CN110105408A

CN110105408A - DNA编码化合物库构建中的On-DNA芳基叠氮化合物的合成方法

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Publication number: CN110105408A
Application number: CN201910383114.1A
Authority: CN
Inventors: 刘炜; 袁友浪; 邓伟; 吴阿亮; 陈雯婷; 李科; 蒯乐天; 杨洪芳; 彭宣嘉
Original assignee: Wuxi Apptec Co Ltd
Current assignee: Wuxi Apptec Co Ltd
Priority date: 2019-05-09
Filing date: 2019-05-09
Publication date: 2019-08-09
Anticipated expiration: 2039-05-09
Also published as: CN110105408B

Abstract

本发明公开了一种用于DNA编码化合物库构建中的On‑DNA芳基叠氮化合物的制备方法：以On‑DNA芳基卤代物为底物，在铜催化剂、配体和碱的存在下，与叠氮试剂反应制得On‑DNA芳基叠氮化合物。本发明所提供的On‑DNA芳基叠氮化合物的制备方法，催化剂廉价易得、反应条件温和、操作方便，适合于多孔板进行的DNA编码化合物库的合成。

Description

DNA编码化合物库构建中的On-DNA芳基叠氮化合物的合成方法

技术领域

本发明属于DNA编码化合物库技术领域，具体涉及一种On-DNA芳基卤代物与叠氮试剂反应得到On-DNA芳基叠氮化合物的方法。

背景技术

美国Scripps研究院的Sydney Brenner和Richard Lerner教授于1992年提出了DNA编码化合物库(DNA Encoded Library，简称DEL)的概念(参考文献：Proc.Natl.Acad.Sci.,1992,89, 5381，专利：US5573905)，该方法通过将一个有机小分子试剂与一段独特序列的DNA在分子水平进行连接(即对小分子试剂进行DNA标记)，利用组合化学的“组合-拆分”策略通过两个至多个循环快速地构建数量巨大的化合物库，该化合物库中每一个化合物都由不同有机小分子试剂残基组成，并由相应的唯一碱基序列的DNA标识，将极少量的DNA编码化合物库与靶标进行亲和筛选，与靶标没有吸附的化合物库分子先被洗掉，留下的与靶标有吸附的化合物库分子再洗脱下来，这时得到的化合物库分子浓度很低，常规手段难以分析和识别，但是通过DNA独有的聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction，简称PCR)可以把得到的与靶标有吸附的化合物库分子中的DNA部分进行复制扩增直至得到的DNA量可以被DNA测序仪识别，测序后的数据再通过构建DNA编码化合物库时创建的有机小分子试剂与每个具体 DNA碱基序列之间的关系表来解码，进而找到可以识别具有潜在活性分子相对应的具体化合物对应的有机小分子试剂，我们再通过传统的有机合成方法把这些有机小分子试剂组合在一起得到筛选的目标分子，再检测并确认其对靶标的生理活性。

DNA编码化合物库的构建方法主要有三种，第一种是以美国Ensemble公司为主利用DNA 模板技术得到的DNA导向分子库(DNA-Templated Chemical Library Synthesis，简称DTCL)，第二种是以美国GSK公司，X-Chem公司和国内的成都先导公司为主利用DNA标记技术得到的 DNA记录分子库(DNA-Recorded Chemical Library，简称DRCL)，第三种是以瑞士Philogen 公司为主基于片段的药物设计(Fragment-based drug discovery，简称FBDD)技术得到的编码自组装分子库(Encoded Self-Assembling Chemical Libraries，简称ESAC)，目前工业上被大量运用的构建DNA编码化合物库的方法主要是第二种，该方法操作简单，成本更低，能更快速地利用组合化学方法得到含有海量的化合物的DNA编码化合物库。

