CN110128402B - 含吡唑环的支状荧光染料化合物 - Google Patents

含吡唑环的支状荧光染料化合物 Download PDF

Info

Publication number
CN110128402B
CN110128402B CN201910465139.6A CN201910465139A CN110128402B CN 110128402 B CN110128402 B CN 110128402B CN 201910465139 A CN201910465139 A CN 201910465139A CN 110128402 B CN110128402 B CN 110128402B
Authority
CN
China
Prior art keywords
compound
fluorescent dye
pyrazole ring
dye compound
living cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910465139.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110128402A (zh
Inventor
仉华
刘俊维
郭玉明
王亚甫
牛慧玉
程定玺
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henan Normal University
Original Assignee
Henan Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henan Normal University filed Critical Henan Normal University
Priority to CN201910465139.6A priority Critical patent/CN110128402B/zh
Publication of CN110128402A publication Critical patent/CN110128402A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110128402B publication Critical patent/CN110128402B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B57/00—Other synthetic dyes of known constitution
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1003—Carbocyclic compounds
    • C09K2211/1011—Condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1029—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing one nitrogen atom as the heteroatom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1044—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing two nitrogen atoms as heteroatoms

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

含吡唑环的支状荧光染料化合物，所述荧光染料具有通式I的结构。该类荧光染料在活细胞非线粒体内具有较低的荧光背景，在活细胞中线粒体区域内具有较强的荧光信号，且对活细胞内O2具有很强的专一性标记。这类化合物具有一定水平的水溶性，同时具有良好的细胞膜通透性。本发明的这类化合物同时还具有较低的生物毒性、光毒性、光漂白性。其光谱范围与生物样品的光谱范围有足够大的差异。

Description

含吡唑环的支状荧光染料化合物
技术领域
本发明涉及一类含吡唑环的荧光染料的制备方法以及其在气体信号分子检测中的应用，尤其对O2分子的识别和定量、动态可视化检测。
背景技术
氧气(O2)，自然界分布最广的气体分子，参与人体和动物的呼吸过程，是人体进行新陈代谢的关键物质，是人体生命活动的第一需要。除此之外，在生活中氧气存在广泛的应用，例如：冶炼工艺、化学工业、医疗保健等方面都具有发挥着重要的作用。近年来，氧气在化学和生物化学反应中发挥着重要的作用，无论是反应物还是产物，都逐渐地引起科研工作者们的主意。目前，很多疾病的发生和氧气有着密切的联系。缺氧是临床各种疾病中极常见的一类病理过程。缺氧是指因组织的氧气供应不足或用氧障碍，从而导致组织的代谢、功能和形态结构发生异常变化的病理过程。大脑、心脏等生命重要器官缺氧也是导致机体死亡的重要原因。细胞缺氧造成组织和细胞的氧含量不够，这不仅是导致疾病和癌症的基本原因，而且也会造成退化性疾病的体质，缺氧是免疫和退化性疾病的一个显著因子。癌症细胞与正常细胞最大的差异在于：癌症细胞为厌氧细胞，只有在氧气不足、血液中氧气浓度太低或自由基浓度太高时才会蔓延和***；而正常的细胞则需要充足的氧气。所有慢性疼痛、病痛都是因为缺少正常细胞生理用量之氧所致。冠心病和心脏病的原因也是心脏获得的氧气量不足导致的。近些年来，氧气在生理学和病理学领域受到广大工作者们的关注。所以建立一种简便的、快速的、有效的、灵敏的、特异性识别和定量、动态监测细胞或组织内的O2以及可对其进行定量成像的技术或方法是一项重要的工作。
