CN103131676A

CN103131676A - 表达重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白基因的家蚕重组杆状病毒及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103131676A
Application number: CN201310001030XA
Authority: CN
Inventors: 张耀洲; 南芙蓉; 张�浩; 舒特俊; 陈剑清
Original assignee: TIANJIN YAOYU BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: TIANJIN YAOYU BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-01-04
Filing date: 2013-01-04
Publication date: 2013-06-05

Abstract

本发明涉及一种表达重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白基因的家蚕重组杆状病毒及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域。本发明通过将重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白(rhTNFR-Fc)基因构建到家蚕杆状病毒表达***中获得重组杆状病毒，从而高效表达目的蛋白，并纯化出目的融合蛋白rhTNFR-Fc。本发明通过家蚕杆状病毒表达***可以高效表达并纯化出融合蛋白rhTNFR-Fc，平均每mL蚕血淋巴可纯化出0.17mg的目的融合蛋白。

Description

表达重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白基因的家蚕重组杆状病毒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种表达重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白基因的家蚕重组杆状病毒及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白(rhTNFR-Fc)是一种可用于治疗如类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的蛋白药物。

肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor, TNF)是一种多功能的细胞因子，与多种疾病及病理反应密切相关，在炎症反应、内毒素性休克、恶液质和类风湿性关节炎等自身免疫性疾病中起关键作用，其过量表达是多种自身免疫性疾病的病理机制之一。对TNF受体(TNFR)的研究表明，Ⅱ型肿瘤坏死因子受体分布广泛，与肿瘤坏死因子的亲和力较强。这种可溶性受体可以中和TNF，在体内对TNF的活性起负调节作用。

用受体免疫球蛋白融合技术，将受体的细胞外区与人免疫球蛋白的Fc段基因融合，在体外表达出相应的重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体(p75)-Fc融合蛋白(rhTNFR-Fc)。它有免疫球蛋白的体内半衰期长、组织穿透力强等特性，可以特异性地与体内的TNF结合，从而抑制关节的炎症反应。

Etanercept (Enbrel^TM)是已经上市的商品化的TNFR-Fc融合蛋白，也是抗TNF最有效的药物之一。也是目前生物技术药物中销售额最高的产品，国内已有Etanercept的仿制产品如上市的益赛普，均由中国仓鼠卵巢细胞（CHO）表达***生产。但是，用于类风湿性关节炎RA治疗时每人每疗程需要0.75～1.5 g蛋白，这一剂量相当大。而哺乳动物细胞昂贵的培养费用和较低的表达水平，是Enbrel和其它类似生物工程药物生产和应用的一个重要“瓶颈”。

家蚕杆状病毒表达载体***是一种应用广泛的真核表达***，我们利用其低生产成本和高效等优点，表达并纯化重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白。利用家蚕杆状病毒表达载体***至今已表达60余种药用蛋白，其中GM-CSF等十余种已实现产业化，但抗体类药用蛋白尚未表达过。而且目前还没有用家蚕杆状病毒表达载体***表达并纯化重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白的相关研究。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种表达重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白基因的家蚕重组杆状病毒，通过构建一种家蚕重组杆状病毒，利用Bac to Bac***将重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白(rhTNFR-Fc)基因构建到杆状病毒表达载体***中进行高效表达，并纯化出目的融合蛋白rhTNFR-Fc。

为达到上述目的，本发明提供一种表达重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白基因的家蚕重组杆状病毒，该病毒含有重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白基因。

优选地，其中所述重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供上述家蚕重组杆状病毒的制备方法，包括以下步骤：

(1)重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白基因的合成；

(2)将步骤(1)所合成的重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白基因连接到转移载体上，并转化感受态细胞，构建重组转移载体；

(3)将步骤(2) 构建的重组转移载体转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，得到重组杆状病毒DNA；