除了DNA起始片段(详见本公司发明专利：CN201711263372.3，CN201711318894.9)外，需要有大量的DNA标签和可以按照一定顺序进行反应的有机小分子试剂。DNA标签的编码可以通过一定的计算机程序来获得(详见本公司发明专利：CN201711247220.4)，再通过DNA 合成仪得到具体的DNA碱基序列的引物。有机小分子试剂的获得，可以使用一定的计算机程序来对获得的试剂清单进行筛选得到(详见本公司发明专利：CN201810378969.0)。

DEL库领域目前最主要的工作之一是DNA上化学反应的开发，简称on-DNA化学反应。因为DNA必须在一定的水相中、pH、温度、金属离子浓度和无机盐浓度下才能保持稳定，因此，对DNA损伤小、有较好的回收率和底物适应性广的on-DNA化学反应，才是大规模应用于DNA 编码化合物库的合成所需要的。

目前公开报道的On-DNA化学反应种类有50多种，每种的反应条件少则一种，多则十几种，可以说，在其他情况一样的情况下，On-DNA化学反应的种类越多，条件越丰富，在DNA 编码化合物库的设计时的选择性才越多，最终DNA编码化合物库的合成成功率才越高，得到的DNA编码化合物库的多样性才越丰富。

表1可用于DRCL构建的On-DNA化学反应种类和具体条件

在On-DNA化学反应中，缓冲液的选择十分重要，我们确定了几种常用的缓冲液的配制和质检方法(详见本公司发明专利：CN201811181396.9)，并提供了在该缓冲液条件下的几种具体的On-DNA化学反应(详见本公司发明专利：CN201811181396.9，CN201811546746.7)。

芳基叠氮化合物具有特殊的结构和理化性质，可用于药物、农药和功能材料等的合成(参考文献：Angew.Chem.Int.Ed.,2005,44,5188)。芳基叠氮化合物也是重要的有机合成中间体，可以被还原得到芳胺(参考文献：Tetrahedron Lett.,2002,43,1919)，可以通过CuAAC 反应与炔烃反应得到1,4-二取代-1,2,3-三氮唑化合物，还能与亚胺、腈基、烯烃等官能团发生 1,3-偶极环加成反应，合成五元氮杂环化合物(参考文献：Synlett.,2002,3,513)。

目前在DNA编码化合物库领域，On-DNA芳基叠氮化合物主要通过On-DNA化合物与带有叠氮基和与On-DNA化合物的功能团互补功能团的二元小分子试剂反应来制备，如DNA氨基化合物与含有叠氮基和羧基的二元试剂通过缩合反应制备On-DNA叠氮化合物，由于这类二元试剂稀少，限制了On-DNA叠氮化合物的获得，进而限制了通过功能团转化得到On-DNA芳胺化合物和On-DNA的1,4-二取代-1,2,3-三氮唑化合物的种类和数量。

为了解决如上问题，我们希望开发一种简便、快捷、可以将On-DNA化合物的功能团原位转化为叠氮基的方法，以便适应大批量多孔板的DNA编码化合物库生产的需求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一，在于提供一种用于DNA编码化合物库构建中的由 On-DNA芳基卤代物制备On-DNA芳基叠氮化合物的合成方法，其中，所述On-DNA芳基卤代物的结构式为：DNA-Ar-X，所制备得到的On-DNA芳基叠氮化合物的结构式如所示： DNA-Ar-N₃；

其中，结构式中的DNA是由经人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链；X是氯、溴、或碘；

其中，结构式中的Ar是单环或双环的芳香环；所述On-DNA芳基卤代物中的X连接于Ar的环上，所述On-DNA芳基叠氮化合物的N₃连接于Ar的环上；

其中，结构式中的DNA与Ar通过一个化学键或多个化学键连接。一个化学键时，是指结构式中的DNA与Ar直接相连；多个化学键时，指结构式中的DNA与Ar之间间隔多个化学键相连，比如，DNA与Ar之间通过一个亚甲基(-CH₂-)相连，即通过两个化学键连接；或DNA与Ar通过一个羰基(-CO-)连接DNA的氨基，也是通过两个化学键连接；或DNA 与Ar通过一个亚甲基羰基(-CH₂CO-)连接DNA的氨基，是通过三个连续的化学键连接。