由于其在生命科学和环境科学的各种应用中的重要性，人们已经致力于开发可靠的氧气检测技术，并且越来越多地关注它们。传统的氧气检测方法有滴定法，电流分析，化学发光和热释光。然而，这些传统方法存在许多的局限性，例如传感过程中的氧气消耗，相对较长的响应时间以及电极的趋势。由于光学氧传感允许对生物物体进行非侵入性测量，多个样品的并行监测和成像，因此在过去的几十年中它引起了相当大的兴趣。除此以外，很多检测技术无法穿越细胞组织外膜，无法实现实时动态的监测。近些年，荧光染料结合不断发展的显微成像技术为消除上述缺陷提供了一种可行的重要显微监测工具，以荧光染料作为核心的光学分子成像技术为O2的相关基础研究提供了一种潜在的可视化工具。目前，菲啶类(EB、PI)、吖啶类(AO)和花菁家族类(Cy、TOTO、SYTO)等荧光染料都已经成为荧光染料研究的核心对象分子。然而，这些染料也存在一些无法改变的缺点。比如：菲啶染料类中的溴化乙锭(EB)作为荧光染料具有很好的光学性质，但其具有较高的生物致癌性。更重要的是，这些传统的荧光染料在荧光稳定性、近红外定靶激发、高分辨率的暗场成像、生物样品的自发荧光干扰等方面具有很大的缺陷(Nature,1999,2:989-996.；Science,1997,275:530.；Angewandte Chemie International Edition,2001,40:2098.)。因此，设计合成并制备低/无毒性、良光稳定性、高膜通透性、高选择性识别和定量、实时动态监测活生物样品(细胞或组织)中的O2的荧光染料仍然存在巨大挑战。
发明内容
本发明的目的首先在于提供一种能够在生物样品中选择性定位、并对O2可以产生足够强烈荧光响应信号的分子。为此，本发明首先提供一类含吡唑环的支状荧光染料化合物，所述化合物具有通式Ⅰ的结构：
Figure BDA0002079205680000021
通式I中：
所述的R1，R2各自独立地选自：-H、-CN、-NH2、-OH、-(CH2)xCH3、-(CH2)xNH2、-(CH2)xCN、-(CH2)xCOOH、-(CH2)xOH、-(CH2)xOCH3、-(CH2)xCOCH3、-NH(CH2)xCH3、-(CH2OCH2)xCOOH、-(CH2OCH2)xOH、-COO(CH2)xCH3、-CH[(CH2)xCOOH]2和-CH[(CH2)xOH]2，其中x独立地选自1-8的整数；
所述的R3选自：-(C6H5)、-(C6H4)CH3、-(C6H4)(CH2)yCH3、-(C6H4)(CH2)yNH2、-(C6H4)N(CH3)2、-(C6H4)NHCH3、-(C6H4)NHCOOH、-(C6H4)N(COOH)2、-(C6H4)NHOH、-(C6H4)NH(CH2)yCH3、-(C6H4)NH2、-(C6H4)NHOH、-(C6H4)N(COOH)2、-(C6H4)NH(CH2)yNH2，其中y独立地选自1-8的整数；
所述的M选自M1～M5：
Figure BDA0002079205680000031
所述的L选自L1～L5：
Figure BDA0002079205680000032
根据本领域的通常认知，所述的-(C6H5)是苯基，-(C6H4)-是取代苯基，取代基在苯环上的位置可以是邻位、对位或者间位。
上述基团的结构式中，“---”用以表示该基团与化合物其它部分连接的饱和单键。
上述本发明的含吡唑环的支状荧光染料化合物可以在细胞和组织内对O2有强烈的荧光响应信号，并且这类荧光染料具有良好的水溶性、光稳定性以及优秀的细胞膜通透性。同时还具有较低的生物毒性、光毒性、光漂白性。其光谱范围与生物样品的光谱范围有足够大的差异，可以避免生物自发荧光的产生。基于此，本发明另一方面旨在提供上述含吡唑环的荧光染料化合物在制备气体信号分子检测试剂中的应用。其中所述的气体信号分子尤其是O2。
在气体信号分子检测中的应用。尤其优选应用于目标物为活细胞或肿瘤组织中O2活动的实时动态监测与标记。
再一方面，本发明旨在提供上述含吡唑环的荧光染料化合物的制备方法，包括如下步骤：
1)R1-M-CHO与R2-L-COCH3按摩尔比1:1-1:10反应，制备化合物R1-M-CH＝CHCO-L-R2；
反应温度为0-100℃，反应时间为1-12小时，反应溶剂选自乙醇、二氯甲烷、甲醇、丙酮、二甲基亚砜、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；