(4)将步骤(3)得到的重组杆状病毒DNA转染家蚕细胞，得到家蚕重组杆状病毒。

优选地，其中所述步骤(1)具体包括：

采用pUC57-rhTNFR-Fc重组载体为模板，以SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4为引物进行PCR扩增，获得重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白基因rhTNFR-Fc。

优选地，其中所述步骤(2)具体包括：

将PCR扩增得到的重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白基因用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后回收，通过用T4连接酶连接到经同样处理的转移载体pFastBac1上，使重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白基因位于多角体基因启动子控制之下，然后转化到Trans10化学感受态细胞中，筛选阳性克隆，得到重组转移载体pFastBac1-rhTNFR-Fc。

优选地，其中所述步骤(3)具体包括：

将步骤(2)得到的重组转移载体pFastBac1-rhTNFR-Fc转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养板上避光培养40-48 h后挑取白斑，培养16-20 h后菌液稀释10⁶重新涂板做筛选，挑取白斑至LB液体培养基进行摇菌培养16-20 h后，用异丙醇抽提重组杆状病毒DNA，并用M13通用引物做PCR鉴定。

优选地，其中所述步骤(4)具体包括：

取步骤(3)鉴定成功的重组杆状病毒DNA通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞，发病后获得零代病毒悬液0-4℃保存，提取病毒基因组用M13通用引物进行PCR鉴定，获得家蚕重组杆状病毒vBm-rhTNFR-Fc。

本发明还提供上述家蚕重组杆状病毒表达的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供上述融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)将上述家蚕重组杆状病毒感染家蚕BmN细胞进行病毒扩增，并做细胞中表达产物的鉴定；

(2)将步骤(1)中扩增得到的F4代病毒用穿刺接种法接种家蚕五龄幼虫，收集发病蚕血；

(3)从步骤(2)收集的蚕血中纯化出上述融合蛋白。

本发明具有以下有益效果：

1、家蚕是我国资源特色，全国多地均可大规模饲养，因此与昂贵的哺乳动物培养基相比，成本相对低廉，可减轻中低收入患者经济负担；

2、通过家蚕杆状病毒表达***可以高效表达并纯化出融合蛋白rhTNFR-Fc，平均每mL蚕血淋巴可纯化出0.17 mg的目的融合蛋白。

附图说明

图1为rhTNFR-Fc基因扩增的电泳分析图；M：10 kb DNA分子量标准；1：PCR产物；

图2为重组转移载体pFastBac1-rhTNFR-Fc的构建示意图；

图3为重组转移载体pFastBac1-rhTNFR-Fc的鉴定图；M：10 kb DNA分子量标准；1：PCR鉴定；2：重组质粒EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定；

图4为重组转移载体pFastBac1-rhTNFR-Fc的测序结果图；

图5为重组杆状病毒Bacmid-rhTNFR-Fc鉴定图；M：10 kb DNA分子量标准；1、3、5：以M 13 上游引物和rhTNFR-Fc下游引物为引物对PCR扩增产物；2、4、6：以rhTNFR-Fc上游引物和M 13 下游引物为引物对PCR扩增产物；

图6为家蚕重组杆状病毒vBm- rhTNFR-Fc的PCR鉴定图；M：10 kb DNA分子量标准；1：以M 13 上游引物和M 13 下游引物为引物对PCR扩增产物；2：以M 13 上游引物和rhTNFR-Fc下游引物为引物对PCR扩增产物；3：以rhTNFR-Fc上游引物和M 13 下游引物为引物对PCR扩增产物；

图7A 为融合蛋白基因rhTNFR-Fc在BmN细胞中表达的SDS-PAGE图； M：预染蛋白分子量标准；1：接种重组病毒vBm-(rhTNFR-Fc)的BmN细胞；

图7B为融合蛋白基因rhTNFR-Fc在BmN细胞中表达的Western Blotting图； M：预染蛋白分子量标准；1：接种重组病毒vBm-(rhTNFR-Fc)的BmN细胞；