具体的，Ar可以选自以下基团：

R₁为氢、卤素、氨基、硝基、氰基、羟基、巯基、芳基甲酮、烷基甲酮、C₁-C₁₂烷基、 C₁-C₆烯烃基、C₁-C₆炔烃基、C₃-C₈环烷基、C₁-C₆烷基氧基、C₁-C₆烷基氨基中的任意一种至多种的随机组合，Ar上可以有一个或多个R₁基团；R₂为连接DNA部分的功能团，具体是一个可以与DNA上的功能团互补反应的功能团，可以是氨基、羧基、醛基、芳卤中的任意一种， R₂可以直接与Ar相连，也可以间隔多个化学键相连；Y为O、S、NH或烷基取代氨基中的任意一种。

本发明所要解决的技术问题之二，在于提供一种可以将On-DNA芳基卤代物原位转化为 On-DNA芳基叠氮化合物的方法。以On-DNA芳基卤代物为原料，以乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜、甲醇、乙醇、叔丁醇、异丙醇、四氢呋喃、 1,4-二氧六环、水、无机盐缓冲液、有机酸缓冲液、有机碱缓冲液中的任意一项或几项为溶剂，在铜催化剂和配体的存在下，与叠氮试剂和碱在20～100℃的条件下反应0.5～24小时，具体反应方程式如下：

所述的On-DNA芳基卤代物是On-DNA芳基氯代物，On-DNA芳基溴代物，On-DNA芳基碘代物；优选地，是On-DNA芳基碘代物；

所述铜催化剂是铜粉、氧化铜、氧化亚铜、硫化铜、硫化亚铜、硫酸铜、醋酸铜、氯化铜、溴化铜、氯化亚铜、溴化亚铜、碘化亚铜、乙酰丙酮铜、二氧化亚铁铜中的一种或几种的混合物；优选地，所述铜催化剂是碘化亚铜。

所述配体是N,N'-二甲基乙二胺、L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-谷氨酸、吡咯烷、L-苏氨酸、 L-高脯氨酸，反式-N,N-二甲基环己-1,2-二胺，顺式-N,N-二甲基环己-1,2-二胺、脯氨酸钠盐、四乙基铵脯氨酸盐中的一种或几种的混合物；优选地，所述配体是N,N'-二甲基乙二胺。

所述叠氮试剂是叠氮化锂、叠氮化钠、叠氮化钾、叠氮化钡、叠氮化铅、叠氮化银、叠氮三甲基硅烷、叠氮磷酸二苯酯、叠氮化三苯基甲烷、二(对硝基苯基)叠氮膦酸酯、三丁基锡叠氮化物、叠氮化四丁基铵、叠氮四甲基胍、乙基叠氮醋酸酯、甲苯磺酰基叠氮、4-乙酰氨基苯磺酰叠氮、2-叠氮-1,3-二甲基咪唑啉六氟磷酸盐；优选地，叠氮试剂是叠氮化钠。

所述碱为抗败血酸钠、柠檬酸、硼氢化钠、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯、氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸铯、碳酸氢钠中的一种或几种的混合物；优选地，所述碱为抗败血酸钠。

本发明中的On-DNA芳基卤代物可以由DNA-NH₂和含有羧酸芳卤二元化合物原位缩合反应制得。

本发明为DNA编码化合物库构中On-DNA芳基叠氮化合物的合成提供新的方法，本发明催化剂廉价易得、反应条件温和、操作方便，适合大批量多孔板的DNA编码化合物库的生产。

