CN110128538A - 一种纯化抗cd20人鼠嵌合单克隆抗体的方法 - Google Patents

一种纯化抗cd20人鼠嵌合单克隆抗体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药领域，涉及到单克隆抗体纯化技术，具体公开了一种离子交换层析纯化抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体的方法。本发明通过将离子交换层析过程中加入添加剂，并用盐调节电导显著改善了层析性能，提高了蛋白质量，降低蛋白浊度。通过本发明的技术方案，可使得目的蛋白纯度达到了99.7％以上，同时酸碱异构体、其他杂质成分和含量很好的控制在抗体的质量要求之内。本发明操作简单，成本低廉，安全性高，可用于工业化大规模生产。

Description

一种纯化抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体的方法
技术领域
本发明属于医药领域，涉及到单克隆抗体的纯化技术，具体涉及一种离子交换层析纯化抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体的方法。
背景技术
CD20是非糖基化的跨膜磷酸蛋白，表达在大多数成熟B细胞表面，分化为浆细胞后，CD20消失。研究表明它可以起到钙离子通道的作用，参与B细胞分化、发育的调节。而在B细胞淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤(NHL)中的表达量异常增高，与在抗体结合后，CD20不被内在化或从细胞膜上脱落。CD20的上述特点使其成为利用单克隆抗体治疗B细胞淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤(NHL)的理想靶抗原。针对这一优势，开发研制了一种抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体，其在与B细胞淋巴瘤表面的抗原结合后，可通过激活补体介导的细胞溶解及细胞毒作用从而破坏和清除肿瘤细胞。
采用重组技术，应用CHO细胞表达***，可以获得大规模的抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体，但细胞环境的多样性和培养细胞补料的加入使得获得的抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体中的杂质多样，主要包括宿主残留蛋白(HCP)核酸、酸碱异构体等，微量的杂质都会在人体内产生免疫反应，因此必须使抗体中的杂质成分和浓度控制在抗体的质量要求之内。杂质的去除适于纯化阶段，优化纯化工艺，提高纯化效率在抗体类药物生产中至关重要。
抗体药物的制造又以下游工艺最为复杂繁琐。下游工艺包含多个步骤，目前常用的是亲和层析、疏水层析、阳离子交换层析和阴离子交换层析的液相色谱分离方法。虽然都是采用这几种层析方法，但是具体的参数不同、填料选择不同都会产生完全不同的效果。
层析方法中粗纯的亲和层析柱可以通过抗体与Fc融合蛋白吸附的特异性从而吸附目的抗体而除去90％以上的细胞上清中的杂质，因此在蛋白A亲和层析之后还需要进行多维纯化的工艺优化。针对于亲和层析获得的抗体CD20人鼠嵌合单克隆抗体异构体、DNA的残留多等问题，对其后续的阳离子阴离子层析进行工艺优化，以求获得高质量的抗体，保证用药安全。
CN105017418A公开了一种单克隆抗体的纯化方法，(1)亲和层析，(2)调亲和层析洗脱液的pH至3.3～3.8，进行病毒灭活，(3)调节pH至中性深层过滤，(4)阴离子交换层析，(5)阳离子交换层析。通过该方法可使得目的蛋白SEC纯度达到99.6％。CN105263947A公开了一种单克隆抗体的纯化工艺，包括离心过滤和深层过滤随后再调节进行细胞分离和净化培养物上清液，亲和层析，低pH温育，中和再调节，疏水层析，超滤-渗滤，阴离子交换柱层析，纳滤、超滤、渗滤、微滤等过程；其中的抗体包括抗CD20抗体。该方法用到的疏水层析需要高浓度盐上样，盐浓度太高容易影响蛋白的结构活性，使得目的蛋白变性或沉淀，同时无法考虑酸碱异构体的去除。针对现有工艺中经过亲和层析获得的抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体含有多种杂质，影响其药效及临床用药安全，很有必要提供一种步骤简单且蛋白纯化效果更好的抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体的纯化方法。