CN110105451B - IL-4Rα抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

IL‑4Rα抗体及其用途。本发明属于抗体技术领域，提供了一种与人白细胞介素‑4受体(hIL‑4R)特异性结合的抗体或其抗原结合片段，包含该抗体或抗原结合片段的药物组合物及其用途。另外，本发明还提供了编码该抗体的核酸分子、包含该核酸分子的载体和宿主细胞，以及制备该抗体的方法。

Description

IL-4Rα抗体及其用途

技术领域

本发明属于抗体技术领域，涉及一种人源化的IL-4R抗体，以及该抗体在治疗与IL-4/IL-4Rα信号传导相关的疾病中的用途。

背景技术

过敏性疾病(例如过敏性鼻炎)可以通过抗组胺药和特异性免疫药得到很好的治疗，然而对于一些更为严重的过敏性疾病如特应性皮炎及哮喘等缺乏特异性的治疗方法，非特异性免疫抑制仍然是主要的治疗方式。

全球大约超过2.35亿哮喘患者，其中大约10-20％的患者不能由现有药物得到有效控制(哮喘恶化)且这部分患者的治疗费用占据所有哮喘治疗支出的80％。特应性皮炎影响10-20％儿童及3-10％成人，其中大约20％患者为中重度特应性皮炎，目前并没有有效的治疗药物。

口服/静脉注射广谱免疫抑制剂如类固醇、环孢菌素A、甲氨蝶呤、硫唑嘌吟及麦考酚酸莫酯等可有效缓解疾病症状。这些免疫抑制剂的活性主要来源于靶向炎症的下游调控因子(如转录因子)：如类固醇结合糖皮质激素受体进而抑制驱动炎症的关键转录因子表达(如NF-kB)；环孢菌素A是一种钙依赖磷酸酶抑制剂，可通过转录因子活化T细胞核因子(NFAT)阻止T细胞活化和增殖所需要的IL-2表达。

全身性用药广谱免疫抑制剂由于其多效性常常导致一系列副作用，如体液潴留、葡萄糖不耐受、高血压、肌无力、骨质疏松、下丘脑-垂体-肾上腺轴系抑制以及增加感染风险。虽然局部用药(如吸入剂、外用滴剂、皮喷剂、软膏等)可减少全身性用药的副作用，但是难以有效治疗严重过敏性疾病。如辉瑞去年12月份获批的非甾体PDE4抑制剂Eucrisa仅对轻度至中度特应性皮炎患者有效。

鉴于过敏性疾病特别是特应性皮炎和哮喘的高发病率以及广谱免疫抑制剂治疗的局限性(安全性及有效性)，尤其是对于部分严重患者，存在未被满足的临床需求，需要更为安全有效的特异性治疗药物。

2型炎症通路描述的是Th2细胞扮演关键角色的一种炎症通路。Th2细胞通过分泌2型细胞因子IL-4、IL-5和IL-13在2型炎症通路中起到关键作用。IL-4可促进Th细胞分化为Th2细胞并增殖，Th2细胞进一步产生IL-4、IL-5和IL-13。IL-5可促进骨髓中嗜酸性粒细胞分化，IL-4、IL-5和IL-13可促使嗜酸性粒细胞转移到特定的组织，IL-4和IL-13还可B细胞的血清型转变进而产生IgE，IL-13还在黏液分泌、杯状细胞增生、平滑肌收缩、胶原产生等方面有重要作用。

2型炎症通路激活的典型标志是IgE、嗜酸性粒细胞及TARC升高，如果2型免疫反应激活过度就会产生严重过敏性疾病，在不同的组织具有不同的疾病表现形式，按照发生的部位不同可分为特应性皮炎、慢性鼻窦炎鼻息肉和哮喘等。

IL-4和IL-13是强效的2型免疫反应的调节子，根据结合受体的不同表现出对应的功能。IL-4和IL-13虽然仅有25％的氨基酸同源性，但是它们的受体复合物(I型受体和II型受体)有一个共同的组成部分IL-4Rα，根据表达分布的细胞不同发挥不同的作用。IL-4可通过I型受体和II型受体发挥作用，而IL-13仅能通过II型受体发挥作用。IL-4与IL-4Rα高亲和力结合且不依赖于γ-链或IL-13Rα1，而IL-4Rα可提高IL-13结合13Rα1的亲和力。

严重过敏性疾病的直接表现是呈现出高浓度的IgE和嗜酸性粒细胞，因此早期靶向2型炎症通路的抗体靶点是IgE，但是后来的研究发现靶向IgE对严重过敏性疾病的治疗并不具备普适性。随着对2型炎症通路的进一步了解，2型炎症通路的关键驱动因子IL-4和IL-13成为新一代治疗严重过敏性疾病抗体药物的热门研究靶点。

IL-4的生物活性是由特定的细胞表面IL-4受体介导的。人体IL-4受体α(hIL-4Rα)抗体在美国专利5717072和7186809中均有描述。而美国专利5714146、5985280和6716587中描述了使用hIL-4R抗体的一些方法。WO2005047331中涉及由Immunex开发的一种IL-4Rα重组蛋白Altrakincept，通过喷雾给药竞争性结合IL-4，抑制体内IL-4与细胞表面IL-4Rα的结合；US6358509中公开了由GSK开发的一种IL-4抗体Pascolizumab，阻止IL-4结合IL-4Rα。这两种IL-4抑制剂虽然在早期研究(临床前、I期临床)中显示较好疗效，但是在大型的后期临床中并没有显示疗效，目前已经停止开发。US8679487中公开了Amgen公司早期也开发了一种IL-4受体α抗体AMG-317，是一种全人源IL-4Rα抗体，抑制IL-4和IL-13的活性，但在治疗哮喘的II期临床遭遇失败而停止开发。

抗-IL-13抗体分子的实例包括：US07/0128192或WO2005007699公开的CAT-354；WO2005062967和WO2005062972中公开的TNX-650和Clinical Trails Gov.Identifier公开的NTC00441818；Clinical Trails Gov.Identifier公开的QAX-576(NTC532233)；以Abgenix的名义提交的US20060140948或WO2006055638，Amgen的US6468528；一Centocor，Inc作为申请人的WO2005091856；以及如在以Glaxo的名义提交的WO2007080174中公开的和以Novartis名义在WO2007045477中公开的抗-IL-13抗体。

典型地如AstraZeneca开发的IL-13抗体Tralokinumab，预计2017年下半年可获得治疗重度哮喘的III期临床结果，有望成为全球首个上市的IL-13抗体。同时AstraZeneca与Abbott共同开发基于生物标志物periostin和DPP4的伴随诊断方法。除此之外，Tralokinumab也已经完成治疗特异性皮炎的IIb期临床试验。

Roche开发的一种IL-13抗体药物Lebrikizumab，2016年2月末，罗氏披露了2项三期临床试验数据，结果一胜一负。在LavoltaI中，显示Lebrikizumab可以显著降低哮喘恶化率，而在LavoltaII中，则未能得到类似结果。根据在2017JP Morgan会议中披露的信息，Roche已经停止哮喘适应症的开发，而在COPD、特应性皮炎、特发性肺纤维化的多个II期临床正在进行中。

在前期的IL-4或IL-13单功能抑制剂开发遇到了诸多挫折(目前还没有产品上市)后，人们想到同时阻断IL-4和IL-13也许是一种可行的途径。同时阻断IL-4和IL-13有至少两种方法可以实现：一是IL-4Rα抗体；二是IL-4和IL-13的双特异性抗体。

同时靶向IL-4和IL-13的在研药物有Sanofi的SAR156597，公开于WO2009052081中，是一种双可变结构域Ig(DVD-Ig)双特异性抗体，用于治疗***性硬皮病和特发性肺纤维化，目前处于II期临床。

WO2005023860涉及Aerovance开发的一种IL-4突变体Pitrakinra，可高亲和力结合IL-4Rα，是IL-4和IL-13的双重拮抗剂，可显著改善哮喘患者的FEV1(一秒用力呼气容积)。PEG修饰的Pitrakinra(Aeroderm)是第一个进行特应性皮炎临床试验的双重阻断剂，虽然显示一定的症状改善但疾病终点改善不具备统计意义。

