CN107365362B - 一种大规模生产高纯度猪圆环病毒orf2蛋白的方法 - Google Patents

一种大规模生产高纯度猪圆环病毒orf2蛋白的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于疫苗制备技术领域，具体涉及一种大规模生产高纯度猪圆环病毒ORF2蛋白的方法。所述方法包括：取猪圆环病毒ORF2蛋白培养液，加入少量壳聚糖摇匀后自然沉降，吸取上清利用中空纤维柱澄清过滤，再利用离子交换柱进行离子交换，洗脱液经G25层析柱脱盐、除菌过滤后，即得高纯度猪圆环病毒ORF2蛋白液。本发明通过化学试剂沉降，澄清过滤，离子交换，层析柱脱盐等工艺，实现了大规模(500L～1000L)高效生产制备高纯度猪圆环病毒ORF2蛋白，高纯度猪圆环病毒ORF2蛋白的回收率可达99.46％，杂蛋白去除率高达98.04％，有效抗原含量高达93.2％。

Description

一种大规模生产高纯度猪圆环病毒ORF2蛋白的方法
技术领域
本发明属于疫苗制备技术领域，具体涉及一种大规模生产高纯度猪圆环病毒ORF2蛋白的方法。
背景技术
猪圆环病毒2型(PCV2)含有2个主要的开放阅读框，其中ORF2基因编码的病毒衣壳蛋白是主要结构蛋白，包含主要的抗原中和表位，具有良好的免疫原性，且PCV1和PCV2之间不发生血清学交叉反应，是检测病毒抗体水平的良好抗原，也是发展新型疫苗的良好靶基因。利用杆状病毒表达***在体外表达重组ORF2蛋白(28kDa)能够自我组装为病毒核衣壳样粒子，并表现出良好的免疫原性。圆环病毒ORF2蛋白具有PCV1和PCV2共同的免疫原性，是现在疫苗的趋势。
目前，针对圆环病毒的常规纯化方法主要采用抗原离心、死端过滤、膜包浓缩等方式，操作复杂，成本昂贵，并且以常规生产工艺流程制备的圆环病毒灭活疫苗在临床应用中有一定的副反应，主要与疫苗中所含的抗原外成分有关。这些成分包括：病毒培养用细胞的残留蛋白质和残留DNA；培养基残留如小牛血清；灭活剂残留；防腐剂(如硫柳汞)等。这些异源成分不仅会引起免疫动物的副反应，而且会大大降低疫苗的效力。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种大规模生产高纯度猪圆环病毒ORF2蛋白的方法。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种大规模生产高纯度猪圆环病毒ORF2蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取猪圆环病毒ORF2蛋白培养液，加入壳聚糖摇匀后自然沉降，吸取上清作为待澄清蛋白液；
(2)将步骤(1)所得待澄清蛋白液利用中空纤维柱澄清过滤，得到猪圆环病毒ORF2蛋白澄清液；
(3)将步骤(2)所得猪圆环病毒ORF2蛋白澄清液利用离子交换柱进行离子交换，随后洗脱，得到猪圆环病毒ORF2蛋白纯化洗脱液；
(4)将步骤(3)所得的猪圆环病毒ORF2蛋白纯化洗脱液利用G25层析柱脱盐，洗脱后得到猪圆环病毒ORF2蛋白纯化液；
(5)步骤(4)所得蛋白纯化液除菌过滤后，即得高纯度猪圆环病毒ORF2蛋白液。
上述方案中，步骤(1)中所述壳聚糖的加入量为猪圆环病毒ORF2蛋白培养液质量的1％～10％，更为优选地，所述壳聚糖的加入量为5％。
上述方案中，步骤(2)所述中空纤维柱的孔径为0.2μm～0.65μmm，更为优选地，所述中空纤维柱的孔径为0.2μm。
上述方案中，步骤(2)所述中空纤维柱的型号为：CFP-2-E-55；所述中空纤维柱的设备型号为VERSAFlux 120。
