CN110095592A - 一种c反应蛋白单膜检测干片 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种C反应蛋白(CRP)单膜检测干片,其包括上支撑层、下支撑层、扩散试剂层和透光层,且上支撑层和下支撑层相互粘合在一起。而扩散试剂层设置在上支撑层和下支撑层之间的透光层上,由水溶性材料、参与化学反应的试剂和球形白色颗粒等组成,包括:固化磷酸胆碱,过氧化物酶标记的鼠抗‑CRP抗体,氯化钙,2‑(3,5‑二甲氧基‑4‑羟苯基)‑4,5‑对(4‑二甲基胺基苯基)咪唑,粘合剂,表面活性剂,蛋白质,白色球型颗粒等。本发明C反应蛋白(CRP)单膜检测干片具有线性更高、重复性好、操作简单、自行检测方便、特异性好等优点,并且布洛芬、止血敏、茶碱等药物对干片的测量无影响。
Description
技术领域
本发明属于体外临床诊断试剂技术领域,具体涉及一种用于生化分析的单膜干片—C反应蛋白单膜的检测干片。
背景技术
生物液体如血清、血浆、全血、尿液、脑脊液等在疾病诊断中是非常重要的。现有的生化分析仪器及配套试剂有很多产品,如VITROS 5600全自动生化免疫分析仪、贝克曼SYNCHRONization-LX20系列全自动生化分析仪、日立7180系列全自动生化分析仪、越华YS-2000Ⅲ型半自动生化分析仪等各种半自动生化分析系列。但是,由于液体试剂保持时间不能过长且不便于运输,所以干式生化分析也逐渐发展起来,作为一种解决问题的手段,如血糖仪就是典型代表,无需额外试剂。
干化学是指预先将反应所需的部分或全部试剂固定在具有特殊结构的载体中,测定时将生物液体样品直接加到固定了试剂的载体上,以样品中的水分为溶剂,引起待测物与载体中的试剂发生化学反应并产生反应信号,最后通过一定仪器检测显示在载体上的反应信号变化,从而测得样品中待测物的浓度。干化学分析技术在近几十年取得了很大的进步,能够应用在湿化学无法触及的领域,如战场、野外或宇宙空间等临床检验,还可应用于食品安全、环境监测等领域。
市场上干化学产品基本上是国外公司的产品,大概有三类。第一类以美国强生公司为代表的多层膜干片的干化学技术;第二类是日本京都公司的干化学技术;第三类是瑞士Roche公司的干化学产品。干化学技术在现在生化分析中应用越来越广泛,改善干片对样品的扩散性能以及抑制化学反应中的影响因素在提高干片的整体性能中是至关重要的。
C反应蛋白(C-reaction protein,CRP)在1930年由Tillet和Francis发现。最初他们观察到一些急性病人的血清可与肺炎链球菌的荚膜C-多糖发生反应,随后证实能与C-多糖反应的物质是一种蛋白质,因而将这种蛋白质命名为C-反应蛋白。CRP是机体非特异性免疫机制的一部分,它结合C-多糖,在Ca2+存在时可结合细胞膜上磷酸胆碱。CRP的检测在临床应用相当广泛,包括急性感染性疾病的诊断和鉴别诊断,手术后感染的监测;抗生素疗效的观察;病程检测及预后判断等。我国现有测试试剂盒技术存在携带不方便,线性较差等缺点。我国干片主要依赖进口,其关键技术是干化学试剂干片的制备,目前市场的干片,一般都存在制备复杂、成本高等不足。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的缺陷,提供一种C-反应蛋白(CRP)单膜检测干片。
实现本发明目的的技术方案是:一种C-反应蛋白(CRP)单膜检测干片,包括上支撑层、下支撑层、扩散试剂层和透光层;所述上支撑层和下支撑层相互粘合在一起,所述扩散试剂层设置在上支撑层和下支撑层之间的透光层上;所述扩散试剂层包括水溶性材料和参与化学反应的试剂,以及球形白色颗粒。
所述上支撑层和下支撑层为透明聚对苯二甲酸类材料、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯或玻璃制品,其透光度在80%以上。
所述扩散试剂层包括:
试剂:固化磷酸胆碱 0.03-0.1mg/cm2,
辣根过氧化物酶标记的鼠抗-CRP抗体 0.0002-0.0008U/cm2,
氯化钙 0.04—0.1mg/cm2
2-(3,5-二甲氧基-4-羟苯基)-4,5-对(4-二甲基胺基苯基)咪唑0.01-0.07mg/cm2
粘合剂 0.1-1.5μL/cm2
表面活性剂 0.5-2μL/cm2
蛋白质 1-10μg/cm2
球形白色颗粒 0.05-0.5mg/cm2。
本发明C-反应蛋白(CRP)单膜检测干片优选为:
试剂:固化磷酸胆碱 0.05-0.08mg/cm2;
辣根过氧化物酶标记的鼠抗-CRP抗体 0.0004-0.0007U/cm2;
氯化钙 0.05-0.09mg/cm2;
2-(3,5-二甲氧基-4-羟苯基)-4,5-对(4-二甲基胺基苯基)咪唑0.02-0.05mg/cm2;
粘合剂 0.3-1μL/cm2;
表面活性剂 0.8-1.5μL/cm2;
蛋白质 2-8μg/cm2;