除此之外，Roche也曾经通过“Knobs into Holes”技术平台做过基于Lebrikizumab改造的靶向IL-4和IL-13双特异性抗体，但是目前未见临床进展。Regeneron通过Dual Trap技术制备的IL-4Rα和IL-13Rα融合蛋白在早期临床研究中取得了很好的效果(降低生物标志物)，但由于缺乏资金而停止。

WO2010053751涉及Regeneron公司开发的一种IL-4Rα抗体，可同时阻断IL-4和IL-13从而调节2型免疫。该专利申请中的抗体涉及6个互补决定区，其序列分别是：

HCDR1为：Gly-Phe-Thr-Phe-X5-X6-Tyr-X8，其中X5为Asp或Arg(优选为Arg)，X6位ASP或Ser(Asp)，X8位Ala或Gly(Ala)

HCDR2为X1-Ser-X3-X4-X5-X6-X7-X8，其中X1＝Ile或Leu(优选为Ile)，X3＝Gly，Tyr或Arg，X4＝Ser，Asp或Thr，X5＝Gly或Ser(优选为Gly)，X6＝Gly、Ser或Val，X7＝Ser或Asn(优选为Asn)，且X8＝Thr、Lys或Ile

HCDR3为

Ala-Lys-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-X⁸-X⁹-X¹⁰-X¹¹-X¹²-X¹³-X¹⁴-X¹⁵-X¹⁶-X¹⁷-X¹⁸，其中X3＝Asp、Glu或Trp，X4＝Gly或Arg，X5＝Leu、Thr或Arg，X6＝Gly、Arg或Ser，X7＝Ile或Gly，X8＝Thr、Phe或Tyr，X9＝Ile、Asp或Phe，X10＝Arg、Tyr或Asp，X11＝Pro、Tyr或缺失，X12＝Arg或缺失，X13＝Tyr或缺失，X14＝Tyr或缺失，X15＝Gly或缺失，X16＝Leu或缺失，X17＝Asp或缺失，且X18＝Val或缺失

LCDR1为Gln-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-X⁸-X⁹-X¹⁰-X¹¹，其中X2＝Asp、Ser或Val，X3＝Ile或Leu，X4＝Ser、Leu或Asn，X5＝Asn、Tyr或Ile，X6＝Trp、Ser或Tyr，X7＝Ile或缺失，X8＝Gly或缺失，X9＝Tyr或缺失，X10＝Asn或缺失，X11＝Tyr或缺失

LCDR2为X¹-X²-Ser，其中X1＝Leu、Ala或Val，X2＝Ala或Gly

LCDR3为X¹-Gln-X³-X⁴-X⁵-X⁶-Pro-X⁸-Thr，其中X1＝Gln或Met，X3＝Ala或Tyr，X4＝Leu或Asn，X5＝Gln或Ser，X6＝Thr、Phe或His，X8＝Tyr、Ile或Trp。

作为蛋白类药物，蛋白质一级结构的氨基酸序列是蛋白质空间结构的基础，而空间结构又直接决定其功能，氨基酸序列的微小变化可能会导致空间结构的巨变，进而导致功能发生改变。抗体的可变区包括6个互补决定区(CDR)，即重链的HCDR1，HCDR2，HCDR3和轻链的LCDR1，LCDR2，LCDR3。其中HCDR3在结构和序列上是最高度可变的，也是最能体现抗体结合的多样性和特异性的关键区域。抗体的互补决定区是维持抗体活性的关键区域，很多情况下即使将其中某一个改变为性质相似的氨基酸也会严重影响整个抗体与抗原的结合，进而影响其生物活性。而任何CDR区域的改造会给抗体的活性带来什么样的变化更是难于预知的。

本发明的申请人出人意料地发现，将dupilumab(度匹鲁单抗)抗体的HCDR3中的108位R变为A或者E的时候可以增加抗体与抗原的结合能力(EC50增加超过50％)，而将108位的R变为其他有代表性的氨基酸如Y、L或Q的时候结合活性均降低50％以上。同样是将R变为A或者E，特别是将106位R变为A或者E的时候，结合活性(EC50)则降低了5-10倍。因此，本发明提供了一种结合活性显著优于度匹鲁单抗的新的IL-4Rα抗体，该抗体通过与IL-4Rα的结合，同时阻断IL-4和IL-13从而调节2型免疫。

基于WHO药物公开的信息(WHO Drug Information,Vol.26,No.4,2012)，度匹鲁单抗的氨基酸序列为：

重链氨基酸序列如下：

EVQLVESGGGLEQPGGSLRLSCAGSGFTFRDYAMTWVRQAPGKGLEWVSSISGSGGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRLSITIRPRYYGLDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG

轻链氨基酸序列如下：

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSIGYNYLDWYLQKSGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGFYYCMQALQTPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

发明概述

本发明的目的之一在于提供与人IL-4Rα特异性结合的抗体或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段与目前已有的dupilumab(度匹鲁单抗)抗体相比，其与IL-4R的亲和力得到进一步改善。该度匹鲁单抗变体相对于度匹鲁单抗包含如下氨基酸替换：LVR第24位氨基酸Arg突变为Ala，或第28位氨基酸Ser突变为Arg，或第32位氨基酸Ser突变为Arg或Lys；HVR第100位Arg突变为Ala，或第106位Arg突变为Ala或Glu，或第108位Arg突变为Ala、Glu、Gln、Tyr或Leu。具体地，本申请涉及一种抗体，其为度匹鲁单抗变体，其中，度匹鲁单抗的重链可变区(HVR)第108位Arg突变为Ala或Glu。

具体地，本发明一方面涉及一种与人白细胞介素-4受体α(hIL-4Rα)特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(HVR)和轻链可变区(LVR)，其中，重链可变区包含：氨基酸序列为Gly-Phe-Thr-Phe-Arg-Asp-Tyr-Ala的CDR1(HCDR1)；氨基酸序列为Ile-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly-Asn-Thr的CDR2(HCDR2)；和，氨基酸序列为Ala-Lys-Asp-Xaa1-Leu-Ser-Ile-Thr-Ile-Xaa2-Pro-Xaa3-Tyr-Tyr-Gly-Leu-Asp-Val的CDR3(HCDR3)，其中Xaa1为Arg或Ala，Xaa2为Arg、Ala或Glu，Xaa3为Arg、Ala或Glu；

轻链可变区包含：氨基酸序列为Gln-Xaa4-Leu-Leu-Tyr-Xaa5-Ile-Gly-Tyr-Asn-Tyr的CDR1(LCDR1)，其中Xaa4为Ser或Arg，Xaa5为Ser、Arg或Lys；氨基酸序列为Leu-Gly-Ser的CDR2(LCDR2)；和，氨基酸序列为Met-Gln-Ala-Leu-Gln-Thr-Pro-Tyr-Thr的CDR3(LCDR3)。

在一个优选实施方案中，所述HCDR3和LCDR1为如下氨基酸序列(a)HCDR3：Ala-Lys-Asp-Xaa1-Leu-Ser-Ile-Thr-Ile-Xaa2-Pro-Xaa3-Tyr-Tyr-Gly-Leu-Asp-Val，其中Xaa1为Arg，Xaa2为Arg，Xaa3为Ala或Glu；和，LCDR1：Gln-Xaa4-Leu-Leu-Tyr-Xaa5-Ile-Gly-Tyr-Asn-Tyr，其中Xaa4为Ser，Xaa5为Ser；(b)HCDR3：Ala-Lys-Asp-Xaa1-Leu-Ser-Ile-Thr-Ile-Xaa2-Pro-Xaa3-Tyr-Tyr-Gly-Leu-Asp-Val，其中Xaa1为Arg，Xaa2为Ala或Glu，Xaa3为Arg；和，LCDR1：Gln-Xaa4-Leu-Leu-Tyr-Xaa5-Ile-Gly-Tyr-Asn-Tyr，其中Xaa4为Ser，Xaa5为Ser；(c)HCDR3：Ala-Lys-Asp-Xaa1-Leu-Ser-Ile-Thr-Ile-Xaa2-Pro-Xaa3-Tyr-Tyr-Gly-Leu-Asp-Val，其中Xaa1为Ala，Xaa2为Arg，Xaa3为Arg；和，LCDR1：Gln-Xaa4-Leu-Leu-Tyr-Xaa5-Ile-Gly-Tyr-Asn-Tyr，其中Xaa4为Ser，Xaa5为Ser；(d)HCDR3：Ala-Lys-Asp-Xaa1-Leu-Ser-Ile-Thr-Ile-Xaa2-Pro-Xaa3-Tyr-Tyr-Gly-Leu-Asp-Val，其中Xaa1为Arg，Xaa2为Arg，Xaa3为Arg；和，LCDR1：Gln-Xaa4-Leu-Leu-Tyr-Xaa5-Ile-Gly-Tyr-Asn-Tyr，其中Xaa4为Arg，Xaa5为Ser；(e)HCDR3：Ala-Lys-Asp-Xaa1-Leu-Ser-Ile-Thr-Ile-Xaa2-Pro-Xaa3-Tyr-Tyr-Gly-Leu-Asp-Val，其中Xaa1为Arg，Xaa2为Arg，Xaa3为Arg；和，LCDR1：Gln-Xaa4-Leu-Leu-Tyr-Xaa5-Ile-Gly-Tyr-Asn-Tyr，其中Xaa4为Ser，Xaa5为Arg或Lys。

