CN110108818B - 一种高效分离检测苯酞衍生物的高效液相色谱法及其应用 - Google Patents

一种高效分离检测苯酞衍生物的高效液相色谱法及其应用 Download PDF

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Abstract

一种高效分离检测苯酞类衍生物的高效液相色谱法，采用苯基‑己基色谱柱或苯基柱，检测波长为226‑230nm或280nm，流速为0.8‑1.2ml/min，柱温为20‑35℃，进样量为10‑100μl，流动相由A相和B相组成，流动相中A相:B相混合的体积比为60：40‑80:20，A相为pH值3‑5的水溶液，B相中乙腈与甲醇的体积比为1：0.8‑1.2。本发明的方法具有专属性好、分离度高、灵敏度优异等优点，可以实现十余种苯酞衍生物的有效分离，可用于苯酞衍生物的分离、含量测定或其有关物质的监控与检测、分离纯化，以便更好地控制这些原料及其制剂的质量，以保障药品的有效性、安全性并实现药品质量可控。

Description

一种高效分离检测苯酞衍生物的高效液相色谱法及其应用
技术领域
本发明属于药物分析领域，具体涉及一种高效分离检测苯酞衍生物的高效液相色谱法及其应用。
背景技术
苯酞也称作邻羟甲基苯甲酸内酯，结构特征为γ-内酯(A环)与苯(B环)的双环融合，是γ-羟基羧酸失去1分子水而形成的内酯。已有研究表明，很多苯酞类化合物具有药理活性，能够应用于心脑血管疾病的预防或治疗。丁苯酞是我国自主研究开发的第三个新化学实体药。2-(α-羟基戊基)苯甲酸药用盐已进入临床开发阶段。另有文献报道了3-丁烯基苯酞具有抑制血栓烷合成的活性。此外，3-(3’-羟基)-丁苯酞、3-羟基-3-丁苯酞(又称3-正丁基-3-羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮)均为具备药理活性的丁苯酞衍生物。前述苯酞类化合物结构近似，在合成制备中可以选择相同的起始原料和中间体进行合成。苯酞类化合物不稳定，易受光照、温度等因素的影响而发生变化和相互转化。且在生产过程中，起始原料、中间体、聚合体、副反应产物、贮藏过程中的降解产物等，都可能被带入终产品成为杂质而影响产品质量。因此，研究制定科学合理的分离检测方法测定苯酞类药物含量及其有关物质，对于保障苯酞类衍生物药品质量具有十分重要的意义，以保障药品的有效性和安全性，进而实现药品质量可控。
丁苯酞的国家药品标准WS1-(X-124)-2005Z公布了丁苯酞的含量及有关物质的检测方法。该方法采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇:水(65:35)为流动相，检测波长280nm，分离度测试溶液为含有丁苯酞和丙苯酞的甲醇溶液。
李婕等采用超高效液相-三重四级杆质谱联用技术对丁苯酞原料药的杂质谱进行分析，公开了丁苯酞在碱条件下生成大量的杂质1(2-(1-羟戊基)-苯甲酸)，杂质1进一步降解的少量杂质3(2-(1-氧代戊基)-苯甲酸)，杂质2为邻苯二甲酸酐法引入的工艺杂质。高效液相部分采用C18色谱柱，流动相为甲醇-0.1％甲酸溶液(60∶40)。
中国专利申请CN201610395891.4公开了一种高效液相色谱法分离测定丁苯酞及其有关物质的方法。该方法通过高效液相色谱仪，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，0.2％磷酸氢二钠和乙腈为流动相进行梯度洗脱，检测波长为226～230nm。该方法解决了邻苯二甲酸、中间体I、中间体II、丙苯酞、丁烯基苯酞、双丁基苯酞杂质与主成分难以分离的问题。该专利的有关物中不包括苯酞和3-正丁基-3-羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮，无法对有关物质苯酞和3-正丁基-3-羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮实现分离测定。除此之外，该专利记载的测定方法不能对以上六种杂质之外的其他苯酞衍生物杂质进行有效的分离和检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效液相检测方法，该方法通过优化色谱条件和梯度洗脱条件，实现十余种苯酞衍生物的有效分离，并具有专属性好，灵敏度高等优点，可用于苯酞衍生物的分离、含量测定、制备纯化或其有关物质的监控。
本发明的目的之一在于提供一种高效分离检测苯酞类衍生物的高效液相色谱法，其特征在于，该方法采用苯基-己基色谱柱或苯基柱，检测波长为226-230nm或280nm，流速为0.8-1.2ml/min，柱温为20-35℃，进样量为10-100μl，流动相由A相和B相组成，其中，流动相中A相:B相混合的体积比为60：40-80:20，A相为pH值3-5的水溶液，所述的B相为由乙腈和甲醇组成的混合溶剂，B相中乙腈与甲醇的体积比为1：0.8-1.2。
本发明的优选技术方案中，所述的流动相中A相:B相的混合体积比为62：38-75:25。
本发明的优选技术方案中，0-40min时，所述的流动相中A相:B相的混合体积比为60：40-80:20，优选流动相中A相:B相的混合体积比为62：38-75:25。
本发明的优选技术方案中，40-50min时，所述的流动相中A相:B相的混合体积比为40:60-55:45，优选流动相中A相:B相的混合体积比为45:55-49:51。
本发明的优选技术方案中，所述的A相为0.08-0.12％体积比的乙酸水溶液，优选A相乙酸水溶液的体积比选自0.09％、0.10％、0.11％的任一种。