上述方案中，步骤(2)所述利用中空纤维柱澄清过滤的具体操作为：首先用无菌的1mol/LNaOH溶液对中空纤维柱进行循环灭菌处理，再用无菌注射水对中空纤维柱进行清洗，直至pH为6.8～7.2，然后用无菌0.01mol/LPBS溶液平衡中空纤维柱，最后将猪圆环病毒ORF2蛋白待澄清蛋白样通过中空纤维柱澄清过滤，收集透过端液体，得到猪圆环病毒ORF2蛋白澄清液。所述待澄清蛋白液利用中空纤维柱澄清过滤的过程为：先透过50％～70％待澄清蛋白液，然后补加体积与剩余待澄清蛋白液体积相同的20mmol/L Tris溶液，继续透过，待透过的体积等于加入的Tris溶液体积后，再补加体积与剩余蛋白液体积相同的20mmol/L Tris溶液，如此洗滤多次后，直至残渣不能透过，结束澄清过滤过程。
上述方案中，步骤(2)所述中空纤维柱澄清过滤时采用的TMP在2.0～3.0psi，进液端流速控制在60～80L/min。
上述方案中，步骤(3)所述离子交换柱型号为：BPG300/500Column。
上述方案中，步骤(3)所述离子交换柱的填料为Capto SP ImpRes。
上述方案中，步骤(3)所述猪圆环病毒ORF2蛋白澄清液利用离子交换柱进行离子交换的过程为：用无菌的0.5mol/L NaOH溶液对离子交换柱冲洗2个柱体积，再用无菌水冲洗直至pH为7.2～7.5，随后用20mmol/LTris溶液平衡离子交换柱至柱前柱后电导率一致(柱前和柱后的电导率都在6.5～6.6ms/cm)，pH稳定在7.0，紫外检测UV280基线平稳；然后将步骤(2)所得猪圆环病毒ORF2蛋白澄清液上样，上样结束后，用20mmol/L Tris溶液洗去未结合的杂蛋白，待UV280值下降至低于0.100AU，再用高盐溶液洗脱猪圆环病毒ORF2蛋白，紫外检测UV280值增加时开始收集洗脱液，待UV280值下降至低于0.100AU时停止收集。
上述方案中，步骤(3)所述猪圆环病毒ORF2蛋白澄清液上样的线性流速为30～100cm/h，压力控制小于2.50bar，上样量控制在70～80mg/ml BSA(填料的最大挂载量为95mg/ml BSA)；洗脱采用的高盐溶液为0.5～2mol/L NaCl溶液，洗脱流速控制在30～100cm/h。
上述方案中，步骤(4)所述G25凝胶层析柱的型号为：BPG450/1000Column。
上述方案中，步骤(4)所述G25凝胶层析柱的填料为：SepHadex G-25。
上述方案中，步骤(4)所述G25凝胶层析柱脱盐的过程为：用无菌的0.5mol/L NaOH溶液对G25凝胶层析柱冲洗2个柱体积，再用无菌水冲洗直至pH为7.2，随后用0.01mol/LPBS溶液平衡G25凝胶层析柱至柱前柱后电导率一致(柱前和柱后的电导率都在15～16ms/cm)，pH稳定在7.0，紫外检测UV280基线平稳；然后将步骤(3)所得猪圆环病毒ORF2蛋白纯化洗脱液上样，上样结束后，洗脱，待UV280值开始回升时，开始收集洗脱液，至第一洗脱峰结束停止收获洗脱液。
上述方案中，步骤(4)所述猪圆环病毒ORF2蛋白纯化洗脱液利用G25层析柱脱盐的上样线性流速为45～100cm/h，压力小于2.0bar，上样量控制在10％～30％(v/v)柱体积，洗脱采用0.01mol/L PBS溶液。
本发明的有益效果：
(1)本发明解决了猪圆环病毒ORF2蛋白难以实现高纯度下大规模生产的技术难题，通过化学试剂沉降，澄清过滤，离子交换，层析柱脱盐等工艺，实现了大规模(500L～1000L)高效生产制备高纯度猪圆环病毒ORF2蛋白，猪圆环病毒ORF2蛋白的回收率可达99.46％，杂蛋白去除率高达98.04％，有效抗原含量高达93.2％。