在一个优选实施方案中，所述HVR的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。在一个优选实施方案中，所述LVR的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。在一个优选实施方案中，所述LVR的氨基酸序列选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9。在一个优选实施方案中，所述HVR的氨基酸序列选自SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：25。

在一个优选实施方案中，所述HVR和LVR选自如下的氨基酸序列组合：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：2，或，SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：2。

在最优选的实施方案中，所述HVR和LVR选自如下的氨基酸序列组合：SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：2，或，SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：2。

另一方面，本发明还涉及一种药物组合物，其包含本发明所述的抗体或其抗原结合片段和可药用载体。同时，本发明还涉及一种分离的核酸分子，其编码本发明所述的抗体或其抗原结合片段；一种表达载体，含有本发明所述核酸分子，以及包含本发明所述的表达载体的宿主细胞，优选真核细胞。

另一方面，本发明涉及一种制备与人IL-4R特异性结合的抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括在有利于本发明所述的抗体或其抗原结合片段表达的条件下表达本发明所述的核酸分子，并回收表达的抗体或其抗原结合片段。

另一方面，本发明涉及抗体或其抗原结合片段在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗人体与IL-4/IL-4Rα信号传导相关的疾病或病症。在一个优选实施方案中，所述疾病或病症选自：哮喘、过敏性皮炎、关节炎、疱疹、慢性原发性荨麻疹、硬皮病、肥大性瘢痕、Whipole病、良性***增生、COPD、特应性皮炎、特发性肺纤维化、变应性反应、川崎病、镰状细胞病、Churg-Strauss综合征、格雷夫斯氏病、先兆子痫、舍格伦综合征、自体免疫淋巴组织增生性综合征、自体免疫性溶血性贫血、巴雷特食管、自体免疫葡萄膜炎、结核病或肾病。

另一方面，本发明涉及一种预防或治疗人体与IL-4/IL-4Rα信号传导相关的疾病或病症的方法，包括给药受试者权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。在一个优选实施方案中，所述疾病或病症选自：哮喘、过敏性皮炎、关节炎、疱疹、慢性原发性荨麻疹、硬皮病、肥大性瘢痕、Whipole病、良性***增生、COPD、特应性皮炎、特发性肺纤维化、变应性反应、川崎病、镰状细胞病、Churg-Strauss综合征、格雷夫斯氏病、先兆子痫、舍格伦综合征、自体免疫淋巴组织增生性综合征、自体免疫性溶血性贫血、巴雷特食管、自体免疫葡萄膜炎、结核病或肾病。在一个优选实施方案中，所述疾病或病症为过敏性皮炎或哮喘。在一个优选实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与其它的治疗自身免疫性疾病的药物联合使用。在一个优选实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与激素类药物、免疫抑制剂或抗组织胺类药物联合使用。

另一方面，本发明涉及一种制品或药盒，包含容器和包装插页，其中所述容器中装有本发明所述的抗体或其抗原结合片段，或者本发明所述的药物组合物，所述包装插页上载有药物的使用说明书。在一个优选实施方案中，该制品或药盒进一步包含一个或多个容器，该容器中装有一种或多种预防或治疗人体与IL-4/IL-4Rα信号传导相关的疾病或病症的其它药物。在一个优选实施方案中，所述其它药物为激素类药物、免疫抑制剂或抗组织胺类药物。

附图说明

图1为dupilumab(度匹鲁单抗)变体D1-D9的SDS-PAGE图：泳道1为分子量标志物(marker)，泳道2为D1，泳道3为D2，泳道4为D3，泳道5为D4，泳道6为D5，泳道7为D6，泳道8为D7，泳道9为D8，泳道10为D9。

图2为度匹鲁单抗变体D8的SEC检测图。

图3为度匹鲁单抗及度匹鲁单抗变体D5、D7、D8和D9的体外中和IL-4的生物效应图，度匹鲁单抗仅能够抑制92％的细胞生长，而D8和D9具有更好的抑制效果，抑制率达98％，明显优于度匹鲁单抗。

图4A-4H显示不同储存条件，例如高温、强光照射、反复冻融、强酸条件下度匹鲁单抗及度匹鲁单抗变体的稳定性对比结果。图4A为50℃条件下三个样品的SEC结果图，图4B为50℃条件下三个样品的ELISA结果图。图4C为反复冻融条件下三个样品的SEC结果图，图4D为反复冻融条件下三个样品的ELISA结果图。图4E为4500lx条件下三个样品的SEC结果图，图4F为4500lx条件下三个样品的ELISA结果图。图4G为强酸条件下三个样品的SEC结果图，图4H为强酸条件下三个样品的ELISA结果图。

发明详述

1.定义：

“IL-4R”即CD124，为由825个氨基酸(信号肽域25个、细胞外域207个、膜贯通部24个、细胞内域569个)组成的Ⅰ型膜贯通性糖蛋白。细胞外域有1个CKR-SF域和1个Ⅲ型纤维蛋白域，有6处N结合型糖链黏着部位。分布于T细胞、B细胞、NK细胞、单核/巨噬细胞、中性粒细胞、造血前驱细胞、肥大细胞、内皮细胞、成纤维细胞、角化细胞等，IL-4R和IL-13R的α链相当，结合了IL-4后可引起若干细胞内蛋白被酪氨酸磷酸化。

“与IL-4/IL-4Rα信号传导相关的疾病”意指其中涉及由IL-4/IL-4Rα信号传导介导的生物学功能的疾病。与IL-4/IL-4Rα信号传导相关的疾病的例子包括例如炎性疾病或病症，如哮喘、特应性皮炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、炎性肠病、多发性硬化、关节炎、过敏性鼻炎、嗜酸细胞性食管炎和牛皮癣。

在一些实施例中，与IL-4/IL-4Rα信号传导相关的疾病是气道炎症。在一些实施例中，与IL-4/IL-4Rα信号传导相关的疾病是皮肤炎症或特应性皮炎。

“变应性反应”、“变应性疾病”或“变应性病症”被视为遗传和环境因素交互作用引起的炎症性疾病。变应性疾病发生有关的分子和细胞免疫机制包括天然免疫刺激减弱导致的T细胞免疫球蛋白黏蛋白区域分子表达的改变.辅助性T细胞1、2型平衡的改变和调节性T细胞平衡的改变等多种因素。在变应性疾病中，特应性皮炎、哮喘和变应性鼻炎是患有***反应的患者中最常见的炎性状况；这些患者通常遭受多重临床症状的发作。***反应的发病机制与针对外源性抗原的异常免疫应答有关(Mueller等人(2002)Structure,binding,and antagonists in the IL-4/IL-13receptor system,Biochim Biophys Acta 1592:237-250)。抗原特异性IgE的过度生产是触发变应性炎症的必要因素。异常2型T辅助细胞(Th2)极化促成增加的IgE应答。活化的T细胞产生的白细胞介素-4(IL-4)和白细胞介素-13(IL-13)是引发和维持***反应中的免疫和炎症反应的主要Th2细胞因子。