附图说明

图1为本发明的原料制备方法，DNA-NH₂与卤代芳基羧基的二元化合物使用EDCI为缩合剂、s-NHS为缩合活化剂，原位反应得到相应的On-DNA芳基卤代化合物的化学反应式。

图2为本发明用On-DNA芳基卤代化合物与叠氮化钠、抗败血酸钠混合，在碘化亚铜和 N,N'-二甲基乙二胺的催化下，反应得到相应的On-DNA芳基叠氮类化合物的化学反应式。

图3A为本发明中由On-DNA芳基碘代物转化为On-DNA芳基叠氮化合物的转化率分布 (转化率以LCMS-LTQ上的TIC峰面积为准)，其中，纵坐标是试剂个数，横坐标是转化率区间，如0-30％表示0％＜转化率≤30％。

图3B为本发明中由On-DNA芳基溴代物转化为On-DNA芳基叠氮化合物的转化率分布 (转化率以LCMS-LTQ上的TIC峰面积为准)，其中，纵坐标是试剂个数，横坐标是转化率区间，如0-30％表示0％＜转化率≤30％。

图3C为本发明中由On-DNA芳基氯代物转化为On-DNA芳基叠氮化合物的转化率分布 (转化率以LCMS-LTQ上的TIC峰面积为准)，其中，纵坐标是试剂个数，横坐标是转化率区间，如0-30％表示0％＜转化率≤30％。

图4为本发明的两步反应后制备得到的On-DNA芳基叠氮化合物的对应的卤代芳基羧酸二元化合物代表化合物的结构式和转化率(转化率以LCMS-LTQ上的TIC峰面积为准)。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1，On-DNA芳基卤代化合物的合成

DNA-NH₂(例如专利CN108070009A的提及的起始头片段)溶于250mM,pH＝9.5的硼酸缓冲液，配制成1mM浓度溶液，分装到96孔板中，与卤代芳基羧基二元化合物使用EDCI 作为缩合剂和s-NHS缩合活化剂反应得到相应的On-DNA芳基卤代化合物(参考文献：Nat.Chem.,2015,7,3,241，见图1)，该反应完成后只做乙醇沉淀处理，浓缩干燥后直接用于下一步的还原反应。

实施例2，On-DNA芳基叠氮化合物的合成

原位生成的DNA-Ar-X重新溶解于超纯水中，配制成1mM浓度溶液，分装到新的96孔板中(10μL,10nmol,1mM水溶液),依次加入叠氮化钠溶液(25μL,5000nmol,200mM水溶液,500eq.)，CuI溶液(10μL,300nmol,30mM的二甲基亚砜溶液,300eq.)，N,N'-二甲基乙二胺溶液(10μL,300nmol,30mM的二甲基亚砜溶液,600eq.)，抗败血酸钠溶液(5μL,1000nmol,200mM水溶液,300eq.)，离心，让溶液沉底，涡旋混匀，再次离心后，置换氮气3次，封膜， 96孔板在PCR仪器中40℃下反应16小时(盖温：40℃)。

除铜：

反应完毕后，向96孔板的每个孔中加入二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液(6.0μL,600nmol, 100mM水溶液,60eq.)，离心，让溶液沉底，涡旋混匀，再次离心后，96孔板在PCR仪器中 80℃下反应30分钟(盖温：100℃)，反应完毕，产生大量沉淀，以4000G的离心力离心 5分钟，将上清液转移到新的96孔板中进行乙醇沉淀。

乙醇沉淀：

向96孔板的每个孔加入反应液体积10％的5M氯化钠溶液，封膜，振荡混匀后，加入总体积3倍的在-20℃储存的冷无水乙醇，于-80℃冰箱冷冻2小时，之后拿出在4℃以4000G的离心力离心30分钟，吸除上清液，沉淀用去离子水溶解后于-40℃真空冻干，得到产物，通过酶标仪检测OD确认回收率，同时检测LC-MS确认每个小分子的转化率。