(2)本发明将化学试剂澄清、中空纤维澄清过滤、离子交换和G25凝胶层析柱脱盐4步整合并应用在猪圆环病毒ORF2蛋白纯化领域，根据猪圆环病毒ORF2蛋白的特性，添加壳聚糖增加细胞碎片的聚集，采用特定型号/孔径的中空纤维澄清过滤预处理，通过CaptoSPImpRes离子交换柱进一步纯化，最后采用G25凝胶层析柱脱盐，获得单一纯净的猪圆环病毒ORF2蛋白。抗原经4步纯化有效去除杂质的同时，减少抗原流失，提高了处理效率、蛋白回收率和杂蛋白去除率。
(3)本发明所述方法操作简单、成本低、处理效率高，适合工业化大规模生产并且纯化所得猪圆环病毒ORF2蛋白的纯度高，在后期疫苗配制过程中，大大减少了抗原的使用量，既节约了成本，又从根本上解决了疫苗的副反应问题，因此，具有良好的推广前景。
(4)本发明所述猪圆环病毒ORF2蛋白纯化工艺，杂蛋白去除率高达98.04％，有效抗原含量高达93.2％。使由杂蛋白引起的疫苗副反应降至更低，提高了疫苗安全性的同时保持了良好的免疫原性；由于猪圆环病毒灭活疫苗接种对象为猪群，高质量的产品大大降低接种猪群的副反应，同时为养殖户带来较高的社会效益和经济效益。
(5)本发明所述方法在相同的实验条件下，匹配相应的罐体和管道，可以进行工艺的线性放大，生产规模可以扩大到2000L、3000L、5000L，均具有可操作性。
附图说明
图1为离子交换纯化图谱。
图2为猪圆环病毒ORF2蛋白纯化全过程SDS-PAGE结果，其中1为蛋白表达原样，2为自然沉降上清，3为经0.2μm澄清过滤样，4为离子交换柱纯化后样品，5为离子交换柱纯化后样品4倍稀释样品，6为离子交换柱纯化后样品8倍稀释样品，7为G25层析柱纯化后样品，8为G25层析柱纯化后样品3倍稀释液，9为空白，M为Marker。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
以下实施例中，所用仪器如下：
中空纤维柱澄清过滤过程中中空纤维柱型号为：CFP-2-E-55。
中空纤维柱澄清过滤中空纤维柱设备型号为VERSAFlux 120。
离子交换柱型号为：BPG300/500 Column。
离子交换柱填料为：Capto SP ImpRes。
脱盐凝胶层析柱型号为：BPG450/1000 Column。
脱盐凝胶层析柱填料为：SepHadex G-25。
上述仪器均购自GE公司。
所用试剂如下：1000L猪圆环病毒培养液，由本公司生产部提供；
猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒由本公司诊断试剂部提供。
纯化所得蛋白通过SDS-PAGE法检测蛋白含量，通过双抗体夹心ELISA法测定ORF2蛋白浓度。
所述线性流速公式v＝30-100cm/h*πr2ml/min中，r表示层析柱半径。
实施例1
一、抗原澄清预处理
将无菌的壳聚糖分别以1wt％、5wt％、10wt％的比例加入到猪圆环病毒ORF2蛋白培养液中，摇匀后在4℃自然沉降，吸取上清作为待澄清蛋白样。
表1猪圆环病毒ORF2蛋白澄清预处理效果评价
样品 蛋白浓度(ug/ml) 杂蛋白去除率 浊度(FTU) 蛋白回收率
蛋白表达原样 11214 - 2000 -
1％壳聚糖 5612 85.01％ 1000 99.8％
5％壳聚糖 4321 92.12％ 300 99.1％
10％壳聚糖 3123 93.50％ 50 91％
采用A280方法检测蛋白浓度及双抗体夹心ELISA法检测有效目的蛋白含量。实验结果见表1。表1结果表明加入壳聚糖可以明显增加细胞碎片等大分子的聚集，增加蛋白样的澄清度，为后期抗原澄清奠定基础。5％的壳聚糖处理后蛋白回收率高达99.1％，杂蛋白去除率92.12％，综合杂蛋白去除率、浊度、蛋白回收率几个参数，5％的壳聚糖更适合抗原的澄清预处理。