IL-4和IL-13信号传导通过具有共享亚基IL-4受体α(IL-4Rα)的两种不同的受体复合物介导，这可促成这两种细胞因子之间的重叠生物应答。IL-4Rα形成两种不同的异二聚受体复合物，以组织和应答特异性方式介导IL-4和IL-13的生物学功能。度匹鲁单抗是针对人IL-4Rα的拮抗性单克隆抗体，其抑制由IL-4和IL-13诱导的生物活性。度匹鲁单抗通过阻止其与受体亚基的结合来阻断IL-4信号转导，而对IL-13信号传导的抑制作用有可能通过干扰二聚受体相互作用来介导。

度匹鲁单抗，作为针对共享的IL-4Rα亚基的全人单克隆抗体，由RegeneronPharmaceuticals,Inc.开发，目前处于治疗中度至重度哮喘和治疗中度至重度特应性皮炎的临床试验中。

本文所述“抗体”由四条肽链即由二硫键互联的两条重链(H)和两条轻链(L)组成的免疫球蛋白分子，每条重链包含重链可变区(HVR或VH)和重链恒定区，重链恒定区包含CH1、CH2和CH3三个结构域，每条轻链包括轻链可变区(LVR或VL)和轻链恒定区，轻链恒定区包含一个结构域(CL1)，VH和VL区可进一步分成被称为互补决定区(CDR)的高变区，其中散布着较保守的被称为框架区(FR)的区域，每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按下列次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。本文中，重链恒定区可选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，优选IgG4，而轻链恒定区选自κ或λ。

术语“可变区”在本文中用于描述抗体的某些部分在抗体序列间有差异且涉及特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的区域。然而，变异性通常不是均匀分布于抗体的整个可变区的。它典型的集中于轻链和重链可变区中称作互补决定区(CDR)或高变区的三个区段。可变区中相对比较保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变区各自包含四个FR，它们大多采取β-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个CDR连接。每条链中的CDR通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的CDR一起促成抗体的抗原结合位点的形成。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应物功能，诸如抗体依赖性细胞毒性中抗体的参与。

术语“互补决定区”、“高变区”和“CDR”指抗体轻链或重链的可变区中存在的高变区或互补决定区(CDR)的一个或多个(参见，Kabat，E.A.等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，Md.，(1987))。这些术语包括Kabat等人定义的高变区(“SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，”KabatE.，等人，USDept.ofHealthandHumanServices，1983)或抗体三维结构中的高变环(Chothia和Lesk，J Mol.Biol.196901-917(1987))。每条链中的CDR通过构架区保持紧密靠近，并且与来自其它链的CDR一起促进抗原结合位点的形成。

术语“构架区”和“FR”指抗体轻链和重链的可变区内构架区的一个或多个(参见，Kabat，E.A.等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，Md.，(1987))。这些术语包括抗体轻链和重链中位于氨基末端和第一CDR之间的那些氨基酸序列，介于CDR之间的那些以及第三CDR和恒定区起点之间的那些氨基酸序列。

CDR和FR残基可以根据标准序列定义(Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInteres,NationalInstitutesofHealth，BethesdaMd.(1987))和结构定义(Chothia和Lesk，J.Mot.Biol.196：901-217(1987))来确定。

在本文指出时，参考Kabat，E.A.，等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(NationalInstitutesofHealth，Bethesda，Md.(1987)和(1991)的编号方案。Kabat利用为所列序列中每个氨基酸分配残基编号的方法，并且分配残基编号的该方法已经成为本领域的标准。当明确指出使用Kabat编号时，本说明书遵循Kabat编号方案。当未指出Kabat编号时，使用顺序氨基酸序列编号(即，序列中的氨基酸使用顺序整数(1、2、3等)以氨基末端到羧基末端的方向从左到右编号。

抗体对抗原或表位的“亲和力”是本领域很好理解的术语，并且表示抗体对表位结合的程度或强度。亲和力可以本领域已知的多种方式测量和/或表示，包括但不限于平衡解离常数(KD或Kd，它可以被定义为抗体的解离速率与结合速率的比率，即，K_off/K_on)、表观平衡解离常数(KD′或Kd′)和IC50(实现竞争测定中50％抑制所需的量)；人源化抗体的相对亲和力也可以通过与例如相关的鼠或嵌合抗体比较来确定。对于本发明目的而言，亲和力是结合抗原或表位的具体抗体群体的平均亲和力。抗体的亲和力可以使用酶联免疫吸附测定(ELISA)或荧光激活的细胞分选(FACS)测定来测量，本文实施例采用了ELISA方法测定本发明抗体与IL-4R的亲和力，参见实施例所述。

2.本发明抗体的制备方法

本发明抗体可以通过任何可用的方法生产，例如重组表达技术。编码与恒定区可操作连接的轻链和重链可变区的核酸可以被***表达载体。轻链和重链可以在相同或不同表达载体中克隆。编码免疫球蛋白链的DNA区段可以被可操作连接至确保免疫球蛋白多肽表达的表达载体的控制序列。表达控制序列包括但不限于启动子(例如，天然结合的或异源的启动子)、信号序列、增强子元件和转录终止序列。在一个实施方案中，表达控制序列是能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的原核启动子***。一旦载体被引入适当的宿主，宿主被保持在适合高水平表达核苷酸序列和收集并纯化抗体的条件下。

表达载体可以是在任何宿主生物体中可复制的，作为附加体或作为宿主染色体DNA的整合部分。在一个实施方案中，表达载体含有选择标记(例如，氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性或新霉素抗性)以允许检测经预期DNA序列转化的那些细胞。

表达载体可用于从任何宿主细胞表达本发明的抗体，包括原核宿主细胞(例如大肠杆菌)、酵母宿主细胞、哺乳动物宿主细胞、植物宿主细胞和昆虫宿主细胞。

在一个实施方案中，使用大肠杆菌生产本发明抗体。适合这种应用的其他原核宿主包括杆菌，例如芽孢杆菌和其他肠杆菌科，例如沙门氏菌属、赛氏杆菌属和各种假单胞杆菌种。在这些原核宿主中，还可以制备表达载体，该表达载体通常含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如复制起点)。此外，将存在任何数目的多种公知启动子，例如乳糖启动子***、色氨酸(trp)启动子***、β-内酰胺酶启动子***或来自λ噬菌体的启动子***。启动子通常任选地与操纵子序列一起控制表达，并且具有核糖体结合位点序列等，用于起始和完成转录和翻译。

其他微生物例如酵母也可用于表达本发明抗体。例如，酵母菌属可用作酵母宿主，具有含有表达控制序列(例如启动子)、复制起点、终止序列及所需其他序列的适合启动子。用于酵母表达技术的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶启动子。可诱导的酵母启动子包括但不限于来自醇脱氢酶、异细胞色素C和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。

在另一个实施方案中，哺乳动物组织细胞培养物可用于表达和生产本发明抗体。任何哺乳动物组织细胞可以用于此类方法，并且本领域已经开发了能够分泌异源蛋白(例如完整免疫球蛋白)的许多适合的宿主细胞系，包括哺乳动物BHK或CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞系、优选骨髓瘤细胞系或转化的B细胞或杂交瘤。在一个实施方案中，细胞是非人的。哺乳动物细胞的表达载体可以包括表达控制序列，例如复制起点、启动子和增强子，以及必要的加工信号位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。在一个实施方案中，表达控制序列是源自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛***瘤病毒、巨细胞病毒等的启动子。

含有感兴趣的多核苷酸序列(例如重链和轻链编码序列和表达控制序列)的载体可以通过公知方法转移至宿主细胞，所述方法根据细胞宿主类型而改变。例如，氯化钙转染常用于原核细胞，而磷酸钙处理、电穿孔、脂质转染、生物弹道术或病毒转染可以用于其它细胞宿主。用于转化哺乳动物细胞的其他方法包括使用凝聚胺(polybrene)、原生质体融合、脂质体、电穿孔和显微注射。为了生产转基因动物，转基因可以被显微注射入受精卵，或者可以被引入胚胎干细胞基因组，此类细胞的核被转移入去核***。

