无菌控制，可显著提高疫苗产量和质量。
附图说明
图1为本发明猪伪狂犬病毒双重超滤***的示意图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
实施例1
一种猪伪狂犬病毒双重超滤***，包括顺次相连的抗原混合罐2、第一浓缩罐3和第二浓缩罐5；
抗原混合罐2与第一浓缩罐3之间设置有一级澄清过滤器9和二级微滤器10；
第一浓缩罐3和第二浓缩罐5之间设置有一重超滤器4；第二浓缩罐5的出口设置有二重超滤器7；
猪伪狂犬病毒双重超滤***还包括与抗原混合罐2、第一浓缩罐3和第二浓缩罐5连通的PBS储罐1和碱罐6，用于对***进行在线清洗和灭菌。
本发明通过在线清洗和灭菌进行无菌控制，通过两种孔径的滤芯进行澄清过滤和微滤，通过两种孔径的切向流膜包进行双重超滤，实现猪伪狂犬病毒的纯化，克服了现有病毒纯化离心、死端过滤以及层析技术的高昂成本等问题。
进一步的，PBS储罐1的出口处设置有除菌滤芯8，然后经过一级澄清过滤器9和二级微滤器10与第一浓缩罐3、第二浓缩罐5、一重超滤器4、二重超滤器7和碱罐6管道连通，便于进行在线清洗和灭菌。
优选的，一级澄清过滤器9为50μm孔径的滤芯；二级微滤器10为0.45μm孔径的滤芯；一重超滤器4为0.2μm孔径的切向流超滤膜包；二重超滤器7为300kDa孔径的切向流超滤膜包，设定不同的过滤孔径，可有效滤除病毒液中的细胞碎片、大分子蛋白聚合物和小分子杂蛋白等，获得较好的纯化效果。
进一步的，PBS储罐1、抗原混合罐2、第一浓缩罐3、第二浓缩罐5和碱罐6顶部均设置有压缩空气通入口，所述空气通入口上方设置有空气过滤器11和阀门12，用于过滤压缩空气，控制空气通断；第一浓缩罐3还连通有第一蠕动泵（未示出）；第二浓缩罐5还连通有第二蠕动泵（未示出），洁净的空气有压缩空气入口进入，进行干燥和为***提供循环动力。
PBS储罐1、抗原混合罐2、第一浓缩罐3、第二浓缩罐5和碱罐6、除菌滤芯8、一级澄清过滤器9和二级微滤器10顶部均还设置有压力表13，用于实时检测***内部压力。
实施例2
一种猪伪狂犬病毒双重超滤的纯化方法，包括：
步骤1：组装***，然后对***进行在线清洗和在线灭菌
在百级环境下，安装***，然后通过通入洁净的压缩空气检验***的气密性；然后通过将碱罐中的0.1M氢氧化钠碱液泵入***中，进行碱水冲洗，然后在PBS储罐中加入纯化水，将纯化水泵入***中进行纯化水脱碱，然后向PBS储罐中加入0.1M PBS溶液，使用0.1MPBS溶液进行冲洗，然后使用洁净的压缩空气吹扫实现***的在线清洗和灭菌；一重超滤器和二重超滤器使用0.1M氢氧化钠碱液循环0.5-1h灭菌，然后再用纯化水冲洗至中心，最后使用0.1M PBS溶液循环平衡1-2h排出即可；灭菌结束后通入洁净的压缩空气，使***压力保持0.1MPa，进行无菌保持；
步骤2：将10L猪伪狂犬病毒加入到抗原混合罐中，然后通过压缩空气通入口通入洁净的压缩空气提供压力，使猪伪狂犬病毒依次通过一级澄清过滤器和二级微滤器，然后进入第一浓缩罐；
步骤3：使用第一蠕动泵将猪伪狂犬病毒泵入一重超滤器中，收集透过端液体至第二浓缩罐，直至第一浓缩罐中猪伪狂犬病毒液体全部透过一重超滤器；
步骤4：向第一浓缩罐加入与猪伪狂犬病毒液体等体积的10L PBS溶液，使用第一蠕动泵继续收集透过端的液体至第二浓缩罐中；
步骤5：开启第二蠕动泵，使第二浓缩罐中的液体经二重超滤器，待第二浓缩罐中的液体达到5L后，向第二浓缩罐中加入15L PBS溶液，使第二浓缩罐中的液体总体积与初始相同，然后继续浓缩；重复洗滤3-5次；透过端的液体为废液，灭活后弃去；