2)化合物R1-M-CH＝CHCO-L-R2与R3-NHNH2按摩尔比1:1-1:10反应，制备通式I的化合物；反应温度为0-150℃，反应时间为1-12小时，反应溶剂选自乙醇、二氯甲烷、甲醇、丙酮、二甲基亚砜、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物。
附图说明
本发明附图14幅：
图1是本发明的含吡唑环的荧光染料化合物的结构通式I。
图2是化合物A1的水溶性检测试验结果图。
图3是化合物A1在水溶液中对O2的检测试验结果图。
图4是化合物A1在活细胞内的成像试验结果图。其中，图(a)是短波长波段成像试验结果图；图(b)是长波长波段成像试验结果图。
图5是化合物A1在活细胞中对O2的检测试验结果图。其中，图(a)和图(b)分别是短波长和长波长波段未经O2处理的细胞成像结果图；图(c)和图(d)分别是短波长和长波长波段经O2处理后的细胞成像结果图。
图6是化合物A2的水溶性检测试验结果图。
图7是化合物A2在水溶液中对O2的检测试验结果图。
图8是化合物A2在活细胞内的成像试验结果图。其中，图(a)是是短波长波段成像试验结果图；图(b)是长波长波段成像试验结果图。
图9是化合物A3的光稳定性检测试验结果图。
图10是化合物A3在活细胞内的成像试验结果图。其中，图(a)是短波长波段成像试验结果图；图(b)是长波长波段成像试验结果图。
图11是化合物A3在活细胞中对O2的检测试验结果图。其中，图(a)和图(b)分别是短波长和长波长波段未经O2处理的细胞成像结果图；图(c)和图(d)分别是短波长和长波长波段经O2处理后的细胞成像结果图。
图12是化合物A4对活细胞毒性的检测试验结果图。
图13是化合物A4在活细胞内的成像试验结果图。其中：图(a)是短波长波段成像试验结果图；图(b)是长波长波段成像试验结果图。
图14是化合物A4在活细胞中对O2的检测试验结果图。其中，图(a)和图(b)分别是短波长和长波长波段未经O2处理的细胞成像结果图；图(c)和图(d)分别是短波长和长波长波段经O2处理后的细胞成像结果图。
具体实施方式
本发明主要目的在于提供一类含吡唑环的支状荧光染料，具有通式Ⅰ的结构。
通式I如附图1：
Figure BDA0002079205680000051
具体的实施方式中，所述的R1选自-H、-CN、-NH2、-OH、-(CH2)xCH3和-(CH2)xNH2；优选R1是-H、-CN、-OH或-(CH2)xCH3；尤其优选-H或-(CH2)xCH3，所述x优选1-4的整数。
另一具体的实施方式中，所述的R2选自-H、-CN、-NH2、-OH、-(CH2)xCH3和-(CH2)xNH2；优选R1是-H、-CN、-OH或-(CH2)xCH3；尤其优选-H或-(CH2)xCH3，所述x优选1-4的整数。
再一具体实施方式中，所述的R3选自-(C6H5)、-(C6H4)CH3、-(C6H4)(CH2)yCH3、-(C6H4)(CH2)yNH2和-(C6H4)N(CH3)2；优选R3为-(C6H5)、-(C6H4)CH3、-(C6H4)(CH2)yCH3或-(C6H4)(CH2)yNH2；更优选-(C6H5)、-(C6H4)CH3；其中y优选为1-4的整数。
另一方面的具体实施方式中，所述的M选自M1～M5；优选为M1、M2、M3或M5；尤其优选M2或M3。
Figure BDA0002079205680000052
再一方面的具体实施方式中，所述的L选自L1～L5，优选L1、L2、L3为L5，更优选L1或L2：
Figure BDA0002079205680000053
以上所描述的各优选技术特征可以相互组合，所得技术方案应当完全包括于本发明所述及的范围。
优选技术特征的组合，获得本发明关于荧光染料的最优选实施方式，所述的含吡唑环的荧光染料可表示为A1、A2、A3和A4：
Figure BDA0002079205680000061
另一方面，本发明进一步提供了上述含吡唑环的荧光染料的制备方法，包括如下步骤：
1)化合物R1-M-CHO与R2-L-COCH3按摩尔比1:1-1:10反应，制备化合物R1-M-CH＝CHCO-L-R2；
反应温度为0-100℃，反应时间为1-12小时，反应溶剂选自乙醇、二氯甲烷、甲醇、丙酮、二甲基亚砜、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；
具体实施方式中，所述步骤1)的反应温度优选0-80℃，更优选10-60℃，最优选20-50℃；所述的反应时间优选1-10h，更优选1-8h，最优选2-6h；所述的反应溶剂优选乙醇、二氯甲烷、甲醇、丙酮、二甲基亚砜、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物，更优选乙醇、二氯甲烷、甲醇、丙酮、二甲基亚砜、醋酸或其混合物，最优选乙醇、二氯甲烷、甲醇、丙酮或其混合物；化合物R1-M-CHO与R2-L-COCH3进行反应优选摩尔比1:1-1:7，更优选1:1-1:6，最优选1:1-1:4。
2)化合物R1-M-CH＝CHCO-L-R2与R3-NHNH2按摩尔比1:1-1：10反应，制备通式I的化合物；
