CN110117315B

CN110117315B - 一种保加利亚乳杆菌后酸化相关基因及其在酸奶中的应用

Info

Publication number: CN110117315B
Application number: CN201910507244.1A
Authority: CN
Inventors: 李晨; 田洪涛; 孙永胜; 谷新晰; 卢海强
Original assignee: Heibei Agricultural University
Current assignee: Heibei Agricultural University
Priority date: 2019-06-12
Filing date: 2019-06-12
Publication date: 2021-02-12
Anticipated expiration: 2039-06-12
Also published as: CN110117315A

Abstract

本发明公开了一种保加利亚乳杆菌参与酸奶后酸化基因及其应用。本发明通过设计引物LDB_RS05285‑F/R(Ldb1239‑F/R)，经PCR扩增后与表达载体进行连接，构建重组质粒，将重组质粒转化进入乳酸菌中，构建重组菌并测定重组菌和对照菌在酸、酸冷处理下存活率，同时将LDB_RS05285基因过表达菌株和对照菌株以相同的菌量分别接种到灭活后的酸奶中，测定酸奶贮藏期的活菌数和pH值的测定，建立了该基因的克隆、表达与功能验证的方法。该基因过量表达可以有效减弱酸奶储存过程中的后酸化问题，提高酸奶储存的稳定性，延长酸奶保质期。为解决酸奶后酸化问题提供了新的思路。

Description

一种保加利亚乳杆菌后酸化相关基因及其在酸奶中的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种保加利亚乳杆菌后酸化相关基因LDB_RS05285的克隆及其在酸奶中的应用。

背景技术

酸奶是以鲜牛奶为原料，向其中添加发酵剂和其它配料，经发酵后，再冷却灌装的一种乳制品。牛奶经乳酸菌发酵后，赋予了牛奶不曾有的功效，如缓解产生乳糖不耐症。酸奶中的益生菌还在改善人体胃肠道功能、抗肿瘤以及延缓衰老、促进人体吸收等方面起到重要的保健作用。研究表明，产品质量高的发酵乳在食用时pH值应为4.2～4.3，然而在发酵乳储存的过程中，产品的pH 值可继续下降，这样就出现发酵乳酸味太重，上边有少量乳清析出，导致酸奶的感官质量下降等现象，这是由于发酵乳发生后酸化造成的。所谓的发酵乳后酸化是指酸奶在发酵结束后，储存、运输、销售、食用前这一过程中，菌体仍在生长繁殖，以致发酵乳由于酸度太高以及感官品质下降而无法被消费者接受的现象，这种现象被称为酸奶的后酸化。

德式乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)又称保加利亚乳杆菌，因发酵性能优良被广泛应用到发酵乳制品行业，其可将大分子的营养物质发酵成小分子的营养成分并且赋予产品特殊的风味，例如可以发酵乳糖生成易于人体吸收的葡萄糖和半乳糖，在一定程度上可以缓解乳糖不耐症。此外，L.bulgaricus还具有调节胃肠道、抑制有害菌的生长、增强免疫力等。然而，L.bulgaricus在发酵工业生产中存在制约行业发展的关键问题，即后酸化。近年来研究表明，在酸奶的发酵中，控制保加利亚乳杆菌的生长是解决后酸化的关键，学者们通过巴氏杀菌，菌株诱变和补充抗菌物质等方法来控制保加利亚乳杆菌的生长和产酸。这些方法都都可以缓解酸乳后酸化的进程，然而效果没有达到绝对抑制，我们前期模拟保加利亚乳杆菌ATCC 11842在酸奶后酸化过程中所受的环境胁迫条件，通过转录组组学测定了在这一过程中的基因表达量变化，分析结果表明保加利亚乳杆菌ATCC 11842通过一系列的适应性调节来应对低pH环境的胁迫作用，主要包括：提高糖酵解途径相关酶的表达量，提供给细胞ATP；调整丙酮酸代谢产物的去向，使丙酮酸代谢更多的转向脂肪酸的生物合成，然而这种代谢机制在冷胁迫作用下退出了酸响应机制；降解错误折叠蛋白，同时提高蛋白质翻译的精确性；DNA的损伤修复等。在这些途径中我们发现了许多参与到酸奶后酸化过程的基因，通过调控后酸化关键基因来缓解酸乳的后酸化程度是一个新的思路，还未有相关的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来源于保加利亚乳杆菌ATCC 11842的后酸化相关基因。

本发明的目的还在于提供上述后酸化相关基因在抑制保加利亚乳杆菌酸奶后酸化过程中的应用。

一种保加利亚乳杆菌后酸化蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白：

1)自序列表中SEQ ID NO：1所示的氨基酸残基序列；

2)将自序列表中的SEQ ID NO：1所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制后酸化活性的蛋白质。

所述保加利亚乳杆菌后酸化蛋白的基因序列如序列表SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

一种含上述保加利亚乳杆菌后酸化基因的载体。

含有上述基因载体的工程菌。

扩增权上述的保加利亚乳杆菌后酸化基因中任一片段的引物。

上述保加利亚乳杆菌后酸化蛋白在延缓酸奶后酸化的过程中的应用。

本发明保加利亚乳杆菌后酸化关键基因LDB_RS05285，采用如下方法获得：

(1)将保加利亚乳杆菌ATCC 11842接种与MRS培养基置于42℃培养箱，培养至对数末期，提取细菌基因组；

(2)设计LDB_RS05285特异引物扩增目的基因，加尾反应，连接pMD19-T 载体，筛选阳性克隆，提取质粒进行酶切验证然后进行测序；

(3)对该基因所编码的蛋白三维结构进行了预测；

(4)运用RT-qPCR技术检测目的基因在酸奶后酸化过程中的表达量；

(5)构建基因过表达载体，通过电转化的方法将重组载体导入宿主菌，筛选阳性克隆子；

(6)运用RT-qPCR技术检测目的基因在重组菌的表达量；

(7)验证该基因在酸奶后酸化过程中的应用。

本发明的有益效果：本发明克隆的LDB_RS05285基因，通过在乳酸菌中过量表达合成铜离子转运蛋白以减弱酸奶储存过程中的后酸化问题，提高酸奶储存的稳定性，延长酸奶保质期，为弱后酸菌株的研发提供良好的保证。

附图说明

图1为保加利亚乳杆菌ATCC 11842基因组提取与目的基因扩增结果。

图2为氨基酸序列预测的蛋白质三维结构。

图3为目的基因在脱脂乳中发酵不同时期的表达量分析。

图4为重组载体转化乳酸乳球菌ML23菌液PCR验证结果。

图5为重组菌中目的基因表达量的测定。

图6为重组菌和对照菌对酸奶后酸化过程的活菌数对比。

图7为重组菌和对照菌对酸奶后酸化过程的pH值变化对比。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1目的基因的克隆与蛋白质三维结构的预测

依据NCBI上已公布的保加利亚乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)ATCC 11842的基因组中LDB_RS05285的基因序列，采用DNAMAN 6.0 软件设计目的基因上下游引物：

LDB_RS05285-F：5-GACGAGCTCGCATGGAAAATAAAGAGGACC-3；

LDB_RS05285-R：5-AAAACTGCAGCATTGGATTACACGTTTTTAAT-3。

Ldb1239-F：5-GACGAGCTCGCATGGCAAATAAAGAGGACC-3；

Ldb1239-R：5-AAAACTGCAGCATTGGATTACACGTTTTTAAT-3。

利用高保真酶从提取的乳酸菌基因组(图1中左半图)中分别进行PCR扩增，95℃预变性5min，95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸2.5min，共35 个循环，循环结束后72℃延伸10min(PCR扩增结果见图1右半图)。扩增完成后利用普通Taq酶进行加“A”反应(72℃，10min)，反应结束后进行纯化，连接克隆载体pMD19-T，构建pMD19-LDB_RS05285质粒并转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选阳性克隆菌株，进行测序。

使用Swiss-Model工具对该基因编码的氨基酸序列进行蛋白质的三级结构预测。

实施例2 LDB_RS05285基因在脱脂乳中发酵不同时期的表达量分析

将保加利亚乳杆菌ATCC 11842接种到脱脂乳培养基中，根据菌株在脱脂乳培养基中的生长曲线和pH值变化，我们选取发酵初期、发酵对数中后期、发酵终点、发酵结束后4℃冰箱冷藏2h、7d、14d，6个不同时间节点的发酵脱脂乳。提取6个时期的总RNA，进行目的基因的相对表达量的测定，通过分析基因在酸奶贮藏过程中表达量变化表明该基因参与到酸奶的后酸化过程。

实施例3重组表达菌株的构建

确定测序结果准确无误后，提取质粒pMD19-LDB_RS05285和pMG36e质粒同时用用PstI和SacI对两个质粒分别进行双酶切，回收酶切产物后用T4 DNA Ligase进行连接，再次转入大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选阳性克隆子，进行测序比对。测序结果正确后，摇菌提取质粒pMG36e-LDB_RS05285，利用电转仪将重组质粒转入乳酸乳球菌ML23感受态细胞中，30℃培养，挑选转化子进行 PCR验证(图2)，电泳检测片段大小正确为重组菌ML23-36e-LDB_RS05285。

实施例4 qRT-PCR检测基因LDB_RS05285在乳酸乳球菌中的表达

试验采用qRT-PCR技术对目基因LDB_RS05285在重组菌株和对照菌内的表达量进行分析，因L.lactis ML23菌株内也存在与目的基因功能相同且两者的同源性较高的序列所以在对照菌株内也检测到了目的基因的表达。结果如图 3-5所示，目的基因在重组菌株(ML23-36e-LDB_RS05285)和对照菌株 (ML23-36e)内都有表达且重组菌株的表达量显著高于对照菌株(P<0.05)。

实施例5重组菌株对酸奶后酸化过程的影响

将活化好的保加利亚乳杆菌ATCC 11842接种到脱脂乳培养基中，37℃培养 11h至脱脂乳凝固然后进行巴氏杀菌，对酸奶中的乳酸菌进行灭活，冷却至室温，将事先培养好的LDB_RS05285基因过表达菌株和对照菌株以相同的菌量分别接种到灭活后的酸奶中，放在4摄氏度冰箱进行冷藏0d、1d、2d、3d、4d、 5d、6d、7d。按时取样进行活菌数和pH值的测定。结果表明：随着贮藏时间的延长，活菌数逐渐减少，0-3d下降明显，4-7d趋于平缓(图6)。在贮藏后期，目的基因过表达的菌株的菌落总数为对照组的92.3％(P>0.05)。在酸奶的贮藏期对照菌株的pH值明显低于目的基因过表达菌株(P<0.05)(图7)。结果表明， LDB_RS05285基因的过量表达一定程度上减弱酸奶储存过程中的后酸化问题，提高酸奶储存的稳定性，延长酸奶保质期。

序列表

<110> 河北农业大学

<120> 一种保加利亚乳杆菌后酸化基因及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 745

<212> PRT

<213> 保加利亚乳杆菌( Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)

<400> 1

Met Glu Asn Lys Glu Asp His Met Asn Met Lys Asn Met Ser Ala Lys

1 5 10 15

Asn Met Glu Asn Asn Glu Ser Asn Met Cys His Met Asp His Asp Met

20 25 30

Thr Glu Thr Asp His Asn Gln Met Asn Met Asp His Asp Met Ala Glu

35 40 45

Thr Asp His Asn Gln Met Asn Met Asp His Asp Met Ala Glu Met Asp

50 55 60

His Ser Gln Met Asn Met Asn His Gly Asp Met Asp Met Ala Gly Thr

65 70 75 80

Asp Met Met Met His Gly Gly Thr Met Met His Met Gly Asn Leu Lys

85 90 95

Val Lys Phe Trp Val Ser Val Val Leu Ala Ile Pro Val Leu Leu Leu

100 105 110

Ala Pro Ile Met Gly Leu Asn Val Ser Ile Leu Ser Phe Ser Ser Pro

115 120 125

Leu Ile Val Gly Ile Ile Ile Val Leu Phe Asp Thr Ala Leu Tyr Phe

130 135 140

Tyr Gly Gly Met Pro Phe Leu Lys Gly Ala Lys Ala Glu Ile Gln Asn

145 150 155 160

Lys Ser Pro Glu Met Met Thr Leu Val Thr Leu Gly Ile Ser Val Ser

165 170 175

Tyr Phe Tyr Ser Leu Tyr Ala Phe Ile Ala Asn Asn Phe Leu Asn Pro

180 185 190

Ala Asn His Val Met Asp Phe Ser Phe Glu Leu Ala Thr Leu Ile Leu

195 200 205

Ile Met Leu Leu Gly His Trp Ile Glu Met Asn Ala Leu Met Gly Ala

210 215 220

Gly Asp Ala Leu Gln Lys Met Ala Ala Leu Leu Pro Lys Thr Ala His

225 230 235 240

Leu Val Thr Asp Asn Gly Glu Thr Lys Glu Val Pro Val Ser Asp Leu

245 250 255

Lys Val Gly Gln Ala Phe Gln Val Arg Ser Gly Glu Ser Ile Pro Ala

260 265 270

Asp Gly Val Ile Thr Ala Gly Glu Ser Thr Val Asn Glu Ala Leu Val

275 280 285

Thr Gly Glu Ser Ala Ala Val Pro Lys Lys Val Gly Asp Lys Val Ile

290 295 300

Gly Gly Ala Thr Asn Asn Asn Gly Thr Leu Thr Val Lys Ile Ser Gly

305 310 315 320

Thr Gly Asp Ser Gly Tyr Leu Ser Gln Val Met Lys Met Val Lys Asn

325 330 335

Ala Gln Gln Ala Lys Ser Lys Ala Glu Asp Lys Ala Asp Leu Val Ala

340 345 350

Lys Tyr Leu Phe Tyr Ala Ala Phe Ser Val Gly Ile Ile Ala Phe Phe

355 360 365

Ala Trp Leu Pro Gln Gly Leu Ala Thr Ala Met Thr Ile Met Val Thr

370 375 380

Val Phe Val Ile Ala Cys Pro His Ala Leu Gly Leu Ala Ile Pro Leu

385 390 395 400

Val Val Ser Arg Ser Thr Thr Ile Gly Ala Gln Asn Gly Leu Leu Val

405 410 415

Arg Asn Arg Gln Ala Ile Glu Ala Ser Gln His Val Ser His Val Leu

420 425 430

Leu Asp Lys Thr Gly Thr Leu Thr Glu Gly Lys Phe Thr Val Asn Ala

435 440 445

Leu Ile Pro Asn Asp Gly Ile Asp Glu Thr Thr Leu Leu Ser Arg Leu

450 455 460

Ala Ala Leu Glu Ser Asn Ser Thr His Pro Leu Ala Gln Ala Ile Ile

465 470 475 480

Thr Glu Ala Gln Ala Lys Gly Ile Glu Val Val Ala Ala Glu Lys Ser

485 490 495

Gln Asn Ile Pro Gly Val Gly Ile Ser Gly Asn Val Asp Gly Thr Asp

500 505 510

Tyr Met Ile Val Asn Gly Asn Tyr Leu Lys Lys Gln Gly Ile Lys Phe

515 520 525

Asp Glu Ala Ala Ala Asp Lys Trp Ala Ala Lys Gly Asn Ser Val Ser

530 535 540

Phe Leu Leu Gln Gly Thr Gln Val Gln Gly Met Val Ala Glu Gly Asp

545 550 555 560

Thr Ile Lys Ala Gly Ala Lys Glu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Lys Arg

565 570 575

Gly Ile Thr Pro Val Met Leu Thr Gly Asp Asn Pro Lys Ala Ala Glu

580 585 590

His Val Ala Asn Leu Leu Gly Leu Thr Glu Phe His Ala Gly Leu Leu

595 600 605

Pro Asp Asp Lys Gln Lys Ile Val Ala Asp Tyr Gln Ala Lys Gly Asn

610 615 620

His Val Ile Met Val Gly Asp Gly Val Asn Asp Ala Pro Ser Leu Ala

625 630 635 640

Ala Ala Asp Ile Gly Ile Ala Ile Gly Ala Gly Thr Asp Val Ala Ile

645 650 655

Asp Ser Ala Asp Val Val Leu Val Lys Ser Glu Pro Ser Asp Ile Leu

660 665 670

His Phe Leu Asp Leu Ala Lys Ile Thr Asn Arg Lys Met Val Gln Asn

675 680 685

Leu Trp Trp Gly Ala Gly Tyr Asn Ile Val Ala Ile Pro Leu Ala Ala

690 695 700

Gly Val Leu Ser Phe Ile Gly Ile Ile Leu Asp Pro Ala Val Gly Ala

705 710 715 720

Val Val Met Ala Met Ser Thr Ile Ile Val Ala Ile Asn Ala Met Gly

725 730 735

Leu Thr Ala Glu Lys Ile Lys Asn Val

740 745

<210> 2

<211> 2238

<212> DNA

<213> 保加利亚乳杆菌( Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)

<400> 2

atggaaaata aagaggacca tatgaatatg aaaaacatga gtgctaagaa tatggaaaat 60

aatgaatcaa atatgtgtca tatggatcac gatatgaccg aaacggatca taatcaaatg 120

aacatggacc acgatatggc cgaaacggat cataatcaaa tgaacatgga ccacgatatg 180

gccgaaatgg atcacagcca aatgaacatg aatcacggtg atatggatat ggctgggacc 240

gacatgatga tgcacggtgg cacaatgatg catatgggga atttgaaagt taaattttgg 300

gtctccgttg tcttagcgat tccagtttta ctgttagcac caatcatggg tttaaacgtt 360

tccatcctta gtttcagttc accgctaatt gttggcatta tcatcgtttt gtttgataca 420

gcactttact tttatggcgg aatgccattt ttaaaggggg ctaaagcgga aattcagaat 480

aaatctcctg aaatgatgac gctagtaacc cttggaattt ccgtttcgta tttctacagt 540

ttgtacgcat ttattgccaa caacttcttg aacccggcaa atcatgtaat ggatttttcg 600

ttcgaacttg caaccctgat tttaattatg cttctaggac actggattga aatgaatgca 660

ttgatggggg ctggggatgc cttacaaaag atggcggccc tgttgcctaa gacggcccat 720

ctagttacag ataatggtga aacaaaagaa gtgccagtat ctgatttaaa agttggtcaa 780

gctttccaag tgcgttcagg tgagagtatt ccagccgatg gtgttattac ggctggggag 840

tcgaccgtga atgaagcact ggtaaccggt gaatctgctg ccgttcccaa gaaagttggc 900

gataaggtca ttggtggtgc aaccaacaat aacgggacgc taacggttaa aattagtggt 960

actggtgact ccggctatct ttctcaagta atgaaaatgg ttaaaaatgc tcagcaagct 1020

aaatctaaag cagaagataa agctgattta gttgccaagt atctatttta cgcggcattt 1080

agtgttggga ttattgcttt ctttgcctgg ttaccccagg gattggcgac tgcaatgacg 1140

atcatggtga ccgtcttcgt gattgcttgc ccgcatgcat taggattagc gattccatta 1200

gtggtttctc gttctactac gattggcgct caaaatgggc tattagttcg aaatcgccaa 1260

gccattgaag caagtcaaca tgttagccac gttctcttgg ataaaactgg cacgttaaca 1320

gaaggtaaat ttacggtgaa tgcattgatt ccaaatgatg ggattgacga aacaacgtta 1380

ttaagccgac tggccgccct tgaaagtaat tcgactcatc cgctggccca agcaatcatt 1440

actgaagccc aagcgaaggg cattgaagtc gttgcggctg aaaagtctca aaatattccg 1500

ggcgttggta tttccggtaa tgttgatggc actgactata tgattgttaa tggtaactat 1560

ttaaagaagc aagggatcaa gtttgacgag gccgctgctg ataaatgggc tgctaagggt 1620

aattccgtca gcttcctatt gcagggcacc caagttcaag gaatggttgc tgaaggcgac 1680

accatcaaag cgggtgctaa ggaattaatt agtggtcttc agaagcgagg aattacccct 1740

gtaatgctca ctggcgataa tccaaaagcc gcggaacacg ttgctaactt actaggattg 1800

actgaattcc atgcaggcct attaccagat gataagcaaa agattgttgc tgattatcaa 1860

gcaaagggca atcacgtcat catggttggt gacggcgtaa atgacgcacc aagtcttgcc 1920

gcggccgata ttggaattgc aattggtgcc ggaaccgatg ttgccattga ttccgctgat 1980

gttgtgttag ttaaatcaga acccagcgat attttacatt ttcttgattt ggctaaaatc 2040

acaaatcgga aaatggttca aaatctctgg tggggagcag gctacaatat tgtcgcaatt 2100

ccacttgctg ccggtgtgtt gtcatttatt ggaatcattc tagacccagc cgttggtgct 2160

gtggtcatgg ctatgtcgac aattatcgtg gcaattaatg cgatgggatt gactgctgaa 2220

aagattaaaa acgtgtaa 2238

<210> 3

<211> 2289

<212> DNA

<213> 保加利亚乳杆菌( Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)

<400> 3

atggcaaata aagaggacca tatgaacatg aaaaacatga gtgctaagaa tatggaaaat 60

aaagaggacc atatgaatat gaaaaacatg agtgctaaga atatggaaaa taatgaatca 120

aatatgtgtc atatggatca cgatatgacc gaaacggatc ataatcaaat gaacatggac 180

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catgcaggcc tattaccaga tgataagcaa aagattgttg ctgattatca agcaaagggc 1920

aatcacgtca tcatggttgg tgacggcgta aatgacgcac caagtcttgc cgcggccgat 1980

attggaattg caattggtgc cggaaccgat gttgccattg attccgctga tgttgtgtta 2040

gttaaatcag aacccagcga tattttacat tttcttgatt tggctaaaat cacaaatcgg 2100

aaaatggttc aaaatctctg gtggggagca ggctacaata ttgtcgcaat tccacttgct 2160

gccggtgtgt tgtcatttat tggaatcatt ctagacccag ccgttggtgc tgtggtcatg 2220

gctatgtcga caattatcgt ggcaattaat gcgatgggat tgactgctga aaagattaaa 2280

aacgtgtaa 2289

Claims

1.一种保加利亚乳杆菌后酸化蛋白在延缓酸奶后酸化的过程中的应用，其特征在于，所述保加利亚乳杆菌后酸化蛋白的基因序列如序列表SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。