本发明的优选技术方案中，所述B相中乙腈与甲醇的体积比选自1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.1、1:1.2的任一种。
本发明的优选技术方案中,稀释溶剂用于配置供试品溶液或对照品溶液，所述的稀释溶剂为20％-40％体积比的乙腈水溶液，优选为乙腈水溶液的体积比选自20％、25％、30％、40％的任一种。
本发明的优选技术方案中,色谱柱的柱温选自20℃、25℃、30℃、35℃的任一种。
本发明的优选技术方案中，进样量选自10μl、20μl、50μl、100μl的任一种。
本发明的优选技术方案中，梯度洗脱条件选自表1、表2、表3任一所述的A相与B相的体积比组成。
本发明的优选技术方案中，在50-50.1min时，使用高比例的有机相冲洗小分子极性物质，50.1-60min时洗脱还原色谱柱。
表1
时间(分钟) 0 5 40 50 50.1 60
A％ 62 62 45 30 62 62
B％ 38 38 55 70 38 38
表2
时间(分钟) 0 5 40 50 50.1 60
A％ 65 65 45 30 30 65
B％ 35 35 55 70 70 35
表3
时间(分钟) 0 5 40 50 50.1 60
A％ 75 70 49 35 75 75
B％ 25 30 51 65 25 25
本发明的优选技术方案中，所述的苯酞类衍生物选自苯酞类衍生物所述的苯酞类衍生物选自邻羧基苯甲醇、邻羧基苯甲醛、苯酞、甲基苯酞、乙基苯酞、丙基苯酞、戊基苯酞、异丁基苯酞、仲丁基苯酞、叔丁基苯酞、2-(ɑ-羰基戊基)苯甲酸、2-(ɑ-羟基戊基)苯甲酸或其药用盐或其酸根、3-正丁基-3-羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮、丁苯酞、丁烯基苯酞的任一种或其组合，优选为2-(ɑ-羟基戊基)苯甲酸或其可药用盐或其酸根、3-正丁基-3-羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮、丁烯基苯酞、丁苯酞的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述的2-(ɑ-羟基戊基)苯甲酸的可药用盐选自其钠盐、钾盐、锂盐、钙盐、镁盐、锌盐的任一种。
本发明的优选技术方案中，所述的苯基-己基色谱柱或苯基柱为商购获得，优选为Agilent或Kinetex公司生产的苯基-己基色谱柱或苯基柱，更优选为Zorbax EclipsePlus、Kinetex Phenyl-Hexyl、ZORBAX Phenyl、ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl、ZORBAX SB-Phenyl、Ultimate XB-Phenyl，Agilent ZORBAX plus Pheny-Hexyl的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述的苯基-己基色谱柱或苯基柱的柱长为4.6mm×250mm，填料粒径优选5μm。
本发明的另一目的在于提供本发明所述的高效分离检测苯酞类衍生物的高效液相色谱法用于分离检测苯酞类衍生物有关物质的方法中的应用，其特征在于，该方法采用苯基-己基色谱柱或苯基柱，检测波长为226-230nm或280nm，流速为0.8-1.2ml/min，柱温为20-35℃，进样量为10-100μl，流动相由A相和B相组成，其中，流动相中A相:B相混合的体积比为60：40-80:20，A相为pH值3-5的水溶液，所述的B相为由乙腈和甲醇组成的混合溶剂，B相中乙腈与甲醇的体积比为1：0.8-1.2。
本发明有关物质测定的优选技术方案中，所述的流动相中A相:B相的混合体积比为62：38-75:25。
本发明有关物质测定的优选技术方案中，0-40min时，所述的流动相中A相:B相的混合体积比为60：40-80:20，优选流动相中A相:B相的混合体积比为62：38-75:25。
本发明有关物质测定的优选技术方案中，40-50min时，所述的流动相中A相:B相的混合体积比为40:60-55:45，优选流动相中A相:B相的混合体积比为45:55-49:51。
本发明有关物质测定的优选技术方案中，所述的A相为0.08-0.12％体积比的乙酸水溶液，优选A相乙酸水溶液的体积比选自0.09％、0.10％、0.11％的任一种。
本发明有关物质测定的优选技术方案中，所述的B相中乙腈与甲醇的体积比选自1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.1、1:1.2的任一种。
本发明有关物质测定的优选技术方案中,稀释溶剂用于配置供试品溶液或对照品溶液，所述的稀释溶剂为20％-40％体积比的乙腈水溶液，优选为乙腈水溶液的体积比选自20％、25％、30％、40％的任一种。
本发明有关物质测定的优选技术方案中,色谱柱的柱温选自20℃、25℃、30℃、35℃的任一种。
本发明有关物质测定的优选技术方案中，所述进样量选自10μl、20μl、50μl、100μl的任一种。
本发明有关物质测定的优选技术方案中，梯度洗脱条件选自表1、表2、表3任一所述的A相与B相的体积比组成。
本发明有关物质测定的优选技术方案中，所述苯酞衍生物选自2-(ɑ-羟基戊基)苯甲酸或其可药用盐、3-正丁基-3-羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮、丁烯基苯酞、丁苯酞的任一种或其组合。
本发明有关物质测定的优选技术方案中，所述的2-(ɑ-羟基戊基)苯甲酸的可药用盐选自钠盐、钾盐、锂盐、钙盐、镁盐或锌盐的任一种。