反应温度为0-150℃，反应时间为1-12小时，反应溶剂选自乙醇、二氯甲烷、甲醇、丙酮、二甲基亚砜、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物。
具体实施方式中，所述步骤2)的反应温度优选10-120℃，更优选30-100℃，最优选50-90℃；所述的反应时间优选1-10h，更优选2-8h，最优选3-7h；所述的反应溶剂优选乙醇、二氯甲烷、甲醇、丙酮、二甲基亚砜、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物，更优选乙醇、二氯甲烷、甲醇、丙酮、二甲基亚砜、醋酸或其混合物，最优选乙醇、二氯甲烷、甲醇、丙酮或其混合物；化合物R1-M-CH＝CHCO-L-R2与R3-NHNH2进行反应优选摩尔比1:1-1:7，更优选1:1-1:6，最优选1:1-1:4。
对本发明采用上述方法合成的含吡唑环的荧光染料化合物，采用核磁共振谱图或质谱来确认其结构。
本发明所述的含吡唑环的荧光染料具备以下优点：
所述染料化合物引入了与O2作用的反应位点，提高了染料对活细胞和组织中O2检测和识别的特异性。
所述染料化合物具有优异的光学性能，应用于生物样品成像时具有低的生物光漂白、光损伤和生物毒性。
所述染料化合物毒副性小，原料易得，结构简单，易于制备，易产业化。
鉴于此，本发明所述的荧光染料可用于活细胞中O2信号分子的标记。除了以本文中所述的形式直接用于活细胞中O2的标记，含有本发明的荧光染料化合物的组合物也可以用于活细胞中O2的标记。所述组合物中应当包含有效量的本发明所提供的荧光染料化合物之一。另外，还可以包含生物样品染色所需要的其它组分，例如溶剂、pH调节剂等。这些组分都是本行业内已知的。上述组合物可以以水溶液形式存在，或者可以以临用前用水配制为溶液的其它合适形式存在。
本发明还提供使用上述本发明的荧光染料化合物标记和动态实时监测活细胞中O2的方法，该方法包括使所述化合物与生物样品接触的步骤。本文中使用的术语“接触”包括但不限于在溶液或固相中接触。
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
荧光染料A1的合成路线及方法：
Figure BDA0002079205680000081
(1)化合物A1-1的合成
将10mmol的化合物1-1与20mmol的1-2加入到含有6mL的3mol/L氢氧化钠水溶液的乙醇(30mL)溶液中，室温下搅拌3h。将反应产物过滤、干燥，并从乙酸乙酯/乙酸(1:1v/v)混合溶液中结晶得到黄色晶体。
(2)化合物A1的合成
将3mmol的A1-1与9mmol的苯肼加入到含有37％HCl的乙醇(40mL)溶液中。将混合物在78℃下搅拌回流6h，得到黄色固体。分离粗产物，并从乙酸乙酯中重结晶得到亮黄色固体。产率：80％；
(3)化合物A1的表征
1H NMR(CDCl3)：8.57-8.48(m,3H)，8.31(q，2H)，8.11(t,1H)，7.99(t,1H)，7.78(d，1H)，7.63(t，1H)，7.37(m，2H)，6.98(m，4H)，6.67(d,.2H),5.19(t，1H)，3.92-3.67(d，2H)。
实施例2
荧光染料化合物A1的水溶性检测试验
将上述实施例中合成的荧光染料化合物A1配成母液，移取不同体积母液加入到水中，配制成浓度分别为1、3、5、7、9、11、13、15和17μM的化合A1的水溶液；依次测定在这些不同浓度下A1水溶液的最大吸收波长下的吸光度。测试结果为图2，结果显示：当化合物A1浓度大于15μM时，吸光度值线性发生偏移，即荧光染料化合物A1在水中的最大溶解度为15μM。
本实施例所用仪器为Agilent 8453紫外分光光度计。
实施例3
荧光染料A1在水溶液中对O2的检测试验
移取上述实施例中合成的荧光染料化合物A1配成的母液于3mL石英比色皿中，依次通入不同体积的O2(0uL，40uL，80uL,120uL，160uL)，测定不同体积O2条件下的发射光谱。结果如图3所示：随着通入O2体积的增加，长波长荧光强度逐渐降低，短波长荧光强度逐渐增高。图3为不同体积O2作用下A1的荧光光谱变化。
实施例4
荧光染料A1在活细胞内的成像试验
选取HepG 2细胞作为研究对象。以终浓度为15.0μM的上述实施例合成的荧光染料化合物A1，在37℃，5％CO2的条件下孵育HepG 2细胞0.5h。然后进行激光共聚焦成像试验。选取代表性区域，用油镜(60×)观察，重复三次，采集波段为410-490nm和500-600nm的荧光。测试结果如图4，其中图4a荧光采集波段为410-490nm，并表现出较强的荧光信号；图4b荧光采集波段为500-600nm，荧光信号强度较弱。结果表明：荧光染料化合物A1可用于HepG 2细胞的成像试验。
实施例5
荧光染料化合物A1对活细胞中对O2的检测试验
选取HepG 2细胞作为研究对象。以终浓度为15.0μM的上述实施例合成的荧光染料化合物A1，在37℃，5％CO2的条件下孵育HepG2细胞0.5h。实验组中通入40μL O2孵育0.5h后。激光共聚焦成像。选取代表性区域，用油镜(60×)观察，重复三次(荧光采集波段为410-490nm和500-600nm)。激发波长为373nm。