图8为融合蛋白基因rhTNFR-Fc在BmN细胞中表达的免疫荧光鉴定图；A：DAPI染色，激光共聚焦显微镜UV激发，100倍视野；B：鼠抗人IgG Fc一抗， iF555 羊抗鼠 IgG (FITC标记)二抗，激光共聚焦显微镜543nm激发，100倍视野；C：鼠抗人IgG Fc一抗， iF555 羊抗鼠 IgG (FITC标记)二抗，DAPI染色，叠加激光共聚焦显微镜，100倍视野；D：激光共聚焦显微镜明场，100倍视野；

图9A为融合蛋白基因rhTNFR-Fc在家蚕血淋巴中表达的SDS-PAGE鉴定图；M：预染蛋白分子量标准；1：正常家蚕五龄幼虫血淋巴上清；2：发病家蚕五龄幼虫血淋巴上清； 3：正常家蚕五龄幼虫血淋巴沉淀；4：发病家蚕五龄幼虫血淋巴沉淀；箭头所示为目的条带；

图9B为融合蛋白基因rhTNFR-Fc在家蚕血淋巴中表达的Western Blotting鉴定图；M：预染蛋白分子量标准；1：正常家蚕五龄幼虫血淋巴上清；2：发病家蚕五龄幼虫血淋巴上清； 3：正常家蚕五龄幼虫血淋巴沉淀；4：发病家蚕五龄幼虫血淋巴沉淀；箭头所示为目的条带；

图10为蚕血淋巴经Superdex 200柱的分离结果图；

图11A为蚕血淋巴经Superdex 200层析柱分离各峰的SDS-PAGE分析图；M：预染蛋白分子量标准； 1：原液；2-6：依次为1^#峰、2^#峰、3^#峰、4^#峰、5^#峰；

图11B为蚕血淋巴经Superdex 200层析柱分离各峰的Western Blotting分析图；M：预染蛋白分子量标准； 1：原液；2-6：依次为1^#峰、2^#峰、3^#峰、4^#峰、5^#峰；

图12A为亲和层析纯化后的SDS-PAGE分析图；M：预染蛋白分子量标准；1：1^#吸收峰蛋白样品；2：1^#吸收峰蛋白样品纯化后；3：2^#吸收峰蛋白样品；4：2^#吸收峰蛋白样品纯化后；

图12B为亲和层析纯化后的Western Blotting分析图；M：预染蛋白分子量标准；1：1^#吸收峰蛋白样品；2：1^#吸收峰蛋白样品纯化后；3：2^#吸收峰蛋白样品；4：2^#吸收峰蛋白样品纯化后；

图13为不同批次蚕血淋巴中纯化后并浓缩的rhTNFR-Fc蛋白SDS-PAGE分析图；M：非预染蛋白分子量标准；1：益赛普(对照)；2-4：不同批次纯化并浓缩后的蛋白；

图14为rhTNFR-Fc融合蛋白一级质谱结果图；

图15A为rhTNFR-Fc融合蛋白二级质谱结果图之一；

图15B为rhTNFR-Fc融合蛋白二级质谱结果图之二；

图16为rhTNFR-Fc蛋白信号肽分析图。

具体实施方式

应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的发明。除非另有说明，本文使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。

下面结合实施例详细说明本发明的具体内容。

实施例1：目的基因rhTNFR-Fc的获得

根据重组质粒pUC57-rhTNFR-Fc中rhTNFR-Fc基因(天津石桥生物科技有限责任公司蔡胜和教授提供)的ORF框(为1473 bp, 编码489个氨基酸残基)设计该基因的上游引物SEQ ID NO:3和下游引物SEQ ID NO:4，上游引物引入EcoR I酶切位点，下游引物引入Xho I酶切位点，进行PCR扩增，获取融合蛋白基因rhTNFR-Fc(见图1)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。具体程序和反应体系如下：