聚合珠 0.15-0.25mg/cm2。
本发明C-反应蛋白(CRP)单膜检测干片中原料选择依据是:
固化磷酸胆碱:与CRP结合,模拟细胞环境
辣根过氧化物酶标记的鼠抗-CRP抗体:氧化过氧化氢,与CRP抗原结合
氯化钙:提供反应所需的Ca2+
2-(3,5-二甲氧基-4-羟苯基)-4,5-对(4-二甲基胺基苯基)咪唑:利于蓝色色素的快速形成
粘合剂:借助其粘性,将球型颗粒连接起来
表面活性剂:降低水的表面能,利于血清扩散
蛋白质:提供反应所需要的环境,模拟细胞环境
球形白色颗粒:作为载体,提供反应场所。
所述透光层采用可见光范围透光率在80%以上的透明塑料片或玻璃制备而成,厚度为0.5-2mm。
所述透光层可以由各种透明塑料(如聚乙烯PE、聚对苯二甲酸乙二醇酯PET、聚丙烯PP、聚碳酸酯PC等)、玻璃等制备而成,尤其以PET。透光层的厚度为0.5-2mm,以1-1.5mm为最佳。可见光范围透光率80%以上,95%以上为最佳。光源从测试孔入射,并透过透光层。
实现本发明目的的结构方案是:本发明的C-反应蛋白(CRP)单膜测试干片包括上支撑层、下支撑层、扩散试剂层和透光层。所述上支撑层和下支撑层相互粘合在一起,在上支撑层的测试区开有加样孔,下支撑层的对应位置开有测试孔,扩散试剂层通过涂布工艺涂覆在透光层上,设置于加样孔和测试孔处的上支撑层和下支撑层之间。
上述的多层膜干片,主要使用的样品是血清、血浆和尿液,如果用全血,需要提前对全血处理,得到血清。
所述样品可以通过加样孔直接加入到扩散试剂层中。扩散试剂层的作用是均匀的将样品扩散并提供反应的场所,并能起到反射光的作用。另外,扩散层也起到去除检测影响因子的作用。
所述扩散试剂层是一层均匀的各向均向的多孔膜,为硫酸钡、二氧化钛、钛酸钡、聚苯乙烯等球型白色颗粒,粒度范围在0.1um-5.0um之间,湿膜厚度为100-300μm,干膜厚度为50-200μm。
本发明的C-反应蛋白(CRP)单膜测试干片通过下述方法测定C-反应蛋白:使用钙作为捕获剂,磷酸胆碱共价结合到颗粒表面上上,结合到辣根过氧化酶为免疫标记物的单克隆CRP抗体上。将一滴患者样本滴在干片上,并通过扩散层均匀地扩散。样本中的CRP与磷酸胆碱交链的捕获颗粒与辣根过氧化物酶标记的抗CRP抗体结合,形成一种不溶解的夹心结构化合物。然后在干片上加入免疫洗液,未结合的物质,同时也提供了用于酶媒介的无色染剂氧化反应所需的过氧化氢。
应用本发明C-反应蛋白(CRP)单膜测试干片的测定方法如下:将样本滴加到测试孔处,30-38℃反应4-6min后,将免疫洗液滴加到测试孔处,30-38℃反应1-3min。将反应后的干片立即在670nm光下进行染料的读取。对照标准曲线图,可根据信号值查得CRP的浓度。其中,样品用量10-15μL,免疫洗液用量10-15μL。
本发明具有积极的效果:线性更高,重复性好;由于操作简单,患者可自行检测,特异性更好,像布洛芬、止血敏、茶碱等对此无影响,适用于全自动生化分析仪,有较大的临床价值。
附图说明
图1为本发明C-反应蛋白(CRP)单膜测试干片结构剖面示意图。
图2为本发明C-反应蛋白(CRP)单膜测试干片的标准曲线图。
图3为对比C-反应蛋白(CRP)单膜测试干片的标准曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的内容更容易被清楚地理解,下面根据具体实施例并结合附图,对本发明作进一步详细的说明。
下面结合图1、图2和表格对本发明C-反应蛋白(CRP)单膜测试干片与对比干片的性能进行比较。图2、图3中横坐标为血清浓度,纵坐标为信号值。
表1为本发明干片和对比干片测定线性方差对比。
表2为本发明测试干片和对比测试干片精确度测定结果对比。
实施例:
固化磷酸胆碱 0.06mg/cm2,
辣根过氧化物酶标记的鼠抗-CRP抗体 0.0006U/cm2,
氯化钙 0.07mg/cm2
2-(3,5-二甲氧基-4-羟苯基)-4,5-对(4-二甲基胺基苯基)咪唑 0.02mg/cm2
粘合剂 0.3μL/cm2
表面活性剂 1.2μL/cm2
蛋白质 5μg/cm2
球形白色颗粒 0.15mg/cm2
对比例:
固化磷酸胆碱 0.09mg/cm2,
辣根过氧化物酶标记的鼠抗-CRP抗体 0.0008U/cm2,
氯化钙 0.05mg/cm2
2-(3,5-二甲氧基-4-羟苯基)-4,5-对(4-二甲基胺基苯基)咪唑 0.06mg/cm2
粘合剂 0.25μL/cm2
表面活性剂 0.5μL/cm2
蛋白质 1μg/cm2
TiO2 0.1mg/cm2
本发明C-反应蛋白(CRP)单膜测试干片的性能测试如下:
试验1:线性方差
配制64.500、49.000、32.250、25.800、21.500、18.429、16.125、14.333、8.063、4.031mg/L C-反应蛋白标准溶液,分别用本发明C-反应蛋白(CRP)单膜测试干片和对比干片来测定其方差,结果见表1.