当编码重链和轻链的核酸分子被克隆入单独表达载体时，该载体可以被共转染以获得表达并组装完整免疫球蛋白。一经表达，完整抗体、其二聚体、单个的轻链和重链、或抗体的其它免疫球蛋白形式可以根据本领域的标准方法纯化，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱色谱、HPLC纯化、凝胶电泳等。至少约90至95％同质性的基本上纯的免疫球蛋白可以被制备用于药物用途。在另一个实施方案中，至少约98至99％或更高同质性的基本上纯的人源化抗体可以被生产用于药物配制和方法。

因此，本发明提供了表达本发明抗体的方法，包括：(a)用编码本文所述抗体的核酸分子转化宿主细胞，和(b)在允许表达该抗体的条件下培养转化的宿主细胞。可以使用在载体上包括选择标记的已知技术，使得表达所述抗体的所述标记的宿主细胞可以容易被选择。

所述抗体的“抗原结合片段”或称为抗体的“抗原结合部分”指抗体保留了与抗原(如hIL-4R)特异性结合能力的一个或多个片段。业已证明，抗体的抗原结合功能可由全长抗体的某些片段来实现。抗体的“抗原结合片段”的实例包括但不限于：(i)Fab片段，即由VL、VH、CL1和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，即由铰链区的二硫键连接的两个F(ab’)片段组成的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段；以及(vi)CDR。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH是由不同的基因编码，但它们可通过重组方法，由一种合成的接头连接在一起而成为单独的相连的链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv，scFv)。这样的单链抗体也涵盖在抗体的“抗原结合片段”范围内。

可以通过这样一种方法制备本发明所述抗体，该方法包括在允许抗体表达的条件下，培养含有编码该抗体的DNA序列并能表达该抗体的宿主细胞，然后从培养物中回收产生的抗体。

用来培养细胞的培养基可以是用于培养该宿主细胞的任何常规培养基，如基本培养基或含有适宜添加物的符合培养基。可以通过市售得到适宜的培养基，或根据已公开的制法制备适宜的培养基。然后可以通过常规方法从培养基中回收由该细胞产生的多肽，这些方法包括通过离心或过滤而从培养基中分离宿主细胞，用盐如硫酸铵沉淀上清液或滤液中的蛋白质成分，根据目的肽的种类而选用各种层析方法如例子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等进行纯化。

3.治疗方法和药剂

本发明提供了包含本发明的抗IL-4Rα抗体或其抗原结合片段的药物组合物。本发明的药物组合物将与适当的载体、赋形剂以及其它制剂一起施用。这些制剂纳入配方是为了改善递送和耐受性等。在所有药剂化学家熟知的药典：雷氏药学大全(Remington′sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company，Easton，PA)中可找到大量适当的配方。

给药剂量随受试者年龄和体型大小、目标疾病、症状、施用途径等不同而调整。当本发明的抗体用来治疗成人的各种与IL-4R相关的病症和疾病时，可采用静脉给药本发明抗体，通常单剂按每公斤体重计约0.01至约20mg/kg给药，更优选的是约0.1至约15、约1至约10，或约3至约10mg/kg体重。根据病症的严重性，可对治疗的频度和持续时间进行调整。

已知有各种药物递送***可用来施用本发明的药物组合物，例如包在脂质体、微颗粒、微胶囊中的胶囊化，能够表达变异病毒的重组细胞，受体介导的胞吞作用(参阅如Wu等人(1987)，J.Biol.Chem.262：4429-4432)。给予药物的方法包括但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜，和口腔等途径。该药物组合物可采用任何方便的途径施用，如通过灌注或静脉团注、上皮和粘膜层(如口腔粘膜、直肠和小肠粘膜)吸收，并可与其它生物活性药剂一起施用。施用方式可为全身性或局部性施用。

该药物组合物也可通过液囊递送，尤其是通过脂质体液囊递送(参阅Langer(1990)Science249：1527-1533；Treat等人(1989)in Liposomes in the Therapy ofInfectious Disease and Cancer，Lopez Berestein and Fidler(编著)，Liss，New York,第353-365页；Lopez-Berestein，同上，第317-327页)。

在某些情况下，该药物组合物可以受控释放***递送。在一个实施方案中，可使用泵(参阅Langer，如上；Sefton(1987)CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201)。在另一个实施方案中，可采用聚合物材料(参阅Medical Applications of Controlled Release，Langerand Wise(编著)，CRC Pres.，Boca Raton，Florida(1974)。关于其它受控释放***的讨论见Langer(1990)Science249：1527-1533。

注射制剂可包括用于静脉内、皮下、皮内和肌肉内注射、滴注等的剂型。这些注射制剂可用已公开的方法制备。例如，注射制剂可通过将抗体或其盐溶于、悬浮于或乳化于惯常用于注射的无菌水介质或油介质的方式来制备。用于注射的水性介质有，例如生理盐水、含有葡萄糖和其它辅助剂的等渗溶液等。它们可与适当的增溶剂如醇(如乙醇)、多元醇(如丙二醇、聚乙二醇)、非离子型表面活性剂[如聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50摩尔)加成物)等结合使用。所用的油介质有，如芝麻油、大豆油等。它们可与增溶剂如苯甲酸苄酯、苯甲醇等结合使用。这样制备的注射剂最好封装在适当的安瓿瓶中。

单一治疗和联合治疗本发明的抗体和抗体片段对于治疗可通过降低IL-4活性而得到改善、抑制或者好转的疾病和紊乱很有用。这些疾病包括那些以IL-4异常表达或过度表达或宿主对IL-4生成的异常反应为特征的疾病。用本发明的抗体或抗体片段治疗的与IL-4相关的疾病包括例如关节炎(包括脓毒性关节炎)、疱疹、慢性原发性荨麻疹、硬皮病、肥大性瘢痕、Whipple病、良性***增生、肺病，如哮喘(轻度、中度和重度)、炎症性疾病，如炎症性肠病、变应性反应、川崎病、镰状细胞病、Churg-Strauss综合症、格雷夫斯氏病、先兆子痫、舍格伦综合征、自体免疫淋巴组织增生综合征、自体免疫溶血性贫血、巴雷特食管、自体免疫葡萄膜炎、结核(病)、遗传过敏性皮炎、溃疡性结肠炎、纤维症和肾病(参阅美国专利7,186,809)。

本发明涵盖联合治疗，其中抗IL-4Rα抗体或抗体片段与一种或多种治疗药剂(或称第二种治疗药剂)联合施用。共同给药和联合治疗并不限于同时给药，而是还包括在涉及给予患者至少一种其它治疗药剂的疗程中至少给予一次抗IL-4Rα抗体或抗体片段的治疗方案。第二种治疗药剂可能为另一种IL-4拮抗剂，如另一种抗体/抗体片段，或可溶的细胞因子受体、IgE拮抗剂、可通过吸入或其它适当方式给药的抗哮喘药物(皮质类固醇、非类固醇药剂、β激动剂、白三烯、拮抗剂、黄嘌呤类、氟替卡松、沙美特罗、舒喘宁)。在一个具体的实施方案中，本发明的抗IL-4R抗体或抗体片段可与IL-1拮抗剂，如利纳西普(rilonacept)或IL-13拮抗剂一起施用。第二种药剂可能包括一种或多种白三烯受体拮抗剂，以治疗诸如变应性发炎疾病，如哮喘和过敏症。白三烯受体拮抗剂的实例包括但不限于孟鲁司特、普仑司特和扎鲁司特。第二种药剂可包括细胞因子抑制剂，如一种或多种TNF(依那西普，ENBRELTM)、IL-9、IL-5或IL-17拮抗剂。

本发明还包括本文所述的任何抗IL-4Rα抗体或抗原结合片段在制备治疗疾病或症状的药物中的应用，其中的疾病或症状是通过消除、抑制或降低人白细胞介素-4(hIL-4)活性而得到改善、好转或抑制的。这类疾病或症状的实例包括，例如，关节炎、疱疹、慢性原发性荨麻疹、硬皮病、肥大性瘢痕、Whipple病、良性***增生、肺病、哮喘、炎症性疾病、变应性反应、川崎病、镰状细胞病、Churg-Strauss综合征、格雷夫斯氏病、先兆子痫、舍格伦综合征、自体免疫淋巴组织增生性综合征、自体免疫性溶血性贫血、巴雷特食管、自体免疫葡萄膜炎、结核(病)、肾病、遗传过敏性皮炎以及哮喘。

本发明的一方面，提供了一种药物组合物，其包括本发明与人IL-4R结合的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体。

在本文中，如无矛盾或特别说明，药物、药物组合物和药物制剂(药剂)可以互换使用。在本文中，药学上可接受的辅料指无毒的填充剂、稳定剂、稀释剂、载体、溶剂或其他制剂辅料。例如，稀释剂、赋形剂，如微晶纤维素、甘露醇等；填充剂，如淀粉、蔗糖等；粘合剂，如淀粉、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和/或聚乙烯吡咯烷酮；崩解剂，如碳酸钙和/或碳酸氢钠；吸收促进剂，如季铵化合物；表面活性剂，如十六烷醇；载体、溶剂，如水、生理盐水、高岭土、皂粘土等；润滑剂，如滑石粉、硬脂酸钙/镁、聚乙二醇等。另外，本发明的药物组合物优选为注射剂。

在本发明的一些实施方案中，本发明药物组合物中的抗体或其抗原结合片段以1mg/ml至1000mg/ml的浓度存在，优选以10mg/ml至1000mg/ml的浓度存在，更优选以50mg/ml至500mg/ml的浓度存在，更优选以100mg/ml至300mg/ml的浓度存在。

本发明的药物组合物优选具有3.0至9.0的pH。其中，可进一步包含缓冲***、防腐剂、表面张力剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂。在本发明的一个实施方案中，本发明的药物组合物是含水制剂。这种制剂通常是溶液或悬浮。本发明的具体实施方案中，该药物组合物是稳定的含水溶液。在本发明的另一个具体实施方案中中，该药物组合物是一种冻干制剂，在使用前医师或患者加入溶剂和/或稀释液溶解所述冻干制剂。

实施例1：度匹鲁单抗变体的表达载体的构建

将HindIII酶切位点(AAGCCT)、KoZAK序列(GCCGCCACC)、ATG、信号肽基因ATGGAGAGAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGT和度匹鲁单抗重链编码基因(SEQ ID NO：35，包括重链可变区编码基因SEQ ID NO：27和恒定区IgG4编码基因)、终止码TAATAATAA和EcoRI编码基因GAATCC依次串联融合，并使用化学合成的方式获得基因片段。通过EcoRI和HindIII位点，将上述片段***真核表达质粒pCDNA 3.1(+)中并测序验证，得到用于抗体度匹鲁单抗重链的表达质粒PCDNA3.1(+)-DH。

将HindIII酶切位点(AAGCCT)、KoZAK序列(GCCGCCACC)、ATG、信号肽基因ATGGAGAGAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGT和度匹鲁单抗轻链编码基因(SEQ ID NO：38，包括轻链可变区编码基因SEQ ID NO：28和恒定区κ编码基因)、终止码TAATAATAA和EcoRI编码基因GAATCC依次串联融合，并使用化学合成的方式获得基因片段。通过EcoRI和HindIII位点，将上述片段***真核表达质粒pCDNA 3.1(+)中并测序验证，得到用于抗体度匹鲁单抗轻链的表达质粒PCDNA3.1(+)-DL。

依据上述同样方法，制备一系列度匹鲁单抗变体的表达质粒，分别称作：pCDNA3.1(+)-D1L，pCDNA 3.1(+)-D2L，pCDNA 3.1(+)-D3L，pCDNA 3.1(+)-D4L，pCDNA 3.1(+)-D5H，pCDNA 3.1(+)-D6H，pCDNA 3.1(+)-D7H，pCDNA 3.1(+)-D8H，pCDNA 3.1(+)-D9H，pCDNA3.1(+)-D10H、pCDNA 3.1(+)-D11H、pCDNA 3.1(+)-D12H、pCDNA 3.1(+)-DH及pCDNA 3.1(+)-DL。

变体D1为将度匹鲁单抗的LVR第24位氨基酸Arg突变为Ala，编码D1的LVR的基因序列为SEQ ID NO：4；突变体D2为将度匹鲁单抗的LVR第28位氨基酸Ser突变为Arg，编码D2的LVR的基因序列为SEQ ID NO：6；突变体D3或D4分别为将度匹鲁单抗的LVR第32位氨基酸Ser突变为Arg或Lys，编码D3和D4的LVR的基因序列分别为SEQ ID NO：8和10；突变体D5为将度匹鲁单抗的HVR第100位Arg突变为Ala，编码D5的HVR的基因序列为SEQ ID NO：12；突变体D6或D7分别为将度匹鲁单抗的HVR第106位Arg突变为Ala或Glu，编码D6或D7的HVR的基因序列分别为SEQ ID NO：14和16；突变体D8-D12分别为将度匹鲁单抗的HVR第108位Arg突变为Ala、Glu、Gln、Tyr或Leu，编码D8-D12的HVR的基因序列分别为SEQ ID NO：18、20、22、24或26。各突变体的重链恒定区均为IgG4，轻链恒定区为κ。

实施例2：度匹鲁单抗及其变体的表达和纯化

使用实施例1所述DNA构建体，通过真核表达细胞FreeStyle^TM293-F Cells(Invitrogen Corporation,R790-07)表达目的抗体。按照FreeStyle^TM293ExpressionSystem操作手册，在质粒转染前一天将细胞密度调整至1x10⁶个/毫升。在质粒转染当天，将质粒按照下表组合，与转染试剂混合后加入细胞培养基中。37℃，8％CO₂持续培养5-7天后，收集细胞培养上清进行抗体纯化。

表达上清用0.22μM滤膜过滤，利用Mabpurix亲和层析柱(购自Sepax公司，65008)从表达上清中捕获表达抗体，用平衡缓冲液(120mM Tris+100mM NaCl,pH7.5)平衡层析柱后，过亲和层析柱，用洗脱缓冲液(0.15M冰醋酸，pH2.8)洗脱。纯化后的抗体进行SDS PAGE、SEC检测，纯度在95％以上。

实施例3：抗原结合亲和力测定

使用实施例2中所述纯化抗体进行体外亲和力测定。以2μg/ml的IL-4R(R&D，7700-4R-050)包被酶标板，100μl/孔，贴封板膜，放置4℃过夜，第二天用洗涤液洗板3次。继而用洗涤液制备10％牛血清白蛋白溶液，以200μl/孔加至酶标板内，37℃2小时，用洗涤液洗板3次；以100μl/孔加入梯度稀释抗体溶液，37℃2小时，用洗涤液洗板3次；稀释液(使用洗涤液配置2％牛血清白蛋白溶液)1/5000稀释HRP标记二抗(编号ab6858，产品来源于Abcam公司)，以100μl/孔加至酶标板内，37℃1小时；用洗涤液洗板5次；以100μ1/孔加入TMB显色液，置室温避光反应5～10分钟，以50μl/孔加人终止液终止反应。并在波长450nm处测定吸光度。

结果显示，相对于度匹鲁单抗，D8和D9具有改善的EC₅₀，分别为3.200nM和1.977nM，尤其是D8，其EC50约为度匹鲁单抗的60％。

实施例4：体外中和IL-4的生物效应

使用实施例2中所述纯化抗体进行体外中和IL-4的生物效应测定。使用RPMI1640基础培养基(C22400500BT，来源于GIBCO公司)，于37℃、5％二氧化碳条件下将TF-1细胞饥饿培养24h。第二天上午收集TF-1细胞，继而用RPMI1640培养基洗涤3次，重悬于完全培养基(含10％胎牛血清的RPMI1640基础培养基)中，细胞浓度为4.0×10⁵个/ml。使用96孔细胞培养板，加入细胞悬液，以及梯度稀释的抗体样品和IL-4，并混合混匀。于37℃、5％二氧化碳条件下培养2天。按照CCK-8(CK04，产品来源Dojindo公司)使用说明书，加入CCK-8稀释液，于37℃、5％二氧化碳条件下培养2.5h，酶标仪检测，以630nm为参比波长，450nm为测定波长测定吸光度，检测细胞活率。