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明提供一种离子交换法纯化抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体的方法，发明人经过研究，发现采用阳离子层析和阴离子层析相结合，并优化了层析条件，可有效去除抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体中的微量杂质，从而提高了抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体的质量和稳定性。本发明的技术方案如下：
一种离子交换层析纯化抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体的方法，包括以下步骤：
(1)对亲和层析获得的样品加入添加剂，调节pH5.0～6.0；
(2)对步骤(1)得到的样品进行阳离子层析；
(3)对步骤(2)得到的样品进行阴离子层析。
优选地，步骤(1)中所述的添加剂为精氨酸，甘氨酸或甘露醇中的一种或几种；添加剂的加入量为每升样品中加0.02～0.05mol添加剂。
优选地，步骤(2)所述阳离子层析利用样品吸附洗脱模式，包括平衡、上样、洗涤、洗脱过程；阳离子层析所用的缓冲液均为含添加剂的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠的缓冲液，电导5.0-8.5mS/cm，其中所述调节电导使用盐选自氯化钠，氯化钾，氯化铵中的一种。
所述的平衡过程为利用平衡缓冲液对阳离子层析柱平衡5CV，CV表示柱体积；其中平衡缓冲液为含添加剂的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH5.0-6.0，电导5.0-7.0mS/cm)，添加剂浓度为0.02～0.05mol/L。
所述的洗涤过程为先用上述平衡缓冲液对阳离子柱进行复平衡3CV，再用洗涤缓冲液洗涤3～8CV，最后用平衡缓冲液复平衡3CV；其中所述的洗涤缓冲液为含添加剂的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH5.0～6.0，电导6.0-8.5mS/cm)，添加剂浓度为0.02～0.05mol/L。
所述的洗脱过程为用洗脱缓冲液对阳离子层析柱进行洗脱，出峰收集流出液；其中洗脱缓冲液为含添加剂的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH6.0～6.5，电导6.5-8.5mS/cm)，添加剂浓度为0.02～0.05mol/L。
优选地，步骤(3)中阴离子层析利用样品流穿模式，包括平衡、上样、洗涤过程。
所述的平衡过程所用缓冲液与阳离子层析所用洗脱缓冲液相同；所述上样过程是将阳离子层析所收集样品进行上样，出峰收集流出液；所述洗涤过程与阳离子层析洗脱过程相同，持续收集流出液至基线平稳，停止收集，所收集的样品即为抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体的原液。
优选地，一种离子交换层析纯化抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体的方法，包括以下步骤：
(1)将亲和层析获得的样品100mL，加入添加剂0.02～0.05mmol，调节pH5.0～6.0待用；
阳离子层析：
(2)平衡：用pH5.0～6.0，电导5.0～7.0mS/cm，含添加剂浓度为0.02～0.05mol/L的平衡缓冲液，对阳离子层析柱进行平衡5CV，流速为200cm/h；
(3)上样：将上述样品进行上样，流速为200cm/h；
(4)洗涤：用平衡缓冲液复平衡3CV，流速为200cm/h；再用pH5.0～6.0，电导6.0～7.0mS/cm，添加剂浓度为0.02～0.05mol/L的洗涤缓冲液对阳离子层析柱进行洗涤6CV，流速为200cm/h；然后再用平衡缓冲液复平衡3CV，流速为200cm/h；
(5)洗脱：用pH6.0～6.5，电导6.5～8.5mS/cm，添加剂浓度为0.02～0.05mol/L的洗脱缓冲液对阳离子层析柱进行洗脱，流速为200cm/h，出峰收集流出液记为CEX Pro；
阴离子层析：
(6)平衡：利用步骤(5)洗脱缓冲液平衡阴离子层析柱5CV，流速为300cm/h；
(7)上样：利用步骤(5)所得样品上样，流速为300cm/h，出峰收集流出液；
