CN110129217B - 一种提高乳酸菌耐热性能的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于乳酸菌加工技术领域，具体涉及一种提高乳酸菌耐热性能的方法及应用，将乳酸菌在合适的条件下进行酸应激及温度应激后，加入至菌体保护剂，可大幅度提到乳酸菌的耐热能力，与原始菌株相比，处理后的乳酸菌的耐热性提升了80多倍，是一种非常适合于大范围推广的方法。

Description

一种提高乳酸菌耐热性能的方法及应用

技术领域

本发明属于乳酸菌加工技术领域，具体涉及一种提高乳酸菌耐热性能的方法及应用。

背景技术

乳酸菌是能够产乳酸的一类革兰氏阳性菌，是最重要的工业微生物，在食品加工中有广泛的应用。大多数乳酸菌具有益生作用，可促进机体的新陈代谢，帮助消化吸收，抑制外源病菌，能很好的调节肠道菌群比例，改善肠道微生态环境，从而预防和治疗疾病。

有研究结果表明，在乳酸菌的培养过程中加入一定浓度的Ca²⁺，可提高细胞膜的稳定性，使其在热环境中不易被破坏，保护细胞活性。紫外诱变等物理诱变方法在提高乳酸菌耐热性方面均有广泛的应用，从基因层面上细菌进行处理，得到一株转录表达发生变化的菌株。胁迫应激可提高乳酸菌胁迫相关蛋白的表达，如热休克蛋白等，进而提高乳酸菌的耐热性。据文献报道，乳酸菌的耐热性的强弱与其货架期成正比。因此提高乳酸菌的耐热性将极大程度上解决乳酸菌菌粉的制备和储藏问题。

热休克蛋白作为乳酸菌抵抗热胁迫的主要蛋白，可以修复和清理由热损伤导致的蛋白变性，维持细胞膜的稳定性来保持细胞活性，目前主要通过胁迫应激来提高热休克蛋白的表达量。对瑞士乳杆菌进行温度预适应，在52℃下水浴处理20min后，耐热性提高了11倍。耐热性提高并不明显。有人对无醇啤酒中细菌的耐热性进行了分析，发现含有5％(v/v)乙醇的啤酒中细菌的耐热普遍高于无醇啤酒，其中乳酸菌类的耐热性提高了4-7倍，致病菌的耐热性提高了3-17倍。

目前，国内外对微生态制剂的研究有了较大的投入。常见的制备方式包括喷雾干燥，冷冻干燥等干燥方式。干燥通常指的是将湿料加热，排出挥发性的水分，得到的固态产物的过程中。但在其生产和储藏的过程中常常面临热，高渗透压等胁迫环境，导致活菌数降低。通过单一的胁迫应激对提高耐热性的作用效果不强，在实际应用中优势得不到明显的体现。在乳酸菌耐热性的研究中，不仅要关注蛋白和转录水平，更要和外界保护作用相结合，极大程度上提高乳酸菌的耐热性。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种提高乳酸菌耐热性能的方法，该方法有效的提高了乳酸菌的耐热性，从而提高乳酸菌在干燥过程中的存活率和保藏期间的稳定性。

本发明的另一个目的在于提供了一种提高乳酸菌耐热性能的方法的应用。

为实现上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种提高乳酸菌耐热性能的方法，包括下述步骤：

1)选择发酵对数期后期的乳酸菌，离心重悬于生理盐水，调节为pH3-6酸压力应激0.5-1.5h；

2)将步骤1)处理的菌株离心重悬于生理盐水，37-50℃水浴0.5-3h；

3)将步骤2)处理后的菌株离心，重悬于菌株保护剂；

所述的菌株保护剂：葡萄糖2.0-2.2％；蛋白胨1.2-1.4％，牛肉粉0.9-1.0％；吐温-80 0.1-0.12％；硫酸镁0.02-0.024％；柠檬酸铵0.20-0.24％，其余为水，以上均为质量百分比。

以上所述的方法中，优选的，第1)和2)的方法包括下述步骤：

1)选择发酵对数期后期的乳酸菌，离心重悬于生理盐水，调节为pH3-4酸压力应激0.5-1.0h；

2)将步骤1)处理的菌株离心重悬于生理盐水，40-50℃水浴2-3h；

以上所述的方法中，优选的，所述的菌株保护剂：葡萄糖2.0％；蛋白胨1.2％，牛肉粉1.0％；吐温-80 0.1％；硫酸镁0.02％；柠檬酸铵0.2％，以上均为质量百分比。

以上所述的方法中，优选的，所述的乳酸菌为：约氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌，干酪乳杆菌；