实验结果如图5所示，图5a和图5b分别为对照组，荧光染料化合物A1在对照组(图5a)中短波长处(410-490nm)有明显而强荧光信号，而在长波长处(图5b,500-600nm)有且较弱的荧光信号。当在实验组内(图5c和5d)通入O2后，荧光染料分子A1与O2反应，随着反应的进行，在短波长(410-490nm，图5c)处的荧光信号明显增强，而在长波长处的荧光明显减弱(500-600nm,图5d)。此实验结果表明荧光染料化合物A1在活细胞内可对O2进行识别成像。
实施例6
荧光染料A2的合成路线及方法：
Figure BDA0002079205680000101
(1)化合物A2-1的合成
将10mmol的化合物1-1与20mmol的1-2加入到含有6mL的3mol/L氢氧化钠水溶液的乙醇(30mL)溶液中，室温下搅拌3h。将反应产物过滤、干燥，并从乙酸乙酯/乙酸(1:1v/v)混合溶液中结晶得到黄色晶体。
(2)化合物A2的合成
将3mmol的A2-1与9mmol的苯肼加入到含有37％HCl的乙醇(40mL)溶液中。将混合物在78℃下搅拌回流6h，得到黄色固体。分离粗产物，并从乙酸乙酯中重结晶得到亮黄色固体。产率：80％。
(3)化合物A2的表征
1H NMR(CDCl3)：8.57-8.48(m,3H)，8.31(q，2H)，8.11(t,1H)，7.99(t,1H)，7.78(d，1H)，7.63(t，1H)，7.19(m，2H)，6.98(m，4H)，6.95(s,3H),6.83(d,.2H),5.19(t，1H)，3.92-3.67(d，2H)。
实施例7
荧光染料化合物A2的水溶性检测试验
将上述实施例中合成的荧光染料化合物A2配成母液，移取不同体积母液加入到水中，配制成浓度分别为1、3、5、7、9、11、13、15、17、19和21μM的化合A2的水溶液，测定在不同浓度下A2水溶液的最大吸收波长下的吸光度。测试结果为图6，结果显示：当化合物A2浓度大于19μM时，吸光度值线性发生偏移，即荧光染料化合物A2在水中的最大溶解度为19μM。
本实施例所用仪器为Agilent 8453紫外分光光度计。
实施例8
荧光染料A2在水溶液中对O2的检测试验
移取上述实施例合成的荧光染料化合物A2配成的母液于含有3mL水的石英比色皿中，依次通入不同体积的O2(0uL，40uL，80uL,120uL，160uL)，测定不同体积O2条件下的发射光谱。结果如图7所示：随着通入O2体积的增加，长波长荧光强度逐渐降低，短波长荧光强度逐渐增高。图7显示了不同体积O2作用下A2的荧光光谱变化。
实施例9
荧光染料A2在活细胞内的成像试验
选取HepG 2细胞作为研究对象。以终浓度为15.0μM的上述实施例合成的荧光染料化合物A2，在37℃，5％CO2的条件下孵育HepG 2细胞0.5h。然后进行激光共聚焦成像试验。选取代表性区域，用油镜(60×)观察，重复三次，采集波段为410-490nm和500-600nm的荧光。测试结果如图8，其中图8a荧光采集波段为410-490nm，并表现出较强的荧光信号；图8b荧光采集波段为500-600nm，荧光信号强度较弱。结果表明：荧光染料化合物A2可用于HepG 2细胞的成像试验。
实施例10
荧光染料A3的合成路线及方法：
Figure BDA0002079205680000111
(1)化合物A3-1的合成
将10mmol的化合物1-1与20mmol的1-2加入到含有6mL的3mol/L氢氧化钠水溶液的乙醇(30mL)溶液中，室温下搅拌3h。将反应产物过滤、干燥，并从乙酸乙酯/乙酸(1：1v/v)混合溶液中结晶得到黄色晶体。
(2)化合物A3的合成
将3mmol的A3-1与9mmol的苯肼加入到含有37％HCl的乙醇(40mL)溶液中。将混合物在78℃下搅拌回流6h，得到黄色固体。分离粗产物，并从乙酸乙酯中重结晶得到亮黄色固体。产率：80％。
(3)化合物A3的表征
1H NMR(CDCl3)：9.50(s,1H)，9.42(d，2H)，8.12(d,1H)，7.82(d,1H)，7.55(t，1H)，7.19(t，2H)，6.97-6.91(d,3H),6.83(d,2H),5.19(t,1H),3.92-3.67(d，2H),3.05(t,2H),1.68(q,2H),0.95(t,3H)。
实施例11
荧光染料化合物A3的光稳定性检测试验
移取一定体积的上述实施例合成的荧光染料化合物A3配成的母液于含有3mLDMSO的四通石英比色皿中，使其终浓度为10μM。测定其在不同时间(0.5h、1.0h、1.5h、2h、3h、4h、5h、6h以及7.0h)下的A3荧光光谱变化。测试结果为图9，结果显示：随着照射时间的逐渐延长，化合物A3的荧光强度保持不变，时间可持续7.0h。
所用仪器为Agilent荧光分光光度计。
实施例12
荧光染料A3在活细胞内的成像试验