本发明有关物质测定的优选技术方案中，所述的有关物质选自苯酞、2-(ɑ-羰基戊基)苯甲酸、3-正丁基-3-羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮、丙基苯酞、邻羧基苯甲醇、邻羧基苯甲醛、异丁基苯酞的任一种或其组合。
本发明有关物质测定的优选技术方案中,所述的有关物质选自苯酞和2-(ɑ-羰基戊基)苯甲酸的组合、3-正丁基-3-羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮和丙基苯酞的组合、邻羧基苯甲醇与邻羧基苯甲醛的组合、异丁基苯酞和丁苯酞的组合的任一种。
本发明有关物质测定的优选技术方案中,所述的有关物质进一步包括甲基苯酞、乙基苯酞、戊基苯酞、仲丁基苯酞、叔丁基苯酞、2-(ɑ-羟基戊基)苯甲酸可药用盐或酸根、丁烯基苯酞中的任一种或其组合。
本发明有关物质测定的优选技术方案中,所述的苯酞衍生物选自2-(ɑ-羟基戊基)苯甲酸或其可药用盐时，有关物质不包括2-(ɑ-羟基戊基)苯甲酸或其可药用盐或其酸根。
本发明有关物质测定的优选技术方案中,所述的苯酞衍生物选自3-正丁基-3-羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮时，所述有关物质不包括3-正丁基-3-羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮。
本发明有关物质测定的优选技术方案中,所述的苯酞类衍生物选自丁苯酞时，所述有关物质不包括丁苯酞。
本发明有关物质测定的优选技术方案中,所述的苯酞类衍生物选自丁烯基苯酞时，所述有关物质不包括丁烯基苯酞。
本发明的另一目的在于提供本发明所述的高效分离检测苯酞类衍生物的高效液相色谱法用于分离检测苯酞类衍生物含量方法中的应用，其特征在于，该方法采用苯基-己基色谱柱或苯基柱，检测波长为226-230nm或280nm，流速为0.8-1.2ml/min，柱温为20-35℃，进样量为10-100μl，流动相由A相和B相组成，其中，流动相中A相:B相混合的体积比为60：40-80:20，A相为pH值3-5的水溶液，所述的B相为由乙腈和甲醇组成的混合溶剂，B相中乙腈与甲醇的体积比为1：0.8-1.2。
本发明含量测定的优选技术方案中，所述的流动相中A相:B相的混合体积比为62：38-75:25。
本发明含量测定的优选技术方案中，0-40min时，所述的流动相中A相:B相的混合体积比为60：40-80:20，优选流动相中A相:B相的混合体积比为62：38-75:25。
本发明含量测定的优选技术方案中，40-50min时，所述的流动相中A相:B相的混合体积比为40:60-55:45，优选流动相中A相:B相的混合体积比为45:55-49:51。
本发明含量测定的优选技术方案中，所述的A相为0.08-0.12％体积比的乙酸水溶液，优选A相乙酸水溶液的体积比选自0.09％、0.10％、0.11％的任一种。
本发明含量测定的优选技术方案中，所述的B相中乙腈与甲醇的体积比选自1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.1、1:1.2的任一种。
本发明含量测定的优选技术方案中,稀释溶剂用于配置供试品溶液或对照品溶液，所述的稀释溶剂为20％-40％体积比的乙腈水溶液，优选为乙腈水溶液的体积比选自20％、25％、30％、40％的任一种。
本发明含量测定的优选技术方案中,色谱柱的柱温选自20℃、25℃、30℃、35℃的任一种。
本发明含量测定的优选技术方案中，所述的进样量选自10μl、20μl、50μl、100μl的任一种。
本发明含量测定的优选技术方案中，梯度洗脱条件选自表1、表2、表3任一所述的A相与B相的体积比组成。
本发明含量测定的优选技术方案中，所述的苯酞类衍生物选自邻羧基苯甲醇、邻羧基苯甲醛、苯酞、甲基苯酞、乙基苯酞、丙基苯酞、戊基苯酞、异丁基苯酞、仲丁基苯酞、叔丁基苯酞、2-(ɑ-羰基戊基)苯甲酸、2-(ɑ-羟基戊基)苯甲酸或其药用盐或其酸根、3-正丁基-3-羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮、丁苯酞、丁烯基苯酞的任一种或其组合。
本发明含量测定的优选技术方案中，所述2-(ɑ-羟基戊基)苯甲酸的可药用盐选自其钠盐、钾盐、锂盐、钙盐、镁盐或锌盐的任一种。
本发明含量测定的优选技术方案中本发明的优选技术方案中,所述苯酞衍生物含量测定中的供试品浓度为0.25-3mg/ml，优选为0.5-2mg/ml。
本发明的色谱条件下，可以有效分离十余种苯酞类衍生物。因此，本发明的固定相和流动相选择还可以应用于制备色谱中。本发明的另一目的在于提供一种苯酞类衍生物的制备方法，其特征在于，该方法使用苯基-己基色谱柱或苯基柱作为固定相，流动相由A相和B相混合而成，其中，A:B混合体积比60：40-80:20，A相为pH值3-5的水溶液，所述的B相为由乙腈和甲醇组成的混合溶剂，B相中乙腈与甲醇的体积比为1：0.8-1.2，流动相的流速为0.8-1.2ml/min，柱温：20-35℃。
在制备苯酞类衍生物分离纯化的优选技术方案中，所述的流动相进一步优选为本发明所述的高效液相色谱法中的流动相。
在制备苯酞类衍生物分离纯化的优选技术方案中，所述的流动相中A相:B相的混合体积比为62：38-75:25。
在制备苯酞类衍生物分离纯化的优选技术方案中，A相为0.08-0.12％体积比的乙酸水溶液，优选A相乙酸水溶液的体积比选自0.09％、0.10％、0.11％的任一种。
