CN110093453A - 检测猪Pegivirus的套式RT-PCR引物组、试剂盒及应用 - Google Patents

检测猪Pegivirus的套式RT-PCR引物组、试剂盒及应用 Download PDF

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李锦辉
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Abstract

本发明涉及生物技术技术领域，特别涉及一种检测猪Pegivirus的套式RT‑PCR引物组、试剂盒及应用。所述的检测猪Pegivirus的套式RT‑PCR引物组，其特征在于包含***引物PPgV–F1、PPgV–R1，内围引物PPgV–F2、PPgV–R2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示，本发明还提供了一种包含上述引物组的试剂盒，该试剂盒采用一步法RT‑PCR和套式PCR相互配合，可高效、快速、特异地扩增目标序列，适用于疫病病原确诊和病原净化检测，例如：出入境现场、养殖场等。

Description

检测猪Pegivirus的套式RT-PCR引物组、试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及生物技术技术领域，特别涉及一种检测猪Pegivirus的套式RT-PCR引物组、试剂盒及应用。
背景技术
Pegivirus(发音为peh-gee病毒)是一种新出现的从发病动物的血清中分离的病毒。Pegivirus是小包膜的单链正义RNA病毒，其基因组大小为9～13kb核苷酸，基因组表征已将所有已知的Pegivirus分类为黄病毒科佩吉病毒属中的11种(A-K)。猪Pegivirus(PPgV)属于Pegivirus K的成员。
Pegivirus可感染包括人类、灵长类动物、猪、马、啮齿动物和蝙蝠等多种哺乳动物。但大多数Pegivirus的致病性是未知的，据报道仅Pegivirus D可引起急性马肝炎或马的血清相关性肝炎。尽管PPgV阳性的猪表现出跛足和水疱等特征性临床症状，但先前的研究报道表明，在PPgV的动物致病性研究中，PPgV对感染猪没有明显的临床效果，因此PPgV感染与任何特定临床疾病之间的关联有待进一步研究。
来自德国和美国的猪中检测到猪的Pegivirus，表明PPgV的广泛的地理分布。已有文献报道我国猪群中已经检测到Pegivirus，而目前，我国鲜有关于PPgV研究的相关报道。针对目前该病的确诊和扩散控制，急需提出和制定快速的诊断方法与有效的防控策略。
发明内容
为了克服现有技术中缺少检测PPgV成熟技术方案的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种检测猪Pegivirus的套式RT-PCR引物组，该引物组能快速、准确、高效地检测鉴定PPgV，特异性好，灵敏度高。
本发明的另一目的在于提供一种检测猪Pegivirus的试剂盒，该试剂盒包括上述引物组，该试剂盒可高效、准确地检测鉴定PPgV。
本发明的再一目的在于提供上述检测猪Pegivirus的套式RT-PCR引物组和试剂盒的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种检测猪Pegivirus的套式RT-PCR引物组，包含***引物PPgV–F1、PPgV–R1，内围引物PPgV–F2、PPgV–R2，其核苷酸序列如下所示：
引物PPgV–F1：5′-ACGGTTGGWCGTTTGAGGAG-3′；
引物PPgV–R1：5′-ACAAGCGGAAAGTGACAKGAAT-3′；
引物PPgV–F2：5′-CACCCYTTTATGCTTACTGCC-3′；
引物PPgV–R2：5′-CCCRCGAGCRAAAATCATACC-3′；
其中，K、Y、R和W表示简并碱基代码，K＝G/T；Y＝C/T；R＝A/G；W＝A/T；
所述的检测猪Pegivirus的套式RT-PCR引物组在检测猪Pegivirus领域中的应用；
所述的检测猪Pegivirus的套式RT-PCR引物组在检测猪Pegivirus领域中的应用，不包含疾病的诊断目的；
一种检测猪Pegivirus的试剂盒，包含上述检测猪Pegivirus的套式RT-PCR引物组；
所述的检测PPgV的试剂盒还包含Primer Script 1step Enzyme Mix、2×1stepBuffer、RNase Free ddH2O、TaKaRa Taq、dNTP Mixture、10×PCR Buffer(Mg2++plus)；
所述的检测PPgV的试剂盒进一步优选包含Primer Script 1step Enzyme Mix、2×1step Buffer、RNase Free ddH2O、TaKaRa Taq、dNTP Mixture、10×PCR Buffer(Mg2++plus)；浓度为10μmol/L的PPgV–F1、浓度为10μmol/L的PPgV–R1、浓度为10μmol/L的PPgV–F2、浓度为10μmol/L的PPgV–R2；
所述的检测猪Pegivirus的试剂盒在检测猪Pegivirus领域中的应用；
所述的检测猪Pegivirus的试剂盒在检测猪Pegivirus领域中的应用，包含如下步骤：
(1)以待测样品RNA为模板，以引物PPgV–F1和引物PPgV–R1为扩增引物，配制一步法RT-PCR反应体系，进行RT-PCR反应；
(2)以步骤(1)制得的RT-PCR反应产物为模板，以引物PPgV–F2和引物PPgV–R2为扩增引物，配制套式PCR反应体系，进行套式PCR反应；
(3)将步骤(2)制得的套式PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，在870bp处出现目的条带的判定为阳性扩增，在870bp处未出现目的条带的判定为阴性扩增；
步骤(1)中所述的RT-PCR反应的反应体系优选为：
步骤(1)中所述的RT-PCR反应的反应参数如下所示：
50℃逆转录反应30min；95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min45s，45个循环；72℃延伸10min；