(8)洗涤：利用步骤(5)洗脱缓冲液继续洗涤阴离子层析柱，流速为300cm/h，持续收集流出液至基线平稳，收集的流出液记为AEX Pro；对实验中步骤所得样品进行分析检测。
本发明所用的阳离子交换层析填料为Capto S Impact或Sepharose HighPerformance，但不局限于此填料，其他高分辨率的阳离子交换层析填料亦适用。本发明所用的阴离子交换层析填料为Q Sepharose Fast Flow或Capto Q，但不局限于此填料，其他阴离子交换层析填料同样适用于本发明。这些填料均可通过商业途径购买到。
本发明中的抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体是体外哺乳动物细胞发酵表达而得到的，动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，单克隆抗体为IgG1类型。
本发明离子交换层析的样品是由亲和层析过程后得到的，本发明不限制亲和层析填料，例如可以是采用填料Mabselect sure，或者Mabselect sure lx等其它对Fc段具有亲和力的填料。
本发明的优点在于操作简单，方便易行，成本低廉，安全性高并可保证目的蛋白的质量，可用于工业化大规模生产。本发明所用的缓冲液为常见的缓冲体系，价格低廉，操作简单。上样过程加入精氨酸、甘氨酸或甘露醇等作为添加剂，降低了蛋白聚体的形成。而在流动相中加入盐和添加剂能够降低蛋白浊度。经过本发明的技术方案可使得抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体的蛋白纯度达到99.7％以上，同时酸碱异构体、其他杂质成分和含量很好的控制在抗体的质量要求之内，总收率达到72％以上。
具体实施方式
为了更好的理解本发明的内容，下面通过具体的实施例来进一步说明本发明的技术方案，但这些实施例并不限制本发明。
实施例中所用的原料与耗材均可通过商业途径或公知方法制备获得。实施例中所用层析***、填料及层析柱均购自GE公司，层析***为AKTAprime plus，层析柱为XK16柱。
本发明实施例中所使用的样品是CHO表达的抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体发酵液，经深层过滤后，进行蛋白A亲和层析及病毒灭活所得样品，该样品含蛋白浓度为8.0g/L，SEC纯度为91.01％，CEX(蛋白主峰65.39％、酸性峰22.01％，碱性峰12.60％)，HCP残留967ppm，DNA残留69pg/mL。实施例中所用柱子柱高均为20cm，上样蛋白量800mg，蛋白以40mg/mL载量上样。
实施例1
(1)将亲和层析获得的样品100mL，加入精氨酸3mmol，调节pH5.5待用。
阳离子层析：
填料：Sepharose High Performance
(2)平衡：用含0.02mol/L精氨酸的0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH5.5，氯化钠调节电导至5.0mS/cm)对阳离子层析柱进行平衡5CV，流速为200cm/h。
(3)上样：将上述样品进行上样，流速为200cm/h。
(4)洗涤：用平衡缓冲液复平衡3CV，流速为200cm/h；再用含0.02mol/L精氨酸的0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH5.5，氯化钠调节电导至6.0mS/cm)对阳离子层析柱进行洗涤6CV，流速为200cm/h；然后再用平衡缓冲液复平衡3CV，流速为200cm/h。
(5)洗脱：用含0.02mol/L精氨酸的0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH6.0，氯化钠调节电导至6.5mS/cm)对阳离子层析柱进行洗脱，流速为200cm/h，出峰收集流出液记为CEX Pro。
阴离子层析：
填料：Q Sepharose Fast Flow
(6)平衡：利用步骤(5)洗脱缓冲液平衡阴离子层析柱5CV，流速为300cm/h。
(7)上样：利用步骤(5)所得样品上样，流速为300cm/h，出峰收集流出液。
(8)洗涤：利用步骤(5)洗脱缓冲液继续洗涤阴离子层析柱，流速为300cm/h，持续收集流出液至基线平稳，收集的流出液记为AEX Pro。对实验中步骤所得样品进行分析检测结果见表1。
表1实施例1中阳离子层析及阴离子层析后样品分析检测结果数据表
实施例2
(1)将亲和层析获得的样品100mL，加入甘氨酸5mmol，调节pH6.0待用。