在制备苯酞类衍生物分离纯化的优选技术方案中，所述的B相中乙腈与甲醇的体积比选自1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.1、1:1.2的任一种。
在制备苯酞类衍生物分离纯化的优选技术方案中，苯酞类衍生物选自邻羧基苯甲醇、邻羧基苯甲醛、苯酞、甲基苯酞、乙基苯酞、丙基苯酞、戊基苯酞、异丁基苯酞、仲丁基苯酞、叔丁基苯酞、2-(ɑ-羰基戊基)苯甲酸、2-(ɑ-羟基戊基)苯甲酸或其药用盐或其酸根、3-正丁基-3-羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮、丁苯酞、丁烯基苯酞的任一种或其组合。
在制备苯酞类衍生物分离纯化的优选技术方案中，苯酞类衍生物为色谱分离度较大的物质，优选选自苯酞、甲基苯酞、2-(ɑ-羰基戊基)苯甲酸、戊基苯酞、仲丁基苯酞、叔丁基苯酞的任一种或其组合，更优选为色谱分离度最大的苯酞、甲基苯酞、2-(ɑ-羰基戊基)苯甲酸的任一种或其组合。
在制备苯酞类衍生物分离纯化的优选技术方案中，分离收集获得溶解目标苯酞类物质的洗脱溶液后，经蒸发、分离、洗涤、干燥步骤，制得高纯度的目标苯酞类物质。
在制备苯酞类衍生物分离纯化的优选技术方案中，所述的蒸发选自减压蒸发、旋转蒸发的任一种或其组合。
在制备苯酞类衍生物分离纯化的优选技术方案中，所述的分离选自过滤分离、离心分离、静置分离的任一种或其组合。
在制备苯酞类衍生物分离纯化的优选技术方案中，所述的洗涤为溶剂洗涤。
在制备苯酞类衍生物分离纯化的优选技术方案中，所述的干燥选自减压干燥、冷冻干燥、真空干燥、喷雾干燥的任一种或其组合。
在制备苯酞类衍生物分离纯化的优选技术方案中，所述2-(ɑ-羟基戊基)苯甲酸可药用盐选自其钠盐、钾盐、锂盐、钙盐、镁盐、锌盐的任一种。
本发明的另一目的在于提供本发明分离纯化制得的高纯度目标苯酞类物质用作标准品或对照品中的应用。
本发明的优选技术方案中，所述的目标苯酞类物质的纯度不低于99.0％，优选不低于99.5％，更优选不低于99.9％。
为了清楚地表述本发明的保护范围，本发明对下述术语进行界定：
本发明所述的酸根为本发明所述的苯酞类衍生物或其可药用盐在溶液中以电离形式存在的阴离子部分。
本发明的稀释溶剂用于溶解和稀释对照品溶液或供试品溶液。
除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
与现有技术相比，本发明具有下述有益效果：
1、本发明研究筛选了高效液相色谱法的色谱条件及梯度洗脱条件，获得一种高效分离检测苯酞类衍生物的高效液相色谱法。该方法具有专属性好、分离度高、灵敏度优异等优点，可以实现十余种苯酞衍生物的有效分离，可用于苯酞衍生物的分离、含量测定或其有关物质的监控与检测，以便更好地控制这些原料及其制剂的质量，以保障药品的有效性和安全性，进而实现药品质量可控。
2、本发明研究高效分离检测苯酞类衍生物的高效液相色谱法，具有下述预想不到的技术效果，一是有效改善了苯酞和2-(ɑ-羰基戊基)苯甲酸的分离度，利于苯酞和2-(ɑ-羰基戊基)苯甲酸的分离检测及含量控制；二是有效改善了3-正丁基-3-羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮和丙基苯酞的分离度，利于3-正丁基-3-羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮和丙基苯酞的分离与检测及含量控制；三是有效改善了异丁基苯酞与丁苯酞的分离度，利于异丁基苯酞与丁苯酞的分离与检测及含量控制；四是有效改善了邻羧基苯甲醇和邻羧基苯甲醛的分离度，利于邻羧基苯甲醇和邻羧基苯甲醛的分离与检测及含量控制。因此，本发明的高效分离检测苯酞类衍生物的高效液相色谱法可用于苯酞类原料及其制剂的质量控制，为确保药品的质量、安全性和有效性提供强有力的技术保障。
3、本发明的高效分离检测苯酞类衍生物的高效液相色谱法实现了十余种苯酞衍生物的有效分离，还可用于制备高纯度的目标苯酞衍生物，制备所得的高纯度目标苯酞类物质用作标准品或对照品中的应用。
附图说明
图1对比例1供试品色谱图；
图2对比例2供试品色谱图；
图3对比例3供试品色谱图；
图4实施例1供试品色谱图；
图5实施例2供试品色谱图；
图6实施例3供试品色谱图；
图7实施例4供试品色谱图。
具体实施方式
以下将结合实施例具体说明本发明。本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明的实质。
本发明的供试化合物及纯度见表4。
表4
Figure BDA0002079509590000101
Figure BDA0002079509590000111
HPLC设备：岛津LC-20A高效液相色谱仪，SPD-20A UV检测器。
色谱柱：Agilent ZORBAX plus Pheny-Hexyl 4.6mm×250mm，5μm；或者菲罗门Titank C18，4.6mm×250mm，5μm；或者GL-C18，4.6mm×250mm，5μm。
对比例1
参照丁苯酞国家药品标准WS1-(X-124)-2005Z，采用HPLC法分离检测丁苯酞及八种有关物质。
色谱柱：菲罗门Titank C18，4.6mm×250mm，5μm；
流动相：甲醇-水(65：35)；
检测波长280nm，流速：1.0ml/min，柱温：30℃，进样量：20μl。
稀释溶剂：甲醇。