选取HepG 2细胞作为研究对象。以终浓度为15.0μM的上述实施例合成的荧光染料化合物A3，在37℃，5％CO2的条件下孵育HepG 2细胞0.5h。然后进行激光共聚焦成像试验。选取代表性区域，用油镜(60×)观察，重复三次，采集波段为410-490nm和500-600nm的荧光。测试结果如图10，其中图10a荧光采集波段为410-490nm，并表现出较强的荧光信号；图10b荧光采集波段为500-600nm，荧光信号强度较弱。结果表明：荧光染料化合物A3可用于HepG2细胞的成像试验。
实施例13
荧光染料化合物A3对活细胞中对O2的检测试验
选取HepG 2细胞作为研究对象。以终浓度为15.0μM的上述实施例合成的荧光染料化合物A3，在37℃，5％CO2的条件下孵育HepG2细胞0.5h。实验组中通入40μL O2孵育0.5h后。激光共聚焦成像。选取代表性区域，用油镜(60×)观察，重复三次(荧光采集波段为410-490nm和500-600nm)。激发波长为373nm。
实验结果如图11所示，实验结果如图11所示，图11a和图11b分别为对照组，荧光染料化合物A3在对照组(图11a)中短波长处(410-490nm)有明显而强荧光信号，而在长波长处(图11b,500-600nm)有且较弱的荧光信号。当在实验组内(图11c和11d)通入O2后，荧光染料分子A3与O2反应，随着反应的进行，在短波长(410-490nm，图11c)处的荧光信号明显增强，而在长波长处的荧光明显减弱(500-600nm,图11d)。此实验结果表明荧光染料化合物A3在活细胞内可对O2进行识别成像。
实施例14
荧光染料A4的合成路线及方法：
Figure BDA0002079205680000131
(1)化合物A4-1的合成
将10mmol的化合物1-1与20mmol的1-2加入到含有6mL的3mol/L氢氧化钠水溶液的乙醇(30mL)溶液中，室温下搅拌3h。将反应产物过滤、干燥，并从乙酸乙酯/乙酸(1：1v/v)混合溶液中结晶得到黄色晶体。
(2)化合物A4的合成
将3mmol的A4-1与9mmol的苯肼加入到含有37％HCl的乙醇(40mL)溶液中。将混合物在78℃下搅拌回流6h，得到黄色固体。分离粗产物，并从乙酸乙酯中重结晶得到亮黄色固体。产率：80％；
(3)化合物A4的表征
1H NMR(CDCl3)：8.92(s,2H)，8.01-7.97(m,3H)，7.57(t,1H)，7.49(d，2H)，7.45(d，2H)，7.25(t,1H),6.95(d,.1H),5.19(t，1H)，3.91-3.66(d，2H)，2.75(q,2H),2.35(s,3H),1.31(t,3H)。
实施例15
荧光染料化合物A4对活细胞毒性的检测试验
分别选用HepG 2和CHO细胞作为研究对象。以细胞存活率来表征染料对细胞毒性的大小。以5*104个/mL的细胞密度接种于96孔板中，每孔内的体积为100μL，在37℃5％CO2条件下培养24h。而后以终浓度(5μM，10μM，15μM，20μM)梯度加入染料分子A4于培养基中，每个梯度浓度设置5个复孔，设置空白对照，培养后检测细胞的存活率。检测时先在每孔中加入20μL 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)溶液，37℃5％CO2条件下培养4h。然后移去原有培养液并加入DMSO(150μL/孔)，而后用酶标仪测定OD值，重复三次，结果如图12所示。结果表明：上述合成的荧光染料A4对于活细胞几乎没有毒性。
实施例16
荧光染料A4在活细胞内的成像试验
选取HepG 2细胞作为研究对象。以终浓度为15.0μM的上述实施例合成的荧光染料化合物A4，在37℃，5％CO2的条件下孵育HepG2细胞0.5h。然后进行激光共聚焦成像试验。选取代表性区域，用油镜(60×)观察，重复三次，采集波段为410-490nm和500-600nm的荧光。测试结果如图13，其中图13a荧光采集波段为410-490nm，并表现出较强的荧光信号；图13b荧光采集波段为500-600nm，荧光信号强度较弱。结果表明：荧光染料化合物A4可用于HepG2细胞的成像试验。
实施例17
荧光染料化合物A4对活细胞中对O2的检测试验
选取HepG 2细胞作为研究对象。以终浓度为15.0μM的上述实施例合成的荧光染料化合物A4，在37℃，5％CO2的条件下孵育HepG2细胞0.5h。实验组中通入40μL O2孵育0.5h后。激光共聚焦成像。选取代表性区域，用油镜(60×)观察，重复三次(荧光采集波段为410-490nm和500-600nm)。激发波长为373nm。
实验结果如图14所示，图14a和图14b分别为对照组，荧光染料化合物A4在对照组(图14a)中短波长处(410-490nm)有明显而强荧光信号，而在长波长处(图14b,500-600nm)有且较弱的荧光信号。当在实验组内(图14c和14d)通入O2后，荧光染料分子A4与O2反应，随着反应的进行，在短波长(410-490nm，图14c)处的荧光信号明显增强，而在长波长处的荧光明显减弱(500-600nm,图14d)。此实验结果表明荧光染料化合物A4在活细胞内可对O2进行识别成像。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。作为荧光染料是本发明新化合物的一种用途，不能认定本发明的化合物仅用于荧光染料，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在基于本发明化合物用作荧光染料的相同作用机理的考虑下，还可以做出若干简单推理，得出本发明的化合物的其他应用用途，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.含吡唑环的支状荧光染料化合物，具有通式Ⅰ的结构：