步骤(2)中所述的套式PCR反应的反应体系优选为：
步骤(2)中所述的套式PCR反应的参数如下所示：
95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min45s，45个循环；72℃延伸10min；
所述的检测猪Pegivirus的试剂盒在检测猪Pegivirus领域中的应用，不包含疾病的诊断目的；
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明提供的检测猪Pegivirus的套式RT-PCR引物组特异性好，灵敏度高，重复性与稳定性好，适用于PPgV的确诊和净化检测。
(2)本发明提供的检测猪Pegivirus的套式RT-PCR引物组和试剂盒采用一步法RT-PCR和套式PCR相互配合，该反应机制可高效、快速、特异地扩增目标序列。
(3)本发明提供的检测猪Pegivirus的试剂盒扩增效率高且特异性强。
(4)本发明提供的检测猪Pegivirus的试剂盒非常适用于疫病病原确诊和病原净化检测，例如：出入境现场、养殖场等。
附图说明
图1是***引物一步法RT-PCR反应产物电泳结果图；其中，泳道M为DNA MarkerDL2000，泳道1～3分别代表阳性对照、被检样品、阴性对照。
图2是内围引物套式PCR反应产物电泳结果图；其中，泳道M为DNA Marker DL2000，泳道1～3分别代表阳性对照、被检样品、阴性对照。
图3是***引物一步法RT-PCR和内围引物套式PCR敏感性结果分析图；其中，泳道Ma为DNA Marker DL2000、Mb为DNA Marker DL1000；泳道1a/1b、2a/2b、3a/3b、4a/4b、5a/5b、6a/6b、7a/7b、8a/8b、9a/9b、10a/10b、11a/11b、12a/12b分别代表初始核酸浓度、101倍倍比核酸稀释浓度、102倍倍比核酸稀释浓度、103倍倍比核酸稀释浓度、104倍倍比核酸稀释浓度、105倍倍比核酸稀释浓度、106倍倍比核酸稀释浓度、107倍倍比核酸稀释浓度、108倍倍比核酸稀释浓度、109倍倍比核酸稀释浓度、1010倍倍比核酸稀释浓度、1011倍倍比核酸稀释浓度和阴性对照的反应产物的一步法RT-PCR和套式PCR电泳结果。
图4是***引物一步法RT-PCR和内围引物套式PCR特异性结果分析图；其中泳道Ma为DNA Marker DL2000、Mb为DNA Marker DL1000；泳道1a/1b、2a/2b、3a/3b、4a/4b、5a/5b、6a/6b、7a/7b分别代表SVV、PDCOV、PEDV、TGEV、PRRSV和阴性对照的一步法RT-PCR和套式PCR电泳结果。
图5是PPgV的套式RT-PCR试剂盒临床样品检测结果图；泳道Ma和Mb分别为DNAMarker DL1000、泳道1～30为检测样品。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中：
塞尼卡谷病毒(SVV)HN16株(即塞内加谷病毒SVV HN16株)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)Ch-A株、猪流行性腹泻病毒(PEDV)CH/GDGZ/2012株、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)CN12株、猪蓝耳病病毒(PRRSV)YA株已在申请号为“CN201810510587.9”、申请名称为“检测塞尼卡谷病毒的RT-LAMP引物组、试剂盒及应用”的中国专利申请中公开；
Primer Script 1step Enzyme Mix、2×1step Buffer、RNase Free ddH2O、TaKaRa Taq、dNTP Mixture、10×PCR Buffer(Mg2++plus)均购自TAKARA生物科技有限公司，货号LMP204；Simpiy P总RNA提取试剂盒(Simpiy P Total RNA Extraction Kit)购自杭州博日科技有限公司，产品编号：BSC52S1。
实施例1
一、引物设计
参考与比对GenBank中PPgV基因序列(Accession:EF058133.1、Accession:NC_034442.1、Accession:KU351671.1、Accession:KU351670.1、Accession:KU351669.1)，利用MegAlign软件进行序列比对，选择位于全基因序列中的保守基因片段NS5B区域作为引物设计区域，确定该保守核甘酸序列中的高度保守片段作为扩增区域，利用引物辅助设计软件primer5根据确定的保守核甘酸序列设计出了三套检测PPgV基因的套式RT-PCR引物组：每一套检测PPgV的套式RT-PCR引物组合物，包括***上游引物引物PPgV–F1、***下游引物引物PPgV–R1、内围上游引物PPgV–F2、内围下游引物PPgV–R2组成；所述引物序列如下表所示：
表1检测猪Pegivirus的套式RT-PCR引物组
其中，K、Y、R、和W表示简并碱基代码，K＝G/T；Y＝C/T；R＝A/G；W＝A/T；
PPgV基因序列的NS5B片段中的高度保守序列如下：
ACGGTTGGTCGTTTGAGGAGGCCGTGGCCAAGCTCCGGTCGGGGGCAGCCTCCGGCCACAACGCTCCTGTAACTGTTGCCGGTCTCAAGCGTGGTGAAGGCAAGCACCATGTTGAAGAATGCCGGCGGCAGCTGCTTGAGGGCGTAGGTTACCACCCCTTTATGCTTACTGCCAAACAGGAAGTGTTCTATCAAGATAAGAAAACTAAGAAACCTCCTAGGCTGATTGTTTTCCCTTCACTTGAATTTCGCGTAGTTGAGAAGATGGCGTTTGGCGACCCTTCCCGCGTTCCCAAGGCTGTGTTGGGGTCTGCTTATGGATTCCAATACACCCCTTTCGAGCGTGTTAAGGTGCTTACTGACATGTGGAAATCTAAACGAAATCCATGTGCCATCGTTGTGGACGCCAAGTGCTTTGACTCTTCAATTACTCCTGGAGATGTGGAACGTGAAACTGAACTCTATTGTGCTGCTTATCGGGACCCCACTTTAATACGCGCGATTAGCAGACACTACGCCCATGGCCCCATGGTTAACAACCGCGGGGTTTGGGTCGGTGAACGCAATTGTCGCGCTAGTGGAGTCCTTACTACCTCATCTAGCAATTGTCTTACTTGTTACTTGAAAGTTAAAGCTGCTACTAGGAAAGTTAAGTTAAAAAACGCTTCAATGCTTATACACGGGGATGATTGTATCATAATCTGTGAGCGCGAGCTCCCTGATGACATTTGTGACCAGCTCCGGGCTGCACTGTTGGCTTATGGCTATGACTGTGAGCCCACGGTCCACTCGTCGTTGGACACGGCTGTCACTTGCTCCACTTTTCTCGCTGAGTGCAAGGTACACGGTGGTGCGCGCATCAACTTCTTATCGACCGACATGCGACGGGCGTTAGCTCGTGCGTGCGGCGGGTATGGAGATGGTGCAGCCTGCGCCGCAGGTTATACTATACAATATCCTCATCACCCAATAACTAGGTATGTATTAATTCCTTTGTTGTTAGGTATGATTTTTGCTCGTGGGGGCAACCCCACGGATGAAATCACATGTAATGTTAGAGGCAATTCCTGTCACTTTCCGCTTGT
二、引物初筛
经过初步筛选，三套引物中第二套引物特异性最好，其含有兼并碱基，有利于碱基互补配对。
实施例2
(1)病毒基因组RNA提取
使用Simpiy P总RNA提取试剂盒(Simpiy P Total RNA Extraction Kit)提取PPgV(该毒株已在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH345724中公开，其名称为China_porcine_pegivirus_GD1Porcine，基因登录号：MH345724)的RNA，以及对照病毒(塞尼卡谷病毒(SVV)HN16株、***病毒(FMDV)疫苗株、猪丁型冠状病毒(PDCoV)Ch-A株、猪流行性腹泻病毒(PEDV)CH/GDGZ/2012株、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)CN12株、猪蓝耳病病毒(PRRSV)YA株以及猪瘟病毒标准阳性血清)的RNA。具体操作步骤如下：
①样本预处理：液体样本(血清、血浆和组织匀浆上清等)直接取100μl放入1.5ml离心管进入下一步；
②在预处理好的样本中，加入60μl的裂解液R2，充分颠倒混匀，室温静置5min；此步骤不可离心，取上清时尽量避免吸到悬浮杂质，以避免下步离心时堵塞纯化柱；
③将上清液吸入纯化柱，纯化柱要套上接液管，12000rpm离心30s；
④弃去接液管中液体，向纯化柱中加入600μl洗涤液，12000rpm离心30s；
⑤弃去接液管中液体，重复洗涤一次；
⑥然后空柱于10000rpm离心1min后将纯化柱转移到一个新1.5ml离心管中；
⑦在纯化柱膜中央加入洗脱液(或pH>7.0的DEPC处理水)50μl，室温静置1min，12000rpm离心30s，获得总RNA，提纯的总RNA如果不立即使用，请保存于-80℃冰箱；
(2)一步法RT-PCR反应体系及反应参数建立
构建20μL一步法RT-PCR反应体系(表2)，同时建立一步法RT-PCR反应参数(表3)。将一步法RT-PCR反应体系中的各组分依次加入PCR反应管中，并在PCR管上用记号笔标记每一个反应管对应的样品名称，将PCR反应管置于微型离心机瞬离至液体全部滞留于反应管底部并保证液体中无气泡存在。将PCR反应管置于PCR仪中按表3的反应参数进行一步法RT-PCR扩增。扩增结束后，制备质量体积比为1.2％的琼脂糖凝胶板，将一步法RT-PCR反应产物按编号依次加入到对应的凝胶板的胶孔中，凝胶板的边孔中加入DNA Marker。于110V恒定电压下电泳45min，电泳结束后用凝胶成像***进行结果分析并拍照。
表2一步法RT-PCR反应体系
表3一步法RT-PCR反应参数
以PPgV总RNA为模板，用***引物PPgV–F1和PPgV–R1进行一步法RT-PCR反应，扩增出约1080bp的目的条带，与预期大小相符(见图1)。
用胶回收试剂盒回收纯化一步法RT-PCR产物，与PMD-19T载体连接，将重组载体转化感受态细胞(DH5α)中，筛选阳性重组质粒，经PCR鉴定，阳性质粒送至华大基因公司进行测序，用DNASTAR(5.7)基因分析软件对测序结果进行分析后表明，扩增目的片段长度为1084bp，与***引物设计时预计的扩增片段长度相符。测序结果如下：
ACGGTTGGTCGTTTGAGGAGGCGGTGGCCAAGCTCCGGTCTGGAGCGGCCTCTGGCCACAATACTCCCGTTACTGTCGCCGGGCTAAAGCGTGGTGAAGGCAAGCACCATGTTGAAGAGTGTCGGCGGCAGCTGCTGGAGGGCGTAGGCTACCACCCTTTTATGCTTACTGCCAAACAGGAAGTGTTCTACCAAGACAAGAAGACCAAAAAACCTCCCAGGCTAATAGTTTTTCCCTCGCTTGAGTTCCGTGTGGTTGAGAAGATGGCATTTGGCGACCCGTCCCGCGTTCCGAAGGCAGTGCTGGGAGCCGCTTACGGGTTCCAGTACACTCCCTTCGAGCGCGTTAAGGTACTCGTTGACATGTGGAAGTCTAAACGAAATCCATGTGCCATTGTTGTTGACGCTAAGTGTTTTGACTCGTCGATCACTCCTGGGGACGTCGAGCGGGAGACTGAGTTATACTGTGCTGCTTATCGGGATACCGCGCTGATACGCGCCATTAGCAAACACTATGCCCATGGCCCCATGGTGAACAACCGTGGGGTCTGGGTTGGTGAGCGCAACTGCCGCGCCAGCGGGGTTCTCACTACCTCATCTAGCAATTGTCTTACCTGCTACTTGAAAGTTAAAGCTGCTACTAGGAAGGTTAAGTTGAAAAATGCATCACTTCTTATACATGGGGATGACTGTATTATAATCTGTGAGCGCGAGCTACCAGATGACATCTGTGACCAGTTGCGAGAGGCGTTGTTGGCATACGGTTACGACTGTGAGCCTTCAGTGCACTCGTCCCTGGACACCGCCGTTACGTGCTCCACGTTCTTAGCTGAGTGTCGGGTTCATGGCGGCGCGCGCGTTAACTTCCTATCCACCGATATGCGACGGGCTCTCGCCCGAGCTTGCGGAGGGTATGGAGATGGCGCTGCTTGTGCTGCGGGTTATACCATTCAGTACCCCCATCATCCTATAACTAGGTATGTTCTAATACCTCTACTGTTGGGCATGATATTCGCTCGGGGGGGCAATCCCACTGACGAAATCACGTGCAATGTCAGGGGCAATTCCTGTCACTTTCCGCTTGT