溶液配制及测定法：精密称取丁苯酞、2-(ɑ-羟基戊基)苯甲酸钾、苯酞、2-(ɑ-羰基戊基)苯甲酸、乙基苯酞、3-正丁基-3-羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮、丙基苯酞、戊基苯酞及丁烯基苯酞各适量，使用甲醇为溶剂，将其配制成含丁苯酞0.5mg/ml，含2-(ɑ-羟基戊基)苯甲酸钾、苯酞、2-(ɑ-羰基戊基)苯甲酸、乙基苯酞、3-正丁基-3-羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮、丙基苯酞、戊基苯酞及丁烯基苯酞各5μg/ml的混合溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1ml，将其置于100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。照上述色谱条件，精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品色谱图见图1，供试品的实验数据见表5。
在该色谱条件下，分别配置苯酞、2-(ɑ-羰基戊基)苯甲酸的定位样品溶液。结果显示，苯酞定位峰的保留时间为4.668min，2-(ɑ-羰基戊基)苯甲酸定位峰的保留时间为4.847min。
表5
Figure BDA0002079509590000121
基于前述苯酞、2-(ɑ-羰基戊基)苯甲酸的定位峰及其保留时间，确定供试品色谱图1和表6中保留时间为4.627min的色谱峰为苯酞和2-(ɑ-羰基戊基)苯甲酸的重合峰。
由图1和表6可见，苯酞和2-(ɑ-羰基戊基)苯甲酸在该色谱条件下无法进行有效分离，不能用于有关物质中含有苯酞和2-(ɑ-羰基戊基)苯甲酸的药品的分离检测和其药品质量控制。且在该色谱条件下，3-正丁基-3-羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮和丙基苯酞的分离度仅为1.00，不符合分离度大于1.5的要求，需要优化其分离条件，更好地控制药品质量。
对比例2
色谱条件：
色谱柱：Agilent ZORBAX plus Pheny-Hexyl，4.6mm×250mm，5μm。
流动相：A相为0.1％乙酸水溶液(体积比)；B相为乙腈。
检测波长280nm，流速：1.0ml/min，柱温：30℃，进样量：10μl。
溶剂：30％乙腈水溶液(体积比)。
梯度洗脱条件见表6。
表6
时间(分钟) 0 5 40 50 50.1 60
A％ 75 70 49 35 75 75
B％ 25 30 51 65 25 25
溶液配制及测定法：
精密称取丁苯酞、3-正丁基-3-羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮、丙基苯酞适量，使用30％乙腈溶液(体积比)配制成含丁苯酞2mg/ml、含杂质3-正丁基-3-羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮、丙基苯酞各20μg/ml的混合溶液，作为供试品溶液；照上述色谱条件，取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱图见图2，供试品的实验数据见表7。
表7
Figure BDA0002079509590000131
Figure BDA0002079509590000141
由图2和表7可见，在该色谱条件下，3-正丁基-3-羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮和丙基苯酞的分离度仅为0.78，不符合高效液相关于分离度大于1.5的要求。
对比例3
色谱条件：色谱柱为GL-C18，4.6mm×250mm，5μm。
流动相：A相为20mmol/L K2HPO4溶液，磷酸调pH至7.5；B相为乙腈。
检测波长280nm流速：1.0ml/min，柱温：30℃，进样量：20μl。
稀释溶剂：A相-B相(80:20)(体积比)。
梯度洗脱条件见表8。
表8
时间(分钟) 0 5 30 45 45.1 55
A％ 20 25 63 63 20 20
B％ 80 75 37 37 80 80
溶液配制及测定法：
精密称取丁苯酞、2-(ɑ-羟基戊基)苯甲酸钾、苯酞、2-(ɑ-羰基戊基)苯甲酸、甲基苯酞、乙基苯酞、丙基苯酞、戊基苯酞、邻羧基苯甲醇、邻羧基苯甲醛、异丁基苯酞、仲丁基苯酞、异丁基苯酞各适量，使用稀释溶剂将其配制成含丁苯酞约0.5mg/ml、2-(ɑ-羟基戊基)苯甲酸钾、苯酞、2-(ɑ-羰基戊基)苯甲酸、甲基苯酞、乙基苯酞、丙基苯酞、戊基苯酞、邻羧基苯甲醇、邻羧基苯甲醛、异丁基苯酞、仲丁基苯酞、异丁基苯酞各约1μg/ml的混合溶液，作为供试品溶液；异丁基苯酞单个定位溶液的浓度为5μg/ml。照上述色谱条件，精密量取供试品溶液与异丁基苯酞定位溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱图见图3，供试品的实验数据见表9。
表9
Figure BDA0002079509590000142
Figure BDA0002079509590000151
在上述色谱条件下，单独测定异丁基苯酞定位溶液定位峰的保留时间为32.649min。
由图3可见，仲丁基苯酞因两个旋光异构体呈现保留时间为31.798和31.991的重叠双峰。结合异丁基苯酞定位峰的保留时间为32.649min，确定图3中保留时间为32.914min的色谱峰为异丁基苯酞与丁苯酞的重合峰。且图3中邻羧基苯甲醇与邻羧基苯甲醛的分离度为0.333，不符合分离度大于1.5的要求。因此，需要优化色谱条件，有效分离邻羧基苯甲醇与邻羧基苯甲醛，异丁基苯酞与丁苯酞，使其满足高效液相分离度大于1.5的要求，进而更好地分离并监控药品中的前述有关物质及其含量，保障药品质量实现可控。