阳离子层析：
填料：Capto S Impact
(2)平衡：用含0.05mol/L的甘氨酸的0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH6.0，氯化钾调节电导至6.0mS/cm)对阳离子层析柱进行平衡5CV，流速为200cm/h。
(3)上样：将上述样品进行上样，流速为200cm/h。
(4)洗涤：用平衡缓冲液复平衡3CV，流速为200cm/h；再用含0.05mol/L甘氨酸的0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH6.0，氯化钾调节电导至7.1mS/cm)对阳离子层析柱进行洗涤7CV，流速为200cm/h；然后再用平衡缓冲液复平衡3CV，流速为200cm/h。
(5)洗脱：用含0.05mol/L的甘氨酸的0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH6.5，氯化钾调节电导至8.5mS/cm)对阳离子层析柱进行洗脱，流速为200cm/h，出峰收集流出液记为CEX Pro。
阴离子层析：
填料：Capto Q
(6)平衡：利用步骤(5)洗脱缓冲液平衡阴离子层析柱5CV，流速为300cm/h。
(7)上样：利用步骤(5)所得样品上样，流速为300cm/h，出峰收集流出液。
(8)洗涤：利用步骤(5)洗脱缓冲液继续洗涤阴离子层析柱，流速为300cm/h，持续收集流出液至基线平稳，收集的流出液记为AEX Pro。对实验中步骤所得样品进行分析检测结果见表2。
表2实施例2中阳离子层析及阴离子层析后样品分析检测结果数据表
实施例3
(1)将亲和层析获得的样品100mL，加入甘露醇2mmol，调节pH5.0待用。
阳离子层析：
填料：Capto S Impact
(2)平衡：用含0.03mol/L甘露醇的0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH5.0，氯化铵调节电导至5.5mS/cm)对阳离子层析柱进行平衡5CV，流速为200cm/h。
(3)上样：将上述样品进行上样，流速为200cm/h。
(4)洗涤：用平衡缓冲液复平衡3CV，流速为200cm/h；再用含0.03mol/L甘露醇的0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH5.0，氯化铵调节电导至7.0mS/cm)对阳离子层析柱进行洗涤3CV，流速为200cm/h；然后再用平衡缓冲液复平衡3CV，流速为200cm/h。
(5)洗脱：用含0.03mol/L甘露醇的0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH6.0，氯化铵调节电导至7.5mS/cm)对阳离子层析柱进行洗脱，流速为200cm/h，出峰收集流出液记为CEX Pro。
阴离子层析：
填料：Q Sepharose Fast Flow
(6)平衡：利用步骤(5)洗脱缓冲液平衡阴离子层析柱5CV，流速为300cm/h。
(7)上样：利用步骤(5)所得样品上样，流速为300cm/h，出峰收集流出液。
(8)洗涤：利用步骤(5)洗脱缓冲液继续洗涤阴离子层析柱，流速为300cm/h，持续收集流出液至基线平稳，收集的流出液记为AEX Pro。对实验中步骤所得样品进行分析检测结果见表3。
表3实施例3中阳离子层析及阴离子层析后样品分析检测结果数据表
实施例4
(1)将亲和层析获得的样品100mL，加入甘氨酸5mmol，调节pH6.0待用。
阳离子层析：
填料：Capto S Impact
(2)平衡：用含0.03mol/L甘氨酸的0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH6.0，氯化钠调节电导至5.5mS/cm)对阳离子层析柱进行平衡5CV，流速为200cm/h。。
(3)上样：将上述样品进行上样，流速为200cm/h。
(4)洗涤：用平衡缓冲液复平衡3CV，流速为200cm/h；再用含0.03mol/L甘氨酸的0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH6.0，氯化钠调节电导至6.5mS/cm)对阳离子层析柱进行平衡5CV，流速为200cm/h；然后再用平衡缓冲液复平衡3CV，流速为200cm/h。
(5)洗脱：用含0.03mol/L甘氨酸的0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH6.0，氯化钠调节电导至7.5mS/cm)对阳离子层析柱进行洗脱，流速为200cm/h，出峰收集流出液记为CEX Pro。