(3)套式PCR反应体系及反应参数建立
构建25μL套式PCR反应体系(表4)，同时建立套式PCR反应参数(表5)。以一步法RT-PCR反应产物为模板，套式PCR反应体系中的其他各组分依次加入PCR反应管中，并在PCR管上用记号笔标记每一个反应管对应的样品名称，将PCR反应管置于微型离心机瞬离至液体全部滞留于反应管底部并保证液体中无气泡存在。将PCR反应管置于PCR仪中按表5的反应参数进行套式PCR扩增。扩增结束后，制备质量体积比为1.2％的琼脂糖凝胶板，将套式PCR反应产物按编号依次加入到对应的凝胶板的胶孔中，凝胶板的边孔中加入DNA Marker。于110V恒定电压下电泳45min，电泳结束后用凝胶成像***进行结果分析并拍照。
表4套式PCR反应体系
表5套式PCR反应参数
以一步法RT-PCR反应产物为模板，用内围引物PPgV–F2和PPgV–R2按表4的反应体系和表5的反应参数进行套式PCR反应，扩增结果见图2，其中，在870bp处出现目的条带的为阳性扩增，在870bp处未出现目的条带的为阴性扩增。
(4)套式RT-PCR检测方法的敏感性结果
以第二步中经测序确认的阳性重组质粒作为模板，测定其浓度为13.8ng/μL，用RNase Free ddH2O连续10倍倍比稀释成11个稀释度，以各阳性重组质粒的各稀释度作为反应模板，首先利用***引物按表2的反应体系和表3的反应参数进行一步法RT-PCR反应，PCR反应管上用记号笔标记每一个反应管对应的样品稀释度。然后利用内围引物以上述一步法RT-PCR反应产物为模板按表4的反应体系和表5的反应参数进行套式PCR反应，PCR反应管上用记号笔标记每一个反应管对应的样品稀释度。反应结束制备具有双排点样空的质量体积比为1.2％的琼脂糖凝胶板，第一排点样空用于一步法RT-PCR电泳检测，第二排点样孔用于套式PCR电泳检测，将一步法RT-PCR反应产物和套式PCR反应产物按编号依次加入到对应的凝胶板的胶孔中，凝胶板的边孔中加入对应的DNA Marker。于110V恒定电压下电泳45min，电泳结束后用凝胶成像***进行结果分析并拍照。检测结果表明：***引物和内围引物可以检测到的最低稀释倍数分别为10-8和10-9，经换算为1.165×102copies/μl和1.165×101copies/μl(见图3)。
(5)套式RT-PCR检测方法的特异性结果
利用Simpiy P总RNA提取试剂盒(Simpiy P Total RNA Extraction Kit)提取阳性PPgV、SVV、PDCOV、PEDV、TGEV、PRRSV共6种病毒(塞尼卡谷病毒(SVV)HN16株、猪丁型冠状病毒(PDCoV)Ch-A株、猪流行性腹泻病毒(PEDV)CH/GDGZ/2012株、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)CN12株、猪蓝耳病病毒(PRRSV)YA株)的核酸，以各病毒RNA和水作为模板，首先利用***引物按表2的反应体系和表3的反应参数进行一步法RT-PCR反应，PCR反应管上用记号笔标记每一个反应管对应的检测样品。然后利用内围引物以上述一步法RT-PCR反应产物为模板按表4的反应体系和表5的反应参数进行套式PCR反应，PCR反应管上用记号笔标记每一个反应管对应的检测样品。反应结束制备具有双排点样空的质量体积比为1.2％的琼脂糖凝胶板，第一排点样空用于一步法RT-PCR电泳检测，第二排点样孔用于套式PCR电泳检测，将一步法RT-PCR反应产物和套式PCR反应产物按编号依次加入到对应的凝胶板的胶孔中，凝胶板的边孔中加入对应的DNA Marker。于110V恒定电压下电泳45min，电泳结束后用凝胶成像***进行结果分析并拍照。结果表明：***引物和内围引物均具有良好的特异性，对照病毒和水均为阴性(图4)。
(6)套式RT-PCR检测方法的临床样品检测
利用Pegivirus的套式RT-PCR引物组检测从发病猪场送检的30份血清，利用Simpiy P总RNA提取试剂盒(Simpiy P Total RNA Extraction Kit)提取送检血清的核酸。以所提取的30份血清核酸为模板，首先利用***引物按表2的反应体系和表3的反应参数进行一步法RT-PCR反应，PCR反应管上用记号笔标记每一个反应管对应的样品编号。然后利用内围引物以上述一步法RT-PCR反应产物为模板按表4的反应体系和表5的反应参数进行套式PCR反应，PCR反应管上用记号笔标记每一个反应管对应的样品样品稀释度。反应结束制备具有双排点样空的质量体积比为1.2％的琼脂糖凝胶板，将套式PCR反应产物按编号依次加入到对应的凝胶板的胶孔中，凝胶板的边孔中加入对应的DNA Marker。于110V恒定电压下电泳45min，电泳结束后用凝胶成像***进行结果分析并拍照。经鉴定该送检样品中有3份血清(6、14、25)存在阳性扩增(见图5)。检测结果如下：
表6临床样品检测结果分析
对阳性扩增的PCR产物，用胶回收试剂盒回收纯化PCR产物，与PMD-19T载体连接，将重组载体转化感受态细胞(DH5α)中，筛选阳性重组质粒，经PCR鉴定，阳性质粒送至华大基因公司进行测序，该三份阳性样品的具体测序结果分别如下所示：
第一份(样品6)：