实施例1
使用HPLC测定对比例1中相同的物质，将C18柱调整为苯基己基柱，调整流动相并进行梯度洗脱。
色谱柱：Agilent ZORBAX plus Pheny-Hexyl，4.6mm×250mm，5μm。
流动相：A相为0.1％乙酸水溶液(体积比)；B相为乙腈：甲醇(1：1，体积比)。
检测波长227nm，流速：1.0ml/min，柱温：30℃，进样量：50μl。
稀释溶剂：30％乙腈水溶液(体积比)。
梯度洗脱条件见表10。
表10
Figure BDA0002079509590000152
Figure BDA0002079509590000161
溶液配制及测定法
精密称取丁苯酞、2-(ɑ-羟基戊基)苯甲酸钾、苯酞、2-(ɑ-羰基戊基)苯甲酸、乙基苯酞、3-正丁基-3-羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮、丙基苯酞、戊基苯酞及丁烯基苯酞各适量，使用30％乙腈水溶液为稀释溶剂，将其配制成含丁苯酞0.25mg/ml、含杂质2-(ɑ-羟基戊基)苯甲酸钾、苯酞、2-(ɑ-羰基戊基)苯甲酸、乙基苯酞、3-正丁基-3-羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮、丙基苯酞、戊基苯酞及丁烯基苯酞各2.5μg/ml的混合溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1ml，用30％乙腈溶液将其配制成含丁苯酞2.5μg/ml的溶液，摇匀，作为对照溶液。照上述色谱条件，精密量取供试品溶液与对照溶液各50μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品色谱图见图4，供试品的实验数据见表11。
表11
Figure BDA0002079509590000162
由图4和表11可见，在该色谱条件下，苯酞的保留时间为7.232，2-(ɑ-羰基戊基)苯甲酸的保留时间为21.096。相对于对比例1而言，实施例1能够将苯酞和2-(ɑ-羰基戊基)苯甲酸的重合峰进行有效分离，且3-正丁基-3-羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮和丙基苯酞的分离度为2.14，利于分离并监控药品中前述有关物质及其含量，实现药品质量可控。
实施例2
色谱柱：Agilent ZORBAX plus Pheny-Hexyl，4.6mm×250mm，5μm。
流动相：A相为0.1％乙酸水溶液；B相为乙腈：甲醇(1：1)溶液。
检测波长为280nm，流速：1.0ml/min，柱温：30℃，进样量：10μl。
溶剂：35％乙腈水溶液(体积比)；
供试品浓度：3mg/ml。
梯度洗脱条件见表12。
表12
时间(分钟) 0 5 40 50 50.1 60
A％ 75 70 49 35 75 75
B％ 25 30 51 65 25 25
溶液配制及测定法：
精密称取丁苯酞、2-(ɑ-羟基戊基)苯甲酸钾、苯酞、2-(ɑ-羰基戊基)苯甲酸、甲基苯酞、乙基苯酞、3-正丁基-3-羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮、丙基苯酞、戊基苯酞、邻羧基苯甲醇、邻羧基苯甲醛、异丁基苯酞、仲丁基苯酞、异丁基苯酞各适量，使用35％乙腈水溶液(体积比)为稀释溶剂，将其配制成含丁苯酞3mg/ml、2-(ɑ-羟基戊基)苯甲酸钾、苯酞、2-(ɑ-羰基戊基)苯甲酸、甲基苯酞、乙基苯酞、3-正丁基-3-羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮、丙基苯酞、戊基苯酞、邻羧基苯甲醇、邻羧基苯甲醛、异丁基苯酞、仲丁基苯酞、异丁基苯酞各3μg/ml的混合溶液，作为供试品溶液；照上述色谱条件，精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品色谱图见图5，供试品的实验数据见表13。
表13
Figure BDA0002079509590000171
Figure BDA0002079509590000181
实施例2优化了对比例2的流动相组成，即在有机B相中添加甲醇。相对于对比例1而言，能够有效分离苯酞和2-(ɑ-羰基戊基)苯甲酸的重合峰。相对于对比例1-2而言，丙基苯酞与3-正丁基-3-羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮的分离度达到2.97，符合高效液相有关分离度的要求。相对于对比例3而言，邻羧基苯甲醇和邻羧基苯甲醛的分离度为1.95，异丁基苯酞与丁苯酞的分离度为2.10，且其他杂质与杂质，杂质与主成分之间分离度都均符合规定。
实施例3
色谱条件如下：
色谱柱：Agilent ZORBAX plus Pheny-Hexyl，4.6mm×250mm，5μm。
流动相：A相为0.1％乙酸水溶液，B相为乙腈：甲醇(1：1)。
检测波长227nm，流速：1.0ml/min，柱温：30℃，进样量：20μl。
溶剂：30％乙腈水溶液。
供试品浓度：0.25mg/ml。
梯度洗脱条件见表14。
表14
时间(分钟) 0 5 40 50 50.1 60 70
A％ 65 65 45 30 30 65 65
B％ 35 35 55 70 70 35 35
溶液配制及测定法：