我们共计验证了314个On-DNA芳基卤代物转化为On-DNA芳基叠氮化合物，其中On-DNA芳基碘代物12个，On-DNA芳基溴代物231个，On-DNA芳基氯代物71个，各自的具体转化率分布见图3A～3C，代表试剂结构和产率见图4。通过转化率分布图可以看出，使用本方法，On-DNA芳基碘代物转化On-DNA芳基叠氮化合物效果较好，>70％的转化率达到58％，On-DNA芳基溴代物转化率适中，>50％的转化率达到29％，On-DNA芳基氯代物转化率较差。

相比于通过DNA氨基化合物与含有羧酸和叠氮的二元化合物经酰胺缩合得到的On-DNA叠氮化合物的方法相比，本发明得到On-DNA叠氮化合物的起始原料On-DNA芳基卤代物是通过DNA氨基化合物与含有羧酸和芳卤的二元化合物缩合得到，由于含有羧酸和芳卤的二元化合物远远多于含有羧酸和叠氮的二元化合物，扩大了得到On-DNA叠氮化合物的途径。

综上所述，上述各实施例及附图仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种DNA编码化合物库构建中的由On-DNA芳基卤代物制备On-DNA芳基叠氮化合物的合成方法，其特征在于，所述On-DNA芳基卤代物的结构式为：DNA-Ar-X，所述On-DNA芳基叠氮化合物的结构式为：DNA-Ar-N₃；在1～1000摩尔当量的铜催化剂和0～1000摩尔当量的配体存在下，摩尔浓度为0.1～5.0mM的DNA-Ar-X溶液、10～2000摩尔当量的叠氮试剂和0～1000摩尔当量的碱在20～100℃下反应0.5～24小时直至反应结束；

其中，结构式中的Ar是单环或双环的芳香环，所述On-DNA芳基卤代物的卤素连接于Ar的环上，所述On-DNA芳基叠氮化合物的N₃连接于Ar的环上；

其中，结构式中的DNA与Ar通过一个或多个化学键连接。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Ar可以选自以下基团：