图3结果显示，度匹鲁单抗抑制92％的细胞生长，而D8和D9具有更好的抑制效果，抑制率达98％，明显优于度匹鲁单抗。

实施例5：度匹鲁单抗突变体的稳定性

为了进一步考察突变后的抗体的性质，通过设计不同的存储条件，采用SEC-HPLC方法(简称SEC)检测抗体储放后的主峰纯度，以及ELISA方法检测抗体储放后的相对活性，比较突变后的抗体和原抗体度匹鲁单抗的稳定性及活性变化。

将纯化的本发明抗体和度匹鲁单抗分别加入到12.5mM乙酸钠、pH：6.15的缓冲溶液中，终浓度约2.7mg/ml。根据预实验的实验结果，1.5ml样品加35.1μl 0.2M Tris-Base，使其达到pH9.0左右，过滤分装200μl/支，各分装7支；2.5ml样品加288μl 0.2M柠檬酸酸化到pH 3.0左右，过滤分装200μl/支，各分装12支；最后剩余样品过滤除菌，200μl/支，各分装30支。所有样品都放在洁净灭菌的西林瓶中，盖灭菌胶塞，压铝盖密封储存。

SEC-HPLC检测：利用凝胶过滤色谱分离不同分子量物质，来定量分析样品的纯度，色谱柱为TSK G3000SWXL，流动相：0.2mol/L磷酸钾缓冲液、0.25mol/L氯化钾pH6.2±0.1，流速为0.5ml/min，洗过时间30min。

ELISA方法(酶标仪检测)：2μg/ml的IL-4R包被酶标板，检测样品500ng/ml为初始浓度5倍稀释8个浓度梯度，转移到酶标板与IL-4R结合，加羊抗人Fab段二抗(JacksonImmuno公司产品)，显色，读板，计算本发明抗体的相对活性(相对活性是指：将各个测试点中同板样品的度匹鲁单抗活性均作为1时本发明抗体的相对活性)。

储存条件包括高温、强光照射、反复冻融、强酸。具体操作、检测点、以及检测项目见下表：

高温试验：50℃恒温培养箱放置20天，检测0点、第5天、第10天、第15天、第20天的样品。结果见图4A和图4B，SEC-HPLC实验结果显示供试样品稳定性与度匹鲁单抗变化趋势一致。0点样品度匹鲁单抗纯度大于本发明抗体，随着高温放置时间延长，都发生不到5％的降低，热稳定性无显著差异。ELISA结果忽略异常结果(图4B中HC-108A第二个点)，本发明抗体的活性始终高于度匹鲁单抗，且随高温放置时间延长，差距变大，说明本发明抗体的结合活性的热稳定性优于度匹鲁单抗。

反复冻融：-80℃、室温反复冻融3次、5次，检测本发明抗体和度匹鲁单抗的变化，结果见4C和图4D。从SEC-HPLC结果看出随冻融次数增多，度匹鲁单抗纯度基本没变化，都接近100％，本发明抗体0点纯度小于度匹鲁单抗，反复冻融后主峰纯度仅有不到5％的降低。然而，反复冻融后对活性影响方面，ELISA显示，本发明抗体在抗御反复冻融导致的活性降低方面优于度匹鲁单抗，本发明抗体同条件下经过冻融，其具有较高的相对活性。

强酸影响：用柠檬酸调样品pH至3.0，25℃放置3天，分别在零点、第一天、第三天观察检测。从图4E的SEC实验结果可以看出，从零点开始三个检测样品纯度都降低10％左右，扣除图4G中HC-R108E第一天检测异常点，三天内所有样品纯度几乎没有进一步减少，根据SEC峰图推测，强酸处理使样品从0点就被破坏，部分发生聚合、部分降解。从图4H看出强酸处理后本发明抗体的结合活性要显著高于同等条件下的度匹鲁单抗，推测由于供试品改构后，等电点降低，从而更加耐酸。

光照影响：将样品于25℃，4500lx光强的药物稳定性试验箱放置10天，分别在0点、第五天、第十天检测样品。结果见图4E和图4F。从SEC结果看出度匹鲁单抗和本发明抗体的目的峰纯度都变化极小，ELISA结果则说明本发明抗体活性随光照时间延长没有下降趋势，说明本发明抗体光稳定性略优于度匹鲁单抗。

综合以上高温、强酸、光照和反复冻融的实验结果可以看出，各因素对抗体的稳定性影响差别不大，但在活性方面，本发明抗体相对于度匹鲁单抗有更好的耐受性，这在后期储放过程中更为有利。

序列表

<110> 北京凯因科技股份有限公司

<120> IL-4Rα抗体及其用途

<141> 2018-01-30

<160> 36

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

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20 25 30

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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1 5 10 15

Gly Pro Ala Ser Ile Ser Cys Ala Ser Ser Gly Ser Leu Leu Thr Ser

20 25 30

Ile Gly Thr Ala Thr Leu Ala Thr Thr Leu Gly Leu Ser Gly Gly Ser

35 40 45

Pro Gly Leu Leu Ile Thr Leu Gly Ser Ala Ala Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ala Ala Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Pro Thr Leu Leu Ile

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Gly Pro Ala Ser Ile Ser Cys Ala Ser Ser Gly Ser Leu Leu Thr Ser

20 25 30

Ile Gly Thr Ala Thr Leu Ala Thr Thr Leu Gly Leu Ser Gly Gly Ser

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Pro Gly Leu Leu Ile Thr Leu Gly Ser Ala Ala Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

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Gly Val Gly Leu Val Gly Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Pro Gly Gly

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Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ala Thr Thr Thr Ala Ala Ser Val

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Gly Val Gly Leu Val Gly Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Pro Gly Gly

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Ser Leu Ala Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Pro Thr Pro Ala Ala Thr

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Ala Met Thr Thr Val Ala Gly Ala Pro Gly Leu Gly Leu Gly Thr Val

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Gly Val Gly Leu Val Gly Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Pro Gly Gly

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Ser Leu Ala Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Pro Thr Pro Ala Ala Thr

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Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ala Thr Thr Thr Ala Ala Ser Val

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ala Thr

1 5

<210> 31

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

Leu Gly Ser Gly

1

<210> 32

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

Met Gly Ala Leu Gly Thr Pro Thr Thr

1 5

<210> 33

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

Gly Val Gly Leu Val Gly Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Ala Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Pro Thr Pro Ala Ala Thr

20 25 30

Ala Met Thr Thr Val Ala Gly Ala Pro Gly Leu Gly Leu Gly Thr Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ala Thr Thr Thr Ala Ala Ser Val

50 55 60

Leu Gly Ala Pro Thr Ile Ser Ala Ala Ala Ser Leu Ala Thr Leu Thr

65 70 75 80

Leu Gly Met Ala Ser Leu Ala Ala Gly Ala Thr Ala Val Thr Thr Cys

85 90 95

Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ile Thr Ile Ala Pro Ala Thr Thr Gly Leu

100 105 110

Ala Val Thr Gly Gly Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

115 120 125

Leu Gly Pro Ser Val Pro Pro Leu Ala Pro Cys Ser Ala Ser Thr Ser

130 135 140

Gly Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Leu Ala Thr Pro Pro Gly

145 150 155 160

Pro Val Thr Val Ser Thr Ala Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

165 170 175

Thr Pro Pro Ala Val Leu Gly Ser Ser Gly Leu Thr Ser Leu Ser Ser

180 185 190

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Leu Thr Thr Thr Cys

195 200 205

Ala Val Ala His Leu Pro Ser Ala Thr Leu Val Ala Leu Ala Val Gly

210 215 220

Ser Leu Thr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Pro Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Pro Leu Pro Pro Pro Leu Pro Leu Ala Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Ala Thr Pro Gly Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser

260 265 270

Gly Gly Ala Pro Gly Val Gly Pro Ala Thr Thr Val Ala Gly Val Gly

275 280 285

Val His Ala Ala Leu Thr Leu Pro Ala Gly Gly Gly Pro Ala Ser Thr

290 295 300

Thr Ala Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gly Ala Thr Leu Ala

305 310 315 320

Gly Leu Gly Thr Leu Cys Leu Val Ser Ala Leu Gly Leu Pro Ser Ser

325 330 335

Ile Gly Leu Thr Ile Ser Leu Ala Leu Gly Gly Pro Ala Gly Pro Gly

340 345 350

Val Thr Thr Leu Pro Pro Ser Gly Gly Gly Met Thr Leu Ala Gly Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Leu Gly Pro Thr Pro Ser Ala Ile Ala Val