实施例2
二、中空纤维柱澄清工艺
1***预处理
1.1将0.2μm、0.45μm、0.65μm中空纤维柱分别安装到中空纤维柱控制设备中，接通相应的管道，组装完毕后用无菌注射用水循环浸润中空纤维柱10min。
1.2***完整性检测
压力保持法检测***的完整性。
1.3***的处理
清洗及灭菌：用无菌0.5mol/L NaOH溶液对***进行循环灭菌处理30min，然后用无菌注射用水对***进行清洗，洗去残余的碱溶液，直至pH为7.0；
1.4水通量的检测
用无菌注射用水在规定的泵速下透过，计算相应温度下中空纤维柱的水通量。
1.5中空纤维柱平衡
用无菌0.01mol/L PBS溶液平衡中空纤维柱5min。
2待澄清样品的澄清过滤过程
2.1取纯悬浮SF-9细胞培养的病毒液200L，加入5％壳聚糖摇匀后沉降，吸取上清作为待澄清蛋白样；
2.2将待澄清蛋白样分别经0.2～0.65μm中空纤维柱，样品在纤维柱内循环5min后，泵速控制在40～50％(进液端流速在60～80L/min)，打开透过端，维持TMP(跨膜压)1.5～2.0psi，循环流速为78L/min，收集透过端液体；待收集透过端液体体积为170L，以2L/min流速连续补加20mmol/L Tris溶液，继续透过，待透过样品的体积等于加入的Tris溶液体积后，再补加与剩余样品等体积的20mmol/L Tris溶液，如此洗滤三次后，至残渣不能透过结束澄清过程，透过端收集的液体280L即为猪圆环病毒ORF2蛋白澄清液。
表2猪圆环病毒ORF2蛋白澄清过滤效果评价
样品 蛋白浓度(ug/ml) 杂蛋白去除率 ORF2蛋白浓度(ug/ml) 蛋白回收率
蛋白表达原样 11214 - 9.83 -
0.2um 5612 94.98％ 4.62 97.00％
0.45um 4321 96.73％ 4.3 90.49％
0.65um 4123 97.62％ 4.2 85.45％
采用A280方法检测蛋白浓度及双抗体夹心ELISA法检测有效目的蛋白含量。实验结果(见表2)。表2结果表明，经中空纤维澄清过滤后杂蛋白去除率高于94％，蛋白回收率高达97％，几乎没有损失。相较于常规的离心和死端过滤，中空纤维膜的开放式流道结构更有助于杂蛋白的透过和去除。在实际操作中0.2um孔径比0.65um孔径的中空纤维柱处理效率更高，蛋白回收率更高。结合杂蛋白去除率、蛋白回收率和操作效率，我们采用0.2um孔径中空纤维柱澄清猪圆环病毒ORF2蛋白效果更好。
实施例3离子交换柱纯化工艺
1***预处理
1.1将离子交换填料Capto SP ImpRes捣匀装入BPG300/500柱中，离子交换柱组装完毕后测柱效。
1.2用无菌0.5mol/L NaOH处理分子筛凝胶层析柱2个柱体积(CV)，再用无菌注射水清洗至pH7.5，然后用20mmol/L Tris溶液平衡离子交换柱至电导率柱前后一致(柱前和柱后电导率在6.5～6.6ms/cm)，pH稳定在7.0，紫外UV280基线平稳。
2纯化过程
将蛋白澄清液上样，设定上样线性流速为30～100cm/h，压力控制小于2.50bar，上样量控制在70～80mg/ml BSA(填料的最大挂载量为95mg/ml BSA)。待所有蛋白澄清液样品280L经离子交换柱上样完成后，用20mmol/L Tris洗未结合的杂蛋白。待UV280值下降至低于0.100AU，分别用高盐溶液0.5mol/L NaCl、1mol/L NaCl、2mol/L NaCl洗脱猪圆环病毒ORF2蛋白。待紫外UV280值增加时开始收集洗脱后样品，待UV280值下降至低于0.100AU时停止收集蛋白，继续洗脱至抗原液全部流出柱体。收集的洗脱样品即为猪圆环病毒ORF2蛋白纯化洗脱液30～35L。
表3猪圆环病毒ORF2蛋白纯化效果评价
样品 蛋白浓度(ug/ml) 杂蛋白去除率 Cap蛋白浓度(ug/ml) 蛋白回收率
蛋白表达原样 11214 - 9.83 -
0.5mol/L NaCl 3012 95.30％ 293 89.00％
1mol/L NaCl 3321 94.20％ 345 97.12％
2mol/L NaCl 3392 93.90％ 357 98.20％
采用A280方法检测蛋白浓度及双抗体夹心ELISA法检测有效目的蛋白含量，实验结果见表3。表3结果显示，不同盐离子浓度对蛋白的回收率有显著的影响。1mol/L NaCl和2mol/LNaCl洗脱过程中电荷多，更有利于目的蛋白的回收，蛋白回收率高达97％。综合考虑杂蛋白去除率和蛋白回收率，离子交换纯化采用2mol/L NaCl洗脱效果更佳。
实施例4 G25层析柱脱盐工艺
用无菌的0.5mol/L NaOH溶液对G25凝胶层析柱冲洗2个柱体积，再用无菌水冲洗直至pH为7.2，随后用0.01mol/L PBS溶液平衡G25凝胶层析柱至柱前柱后电导率一致(柱前和柱后的电导率都在15～16ms/cm)，pH稳定在7.0，紫外检测UV280基线平稳；然后将步骤(3)所得猪圆环病毒ORF2蛋白纯化洗脱液以15％柱体积上样G25层析柱脱盐，设定上样的线性流速为45～100cm/h，压力小于2.0bar，上样结束后，用0.01mol/L PBS溶液洗脱，待UV280值开始回升时，开始收集洗脱液，至第一洗脱峰结束停止收获洗脱液，洗脱后得到猪圆环病毒ORF2蛋白纯化样。G25层析柱脱盐的目的是为了将高盐的洗脱液置换为低盐的缓冲液，以利于蛋白质的稳定。
据实施例1～4确定的最优纯化工艺，具体工艺流程如下：
1预处理：纯悬浮培养的蛋白培养液加5％壳聚糖沉降后，吸取上清。
2澄清：待澄清蛋白样，经0.2μm中空纤维柱处理，得澄清后蛋白样。
3纯化：将澄清后蛋白样经离子交换柱纯化，2mol/L NaCl洗脱得猪圆环病毒ORF2蛋白洗脱液。
4脱盐：纯化后的蛋白洗脱样经G25层析柱脱盐，得猪圆环病毒ORF2蛋白纯化样。
5检测：取样后，检测蛋白浓度和ORF2蛋白含量。
据此工艺进行3批样品的试验进行对比，收集并比较数据。
试验1
1.澄清：纯悬浮培养的蛋白培养液加入5％壳聚糖摇匀后沉降，吸取上清300L，经0.2μm中空纤维柱处理，得澄清后蛋白样400L。
2.纯化：澄清蛋白样400L经离子交换柱纯化，得蛋白洗脱样40L。
3.脱盐：蛋白洗脱样经G25层析柱脱盐，得蛋白纯化样。
4.检测：取样后，检测蛋白浓度和ORF2蛋白含量。
试验2
1.澄清：纯悬浮培养的蛋白培养液加入5％壳聚糖摇匀后沉降，吸取上清400L，经0.45μm中空纤维柱处理，得澄清后蛋白样500L。
2.纯化：澄清蛋白样500L经离子交换柱纯化，得蛋白洗脱样43L。
3.脱盐：蛋白洗脱样经G25层析柱脱盐，得蛋白纯化样。
4.检测：取样后，检测蛋白浓度和ORF2蛋白含量。
试验3
1.澄清：纯悬浮培养的蛋白培养液加入5％壳聚糖摇匀后沉降，吸取上清500L，经0.65μm中空纤维柱处理，得澄清后样品600L。
2.纯化：澄清蛋白样经离子交换柱纯化，得蛋白洗脱样50L。
3.脱盐：蛋白洗脱样经G25层析柱脱盐，得蛋白纯化样。
4.检测：取样后，检测蛋白浓度和ORF2蛋白含量。
采用A280方法检测蛋白浓度及双抗体夹心ELISA法检测有效目的蛋白含量。实验结果见表4。