精密称取丁苯酞、2-(ɑ-羟基戊基)苯甲酸钾、苯酞、2-(ɑ-羰基戊基)苯甲酸、甲基苯酞、乙基苯酞、3-正丁基-3-羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮、丙基苯酞、戊基苯酞、邻羧基苯甲醇、邻羧基苯甲醛、异丁基苯酞、仲丁基苯酞、异丁基苯酞各适量，使用30％乙腈水溶液，将其配制成含丁苯酞约0.25mg/ml、含2-(ɑ-羟基戊基)苯甲酸钾、苯酞、2-(ɑ-羰基戊基)苯甲酸、甲基苯酞、乙基苯酞、3-正丁基-3-羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮、丙基苯酞、戊基苯酞、邻羧基苯甲醇、邻羧基苯甲醛、异丁基苯酞、仲丁基苯酞、异丁基苯酞各约0.25μg/ml的混合溶液，作为供试品溶液。照上述色谱条件，精密量取供试品溶液50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品色谱图见图6，供试品的实验数据见表15。
表15
Figure BDA0002079509590000191
在该色谱条件下，十四个物质之间的分离度大于1.5。相对于对比例1而言，苯酞和2-(ɑ-羰基戊基)苯甲酸的重合峰能够有效分离。相对于对比例1-2而言，丙基苯酞与3-正丁基-3-羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮的分离度达到3.01。相对于对比例3而言，邻羧基苯甲醇和邻羧基苯甲醛的分离度为1.89，异丁基苯酞与丁苯酞的分离度为2.28。
实施例4
色谱柱：Agilent ZORBAX plus Pheny-Hexyl，4.6mm×250mm，5μm。
流动相：A相为0.1％乙酸水溶液，B相为乙腈：甲醇(1：1)。
检测波长227nm，流速：1.0ml/min，柱温：30℃，进样量：50μl。
溶剂：30％乙腈水溶液(体积比)。
供试品浓度：0.25mg/ml。
梯度洗脱条件见表16。
表16
时间(分钟) 0 5 40 50 50.1 60
A％ 62 62 45 30 62 62
B％ 38 38 55 70 38 38
溶液配制方法及浓度同实施例3，实施例4供试品色谱图见图7。
1、定量限与检测限
十四个物质的检测限为0.55-1.05ng，定量限为1.05-2.10ng。
2、线性与范围
在0.021μg/ml-1.145μg/ml浓度范围内，十四个物质的浓度与峰面积呈良好的线性关系，r均大于等于0.9999。
3、精密度与重复性良好
重复性：同一批次样品，重复测定6次的测得结果无明显差异，表明本法重复性良好。
4、回收率与准确度良好
本方法测得本品中各杂质的高中低3个浓度(限度浓度的50％、100％、150％的溶液)，9份样品的回收率均在90％～110％范围，且其回收率RSD均小于5.0％。表明检测结果符合验证要求，本方法的准确度良好。
5、溶液稳定性良好
有关物质混合样品溶液在室温条件下分别于0h、5h、10h、15h、20h、25h进样检测，各杂质峰面积的RSD均小于2.0％；有关物质供试品溶液在室温条件下分别于0h、5h、10h、15h、20h、25h进样检测，各杂质检出量无明显变化，且未检出新的杂质，说明本品在室温下放置25h，溶液稳定性良好。
6、耐用性较好
本方法经改变柱温、流速、缓冲盐浓度、有机相比例、改变不同厂家色谱柱后，杂质的检出量及检出的杂质个数均无明显变化。
***适用性溶液中，杂质与杂质、杂质与主成分之间的分离度良好，耐用性较好。

Claims (24)

1.一种高效分离检测苯酞衍生物的高效液相色谱法，其特征在于，该方法采用苯基-己基色谱柱，检测波长为226-230nm或280nm，流速为0.8-1.2mL/min，柱温为20-35℃，进样量为10-100μL，流动相由A相和B相组成，其中，A相为pH值3-5的酸溶液，所述的B相为由乙腈和甲醇组成的混合溶剂，B相中乙腈与甲醇的体积比为1：0.8-1.2；
所述的苯酞衍生物选自邻羧基苯甲醇、邻羧基苯甲醛、苯酞、甲基苯酞、乙基苯酞、丙基苯酞、戊基苯酞、异丁基苯酞、仲丁基苯酞、叔丁基苯酞、2-(ɑ-羰基戊基)苯甲酸、2-(ɑ-羟基戊基)苯甲酸或2-(ɑ-羟基戊基)苯甲酸的药用盐、3-正丁基-3-羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮、丁苯酞、丁烯基苯酞中的两种以上；
梯度洗脱条件中A相与B相的体积组成为：
时间(分钟) 0 5 40 50 50.1 60 A％ 62-75 62-70 45-49 30-35 30-75 62-75 B％ 25-38 30-38 51-55 65-70 25-70 25-38
。
2.根据权利要求1所述的高效分离检测苯酞衍生物的高效液相色谱法，其特征在于，A相为体积百分比为0.08-0.12％的乙酸水溶液。
3.根据权利要求1-2任一项所述的高效分离检测苯酞衍生物的高效液相色谱法，其特征在于，A相为体积百分比为0.09％、0.10％或0.11％的乙酸水溶液。
4.根据权利要求1所述的高效分离检测苯酞衍生物的高效液相色谱法，其特征在于，B相中乙腈与甲醇的体积比选自1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.1、1:1.2的任一种。
5.根据权利要求1所述的高效分离检测苯酞衍生物的高效液相色谱法，其特征在于，稀释溶剂用于配置供试品溶液或对照品溶液，稀释溶剂为体积百分比为20-40％的乙腈水溶液。
6.根据权利要求5所述的高效分离检测苯酞衍生物的高效液相色谱法，其特征在于，所述的稀释溶剂为体积百分比为20％、25％、30％或40％的乙腈水溶液。
7.根据权利要求1所述的高效分离检测苯酞衍生物的高效液相色谱法，其特征在于，色谱柱的柱温选自20℃、25℃、30℃、35℃的任一种。