CACCCTTTTATGCTTACTGCCAAACAGGAAGTGTTCTACCAAGATAAGAAAACAAAAAAACCTCCCAGACTAATAGTTTTCCCCTCGCTCGAGTTCCGTGTGGTTGAGAAGATGGCATTTGGCGACCCGTCCCGCGTCCCGAAGGCAGTGCTGGGAGCCGCTTACGGGTTCCAGTACACCCCTTTTGAGCGCGTTAAGGTACTCATTGACATGTGGAAATCCAAGCGAAATCCATGTGCCATTGTTGTTGACGCTAAGTGTTTTGACTCTTCGATCACTCCTGGGGATGTCGAGCGGGAGACTGAGTTATACTGTGCTGCTTATCGAGACACCGCGCTGATACGCGCCATTAGCAAACACTACGCCCATGGCCCCATGGTGAACAACCGTGGAGTTTGGGTCGGTGAGCGCAACTGTCGCGCCAGCGGGGTTCTCACTACCTCATCTAGCAATTGTCTTACTTGTTACTTGAAAGTTAAAGCTGCTACTAGGAAGGTCAAGTTGAAAAATGCATCACTTCTTATACATGGGGATGACTGTATCATAATCTGTGAGCGCGAGCTACCAGATGACATCTGTGACCAGTTGCGGGAAGCGTTGTTGGCTTACGGTTATGACTGTGAGCCTTCAGTGCACTCGTCTCTGGACACCGCCGTCACGTGTTCCACATTCTTAGCTGAGTGTCGCGTTCATGGCGGTGCACGCGTTAACTTCTTATCCACCGACATGCGTCGGGCTCTTGCCCGAGCTTGCGGTGGGTATGGAGATGGCGCTGCTTGCGCTGCGGGTTATACCATTCAGTACCCCCATCATCCCATAACTAGGTATGTTTTAATACCTCTGCTGTTGGGCATGATTTTCGCTCGTGGG
第二份(样品14)：
CACCCTTTTATGCTTACTGCTAAACAGGAAGTGTTCTACCAAGATAAGAAAACAAAAAAACCTCCCAGATTAATAGTTTTCCCCTCGCTCGAGTTCCGTGTGGTTGAGAAGATGGCATTTGGCGACCCGTCCCGCGTTCCGAAGGCAGTGCTGGGGGCCGCTTACGGGTTCCAGTACACCCCTTTTGAGCGCGTCAAGGTACTCATTGACATGTGGAAGTCCAAGCGAAATCCATGTGCCATTGTTGTTGACGCTAAGTGTTTTGACTCTTCGATCACTCCTGGGGATGTCGAGCGGGAGACTGAGTTATACTGTGCTGCTTATCGAGACACCGCGCTGATACGCGCCATTAGCAAACACTATGCCCATGGCCCCATGGTGAACAACCGTGGAGTTTGGGTTGGTGAGCGCAACTGCCGCGCCAGTGGGGTTCTCACTACCTCATCTAGCAATTGTCTTACTTGTTACTTGAAAGTTAAAGCTGCTACTAGGAAGGTCAAGTTGAAAAATGCATCACTTCTTATACATGGGGATGACTGTATCATAATCTGTGAGCGCGAGCTACCAGATGACATCTGTGACCAGTTGCGGGAAGCGTTGTTGGCTTACGGTTATGACTGTGAGCCTTCAGTGCACTCGTCTCTGGACACCGCCGTCACGTGCTCCACATTCTTAGCTGAGTGTCGGGTTCATGGCGGCGCACGCGTTAACTTCCTATCCACCGACATGCGTCGAGCTCTTGCCCGAGCTTGCGGGGGGTATGGAGATGGCGCTGCTTGCGCCGCGGGTTATACCATTCAGTATCCCCATCATCCCATAACTAGGTATGTTCTAATACCTCTATTGTTGGGCATGATCTTCGCTCGTGGG
第三份(样品25)：
CACCCTTTCATGCTTACTGCCAAACAGGAAGTGTTCTACCAAGATAAGAAGACTAAAAAACCTCCCAGATTAATAGTTTTCCCCTCGCTCGAGTTCCGCGTGGTTGAGAAGATGGCATTTGGCGACCCGTCCCGCGTTCCGAAGGCAGTGCTGGGAGCCGCTTACGGGTTCCAGTACACCCCTTTTGAGCGCGTTAAGGTGCTCACTGACATGTGGAAGTCCAAACGGAGTCCATGTGCCATTGTTGTTGACGCCAAGTGTTTTGATTCTTCGATCACTCCTGGGGACGTCGAGCGGGAGACTGAGTTATACTGTGCTGCTTACCGAGACACCGCGCTGATACGCGCCATTAGCAAACACTACGCCCATGGCCCCATGGTAAACAACCGTGGAGTTTGGGTTGGTGAGCGCAACTGTCGCGCCAGTGGGGTTCTCACTACCTCATCTAGCAATTGTCTTACTTGTTACTTGAAAGTTAAAGCTGCTACTAGGAAGGTTAAGTTGAAAAATGCATCACTTCTTATACATGGGGATGACTGTATCATAATCTGCGAGCGCGAGCTACCAGATGACATCTGTGACCAGTTGCGAGATGCGTTGTTGGCATATGGTTACGACTGTGAGCCTTCAGTGCACTCGTCTCTGGATACCGCCGTTACATGCTCCACATTCTTAGCTGAGTGTCGGGTTCACGGCGGCGCACGCGTCAACTTCCTATCCACCGACATGCGGCGGGCACTCGCCCGGGCGTGCGGAGGGTATGGAGATGGCGCTGCTTGTGCTGCGGGTTATACCATCCAATACCCCCATCATCCTATAACTAGGTATGTTTTAATACCTCTACTATTGGGCATGATCTTCGCTCGTGGG
测序结果显示3份阳性样品的扩增产物的序列均存在与Pegivirus的NS5B片段中保守序列同源性很高的基因序列，进一步用DNASTAR(5.7)基因分析软件对测序结果进行分析后表明，3份阳性样品的扩增产物的序列之间的同源性在94.5％～97.5％之间，3份阳性样品与标准Pegivirus的NS5B序列的同源性在93.8.5％～97.5％之间，该结果表明30送检份血清中有三份为猪Pegivirus阳性感染。该结果也进一步验证了本发明中所建立的检测猪Pegivirus的套式RT-PCR引物组的特异性和该方法用于临床检测的可行性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 检测猪Pegivirus的套式RT-PCR引物组、试剂盒及应用