Figure FDA0003359244040000011
通式I中：
所述的R1，R2各自独立地选自-H或-(CH2)xCH3，x选自1-4的整数；
所述的R3选自-(C6H5)或-(C6H4)CH3；
所述的M选自M2或M3：
Figure FDA0003359244040000012
所述的L选自L1或L2：
Figure FDA0003359244040000013
2.根据权利要求1所述的化合物，选自化合物A1、A2、A3和A4：
Figure FDA0003359244040000021
3.权利要求1所述的含吡唑环的荧光染料化合物的制备方法，包括如下步骤：
1)R1-M-CHO与R2-L-COCH3按摩尔比1:1-1:10反应，制备化合物R1-M-CH＝CHCO-L-R2；
反应温度为0-100℃，反应时间为1-12小时，反应溶剂选自乙醇、二氯甲烷、甲醇、丙酮、二甲基亚砜、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物；
2)化合物R1-M-CH＝CHCO-L-R2与R3-NHNH2按摩尔比1:1-1:10反应，制备通式I的化合物；
Figure FDA0003359244040000022
反应温度为0-150℃，反应时间为1-12小时，反应溶剂选自乙醇、二氯甲烷、甲醇、丙酮、二甲基亚砜、丙三醇、乙酸乙酯、醋酸或其混合物。
4.权利要求1所述的含吡唑环的支状荧光染料化合物在制备氧气信号分子检测试剂中的应用。
CN201910465139.6A 2019-05-30 2019-05-30 含吡唑环的支状荧光染料化合物 Active CN110128402B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910465139.6A CN110128402B (zh) 2019-05-30 2019-05-30 含吡唑环的支状荧光染料化合物

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910465139.6A CN110128402B (zh) 2019-05-30 2019-05-30 含吡唑环的支状荧光染料化合物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110128402A CN110128402A (zh) 2019-08-16
CN110128402B true CN110128402B (zh) 2022-03-22

Family

ID=67583080

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910465139.6A Active CN110128402B (zh) 2019-05-30 2019-05-30 含吡唑环的支状荧光染料化合物

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110128402B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114199653A (zh) * 2021-10-28 2022-03-18 济南德亨医学科技有限公司 一种***微生物免疫荧光染色液

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101548974A (zh) * 2009-05-26 2009-10-07 上海师范大学 一种具有荧光和抗癌活性的化合物及其制备和应用
CN102796045A (zh) * 2012-09-11 2012-11-28 山东大学 吡唑啉衍生物及其制备方法与应用
CN106478731A (zh) * 2016-09-07 2017-03-08 大连理工大学 一类双发射比率型氧气探针及应用
CN110054591A (zh) * 2018-12-26 2019-07-26 浙江工业大学 一种光致发光材料及其制备方法与应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101548974A (zh) * 2009-05-26 2009-10-07 上海师范大学 一种具有荧光和抗癌活性的化合物及其制备和应用
CN102796045A (zh) * 2012-09-11 2012-11-28 山东大学 吡唑啉衍生物及其制备方法与应用
CN106478731A (zh) * 2016-09-07 2017-03-08 大连理工大学 一类双发射比率型氧气探针及应用