阴离子层析：
填料：Capto Q
(6)平衡：利用步骤(5)洗脱缓冲液平衡阴离子层析柱5CV，流速为300cm/h。
(7)上样：利用步骤(5)所得样品上样，流速为300cm/h，出峰收集流出液。
(8)洗涤：利用步骤(5)洗脱缓冲液继续洗涤阴离子层析柱，流速为300cm/h，持续收集流出液至基线平稳，收集的流出液记为AEX Pro。对实验中步骤所得样品进行分析检测结果见表4。
表4实施例4中阳离子层析及阴离子层析后样品分析检测结果数据表
实施例5
(1)将亲和层析获得的样品100mL，加入精氨酸5mmol，调节pH6.0待用。
阳离子层析：
填料：Capto S Impact
(2)平衡：用含0.05mol/L精氨酸的0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH6.0，氯化钠调节电导至7.0mS/cm)对阳离子层析柱进行平衡5CV，流速为200cm/h。。
(3)上样：将上述样品进行上样，流速为200cm/h。
(4)洗涤：用平衡缓冲液复平衡3CV，流速为200cm/h；再用含0.05mol/L精氨酸的0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH6.0，氯化钠调节电导至8.0mS/cm)对阳离子层析柱洗涤5CV，然后再用平衡缓冲液洗涤3CV，流速为200cm/h。
(5)洗脱：用含0.05mol/L精氨酸的0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH6.5，氯化钠调节电导至8.5mS/cm)对阳离子层析柱进行洗脱，流速为200cm/h，出峰收集流出液记为CEX Pro。
阴离子层析：
填料：Q Sepharose Fast Flow
(6)平衡：利用步骤(5)洗脱缓冲液平衡阴离子层析柱5CV，流速为300cm/h。
(7)上样：利用步骤(5)所得样品上样，流速为300cm/h，出峰收集流出液。
(8)洗涤：利用步骤(5)洗脱缓冲液继续洗涤阴离子层析柱，流速为300cm/h，持续收集流出液至基线平稳，收集的流出液记为AEX Pro。对实验中步骤所得样品进行分析检测结果见表5。
表5实施例5中阳离子层析及阴离子层析后样品分析检测结果数据表
实施例6
(1)将亲和层析获得的样品100mL，加入甘露醇5mmol，调节pH6.0待用。
阳离子层析：
填料：Capto S Impact
(2)平衡：用含0.05mol/L甘露醇的0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH6.0，氯化钠调节电导至7.0mS/cm)对阳离子层析柱进行平衡5CV，流速为200cm/h。。
(3)上样：将上述样品进行上样，流速为200cm/h。
(4)洗涤：用平衡缓冲液复平衡3CV，流速为200cm/h；再用含0.05mol/L甘露醇的0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH6.0，氯化钠调节电导至8.0mS/cm)对阳离子层析柱洗涤5CV，然后再用平衡缓冲液洗涤3CV，流速为200cm/h。
(5)洗脱：用含0.05mol/L甘露醇的0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH6.5，氯化钠调节电导至8.5mS/cm)对阳离子层析柱进行洗脱，流速为200cm/h，出峰收集流出液记为CEX Pro。
阴离子层析：
填料：Q Sepharose Fast Flow
(6)平衡：利用步骤(5)洗脱缓冲液平衡阴离子层析柱5CV，流速为300cm/h。
(7)上样：利用步骤(5)所得样品上样，流速为300cm/h，出峰收集流出液。
(8)洗涤：利用步骤(5)洗脱缓冲液继续洗涤阴离子层析柱，流速为300cm/h，持续收集流出液至基线平稳，收集的流出液记为AEX Pro。对实验中步骤所得样品进行分析检测结果见表6。
表6实施例6中阳离子层析及阴离子层析后样品分析检测结果数据表
对比实施例1
(1)将亲和层析获得的样品100mL，调节pH6.0待用。
阳离子层析：
填料：Capto S Impact
(2)平衡：用0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH6.0，氯化钠调节电导至7.0mS/cm)对阳离子层析柱进行平衡5CV，流速为200cm/h。。