<130> 1
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物PPgV-F1
<400> 1
acggttggwc gtttgaggag 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物PPgV-R1
<400> 2
acaagcggaa agtgacakga at 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物PPgV-F2
<400> 3
cacccyttta tgcttactgc c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物PPgV-R2
<400> 4
cccrcgagcr aaaatcatac c 21
<210> 5
<211> 1084
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PPgV基因序列的NS5B片段中的高度保守序列
<400> 5
acggttggtc gtttgaggag gccgtggcca agctccggtc gggggcagcc tccggccaca 60
acgctcctgt aactgttgcc ggtctcaagc gtggtgaagg caagcaccat gttgaagaat 120
gccggcggca gctgcttgag ggcgtaggtt accacccctt tatgcttact gccaaacagg 180
aagtgttcta tcaagataag aaaactaaga aacctcctag gctgattgtt ttcccttcac 240
ttgaatttcg cgtagttgag aagatggcgt ttggcgaccc ttcccgcgtt cccaaggctg 300
tgttggggtc tgcttatgga ttccaataca cccctttcga gcgtgttaag gtgcttactg 360
acatgtggaa atctaaacga aatccatgtg ccatcgttgt ggacgccaag tgctttgact 420
cttcaattac tcctggagat gtggaacgtg aaactgaact ctattgtgct gcttatcggg 480
accccacttt aatacgcgcg attagcagac actacgccca tggccccatg gttaacaacc 540
gcggggtttg ggtcggtgaa cgcaattgtc gcgctagtgg agtccttact acctcatcta 600
gcaattgtct tacttgttac ttgaaagtta aagctgctac taggaaagtt aagttaaaaa 660
acgcttcaat gcttatacac ggggatgatt gtatcataat ctgtgagcgc gagctccctg 720
atgacatttg tgaccagctc cgggctgcac tgttggctta tggctatgac tgtgagccca 780
cggtccactc gtcgttggac acggctgtca cttgctccac ttttctcgct gagtgcaagg 840
tacacggtgg tgcgcgcatc aacttcttat cgaccgacat gcgacgggcg ttagctcgtg 900
cgtgcggcgg gtatggagat ggtgcagcct gcgccgcagg ttatactata caatatcctc 960
atcacccaat aactaggtat gtattaattc ctttgttgtt aggtatgatt tttgctcgtg 1020
ggggcaaccc cacggatgaa atcacatgta atgttagagg caattcctgt cactttccgc 1080
ttgt 1084
<210> 6
<211> 1084
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 测序结果
<400> 6
acggttggtc gtttgaggag gcggtggcca agctccggtc tggagcggcc tctggccaca 60
atactcccgt tactgtcgcc gggctaaagc gtggtgaagg caagcaccat gttgaagagt 120
gtcggcggca gctgctggag ggcgtaggct accacccttt tatgcttact gccaaacagg 180
aagtgttcta ccaagacaag aagaccaaaa aacctcccag gctaatagtt tttccctcgc 240
ttgagttccg tgtggttgag aagatggcat ttggcgaccc gtcccgcgtt ccgaaggcag 300
tgctgggagc cgcttacggg ttccagtaca ctcccttcga gcgcgttaag gtactcgttg 360
acatgtggaa gtctaaacga aatccatgtg ccattgttgt tgacgctaag tgttttgact 420
cgtcgatcac tcctggggac gtcgagcggg agactgagtt atactgtgct gcttatcggg 480
ataccgcgct gatacgcgcc attagcaaac actatgccca tggccccatg gtgaacaacc 540
gtggggtctg ggttggtgag cgcaactgcc gcgccagcgg ggttctcact acctcatcta 600
gcaattgtct tacctgctac ttgaaagtta aagctgctac taggaaggtt aagttgaaaa 660
atgcatcact tcttatacat ggggatgact gtattataat ctgtgagcgc gagctaccag 720
atgacatctg tgaccagttg cgagaggcgt tgttggcata cggttacgac tgtgagcctt 780
cagtgcactc gtccctggac accgccgtta cgtgctccac gttcttagct gagtgtcggg 840
ttcatggcgg cgcgcgcgtt aacttcctat ccaccgatat gcgacgggct ctcgcccgag 900
cttgcggagg gtatggagat ggcgctgctt gtgctgcggg ttataccatt cagtaccccc 960
atcatcctat aactaggtat gttctaatac ctctactgtt gggcatgata ttcgctcggg 1020
ggggcaatcc cactgacgaa atcacgtgca atgtcagggg caattcctgt cactttccgc 1080
ttgt 1084
<210> 7
<211> 870
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 样品6
<400> 7
caccctttta tgcttactgc caaacaggaa gtgttctacc aagataagaa aacaaaaaaa 60
cctcccagac taatagtttt cccctcgctc gagttccgtg tggttgagaa gatggcattt 120
ggcgacccgt cccgcgtccc gaaggcagtg ctgggagccg cttacgggtt ccagtacacc 180
ccttttgagc gcgttaaggt actcattgac atgtggaaat ccaagcgaaa tccatgtgcc 240
attgttgttg acgctaagtg ttttgactct tcgatcactc ctggggatgt cgagcgggag 300
actgagttat actgtgctgc ttatcgagac accgcgctga tacgcgccat tagcaaacac 360
tacgcccatg gccccatggt gaacaaccgt ggagtttggg tcggtgagcg caactgtcgc 420
gccagcgggg ttctcactac ctcatctagc aattgtctta cttgttactt gaaagttaaa 480
gctgctacta ggaaggtcaa gttgaaaaat gcatcacttc ttatacatgg ggatgactgt 540
atcataatct gtgagcgcga gctaccagat gacatctgtg accagttgcg ggaagcgttg 600
ttggcttacg gttatgactg tgagccttca gtgcactcgt ctctggacac cgccgtcacg 660
tgttccacat tcttagctga gtgtcgcgtt catggcggtg cacgcgttaa cttcttatcc 720
accgacatgc gtcgggctct tgcccgagct tgcggtgggt atggagatgg cgctgcttgc 780
gctgcgggtt ataccattca gtacccccat catcccataa ctaggtatgt tttaatacct 840
ctgctgttgg gcatgatttt cgctcgtggg 870
<210> 8
<211> 870
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 样品14
<400> 8
caccctttta tgcttactgc taaacaggaa gtgttctacc aagataagaa aacaaaaaaa 60
cctcccagat taatagtttt cccctcgctc gagttccgtg tggttgagaa gatggcattt 120
ggcgacccgt cccgcgttcc gaaggcagtg ctgggggccg cttacgggtt ccagtacacc 180
ccttttgagc gcgtcaaggt actcattgac atgtggaagt ccaagcgaaa tccatgtgcc 240
attgttgttg acgctaagtg ttttgactct tcgatcactc ctggggatgt cgagcgggag 300
actgagttat actgtgctgc ttatcgagac accgcgctga tacgcgccat tagcaaacac 360
tatgcccatg gccccatggt gaacaaccgt ggagtttggg ttggtgagcg caactgccgc 420
gccagtgggg ttctcactac ctcatctagc aattgtctta cttgttactt gaaagttaaa 480
gctgctacta ggaaggtcaa gttgaaaaat gcatcacttc ttatacatgg ggatgactgt 540
atcataatct gtgagcgcga gctaccagat gacatctgtg accagttgcg ggaagcgttg 600
ttggcttacg gttatgactg tgagccttca gtgcactcgt ctctggacac cgccgtcacg 660
tgctccacat tcttagctga gtgtcgggtt catggcggcg cacgcgttaa cttcctatcc 720
accgacatgc gtcgagctct tgcccgagct tgcggggggt atggagatgg cgctgcttgc 780
gccgcgggtt ataccattca gtatccccat catcccataa ctaggtatgt tctaatacct 840
ctattgttgg gcatgatctt cgctcgtggg 870
<210> 9
<211> 870