以上所述的方法中，最佳的，所述的乳酸菌为：干酪乳杆菌(干酪乳杆菌固态发酵及干燥工艺研究，谢贻天，2013)。

一种提高乳酸菌耐热性能的方法的应用，包括利用本发明的方法制备出的乳酸菌用于乳酸菌的保藏或运输。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

采用本发明的方法，可使乳酸菌耐热性能提高，使干燥和储藏期间乳酸菌的活性和稳定性有所提升。保证乳酸菌生理功能的有效发挥，扩大其应用范围。

本发明除了利用胁迫应激的方式提高乳酸菌的耐热性，同时提供了一种适用于乳酸菌的菌株保护剂，使得最终的耐热性有大幅提高。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

一种提高乳酸菌耐热性能的方法，包括下述步骤：

本实施例涉及到的斜面培养基，种子培养基以及发酵培养基均为MRS；

1)种子液的制备：将-80℃冷冻保藏的乳酸菌在固态培养基上划线活化，挑取单菌落接种于MRS液态培养基中，37℃培养16h后，以2％(v/v)的接种量接种至种子培养基中，培养12h作为种子液；将种子液以2％(v/v)接种量接种新鲜MRS培养基中，37℃下静置培养15h，此时菌浓度为1.23×10⁹CFU/ml。对该起始菌株检测其耐热性，存活率为0.62％。；所述的乳酸菌为：干酪乳杆菌(干酪乳杆菌固态发酵及干燥工艺研究，谢贻天，2013)。

2)将步骤1获得的乳酸菌液8000rpm，室温离心4min，生理盐水洗涤两次；

3)生理盐水重悬上述菌体，浓度为10⁹CFU/ml，并调节悬浮液至pH4，酸压力应激下0.5h后，检测其耐热性，存活率为2.24％，耐热性能提高3.62倍；

4)将酸压力处理后的菌液8000rpm再次离心，50℃预热的生理盐水洗涤2次并重悬，菌浓度为10⁹CFU/ml，50℃水浴处理3h后，对该菌株检测其耐热性，存活率为13.20％，耐热性能提高21.28倍。

以上所述的耐热性能的评价方法：将发酵细胞液离心并用生理盐水洗涤，除去发酵液对耐热性的影响，37℃预热的生理盐水重悬，置于58℃下水浴加热10min，立即冰上5min，用稀释点样法放测定活菌数，计算出存活率。

5)离心得到上述压力应激后的乳酸菌，重悬于37℃预热的菌体保护剂中；

所述的菌体保护剂为：葡萄糖2.0％；蛋白胨1.2％，牛肉粉1.0％；吐温-80 0.1％；硫酸镁0.02％；柠檬酸铵0.2％，以上均为质量百分比。

6)调节菌悬液浓度为10¹⁰CFU/ml，，置于58℃下水浴加热10min，立即冰上5min，用稀释点样法放测定活菌数，计算出存活率，存活率为53.44％，耐热性能提高86.20倍。

7)将步骤6)处理得到菌液以料水比(质量比)为2:1的比例添加麸皮粉，混合均匀，菌数为2.43×10⁹CFU/g，含水率为39％。置于鼓风干燥箱中：干燥温度为55℃，干燥时长为0.5h。干燥后含水率为5.08％，活菌数为7.37×10⁸CFU/g，干燥后存活率为30.29％。

8)将得到的乳酸菌菌粉置于玻璃干燥器中，4℃下保藏60d，存活菌数为7.05×10⁸CFU/g，存活率为95.65％。

稀释点样法：将菌菌悬液分别稀释10⁴，10⁵，10⁶，10⁷倍，使用涡旋仪充分混匀。取10ul稀释后的样品于MRS固态平板上，37℃培养48h后计数。

Claims (4)

1.一种提高乳酸菌耐热性能的方法，包括下述步骤：

1）选择发酵对数期后期的乳酸菌，离心重悬于生理盐水，调节为pH3-4酸压力应激0.5-1.0h；

2）将步骤1）处理的菌株离心重悬于生理盐水，40-50℃水浴2-3h；

3）将步骤2）处理后的菌株离心，重悬于菌株保护剂；

所述的菌株保护剂：葡萄糖2.0-2.2%；蛋白胨1.2-1.4%，牛肉粉0.9-1.0%；吐温-800.1-0.12%；硫酸镁0.02-0.024%；柠檬酸铵0.20-0.24%，其余为水，以上均为质量百分比；

所述的乳酸菌为干酪乳杆菌（ Lactobacillus casei ） 。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的菌株保护剂：葡萄糖2.0%；蛋白胨1.2%，牛肉粉1.0%；吐温-80 0.1%；硫酸镁0.02%；柠檬酸铵0.2%。

3.权利要求1所述的方法在干酪乳杆菌保藏中的应用。

4.权利要求1所述的方法在干酪乳杆菌运输中的应用。