R₁为氢、卤素、氨基、硝基、氰基、羟基、巯基、芳基甲酮、烷基甲酮、C₁-C₁₂烷基、C₁-C₆烯烃基、C₁-C₆炔烃基、C₃-C₈环烷基、C₁-C₆烷基氧基、C₁-C₆烷基氨基中的任意一种至多种的随机组合，Ar上可以有一个或多个R₁基团；R₂为连接DNA部分的功能团，具体是一个可以与DNA上的功能团互补反应的功能团，可以是氨基、羧基、醛基、芳卤中的任意一种，R₂可以直接与Ar相连，也可以间隔多个化学键相连；Y为O、S、NH或烷基取代氨基中的任意一种。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA-Ar-X水溶液的摩尔浓度是0.1～5.0mM；优选地，所述DNA-Ar-X的摩尔浓度是0.1mM，0.2mM，0.3mM，0.4mM，0.5mM，0.6mM，0.7mM，0.8mM，0.9mM，1.0mM，1.5mM，2.0mM，2.5mM，3.0mM，3.5mM，4.0mM，4.5mM或5.0mM；更优选地，所述DNA-Ar-X的摩尔浓度为1.0mM。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应溶液是含乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜、甲醇、乙醇、叔丁醇、异丙醇、四氢呋喃、1,4-二氧六环、无机盐缓冲液、有机酸缓冲液、有机碱缓冲液中的任意一种或几种的含水的混合溶剂，且最终反应液中水的含量不低于20％；优选地，所述DNA-Ar-X溶于水、无机盐缓冲液、有机酸缓冲液或有机碱缓冲液。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述铜催化剂是铜粉、氧化铜、氧化亚铜、硫化铜、硫化亚铜、硫酸铜、醋酸铜、氯化铜、溴化铜、氯化亚铜、溴化亚铜、碘化亚铜、乙酰丙酮铜、二氧化亚铁铜中的一种或几种的混合物；优选地，所述铜催化剂是碘化亚铜。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述铜催化剂的摩尔当量是1～1000当量；优选的，所述铜催化剂的摩尔当量是1当量，2当量，3当量，4当量，5当量，6当量，7当量，8当量，9当量，10当量，20当量，30当量，40当量，50当量，60当量，70当量，80当量，90当量，100当量，200当量，300当量，400当量，500当量，600当量，700当量，800当量，900当量或1000当量；更优选地，所述铜催化剂的摩尔当量是30当量。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述配体是N,N'-二甲基乙二胺、L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-谷氨酸、吡咯烷、L-苏氨酸、L-高脯氨酸，反式-N,N-二甲基环己-1,2-二胺，顺式-N,N-二甲基环己-1,2-二胺、脯氨酸钠盐、四乙基铵脯氨酸盐中的一种或几种的混合物；优选地，所述配体是N,N'-二甲基乙二胺。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述配体的摩尔当量是0～1000当量；优选的，所述配体的摩尔当量是0当量，1当量，2当量，3当量，4当量，5当量，6当量，7当量，8当量，9当量，10当量，20当量，30当量，40当量，50当量，60当量，70当量，80当量，90当量，100当量，200当量，300当量，400当量，500当量，600当量，700当量，800当量，900当量或1000当量；更优选地，所述配体的摩尔当量是60当量。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述叠氮试剂是叠氮化锂、叠氮化钠、叠氮化钾、叠氮化钡、叠氮化铅、叠氮化银、叠氮三甲基硅烷、叠氮磷酸二苯酯、叠氮化三苯基甲烷、二(对硝基苯基)叠氮膦酸酯、三丁基锡叠氮化物、叠氮化四丁基铵、叠氮四甲基胍、乙基叠氮醋酸酯、甲苯磺酰基叠氮、4-乙酰氨基苯磺酰叠氮、或2-叠氮-1,3-二甲基咪唑啉六氟磷酸盐；优选地，叠氮试剂是叠氮化钠。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述叠氮试剂的摩尔当量是10～2000当量；优选的，所述叠氮试剂的当量是10当量，20当量，30当量，40当量，50当量，60当量，70当量，80当量，90当量，100当量，200当量，300当量，400当量，500当量，600当量，700当量，800当量，900当量，1000当量，1100当量，1200当量，1300当量，1400当量，1500当量，1600当量，1700当量，1800当量，1900当量或2000当量；更优选地，所述叠氮试剂的摩尔当量是500当量。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碱为抗败血酸钠、柠檬酸、硼氢化钠、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯、氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸铯、碳酸氢钠中的一种或几种的混合物；优选地，所述碱为抗败血酸钠。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碱的摩尔当量是0～1000当量；优选的，所述铜催化剂的当量是0当量，1当量，2当量，3当量，4当量，5当量，6当量，7当量，8当量，9当量，10当量，20当量，30当量，40当量，50当量，60当量，70当量，80当量，90当量，100当量，200当量，300当量，400当量，500当量，600当量，700当量，800当量，900当量或1000当量；更优选地，所述碱的摩尔当量是100当量。

13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应的反应温度为20～100℃；优选地，所述反应的反应温度为20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，65℃，70℃，75℃，80℃，85℃，90℃，95℃，或100℃；更优选地，所述还原反应的反应温度为40℃。

14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应的反应时间为0.5～24小时；优选地的，所述反应的反应时间为0.5小时，1小时，2小时，3小时，4小时，5小时，6小时，7小时，8小时，9小时，10小时，11小时，12小时，13小时，14小时，15小时，16小时，17小时，18小时，19小时，20小时，21小时，22小时，23小时或24小时；更优选地，所述反应的反应时间是16小时。

15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法用于批量的多孔板操作；优选的，所述方法用于多孔板的DNA编码化合物库的合成。