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 样品25
<400> 9
caccctttca tgcttactgc caaacaggaa gtgttctacc aagataagaa gactaaaaaa 60
cctcccagat taatagtttt cccctcgctc gagttccgcg tggttgagaa gatggcattt 120
ggcgacccgt cccgcgttcc gaaggcagtg ctgggagccg cttacgggtt ccagtacacc 180
ccttttgagc gcgttaaggt gctcactgac atgtggaagt ccaaacggag tccatgtgcc 240
attgttgttg acgccaagtg ttttgattct tcgatcactc ctggggacgt cgagcgggag 300
actgagttat actgtgctgc ttaccgagac accgcgctga tacgcgccat tagcaaacac 360
tacgcccatg gccccatggt aaacaaccgt ggagtttggg ttggtgagcg caactgtcgc 420
gccagtgggg ttctcactac ctcatctagc aattgtctta cttgttactt gaaagttaaa 480
gctgctacta ggaaggttaa gttgaaaaat gcatcacttc ttatacatgg ggatgactgt 540
atcataatct gcgagcgcga gctaccagat gacatctgtg accagttgcg agatgcgttg 600
ttggcatatg gttacgactg tgagccttca gtgcactcgt ctctggatac cgccgttaca 660
tgctccacat tcttagctga gtgtcgggtt cacggcggcg cacgcgtcaa cttcctatcc 720
accgacatgc ggcgggcact cgcccgggcg tgcggagggt atggagatgg cgctgcttgt 780
gctgcgggtt ataccatcca atacccccat catcctataa ctaggtatgt tttaatacct 840
ctactattgg gcatgatctt cgctcgtggg 870

Claims (10)

1.一种检测猪Pegivirus的套式RT-PCR引物组，其特征在于包含***引物PPgV–F1、PPgV–R1，内围引物PPgV–F2、PPgV–R2，其核苷酸序列如下所示：
引物PPgV–F1：5′-ACGGTTGGWCGTTTGAGGAG-3′；
引物PPgV–R1：5′-ACAAGCGGAAAGTGACAKGAAT-3′；
引物PPgV–F2：5′-CACCCYTTTATGCTTACTGCC-3′；
引物PPgV–R2：5′-CCCRCGAGCRAAAATCATACC-3′；
其中，K、Y、R、和W表示简并碱基代码，K＝G/T；Y＝C/T；R＝A/G；W＝A/T。
2.权利要求1所述的检测猪Pegivirus的套式RT-PCR引物组在检测猪Pegivirus领域中的应用。
3.一种检测猪Pegivirus的试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的检测猪Pegivirus的套式RT-PCR引物组。
4.根据权利要求3所述的检测PPgV的试剂盒，其特征在于还包含Primer Script 1step Enzyme Mix、2×1 step Buffer、RNase Free ddH2O、TaKaRa Taq、dNTP Mixture、10×PCR Buffer。
5.根据权利要求4所述的检测PPgV的试剂盒，其特征在于包含Primer Script 1 stepEnzyme Mix、2×1 step Buffer、RNase Free ddH2O、TaKaRa Taq、dNTP Mixture、10×PCRBuffer；浓度为10μmol/L的PPgV–F1、浓度为10μmol/L的PPgV–R1、浓度为10μmol/L的PPgV–F2、浓度为10μmol/L的PPgV–R2。
6.权利要求3～5任一项所述的检测猪Pegivirus的试剂盒在检测猪Pegivirus领域中的应用。
7.根据权利要求6所述的检测猪Pegivirus的试剂盒在检测猪Pegivirus领域中的应用，其特征在于包含如下步骤：
(1)以待测样品RNA为模板，以引物PPgV–F1和引物PPgV–R1为扩增引物，配制一步法RT-PCR反应体系，进行RT-PCR反应；
(2)以步骤(1)制得的RT-PCR反应产物为模板，以引物PPgV–F2和引物PPgV–R2为扩增引物，配制套式PCR反应体系，进行套式PCR反应；
(3)将步骤(2)制得的套式PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，在870bp处出现目的条带的判定为阳性扩增，在870bp处未出现目的条带的判定为阴性扩增。
8.根据权利要求7所述的检测猪Pegivirus的试剂盒在检测猪Pegivirus领域中的应用，其特征在于：
步骤(1)中所述的RT-PCR反应的反应体系为：
步骤(1)中所述的RT-PCR反应的反应参数如下所示：
50℃逆转录反应30min；95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min45s，45个循环；72℃延伸10min。
9.根据权利要求7所述的检测猪Pegivirus的试剂盒在检测猪Pegivirus领域中的应用，其特征在于：
步骤(2)中所述的套式PCR反应的反应体系为：
10.根据权利要求7所述的检测猪Pegivirus的试剂盒在检测猪Pegivirus领域中的应用，其特征在于：
步骤(2)中所述的套式PCR反应的参数如下所示：
95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min45s，45个循环；72℃延伸10min。
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