CN110054591A (zh) * 2018-12-26 2019-07-26 浙江工业大学 一种光致发光材料及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"AN EXAMPLE OF HOW PHOTOPHYSICAL PROPERTIES CAN INFLUENCE THE MAGNITUDE OF SOLVENT REACTIONS ISOTOPE EFFECTS UPON PHOTO-OXIDATION";R. STEPHEN DAVIDSON等;《Photochemistry and Photobiology》;19841231;第40卷(第1期);第23-28页 *
"Efficient Photooxidation of Aryl(hetaryl)pyrazolines by Benzoquinone";Valery F. Traven等;《Photochemistry and Photobiology》;20190106;第95卷(第4期);第924-930页 *
"Highly efficient luminescent benzoylimino derivative and fluorescent probe from a photochemical reaction of imidazole as an oxygen sensor";Yue Yu等;《ChemComm》;20181213;第55卷;第977-980页 *
"Synthesis and Antimicrobial activity Evaluation of some Novel Pyrazolines";M. V. Jyothi等;《J. Chem. Pharm. Res.》;20121231;第4卷(第5期);第2626-2630页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110128402A (zh) 2019-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Liu et al. A new fluorescent probe with a large turn-on signal for imaging nitroreductase in tumor cells and tissues by two-photon microscopy
CN109970751B (zh) 一种双位点、高灵敏pH荧光探针及其合成与应用
CN111303102A (zh) 一种硝基还原酶响应的乏氧探针化合物及其制备与应用
CN109897625B (zh) 选择性检测半胱氨酸荧光探针及其合成方法和应用
CN112920210B (zh) 一种红光可激活的光动力治疗-化疗联用前药及其制备和应用
WO2013131235A1 (zh) 一类以萘为母体的双光子荧光探针、其制备方法及应用
CN106083888A (zh) 一种检测癌细胞内硫化氢的荧光探针
CN110128402B (zh) 含吡唑环的支状荧光染料化合物
CN107383078B (zh) 苯基硼酸酯化合物及包含该化合物的过氧化苯甲酰检测试剂盒
DE60125958T2 (de) Reagenzien zur bestimmung von atomaren sauerstoff
KR101171919B1 (ko) 티올 선택성을 갖는 플루오레세인 유도체를 포함하는 형광 센서 및 이를 이용한 티올 검출방법
CN107286151A (zh) 一种基于咔唑的双光子荧光探针及其制备方法和用途
CN108484479B (zh) 一种咔唑基双光子荧光探针及其制备方法和用途
CN109608495B (zh) 一种检测hno的化合物及其制备方法和应用
CN114736199B (zh) 一种基于亚甲基蓝的近红外荧光探针及其合成方法和应用
CN108774249B (zh) 噁嗪类化合物及其应用
CN116375692A (zh) 一种用于检测半胱氨酸的近红外荧光分子探针及其制备方法和试剂盒
CN110642772A (zh) 检测硝基还原酶的近红外比率荧光探针及制备方法和应用
CN111635385B (zh) 一种线粒体靶向的双光子激发近红外发射的硫化氢荧光探针及其制备方法和应用
CN112079858B (zh) 一种香豆素衍生物Th-HM1及其合成方法和应用
CN112538089B (zh) 近红外硅基罗丹明荧光染料、制备方法及其在线粒体脊膜原位免洗成像中的应用
CN109678888B (zh) 噁嗪类化合物及其用途
CN108840818B (zh) 一种用于检测硫化氢的比色型咔唑类荧光探针的合成与应用
CN114230494A (zh) 大斯托克斯位移近红外荧光探针的合成及其在检测硫化氢中的应用
CN115043893B (zh) 一种肝细胞靶向的次氯酸近红外荧光探针及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant