CN114317789B

CN114317789B - 一种反映酸奶后酸化程度的标志物及其应用

Info

Publication number: CN114317789B
Application number: CN202111657237.3A
Authority: CN
Inventors: 李晨; 田洪涛; 张欣; 李东尧; 张娜; 高哲
Original assignee: Hebei Agricultural University
Current assignee: Hebei Agricultural University
Priority date: 2021-12-30
Filing date: 2021-12-30
Publication date: 2023-07-14
Anticipated expiration: 2041-12-30
Also published as: CN114317789A

Abstract

本发明公开了一种反映酸奶后酸化程度的标志物及其应用。所述标志物为LDB_RS05555基因的转录或者转录后翻译产物。本发明发现的LDB_RS05555基因标志物与传统通过测定酸奶贮藏期间的酸度值变化来评估后酸化程度的方法相比，能够快速准确的对菌株后酸化性能进行预测，既省时又省力，同时还具备传统方法所不具备的预测性优势。

Description

一种反映酸奶后酸化程度的标志物及其应用

技术领域

本发明属于酸奶后酸化抑制技术领域，具体涉及一种反映酸奶后酸化程度的标志物及其应用。

背景技术

酸奶后酸化是指酸奶发酵结束后，特别是在贮藏过程中，耐酸性较强的保加利亚乳杆菌不断产酸导致酸奶口感劣变的现象。针对这一问题，许多学者提出了不同的措施来抑制后酸化的发生。例如改变发酵剂中球菌与杆菌的比例(Torriani et al,1996,International Dairy Journal 6,625-636)；添加葡萄糖氧化酶(Cruz et al,2013,FoodResearch International 51,723-728)以及过氧化物酶等(Nakada et al,1996,International Dairy Journal 6,33-42)。评价这些措施对后酸化抑制程度的好坏往往需要测定酸奶发酵结束后在整个贮藏过程中的pH或酸度变化。寻求能够快速准确反映酸奶后酸化程度的生物标志物因此显得十分必要。发明人前期体外模拟了酸奶后酸化的发生过程，通过转录组测序结合荧光定量PCR技术揭示了参与后酸化的候选基因。这些基因与后酸化的关系颇为密切，发明人曾在这些基因中发现了一个后酸化特异基因。对剩余基因进行挖掘，寻求基因表达量与后酸化程度有显著相关性的基因作为生物标志物，利用该标志物建立一套集弱后酸化菌株筛选、后酸化抑制措施评定的方法显得尤为重要。

当下对菌株后酸化性能以及后酸化抑制措施效果的评定主要依据测定酸奶在整个贮藏过程中的酸度或者pH变化。采用这种传统方法一方面工作量大，繁琐耗时，无法在短期内实现对酸奶后酸化程度的评估；另一方面，传统方法无法预测酸奶后酸化程度变化趋势。目前，从基因角度入手，利用分子生物学手段，筛选能够快速准确反映酸奶后酸化程度的基因作为生物标志物尚未有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种反映酸奶后酸化程度的标志物及其应用。

一种反映酸奶后酸化程度的标志物，所述标志物为LDB_RS05555基因的转录或者转录后翻译产物。

所述LDB_RS05555基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。

所述LDB_RS05555基因的编码蛋白还包括序列表SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经替换、缺失、或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列，以及编码这些氨基酸序列的核苷酸序列。

LDB_RS05555基因共有855个碱基，可编码具有284个氨基酸的蛋白质。该蛋白质的分子式为C₁₄₄₅H₂₂₈₉N₃₈₇O₄₁₇S₆，理论等电点9.04，由20种常见的氨基酸组成，其中氨基酸含量最高的是苏氨酸(Leu)11.3％，其次是丙氨酸(Ala)8.1％，甘氨酸(Gly)7.7％，含量最少的是半胱氨酸(Cys)0.7％。不稳定指数为38.37，表明目的蛋白为稳定蛋白。LDB_RS05555基因的平均疏水性为-0.168，表明该蛋白为亲水蛋白。NCBI对该基因的描述为LysR家族转录调节因子。

所述酸奶后酸化的发酵菌为保加利亚乳杆菌。

LDB_RS05555基因的表达水平在预测酸奶后酸化进程中的应用。

本发明利用五种后酸化性能不同的保加利亚乳杆菌(命名为Lb-S1,LD,DR,11842,S-1)分别进行酸奶发酵，待酸奶凝乳后置于4℃条件下低温贮藏，2小时后分别取样用于RNA提取和cDNA合成。剩余酸奶继续置于4℃条件下贮藏，每隔3.5天测定酸奶的滴定酸度，测定酸奶在21天低温贮藏过程中的酸度变化。以cDNA为模板，rpob作为内参基因，发明人从69个后酸化候选基因中选取了55个基因进行相对表达量测定。利用相关性分析，探究了LDB_RS055555的表达量与第3.5天的酸度值之差的关系并获得相应的回归公式。利用分离自新疆酸奶中的一株保加利亚乳杆菌(R2-6)对筛选出的呈现显著相关性的基因进行验证。按照上述同样的方法，将R2-6接种到脱脂乳中进行酸奶发酵，凝乳后，4℃贮藏2小时后取样，提取RNA进行反转录合成cDNA。以cDNA为模板，按照上述同样的方法测定目的基因的表达量。将测得的表达量带入相应的回归公式中计算出理论酸度值差值。剩余酸奶同样继续放在4℃条件下贮藏并且每隔3.5天测定酸奶在21天贮藏期内的滴定酸度。利用T检验对理论酸度值与实际测量酸度值进行显著性差异分析。对于差异不显著的基因，说明可以根据该基因的表达量预测出菌株发酵过程中的产酸性能，这样的基因正是我们要筛选的后酸化生物标志物基因。

本发明的有益效果：本发明发现的LDB_RS05555基因标志物与传统通过测定酸奶贮藏期间的酸度值变化来评估后酸化程度的方法相比，能够快速准确的对菌株后酸化性能进行预测，既省时又省力，同时还具备传统方法所不具备的预测性优势。另外，利用本发明的生物标志物基因还可以筛选出更多潜在的后酸化抑制措施。

附图说明

图1为目的基因相对表达量与酸度值之差相关性分析。

图2为生物标志物基因LDB_RS05555在突变体中的适用性分析。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

实施例1酸奶发酵和贮藏期间酸度测定

将培养至对数中期的五株不同保加利亚乳杆菌(Lb-S1，LD，DR，11842，S-1)分别按照1％的接种量接种至10mL脱脂乳培养基中，42℃静置培养，以此接种量在脱脂乳培养基中进行传代培养，直至凝乳时间稳定(5代左右)。参照GB5009.239-2016方法分别测定酸奶在发酵过程中的酸度变化，记录发酵终点的酸度值。凝乳后，将酸奶置于4℃冰箱贮藏。贮藏2小时后，每组样品分别吸取2mL酸奶于无RNase的EP管中，-80℃保存，用于后续RNA的提取。剩余酸奶样品继续置于4℃条件下贮藏并分别在凝乳后的第3.5天、7天、10.5天、14天、17.5天以及第21天测定酸奶的滴定酸度并分别计算在这些天数下酸度值之差。

酸度值之差＝当天测定的酸度值-发酵终点酸度值。

实施例2 RNA提取、cDNA合成以及基因相对表达量的测定

将低温保存的酸奶样品取出分别置于液氮预冷的研钵中。加入液氮，将样品磨成粉末状后转移至无RNase的EP管中。使用北京索莱宝公司生产的Total RNA ExtractionKit抽提细胞总RNA。利用Thermo Scientific公司的NanoDrop ND-1000检测样品RNA的A280/A260值来评估RNA质量。进一步地，对质量达到要求的RNA采用北京全式金生物

One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix合成cDNA。以cDNA为模板，使用北京全式金生物/>

Green qPCR SuperMix对从前期筛选的后酸化候选基因中选取的14个目的基因进行相对表达量的测定。反应在Roche公司生产的LightCycler 96仪器上进行，使用rpob作为内参基因。依据NCBI上公布的保加利亚乳杆菌ATCC11842基因组序列，采用DNAMAN 6.0软件设计目的基因和内参基因的上下游引物(表1)。反应体系为：/>

Green qPCR SuperMix 10μL、上下游引物各1μL、模板2μL、ddH₂O 6μL。PCR反应程序如下：94℃预变性300S，94℃变性5S，51℃退火15S，72℃延伸10S，共45个循环。反应结束后，采用2^-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

表1.基于转录组测序筛选的用于相关性分析的目的基因和内参基因上下游引物

表2LDB_RS05555基因表达量预测的酸度值与实际测量酸度值差异显著性分析

注：*表示显著性水平0.05下呈现差异，**表示显著性水平0.01下呈现差异

实施例3后酸化生物标志物基因的筛选与验证

采用GraphPad Prism 8.0.1软件对目的基因相对表达量与酸度值之差进行相关性分析，结果发现LDB_RS05555基因第3.5天存在显著相关性(图1)。进一步地，利用分离自新疆酸奶中的一株保加利亚乳杆菌(R2-6)进行发酵酸奶来验证这几个基因的可靠性。同样，分别在凝乳后的第3.5天、7天、10.5天、14天、17.5天以及第21天测定酸奶的滴定酸度并分别计算在这些天数下酸度值之差。按照上述方法与步骤进行RNA提取、cDNA合成以及qPCR反应。将测得的基因表达量分别代入对应的回归方程获得预测酸度值差值。将酸度值差值与发酵终点酸度值相加得到预测酸度值。使用SPSS 19.0软件对预测酸度值与实际酸度值进行独立样本T检验，结果发现LDB_RS05555基因预测结果与实际结果差异不显著，表明LDB_RS05555基因可以作为预测酸奶后酸化程度的生物标志物。

实施例4 LDB_RS05555基因作为酸奶后酸化生物标志物对化学诱变弱后酸化菌株产酸性能的判定

以实验室菌库保存的弱后酸化菌株rp-1作为出发菌株(Lb-S1为野生型，采用硫新霉素进行诱变育种)，探究LDB_RS05555作为弱后酸化生物标志物在突变体中的适用性。将过夜活化好的保加利亚乳杆菌Lb-S1以及rp-1分别按照1％的接种量接种至脱脂乳中，反复传代，直至凝乳时间稳定，分别记录发酵终点酸度值。将凝乳后的酸奶置于4℃条件下贮存，2h后分别取样提取RNA，测定LDB_RS05555基因相对表达量。剩余酸奶继续置于4℃条件下贮藏21天并每隔3.5天分别测定酸奶的滴定酸度。结果如图2所示，由Lb-S1以及rp-1发酵的酸奶在4℃条件下贮藏至第3.5天时酸度值分别增加了大约9.62°T以及7.16°T。但从相对基因表达量来看，菌株rp-1要显著高于Lb-S1。这表明在突变体中，LDB_RS05555基因表达量与菌株产酸性能仍然呈负相关，LDB_RS05555作为弱后酸化生物标志在突变体中仍适用。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 河北农业大学

<120> 一种反映酸奶后酸化程度的标志物及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 855

<212> DNA

<213> 保加利亚乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)

<400> 1

atgaatttca agcagctcaa ttactttctg gtcgtagccg aggaagggca gattacttca 60

gccgccaagc ggctctttgt cggccagcca gccctcagct accaattaaa gcaattagaa 120

gaggagctag gggctaagct ctttatccgt cagccttatg gaattgaact gaccgaggct 180

ggaaaaaagc tgcgggatta tgctggtcag attttgacat tagccaaaaa cgtccaaact 240

gaaattacgg agctggaccg gggcgggtgg ggaagggtta aattaggttc cgtctcttct 300

tcaatcggcg agcttccttc cgccaaattg acggcttttg cccgccagca tcccggcgtc 360

tcctttgaca tctacgaaga caacactttc ggcatcctgg acaagctgca gggcaacctg 420

ctggacctgg ccatcgtccg caccccctac aaccgggtca acttgaactt tgtcgacatc 480

agcgatgagc cgatgaccgc ggttacctgc caggactttt tccctggcaa gggaaaagta 540

gggctgcagg acctggccgg ccagcccttg gtcatctacc ggcgctttga ggacatgttc 600

aaggaagcct tcgcggaaaa aggtctcacc ccaaattttg tggttaagtg cgatgattcc 660

agaaccgcta tccgctggag cgactctggc ctggggattg ccctggtgcc ggaatcaatc 720

gccaaaactt atgccaaagg ccacatctac ccaatcgact cggctaagtg gcggacccgc 780

ctgcagctag tctggcgcaa agaccgggtg gttaccccct taatgcggca aattattgcc 840

ctatatgcaa aataa 855

<210> 2

<211> 122

<212> PRT

<213> 保加利亚乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)

<400> 2

Met Ser Lys Phe Gly Ser Phe Leu Leu Gly Ala Val Phe Gly Ala Ala

1 5 10 15

Ala Gly Val Ala Ala Ala Ser Leu Ile Ser Asp Asp Lys Leu Lys Glu

20 25 30

Val Lys Asp Lys Ile Lys Ser Asn Pro Asn Val Glu Asp Leu Lys Glu

35 40 45

Lys Tyr Asp Asn Gly Thr Glu Ile Leu Lys Asn Gln Leu Ala Ser Phe

50 55 60

Pro Lys Asn Ile Glu Asp Asp Ser Glu Leu Lys Asp Phe Asp Asp Ile

65 70 75 80

Val Ile Asp Asp Ser Ala Asn Gly Ala Gly Glu Gln Asp Ala Ser Asp

85 90 95

Leu Asp Asn Ala Glu Lys Ser Glu Glu Gly Glu Glu Lys Pro Glu Glu

100 105 110

Pro Ser Thr Pro Thr Ser Pro Asp Gln Glu

115 120

Claims

1.LDB_RS05555基因在预测酸奶后酸化程度中的应用，其特征在于，所述LDB_RS05555基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 1所示；所述酸奶后酸化的发酵菌为保加利亚乳杆菌。