8.根据权利要求1所述的高效分离检测苯酞衍生物的高效液相色谱法，其特征在于，进样量选自10μL、20μL、50μL、100μL的任一种。
9.根据权利要求1所述的高效分离检测苯酞衍生物的高效液相色谱法，所述的梯度洗脱条件选自表1、表2、表3任一所述的A相与B相的体积组成：
表1
时间(分钟) 0 5 40 50 50.1 60 A％ 62 62 45 30 62 62 B％ 38 38 55 70 38 38
表2
时间(分钟) 0 5 40 50 50.1 60 A％ 65 65 45 30 30 65 B％ 35 35 55 70 70 35
表3
时间(分钟) 0 5 40 50 50.1 60 A％ 75 70 49 35 75 75 B％ 25 30 51 65 25 25
。
10.根据权利要求1所述的高效分离检测苯酞衍生物的高效液相色谱法，其特征在于，苯酞衍生物选自2-(ɑ-羟基戊基)苯甲酸或2-(ɑ-羟基戊基)苯甲酸的可药用盐、3-正丁基-3-羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮、丁烯基苯酞、丁苯酞中的两种以上。
11.根据权利要求10所述的高效分离检测苯酞衍生物的高效液相色谱法，其特征在于，2-(ɑ-羟基戊基)苯甲酸的可药用盐选自其钠盐、钾盐、锂盐、钙盐、镁盐、锌盐的任一种。
12.根据权利要求1所述的高效分离检测苯酞衍生物的高效液相色谱法，其特征在于，苯基-己基色谱柱为商购获得。
13.根据权利要求12所述的高效分离检测苯酞衍生物的高效液相色谱法，其特征在于，苯基-己基色谱柱为Agilent或Kinetex公司生产的苯基-己基色谱柱。
14.根据权利要求12-13任一项所述的高效分离检测苯酞衍生物的高效液相色谱法，其特征在于，苯基-己基色谱柱为Zorbax Eclipse Plus、Kinetex Phenyl-Hexyl、AgilentZORBAX plus Pheny-Hexyl的任一种。
15.根据权利要求1所述的高效分离检测苯酞衍生物的高效液相色谱法，其特征在于，苯基-己基色谱柱的尺寸为 4.6mm×250mm，填料粒径为5μm。
16.根据权利要求1所述的高效分离检测苯酞衍生物的高效液相色谱法，其特征在于，所述的苯酞衍生物为邻羧基苯甲醇、邻羧基苯甲醛、苯酞、甲基苯酞、乙基苯酞、丙基苯酞、戊基苯酞、异丁基苯酞、仲丁基苯酞、叔丁基苯酞、2-(ɑ-羰基戊基)苯甲酸、2-(ɑ-羟基戊基)苯甲酸或2-(ɑ-羟基戊基)苯甲酸的药用盐、3-正丁基-3-羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮、丁苯酞和丁烯基苯酞。
17.一种制备高纯度苯酞衍生物的方法，其特征在于，该方法使用苯基-己基色谱柱作为固定相，流动相由A相和B相混合而成，所述的A相为pH值3-5的酸溶液，所述的B相为由乙腈和甲醇组成的混合溶剂，B相中乙腈与甲醇的体积比为1：0.8-1.2，流动相的流速为0.8-1.2mL/min，柱温：20-35℃；
所述的苯酞衍生物选自邻羧基苯甲醇、邻羧基苯甲醛、苯酞、甲基苯酞、乙基苯酞、丙基苯酞、戊基苯酞、异丁基苯酞、仲丁基苯酞、叔丁基苯酞、2-(ɑ-羰基戊基)苯甲酸、2-(ɑ-羟基戊基)苯甲酸或2-(ɑ-羟基戊基)苯甲酸的药用盐、3-正丁基-3-羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮、丁苯酞、丁烯基苯酞中的两种以上；
梯度洗脱条件中A相与B相的体积比组成为：
时间(分钟) 0 5 40 50 50.1 60 A％ 62-75 62-70 45-49 30-35 30-75 62-75 B％ 25-38 30-38 51-55 65-70 25-70 25-38
。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，A相为体积百分比为0.08-0.12％的乙酸水溶液。
19.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，A相为体积百分比为0.09％、0.10％或0.11％的乙酸水溶液。
20.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，B相中乙腈与甲醇的体积比选自1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.1、1:1.2的任一种。
21.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，苯酞衍生物选自2-(ɑ-羟基戊基)苯甲酸或2-(ɑ-羟基戊基)苯甲酸的可药用盐、3-正丁基-3-羟基-1(3H)-异苯并呋喃酮、丁烯基苯酞、丁苯酞中的两种以上。
22.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：
分离收集获得溶解目标苯酞衍生物的洗脱溶液，将收集到的洗脱溶液经蒸发、分离、洗涤、干燥，制得高纯度的目标苯酞衍生物。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，干燥选自减压干燥、冷冻干燥、真空干燥、喷雾干燥的任一种或其组合。
24.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述2-(ɑ-羟基戊基)苯甲酸的可药用盐选自其钠盐、钾盐、锂盐、钙盐、镁盐、锌盐的任一种。
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