(3)上样：将上述样品进行上样，流速为200cm/h。
(4)洗涤：用平衡缓冲液复平衡3CV，流速为200cm/h；再用0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH6.0，氯化钠调节电导至8.0mS/cm)对阳离子层析柱洗涤5CV，然后再用平衡缓冲液洗涤3CV，流速为200cm/h。
(5)洗脱：用0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH6.5，氯化钠调节电导至8.5mS/cm)对阳离子层析柱进行洗脱，流速为200cm/h，出峰收集流出液记为CEX Pro。
阴离子层析：
填料：Q Sepharose Fast Flow
(6)平衡：利用步骤(5)洗脱缓冲液平衡阴离子层析柱5CV，流速为300cm/h。
(7)上样：利用步骤(5)所得样品上样，流速为300cm/h，出峰收集流出液。
(8)洗涤：利用步骤(5)洗脱缓冲液继续洗涤阴离子层析柱，流速为300cm/h，持续收集流出液至基线平稳，收集的流出液记为AEX Pro。对实验中步骤所得样品进行分析检测结果见表7。
表7对比实施例1中阳离子层析及阴离子层析后样品分析检测结果数据表
对比实施例2
(1)将亲和层析获得的样品100mL，加入组氨酸5mmol，调节pH6.0待用。
阳离子层析：
填料：Capto S Impact
(2)平衡：用含0.05mol/L组氨酸的0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH6.0，氯化钠调节电导至7.0mS/cm)对阳离子层析柱进行平衡5CV，流速为200cm/h。。
(3)上样：将上述样品进行上样，流速为200cm/h。
(4)洗涤：用平衡缓冲液复平衡3CV，流速为200cm/h；再用含0.05mol/L组氨酸的0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH6.0，氯化钠调节电导至8.0mS/cm)对阳离子层析柱洗涤5CV，然后再用平衡缓冲液洗涤3CV，流速为200cm/h。
(5)洗脱：用含0.05mol/L组氨酸的0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH6.5，氯化钠调节电导至8.5mS/cm)对阳离子层析柱进行洗脱，流速为200cm/h，出峰收集流出液记为CEX Pro。
阴离子层析：
填料：Q Sepharose Fast Flow
(6)平衡：利用步骤(5)洗脱缓冲液平衡阴离子层析柱5CV，流速为300cm/h。
(7)上样：利用步骤(5)所得样品上样，流速为300cm/h，出峰收集流出液。
(8)洗涤：利用步骤(5)洗脱缓冲液继续洗涤阴离子层析柱，流速为300cm/h，持续收集流出液至基线平稳，收集的流出液记为AEX Pro。对实验中步骤所得样品进行分析检测结果见表8。
表8对比实施例2中阳离子层析及阴离子层析后样品分析检测结果数据表
对比实施例3
(1)将亲和层析获得的样品100mL，加入甘露醇1mmol，调节pH6.0待用。
阳离子层析：
填料：Capto S Impact
(2)平衡：用含0.01mol/L甘露醇的0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH6.0，氯化钠调节电导至7.0mS/cm)对阳离子层析柱进行平衡5CV，流速为200cm/h。。
(3)上样：将上述样品进行上样，流速为200cm/h。
(4)洗涤：用平衡缓冲液复平衡3CV，流速为200cm/h；再用含0.01mol/L甘露醇的0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH6.0，氯化钠调节电导至8.0mS/cm)对阳离子层析柱洗涤5CV，然后再用平衡缓冲液洗涤3CV，流速为200cm/h。
(5)洗脱：用含0.01mol/L甘露醇的0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH6.5，氯化钠调节电导至8.5mS/cm)对阳离子层析柱进行洗脱，流速为200cm/h，出峰收集流出液记为CEX Pro。
阴离子层析：
填料：Q Sepharose Fast Flow
(6)平衡：利用步骤(5)洗脱缓冲液平衡阴离子层析柱5CV，流速为300cm/h。
(7)上样：利用步骤(5)所得样品上样，流速为300cm/h，出峰收集流出液。
(8)洗涤：利用步骤(5)洗脱缓冲液继续洗涤阴离子层析柱，流速为300cm/h，持续收集流出液至基线平稳，收集的流出液记为AEX Pro。对实验中步骤所得样品进行分析检测结果见表9。
表9对比实施例3中阳离子层析及阴离子层析后样品分析检测结果数据表
对比实施例4
(1)将亲和层析获得的样品100mL，加入甘露醇10mmol，调节pH6.0待用。
阳离子层析：
填料：Capto S Impact
(2)平衡：用含0.1mol/L甘露醇的0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH6.0，氯化钠调节电导至7.0mS/cm)对阳离子层析柱进行平衡5CV，流速为200cm/h。。
(3)上样：将上述样品进行上样，流速为200cm/h。
(4)洗涤：用平衡缓冲液复平衡3CV，流速为200cm/h；再用含0.1mol/L甘露醇的0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH6.0，氯化钠调节电导至8.0mS/cm)对阳离子层析柱洗涤5CV，然后再用平衡缓冲液洗涤3CV，流速为200cm/h。
(5)洗脱：用含0.1mol/L甘露醇的0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH6.5，氯化钠调节电导至8.5mS/cm)对阳离子层析柱进行洗脱，流速为200cm/h，出峰收集流出液记为CEX Pro。
阴离子层析：
填料：Q Sepharose Fast Flow
(6)平衡：利用步骤(5)洗脱缓冲液平衡阴离子层析柱5CV，流速为300cm/h。
(7)上样：利用步骤(5)所得样品上样，流速为300cm/h，出峰收集流出液。
(8)洗涤：利用步骤(5)洗脱缓冲液继续洗涤阴离子层析柱，流速为300cm/h，持续收集流出液至基线平稳，收集的流出液记为AEX Pro。对实验中步骤所得样品进行分析检测结果见表10。
表10对比实施例4中阳离子层析及阴离子层析后样品分析检测结果数据表
对比实施例5
(1)将亲和层析获得的样品100mL，加入精氨酸5mmol，调节pH6.0待用。
阳离子层析：
填料：Capto S Impact
(2)平衡：用含0.05mol/L精氨酸的0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH6.0，氯化钠调节电导至7.0mS/cm)对阳离子层析柱进行平衡5CV，流速为200cm/h。。
(3)上样：将上述样品进行上样，流速为200cm/h。
(4)洗涤：用平衡缓冲液复平衡3CV，流速为200cm/h；再用含0.05mol/L精氨酸的0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH7.2)对阳离子层析柱洗涤5CV，然后再用平衡缓冲液洗涤3CV，流速为200cm/h。
(5)洗脱：用含0.05mol/L精氨酸的0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH6.5，氯化钠调节电导至8.5mS/cm)对阳离子层析柱进行洗脱，流速为200cm/h，出峰收集流出液记为CEX Pro。
阴离子层析：
填料：Q Sepharose Fast Flow
(6)平衡：利用步骤(5)洗脱缓冲液平衡阴离子层析柱5CV，流速为300cm/h。
(7)上样：利用步骤(5)所得样品上样，流速为300cm/h，出峰收集流出液。
(8)洗涤：利用步骤(5)洗脱缓冲液继续洗涤阴离子层析柱，流速为300cm/h，持续收集流出液至基线平稳，收集的流出液记为AEX Pro。对实验中步骤所得样品进行分析检测结果见表11。
表11对比实施例5中阳离子层析及阴离子层析后样品分析检测结果数据表
对比实施例6
(1)将亲和层析获得的样品100mL，调节pH6.5待用。
疏水层析：
填料：Capto phenyl Jmpres
(2)平衡：用0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH6.5，氯化钠调节电导大于90mS/cm)平衡层析柱5CV，流速200cm/h；
(3)上样：将上述样品用氯化钠调节电导90mS/cm进行上样，流速200cm/h；
(4)洗脱：用0.02mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH6.5，氯化钠调节电导8.5mS/cm)洗脱，收集流出液记为：HIC Pro
阴离子层析：
填料：Q Sepharose Fast Flow
(5)平衡：利用步骤(4)洗脱缓冲液平衡阴离子层析柱5CV，流速为300cm/h。
(6)上样：利用步骤(4)所得样品上样，流速为300cm/h，出峰收集流出液。
(7)洗涤：利用步骤(4)洗脱缓冲液继续洗涤阴离子层析柱，流速为300cm/h，持续收集流出液至基线平稳，收集的流出液记为AEX Pro。对实验中步骤所得样品进行分析检测结果见表12。
表12对比实施例6中阳离子层析及阴离子层析后样品分析检测结果数据表

Claims (10)

1.一种离子交换层析纯化抗CD20的人鼠嵌合单克隆抗体的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)对亲和层析获得的样品加入添加剂，调节pH5.0～6.0；
(2)对步骤(1)得到的样品进行阳离子层析，平衡、上样、洗涤、洗脱；
(3)对步骤(2)得到的样品进行阴离子层析，平衡、上样、洗涤。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的添加剂为精氨酸，甘氨酸或甘露醇中的一种或几种；添加剂的加入量为每升样品中加入0.02～0.05mol添加剂。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)阳离子层析洗涤过程为先用平衡缓冲液复平衡，再用洗涤缓冲液洗涤，最后再用平衡缓冲液复平衡。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)阳离子层析与步骤(3)阴离子层析所用的缓冲液均为含添加剂的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠的缓冲液，所述添加剂与步骤(1)所述添加剂相同；添加剂浓度为0.02～0.05mol/L，缓冲液电导5.0～8.5mS/cm。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，调节电导使用盐选自氯化钠，氯化钾，氯化铵中的一种。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)阳离子层析平衡过程所用的平衡缓冲液pH5.0～6.0，电导5.0～7.0mS/cm，添加剂浓度为0.02～0.05mol/L。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)阳离子层析洗涤过程所用的洗涤缓冲液pH5.0～6.0，电导6.0～7.0mS/cm，添加剂浓度为0.02～0.05mol/L。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)阳离子层析洗脱过程所用的缓冲液pH6.0～6.5，电导6.5～8.5mS/cm，添加剂浓度为0.02～0.05mol/L。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)阴离子层析平衡、洗涤过程所用的缓冲液与步骤(2)阳离子层析洗脱缓冲液相同。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)将亲和层析获得的样品100mL，加入添加剂0.02～0.05mmol，调节pH5.0～6.0待用；
阳离子层析：
(2)平衡：用pH5.0～6.0，电导5.0～7.0mS/cm，含添加剂浓度为0.02～0.05mol/L的平衡缓冲液，对阳离子层析柱进行平衡5CV，流速为200cm/h；
(3)上样：将上述样品进行上样，流速为200cm/h；
(4)洗涤：用平衡缓冲液复平衡3CV，流速为200cm/h；再用pH5.0～6.0，电导6.0～7.0mS/cm，添加剂浓度为0.02～0.05mol/L的洗涤缓冲液对阳离子层析柱进行洗涤6CV，流速为200cm/h；然后再用平衡缓冲液复平衡3CV，流速为200cm/h；
(5)洗脱：用pH6.0～6.5，电导6.5～8.5mS/cm，添加剂浓度为0.02～0.05mol/L的洗脱缓冲液对阳离子层析柱进行洗脱，流速为200cm/h，出峰收集流出液记为CEX Pro；
阴离子层析：
(6)平衡：利用步骤(5)洗脱缓冲液平衡阴离子层析柱5CV，流速为300cm/h；
(7)上样：利用步骤(5)所得样品上样，流速为300cm/h，出峰收集流出液；
(8)洗涤：利用步骤(5)洗脱缓冲液继续洗涤阴离子层析柱，流速为300cm/h，持续收集流出液至基线平稳，收集的流出液记为AEX Pro。
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