表1本发明干片和对比干片测定线性方差对比
本发明C-反应蛋白(CRP)单膜测试干片和对比C-反应蛋白(CRP)单膜测试干片的测试方法如下:将样本滴加到测试孔处,30-38℃反应4-6min后,将免疫洗液滴加到测试孔处,30-38℃反应1-3min。将反应后的干片立即在670nm光下进行染料的读取。对照标准曲线图,可根据信号值查得CRP的浓度。其中,样品用量10-15μL,免疫洗液用量10-15μL。
本发明干片与对比干片相比,方差更大,线性更好。
试验2:准确度
由表1可得,本发明C-反应蛋白(CRP)单膜测试干片得到的标准曲线为:y=-0.00207x+0.40386,对比C-反应蛋白(CRP)单膜测试干片得到的标准曲线为:y=-0.000322x+0.08938,分别用本发明C-反应蛋白(CRP)单膜测试干片和对比C-反应蛋白(CRP)单膜测试干片测定不同浓度的血清样品,测试后得到信号值,由标准曲线上查得血清浓度值。结果见表2.
表2本发明测试干片和对比测试干片精确度测定结果对比
从表2上可以看出,本发明测试干片测得的值比对比干片更接近理论值,准确度更高,本发明测试干片更好。
以上所述的具体实施例,对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明,可以理解的是,以上所述仅为本发明的具体实施例而已,并不用于限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种C反应蛋白单膜检测干片,其特征在于包括上支撑层、下支撑层、扩散试剂层和透光层;所述上支撑层和下支撑层相互粘合在一起,所述扩散试剂层设置在上支撑层和下支撑层之间的透光层上;所述扩散试剂层包括水溶性材料和参与化学反应的试剂,以及球形白色颗粒。
2.根据权利要求1所述的干片,其特征在于,所述上支撑层和下支撑层为透明聚对苯二甲酸类材料、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯或玻璃制品,其透光度在80%以上。
3.根据权利要求1所述的干片,其特征在于,所述扩散试剂层包括:
试剂:固化磷酸胆碱0.03-0.1mg/cm2,
辣根过氧化物酶标记的鼠抗-CRP抗体0.0002-0.0008U/cm2,
氯化钙0.04-0.1mg/cm2
2-(3,5-二甲氧基-4-羟苯基)-4,5-对(4-二甲基胺基苯基)咪唑0.01—0.07mg/cm2
粘合剂 0.1-1.5μL/cm2
表面活性剂 0.5-2μL/cm2
蛋白质 1-10μg/cm2
球形白色颗粒 0.05-0.5mg/cm2。
4.根据权利要求1所述的干片,其特征在于,所述扩散试剂层包括:
试剂:固化磷酸胆碱0.05-0.08mg/cm2,
辣根过氧化物酶标记的鼠抗-CRP抗体0.0004-0.0007U/cm2,
氯化钙0.05-0.09mg/cm2
2-(3,5-二甲氧基-4-羟苯基)-4,5-对(4-二甲基胺基苯基)咪唑0.02-0.05mg/cm2
粘合剂 0.3-1μL/cm2
表面活性剂 0.8-1.5μL/cm2
蛋白质 2-8μg/cm2
球形白色颗粒 0.15-0.25mg/cm2。
5.根据权利要求1所述的干片,其特征在于,所述透光层采用可见光范围透光率在80%以上的透明塑料片或玻璃制备而成,厚度为0.5-2mm。
6.根据权利要求1所述的干片,其特征在于,所述透光层的材料选自聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚丙烯或聚碳酸酯,可见光范围透光率95%以上,厚度为1-1.5mm。
7.根据权利要求1所述的干片,其特征在于,所述上支撑层的测试区开有加样孔,所述下支撑层的对应位置开有测试孔,所述扩散试剂层通过涂布工艺涂覆在透光层上。
8.根据权利要求1所述的干片,其特征在于,所述扩散试剂层为一层均匀的各向均向的多孔膜,所述球型白色颗粒为硫酸钡、二氧化钛、钛酸钡、聚苯乙烯,粒度范围在0.1um-5.0um之间,湿膜厚度为100-300μm,干膜厚度为50-200μm。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190806 |
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