CN110090231A - 酪酸梭菌在制备预防或治疗胆管癌制剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了酪酸梭菌在制备预防或治疗胆管癌制剂中的应用，具体是用酪酸梭菌为主要活性成分，制成药品等生物制剂，在预防或治疗胆管癌中的应用，属于生物医药领域。

Description

酪酸梭菌在制备预防或治疗胆管癌制剂中的应用
技术领域
本发明涉及酪酸梭菌在制备预防或治疗胆管癌制剂中的应用，具体是用酪酸梭菌预防或治疗胆管癌，属于生物医药领域。
背景技术
胆管癌作为常见的胆道恶性肿瘤，是继肝癌之后的第二大原发性肝胆恶性肿瘤，由于其解剖位置，生长特点以及缺少确切的诊断标准使其早期诊断困难，而临床症状的不明显及有限的治疗手段，使得其预后极差。
近几年胆管癌的发病率逐年升高，手术切除是治疗胆管癌的首选方法，但由于胆管癌多病灶、伴有***转移、腹膜及远处转移，手术病人长期存活率仍不理想，大多数患者被确诊时已处于癌症晚期，所以5年生存率低于10％，并且大约80％的胆管癌由于转移或进展期只能行姑息治疗，现有治疗药物效果也不理想。
本发明人经过研究发现，酪酸梭菌能够有效预防或治疗胆管癌，安全没有任何毒副作用，效果优于双歧杆菌，且未见相关研究报道，特申请此发明专利。
发明内容
本发明的目的是提供一种能预防或治疗胆管癌的制剂，该制剂由酪酸梭菌制成。
本发明的制剂的制备优选是通过下述步骤实施的，但不局限于此制备工艺，公知的能实现的制备工艺均可以：采取可能含酪酸梭菌的样品，然后将样品置于灭菌厌氧瓶内，吹入氮气同时充分混合，迅速从中取2克样品加入18mL灭菌的稀释液中，吹入氮气同时充分混匀，在无菌操作台内，进行10-1、10-2、10-3、10-4，10-5，10-6，10-7梯度稀释，取10-5，10-6，10-7三个稀释梯度，分别涂布于酪酸梭菌选择性单菌落分离固体培养基上，置于厌氧罐内，厌氧37℃下培养48小时，选择长势良好的单菌落分别接种于液体扩增培养基中，置于厌氧罐内，厌氧37℃下扩增培养48小时。将所得培养液离心(12000rpm)分离出菌体后，将菌体冷冻真空干燥，调制出干燥菌粉，然后进行菌种鉴定和毒性试验，将鉴定为酪酸梭菌的干燥菌粉按需要比例添加辅料制成片剂、胶囊、散剂、粉剂或液体制剂等各种剂型，也可加入其他活菌或低聚果糖等低聚糖起到协同作用。
酪酸梭菌选择性单菌落分离固体培养基优选但不局限于：纯化水1L，蛋白胨40.0g，Na2HPO4 5.0g，K2HPO4 1.0g，NaCl 2.0g，MgSO4 0.1g，葡萄糖2.0g，琼脂25.0g，调pH7.6，116℃灭菌20分钟，待其冷至50℃左右，加入卵黄液50.0mL，加入终浓度为200μg/mL的硫酸多粘菌素B，加入终浓度200μg/mL的新霉素，充分混匀后，分注于平皿中。
酪酸梭菌液体扩增培养基优选但不局限于：纯化水1L，胰蛋白胨10.0g，牛肉浸膏10.0g，酵母浸膏3.0g，葡萄糖5.0g，NaCl 5.0g，可溶性淀粉1.0g，半胱氨酸盐酸盐0.5g，醋酸钠3.0g，琼脂0.5g，调pH 6.6-7.0，121℃，灭菌15分钟。
为进一步具体说明本发明，发明人利用上述方法通过酪酸梭菌选择性单菌落分离固体培养基分离鉴定出了无毒性的酪酸梭菌，本发明所述酪酸梭菌并不局限于为说明本发明所述的菌，只要无毒性的酪酸梭菌均是本发明所述，均在本发明的保护范围内。
本发明所述酪酸梭菌优选但不限于酪酸梭菌DF96101保藏编号CGMCC 0313.1或丁酸梭菌QA-08保藏编号CGMCC 2303。
本发明实施说明中优选使用的酪酸梭菌的细菌学性质：
1、为说明本发明，本发明利用上述方法分离的酪酸梭菌为酪酸梭菌DF96101保藏编号CGMCC 0313.1或丁酸梭菌QA-08保藏编号CGMCC 2303。
2、菌落形态
显微镜观察：长3.0-6.0微米，宽0.6-1.2微米，直杆或梭状菌，革兰氏染色阳性，产芽孢，孢子欠端生。
平板形态：菌落圆形，边缘不整齐，稍凸，不透明，颜色淡黄，表面无光泽。
3、生理生化鉴定
硫化氢:-；吲哚:-；明胶液化:-；氨:-；硝酸盐还原:-；卵磷脂酶反应:-；脲酶:-；V-P试验:-；接触酶:-；是否需氧:厌氧性。
4、糖酵解实验鉴定
***糖:+；鼠李糖:+；纤维二糖:+；D-山梨醇:-；D-果糖:+；可溶性淀粉:+；D-半乳糖:+；蔗糖:+；葡萄糖:+；海藻糖:+；菊糖:+；木糖:+；乳糖:+；葡萄糖酸盐(钠):+；D(+)甘露糖:+；麦芽糖:+；D-甘露醇:+；甘油:+；D(+)棉籽糖:+；核糖:+；松三糖:+；蜜二糖:+。
本发明所述的酪酸梭菌指活的生物个体。
本发明是以有效剂量按上述方法分离的酪酸梭菌作为主要活性成份，按照一定的制剂工艺，加入常规的赋形剂、调味剂、崩解剂、防腐剂、润滑剂、湿润剂、黏合剂、溶剂、增稠剂、增溶剂等辅料，制成任何一种适合于使用的剂型，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、液体制剂、粉剂等剂型。
本发明所述酪酸梭菌作为主要药物活性成份制成活菌制剂。
本发明所指有效剂量是指按上述方法分离的酪酸梭菌根据上面所述单独或组合作为主要药物活性成份制成的固体活菌制剂包含的总活菌数不能低于1×106CFU/g，一般在1×107CFU/g以上，最高可达到1×1012CFU/g或1×1012CFU/g以上。
本发明所指有效剂量是指按上述方法分离的酪酸梭菌根据上面所述单独或组合作为主要药物活性成份制成的液体活菌制剂包含的总活菌数不能低于1×106CFU/mL，一般在1×107CFU/mL以上，最高可达到1×1012CFU/mL或1×1012CFU/mL以上。
本发明所述制剂包括酪酸梭菌单独应用或与其他药物联合应用，尤其包括酪酸梭菌单独应用或与双歧杆菌联合应用。
本发明所述双歧杆菌指活的生物个体。
本发明所述双歧杆菌联合应用的制剂中，固体制剂包含的双歧杆菌总活菌数不低于1×106CFU/g，一般在1×107CFU/g以上，最高可达到1×1012CFU/g或1×1012CFU/g以上；或液体制剂包含的双歧杆菌总活菌数不低于1×106CFU/mL，一般在1×107CFU/mL以上，最高可达到1×1012CFU/mL或1×1012CFU/mL以上。
由于本发明首次公开了酪酸梭菌作为主要活性成份制成制剂在预防或治疗胆管癌中的应用，因此含上述酪酸梭菌的制剂在预防或治疗胆管癌制剂中的应用均属于本发明的保护范围。
本发明所述的酪酸梭菌在制成任何一种剂型时，均具有预防或治疗胆管癌的作用。如果其组份中含有酪酸梭菌成份制备成制剂，在其包装或说明书等标识上或者在其他任何宣传品上只要注明或提示具有预防或治疗胆管癌的作用，则落入本发明的保护范围之内。
本发明所述的酪酸梭菌可以制成药品、保健食品、食品或饮品等。
具体实施方式
制备例说明：上述已经对酪酸梭菌制剂的制备进行说明，这里通过酪酸梭菌DF96101保藏编号CGMCC 0313.1或丁酸梭菌QA-08保藏编号CGMCC 2303为例进行具体说明，其他酪酸梭菌菌种制剂的制备方法本领域技术人员通过本实施例很容易掌握，其他剂型的制备方法本领域技术人员通过本实施很容易掌握，在此不再一一叙述说明。制备方法并不局限于本发明实施例所述，公知的能够达到制备目的的方法均可以，实施例的制备说明只是对本发明的说明，并不是对本发明保护范围的限制。
制备实施例1酪酸梭菌粉剂的制备
1菌粉的制备和菌种的鉴定
采取人的粪便样品，然后将样品置于灭菌厌氧瓶内，吹入氮气同时充分混合，迅速从中取2克样品加入18mL灭菌的稀释液中，吹入氮气同时充分混匀，在无菌操作台内，进行10-1、10-2、10-3、10-4，10-5，10-6，10-7梯度稀释，取10-5，10-6，10-7三个稀释梯度，分别涂布于酪酸梭菌选择性单菌落分离固体培养基上，置于厌氧罐内，厌氧37℃下培养48小时，选择长势良好的单菌落分别接种于液体扩增培养基中，置于厌氧罐内，厌氧37℃下扩增培养48小时。将所得培养液离心(12000rpm)分离出菌体后，将菌体冷冻真空干燥，调制出干燥菌粉，然后进行菌种鉴定，经生理生化鉴定为酪酸梭菌，为酪酸梭菌DF96101保藏编号CGMCC 0313.1或丁酸梭菌QA-08保藏编号CGMCC 2303。
酪酸梭菌DF96101保藏编号CGMCC 0313.1或丁酸梭菌QA-08保藏编号CGMCC 2303菌粉制备，将酪酸梭菌DF96101保藏编号CGMCC 0313.1或丁酸梭菌QA-08保藏编号CGMCC2303接种到酪酸梭菌液体扩增培养基中，厌氧37℃下扩增培养48小时。将所得培养液离心(12000rpm)分离出菌体后，将菌体冷冻真空干燥，调制出干燥菌粉，活菌数均为1×109CFU/g以上。
2毒性试验
2.1动物及分组取30只SPF级别大鼠，6-8周龄，体重14-18g，随机分入酪酸梭菌CGMCC 0313.1组、丁酸梭菌CGMCC 2303组和未给药组，每组10只。2.2制备菌液将上述不同的酪酸梭菌菌粉分别用纯化水调制为含菌数均为1×109CFU/mL的菌液。
2.3方法各酪酸梭菌组和未给药组均给予相同的基础饲料，且饲养条件均一致，各酪酸梭菌组每天灌服酪酸梭菌菌液0.5mL，未给药组每天灌服纯化水0.5mL，饲喂14天，观察体重及毒性反应。
2.4结果
各组大鼠均未出现异常情况，未发生振颤、痉挛、运动失调、姿态异常，无眼球突出，排尿正常，皮肤、呼吸正常，无死亡情况，未见中毒反应。
3制备成粉剂等剂型
根据上述步骤和方法分离鉴定后，经实验检验无毒性，就可将酪酸梭菌菌种制成菌粉，然后按照需要添加相关辅料制成各种剂型，优选据酪酸梭菌菌粉的活菌数，按比例添加淀粉制成粉剂，使活菌数不低于1×107CFU/g，然后装袋。
应用效果实施例说明：
本发明以酪酸梭菌DF96101保藏编号CGMCC 0313.1或丁酸梭菌QA-08保藏编号CGMCC 2303为代表说明酪酸梭菌的应用效果，菌粉由青岛东海药业有限公司提供。本发明中使用的双歧杆菌来自于市场销售产品，公众能够购买到的双歧杆菌活菌均可。
应用效果实施例1：酪酸梭菌在治疗胆管癌中的应用
1模型组制备：
1.1实验动物6周龄健康裸鼠，体重18-22g。实验前按昼夜节律采光12h，控制温度、湿度，自由摄取食物和水，每日定时更换饲料，排除其它应激因素干扰。
1.2制备方式采用移植瘤模型的方法建立大鼠胆管癌模型。将胆管癌细胞株置于含10％小牛血清的RPMI1640培养液中培养，传代2-3周，离心后制成1mL含有107-108个细胞的悬液中。每只裸鼠左上肢腋窝部位注射0.2mL的瘤细胞悬液。
1.3模型组制备结果造模成功。
2药物治疗实验：
2.1实验方法将造模成功的裸鼠随机分为酪酸梭菌(DF96101)治疗组(n＝10)、酪酸梭菌(QA-08)治疗组(n＝10)、双歧杆菌治疗组(n＝10)、模型对照组(n＝10)。所有对象均给予相同的基础饲料，且饲养条件均一致。各治疗组和模型对照组按1.2所述方式建立模型，并于模型建立的第8天起，酪酸梭菌(DF96101、QA-08)和双歧杆菌治疗组使用含菌数为1×106CFU/mL(用0.9％生理盐水调制菌粉)的菌液灌服0.5mL，模型对照组灌服0.9％生理盐水0.5mL，直至第28天结束。
2.2检测所有对象均在第29天行抑瘤率测定。数据使用SPSS 21.0进行统计学分析。观察酪酸梭菌对胆管癌的影响，并与双歧杆菌进行比较。
3结果
与胆管癌模型大鼠相比，酪酸梭菌DF96101和QA-08治疗后，肿瘤显著缩小(P＜0.05)，差异具有统计学意义。与双歧杆菌治疗组相比，酪酸梭菌DF96101和QA-08治疗组肿瘤显著缩小(P＜0.05)，差异具有统计学意义。酪酸梭菌DF96101治疗组和QA-08治疗组之间，抑瘤率均无统计学差异(P＞0.05)。酪酸梭菌对胆管癌有显著预防和治疗作用，疗效显著优于双歧杆菌治疗组。见表1。
表1不同组别抑瘤率变化统计分析
组别 例数 抑瘤率(％)
模型对照组 10 /
双歧杆菌治疗组 10 19.1
酪酸梭菌(DF96101)治疗组 10 62.3
酪酸梭菌(QA-08)治疗组 10 61.8
4讨论
酪酸梭菌制剂能够有效预防或治疗胆管癌，明显改善胆管癌症状，抑制胆管癌的发展进程，且无任何毒副作用，应用依从性好，是预防或治疗胆管癌的新方法、新突破。
本发明在实施过程中所使用的酪酸梭菌菌种已分别于1997年7月28日和2007年12月26日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101)保藏，共两个下述菌种，但本发明所述的酪酸梭菌并不局限于这两种微生物菌种。
(1)分类命名：酪酸梭菌Clostridium butyricum，保存编号0313.1。
(2)分类命名：丁酸梭菌Clostridium butyricum，保存编号2303。
上述两个菌种经该微生物中心检测，检测结果均为存活。

Claims (9)

1.酪酸梭菌在制备预防或治疗胆管癌制剂中的应用。
2.按权利要求1所述应用，其特征在于所述制剂包括酪酸梭菌单独应用或与其他药物联合应用。
3.按权利要求1所述应用，其特征在于所述制剂包括药品、保健食品、食品、饮品。
4.按权利要求1所述应用，其特征在于所述酪酸梭菌指活的生物个体。
5.按权利要求1所述应用，其特征在于所述酪酸梭菌包括酪酸梭菌DF96101保藏编号CGMCC 0313.1或丁酸梭菌QA-08保藏编号CGMCC 2303。
6.按权利要求2所述应用，其特征在于所述制剂包括酪酸梭菌单独应用或与双歧杆菌联合应用。
7.按权利要求6所述应用，其特征在于所述双歧杆菌指活的生物个体。
8.按权利要求1所述制剂，其特征在于固体制剂包含的酪酸梭菌总活菌数不低于1×106CFU/g，一般在1×107CFU/g以上，最高可达到1×1012CFU/g或1×1012CFU/g以上；或液体制剂包含的酪酸梭菌总活菌数不低于1×106CFU/mL，一般在1×107CFU/mL以上，最高可达到1×1012CFU/mL或1×1012CFU/mL以上。
9.按权利要求6所述制剂，其特征在于固体制剂包含的双歧杆菌总活菌数不低于1×106CFU/g，一般在1×107CFU/g以上，最高可达到1×1012CFU/g或1×1012CFU/g以上；或液体制剂包含的双歧杆菌总活菌数不低于1×106CFU/mL，一般在1×107CFU/mL以上，最高可达到1×1012CFU/mL或1×1012CFU/mL以上。
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