步骤6：对第二浓缩罐中的病毒液体使用PBS进行重悬，用于后续的配苗、分装及冻干。
对上述样品以BCA蛋白浓度试剂盒进行检测，可溶性蛋白残存率为5.7-6.1%，残存率较低，证明多数被去除。
综上可知，本发明***设计合理，纯化效果较好，可显著提高疫苗的掺量和质量。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种猪伪狂犬病毒双重超滤装置，其特征在于，包括顺次相连的抗原混合罐、第一浓缩罐和第二浓缩罐；
所述抗原混合罐与所述第一浓缩罐之间设置有一级澄清过滤器和二级微滤器；
所述第一浓缩罐和第二浓缩罐之间设置有一重超滤器；所述第二浓缩罐的出口设置有二重超滤器；
所述猪伪狂犬病毒双重超滤装置还包括与所述抗原混合罐、第一浓缩罐和第二浓缩罐连通的PBS储罐和碱罐，用于对装置进行在线清洗和灭菌;
所述一级澄清过滤器为50μm孔径的滤芯；
所述二级微滤器为0.45μm孔径的滤芯；
所述一重超滤器为0.2μm孔径的切向流超滤膜包；
所述二重超滤器为300kDa孔径的切向流超滤膜包；
所述PBS储罐、抗原混合罐、第一浓缩罐、第二浓缩罐和碱罐顶部均设置有压缩空气通入口。
2.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病毒双重超滤装置，其特征在于，所述PBS储罐的出口处设置有除菌滤芯，然后经过一级澄清过滤器和二级微滤器与所述第一浓缩罐、第二浓缩罐、一重超滤器、二重超滤器和碱罐管道连通。
3.根据权利要求2所述的猪伪狂犬病毒双重超滤装置，其特征在于，所述第一浓缩罐还连通有第一蠕动泵；
所述第二浓缩罐还连通有第二蠕动泵。
4.一种猪伪狂犬病毒双重超滤的纯化方法，其特征在于，采用权利要求3所述的猪伪狂犬病毒双重超滤装置。
5.根据权利要求4所述的猪伪狂犬病毒双重超滤的纯化方法，其特征在于，包括：
步骤1：组装装置，然后对装置进行在线清洗和在线灭菌；
步骤2：将猪伪狂犬病毒加入到抗原混合罐中，然后通过压缩空气通入口不断通入洁净的压缩空气，使猪伪狂犬病毒依次通过一级澄清过滤器和二级微滤器，进入第一浓缩罐；
步骤3：使用第一蠕动泵将猪伪狂犬病毒泵入一重超滤器中，收集透过端液体至第二浓缩罐，直至第一浓缩罐中猪伪狂犬病毒液体全部透过一重超滤器；
步骤4：向第一浓缩罐加入与猪伪狂犬病毒液体等体积的PBS溶液，使用第一蠕动泵继续收集透过端的液体至第二浓缩罐中；
步骤5：开启第二蠕动泵，使第二浓缩罐中的液体经二重超滤器，待第二浓缩罐中的液体达到要求体积后，向第二浓缩罐中加入PBS溶液，使第二浓缩罐中的液体总体积与初始相同，然后继续浓缩；重复洗滤多次，直至达到工艺要求；透过端的液体为废液，灭活后弃去；
步骤6：对第二浓缩罐中的病毒液体使用PBS溶液进行重悬，用于后续的配苗、分装及冻干。
6.根据权利要求5所述的猪伪狂犬病毒双重超滤的纯化方法，其特征在于，所述步骤1具体为：在百级环境下，安装装置，通过通入洁净的压缩空气检验装置的气密性；然后将碱罐中的碱液泵入装置中，进行碱水冲洗；然后在PBS储罐中加入纯化水，将纯化水泵入装置中进行纯化水脱碱，然后向PBS储罐中加入PBS溶液，使用PBS溶液进行冲洗，然后使用洁净的压缩空气吹扫实现装置的在线清洗和灭菌；灭菌结束后通入洁净的压缩空气，使装置压力保持0.1MPa，进行无菌保持。
7.根据权利要求6所述的猪伪狂犬病毒双重超滤的纯化方法，其特征在于，所述一重超滤器和二重超滤器使用碱液循环0.5-1h灭菌，然后再用纯化水冲洗至中性，最后使用PBS溶液循环平衡1-2h排出即可。
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