370 375 380

Gly Thr Gly Ser Ala Gly Gly Pro Gly Ala Ala Thr Leu Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Ala Ser Ala Gly Ser Pro Pro Leu Thr Ser Ala Leu Thr

405 410 415

Val Ala Leu Ser Ala Thr Gly Gly Gly Ala Val Pro Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Gly Ala Leu His Ala His Thr Thr Gly Leu Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Gly

450

<210> 34

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

Ala Ile Val Met Thr Gly Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ala Ser Ile Ser Cys Ala Ser Ser Gly Ser Leu Leu Thr Ser

20 25 30

Ile Gly Thr Ala Thr Leu Ala Thr Thr Leu Gly Leu Ser Gly Gly Ser

35 40 45

Pro Gly Leu Leu Ile Thr Leu Gly Ser Ala Ala Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Ala Ala Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Pro Thr Leu Leu Ile

65 70 75 80

Ser Ala Val Gly Ala Gly Ala Val Gly Pro Thr Thr Cys Met Gly Ala

85 90 95

Leu Gly Thr Pro Thr Thr Pro Gly Gly Gly Thr Leu Leu Gly Ile Leu

100 105 110

Ala Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Pro Ile Pro Pro Pro Ser Ala Gly

115 120 125

Gly Leu Leu Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Ala Ala Pro

130 135 140

Thr Pro Ala Gly Ala Leu Val Gly Thr Leu Val Ala Ala Ala Leu Gly

145 150 155 160

Ser Gly Ala Ser Gly Gly Ser Val Thr Gly Gly Ala Ser Leu Ala Ser

165 170 175

Thr Thr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Leu Ala Ala Thr Gly

180 185 190

Leu His Leu Val Thr Ala Cys Gly Val Thr His Gly Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Leu Ser Pro Ala Ala Gly Gly Cys

210 215

<210> 35

<211> 1353

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

gaggtgcagc tggtggagag cggcggcggc ctggagcagc ccggcggcag cctgaggctg 60

agctgcgccg gcagcggctt caccttcagg gactacgcca tgacctgggt gaggcaggcc 120

cccggcaagg gcctggagtg ggtgagcagc atcagcggca gcggcggcaa cacctactac 180

gccgacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca acagcaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caaggacagg 300

ctgagcatca ccatcaggcc caggtactac ggcctggacg tgtggggcca gggcaccacc 360

gtgaccgtga gcagcgccag caccaagggc cccagcgtgt tccccctggc cccctgcagc 420

aggagcacca gcgagagcac cgccgccctg ggctgcctgg tgaaggacta cttccccgag 480

cccgtgaccg tgagctggaa cagcggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttccccgcc 540

gtgctgcaga gcagcggcct gtacagcctg agcagcgtgg tgaccgtgcc cagcagcagc 600

ctgggcacca agacctacac ctgcaacgtg gaccacaagc ccagcaacac caaggtggac 660

aagagggtgg agagcaagta cggccccccc tgccccccct gccccgcccc cgagttcctg 720

ggcggcccca gcgtgttcct gttccccccc aagcccaagg acaccctgat gatcagcagg 780

acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac gtgagccagg aggaccccga ggtgcagttc 840

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aacgccaaga ccaagcccag ggaggagcag 900

ttcaacagca cctacagggt ggtgagcgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac 960

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgagcaac aagggcctgc ccagcagcat cgagaagacc 1020

atcagcaagg ccaagggcca gcccagggag ccccaggtgt acaccctgcc ccccagccag 1080

gaggagatga ccaagaacca ggtgagcctg acctgcctgg tgaagggctt ctaccccagc 1140

gacatcgccg tggagtggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc 1200

cccgtgctgg acagcgacgg cagcttcttc ctgtacagca ggctgaccgt ggacaagagc 1260

aggtggcagg agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1320

tacacccaga agagcctgag cctgagcctg ggc 1353

<210> 36

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

gacatcgtga tgacccagag ccccctgagc ctgcccgtga cccccggcga gcccgccagc 60

atcagctgca ggagcagcca gagcctgctg tacagcatcg gctacaacta cctggactgg 120

tacctgcaga agagcggcca gagcccccag ctgctgatct acctgggcag caacagggcc 180

agcggcgtgc ccgacaggtt cagcggcagc ggcagcggca ccgacttcac cctgaagatc 240

agcagggtgg aggccgagga cgtgggcttc tactactgca tgcaggccct gcagaccccc 300

tacaccttcg gccagggcac caagctggag atcaagagga ccgtggccgc ccccagcgtg 360

ttcatcttcc cccccagcga cgagcagctg aagagcggca ccgccagcgt ggtgtgcctg 420

ctgaacaact tctaccccag ggaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag 480

agcggcaaca gccaggagag cgtgaccgag caggacagca aggacagcac ctacagcctg 540

agcagcaccc tgaccctgag caaggccgac tacgagaagc acaaggtgta cgcctgcgag 600

gtgacccacc agggcctgag cagccccgtg accaagagct tcaacagggg cgagtgc 657

Claims (13)

1.一种与人白细胞介素-4受体α(hIL-4Rα)特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(HVR)和轻链可变区(LVR)，其中，

重链可变区包含：

氨基酸序列为Gly-Phe-Thr-Phe-Arg-Asp-Tyr-Ala的HCDR1；

氨基酸序列为Ile-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly-Asn-Thr的HCDR2；和，

氨基酸序列为Ala-Lys-Asp-Xaa1-Leu-Ser-Ile-Thr-Ile-Xaa2-Pro-Xaa3-Tyr-Tyr-Gly-Leu-Asp-Val的HCDR3，其中Xaa1为Arg，Xaa2为Arg，Xaa3为Ala或Glu；

轻链可变区包含：

氨基酸序列为Gln-Xaa4-Leu-Leu-Tyr-Xaa5-Ile-Gly-Tyr-Asn-Tyr的LCDR1，其中Xaa4为Ser，Xaa5为Ser；

氨基酸序列为Leu-Gly-Ser的LCDR2；和，

氨基酸序列为Met-Gln-Ala-Leu-Gln-Thr-Pro-Tyr-Thr的LCDR3。

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其为度匹鲁单抗的变体，其中，度匹鲁单抗的重链可变区(HVR)第108位Arg突变为Ala或Glu。

3.一种药物组合物，其包含权利要求1～2中任一项所述的抗体或其抗原结合片段和可药用载体。

4.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1～2中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

5.一种表达载体，含有权利要求4所述核酸分子。

6.包含权利要求5的表达载体的宿主细胞。

7.权利要求6的宿主细胞，其为真核细胞。

8.一种制备与人IL-4R特异性结合的抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括在有利于权利要求1～2中任一项的抗体或其抗原结合片段表达的条件下表达权利要求4的核酸分子，并回收表达的抗体或其抗原结合片段。

9.权利要求1～2中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗人体与IL-4/IL-4Rα信号传导相关的疾病或病症。

10.权利要求9所述的用途，其中所述疾病或病症选自：哮喘、过敏性皮炎、关节炎、疱疹、慢性原发性荨麻疹、硬皮病、肥大性瘢痕、Whipole病、良性***增生、COPD、特应性皮炎、特发性肺纤维化、变应性反应、川崎病、镰状细胞病、Churg-Strauss综合征、格雷夫斯氏病、先兆子痫、舍格伦综合征、自体免疫淋巴组织增生性综合征、自体免疫性溶血性贫血、巴雷特食管、自体免疫葡萄膜炎、结核病或肾病。

11.一种制品或药盒，包含容器和包装插页，其中所述容器中装有权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，或者权利要求3的药物组合物，所述包装插页上载有药物的使用说明书。

12.权利要求11的制品或药盒，进一步包含一个或多个容器，该容器中装有一种或多种预防或治疗人体与IL-4/IL-4Rα信号传导相关的疾病或病症的其它药物。

13.权利要求12的制品或药盒，其中所述其它药物为激素类药物、免疫抑制剂或抗组织胺类药物。

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