表4猪圆环病毒ORF2蛋白纯化对比实验结果
样品 蛋白浓度(ug/ml) 杂蛋白去除率 ORF2蛋白浓度(ug/ml) 蛋白回收率
蛋白表达原样 11214 - 9.83 -
试验1 3142 91.30％ 364 98.10％
试验2 2456 94.20％ 398 91.00％
试验3 2598 96.00％ 429 87.00％
结果显示，用本工艺制备的三批纯化后抗原，杂蛋白去除率最高可达为96.0％，蛋白回收率高达98.1％。纯化工艺稳定，可以提升蛋白浓度，减少后期成品之间的差异。对比实验还说明以0.2μm中空纤维澄清过滤和离子交换纯化是最佳的工艺组合，并且在大规模化生产中优势更明显，也是本专利最需要保护的。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所做的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种大规模生产高纯度猪圆环病毒ORF2蛋白的方法，其特征在于，包括如
下步骤：
（1）取猪圆环病毒ORF2蛋白培养液，加入壳聚糖摇匀后自然沉降，吸取上清作为待澄清蛋白液；
（2）将步骤（1）所得待澄清蛋白液利用中空纤维柱澄清过滤，得到猪圆环病毒ORF2蛋白澄清液；所述中空纤维柱的孔径为0.2μm~0.65μm；所述待澄清蛋白液利用中空纤维柱澄清过滤的具体操作过程为：先透过50%~70%待澄清蛋白液，然后补加体积与剩余待澄清蛋白液体积相同的20mmol/L Tris溶液，继续透过，待透过的体积等于加入的Tris溶液体积后，再补加体积与剩余蛋白液体积相同的20mmol/L Tris溶液，如此洗滤多次后，直至残渣不能透过，结束澄清过滤过程；
（3）将步骤（2）所得猪圆环病毒ORF2蛋白澄清液利用离子交换柱进行离子交换，随后洗脱，得到猪圆环病毒ORF2蛋白纯化洗脱液；所述离子交换柱的填料为Capto SP ImpRes；所述利用离子交换柱进行离子交换时，猪圆环病毒ORF2蛋白澄清液的上样线性流速为30~100cm/h，压力控制小于2.50bar，上样量控制在70~80mg/ml BSA；洗脱采用的洗脱液为0.5~2mol/L NaCl 溶液，洗脱流速为30~100cm/h；
（4）将步骤（3）所得的猪圆环病毒ORF2蛋白纯化洗脱液利用G25层析柱脱盐，洗脱后得到猪圆环病毒ORF2蛋白纯化液；所述G25凝胶层析柱的填料为：SepHadex G-25；所述利用G25层析柱脱盐时，猪圆环病毒ORF2蛋白纯化洗脱液的上样线性流速为45~100cm/h，压力小于2.0bar，上样量控制在10%~30%柱体积，洗脱采用的洗脱液为0.01mol/L PBS溶液；
（5）步骤（4）所得蛋白纯化液除菌过滤后，即得高纯度猪圆环病毒ORF2蛋白液。
2.根据权利要求1所述的大规模生产高纯度猪圆环病毒ORF2蛋白的方法，其
特征在于，步骤（1）中所述壳聚糖的加入量为猪圆环病毒ORF2蛋白培养液质量的1%~10%。
3.根据权利要求1所述的大规模生产高纯度猪圆环病毒ORF2蛋白的方法，
其特征在于，步骤（2）所述中空纤维柱澄清过滤时采用的TMP在2.0~3.0psi，进液端流速控制在60~80L/min。
4.根据权利要求1所述的大规模生产高纯度猪圆环病毒ORF2蛋白的方法，
其特征在于，步骤（2）所述中空纤维柱的型号为：CFP-2-E-55；步骤（3）所述离子交换柱的型号为：BPG300/500 Column；步骤（4）所述G25凝胶层析柱的型号为：BPG450/1000Column。
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