反应程序：

反应体系：

将PCR产物用EcoR I、Xho I(均购自Invitrogen 公司)进行双酶切后，割胶回收以备后用。

实施例2：重组转移载体pFastBac1-rhTNFR-Fc的构建

对实施例1所得rhTNFR-Fc融合蛋白基因PCR回收片段用EcoR I酶和Xho I酶(Fermentas公司)进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收酶切后片段；同时用EcoR I酶和Xho I酶对pFastBac1(Invitrogen公司)进行酶切并用琼脂糖凝胶电泳回收酶切后片段；然后用T4连接酶(Fermentas公司)将回收的融合蛋白基因连接到酶切后的转移载体pFastBac1上，转化Trans10化学感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，筛选阳性克隆，得到重组转移载体pFastBac1-rhTNFR-Fc (见图2、图3)，对其进行基因测序(图4)，由测序结果可知融蛋白合基因成功克隆至转移载体pFastBac1上。

实施例3：家蚕重组杆状病毒vBm-rhTNFR-Fc的获取与鉴定

将实施例2中所获得的重组转移质粒pFastBac1-(rhTNFR-Fc)转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞(购自Invitrogen公司)，在含有购自Bio Basic Inc公司的卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)的LB固体培养板(购自Invitrogen公司)上进行蓝白斑筛选，避光培养48 h后挑取单菌落白斑，培养16 h后菌液稀释10⁶重新涂板做筛选，挑取白斑至LB培养基摇菌培养16 h后，用异丙醇在超净台中抽提重组杆状病毒(Bacmid-rhTNFR-Fc)基因组，用M13通用引物PCR 鉴定是否转座成功(图5)。

M13 上游引物：5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’

M13 下游引物：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’

将鉴定成功的重组Bacmid-rhTNFR-Fc参照Invitrogen 公司脂质体转染试剂Cellfectin ⅡReagent 说明书的方法，经脂质体介导法转染家蚕BmN 细胞(本实验室保存)，待该家蚕BmN细胞发病(显微镜下观察)后收集第一代家蚕重组杆状病毒悬液并于4℃保存，用Viral DNA Kit(200)(购自OMEGA公司)提取病毒基因组，然后用M13通用引物进行PCR 鉴定。将所得鉴定成功的家蚕重组杆状病毒命名为vBm-rhTNFR-Fc(见图6)。

实施例4：融合蛋白基因rhTNFR-Fc在家蚕BmN细胞中的表达及鉴定

将实施例3中获取的家蚕重组杆状病毒vBm-rhTNFR-Fc以MOI=10 pfu/cell的剂量转染对数生长期的家蚕BmN 细胞中，在含有10%胎牛血清的Sf-900ⅡSFM 培养基(购自Invitrogen公司)中27℃培养3～4 d，待发病后，4℃，500 rpm 离心10 min收集培养上清和沉淀。细胞沉淀用pH 7.4 的PBS 洗涤重悬，与2×SDS 上样缓冲液混合，60℃加热30 min，进行SDS-PAGE 蛋白电泳，用羊抗人 IgG-Fc一抗、辣根酶标记的鼠抗羊 IgG(H+L)二抗进行Western Blotting分析，结果表明融合蛋白基因rhTNFR-Fc在家蚕BmN细胞中成功表达(见图7A 、图7B)。

同时采用鼠抗人IgG Fc一抗，iF555 羊抗鼠 IgG(FITC标记)二抗进行免疫荧光实验。用LEIVA TCS SP51激光共聚焦显微镜，分别取明场、UV激发光、543 nm激发光、UV激发光和543 nm激发光叠加(均100倍视野)观察拍照。结果也验证了融合蛋白基因rhTNFR-Fc在家蚕BmN细胞中成功表达(图8)。

实施例5：融合蛋白基因rhTNFR-Fc在家蚕五龄幼虫中的表达及鉴定

将实施例4扩增后的家蚕重组杆状病毒vBm- rhTNFR-Fc F4代于腹部倒数第二节处穿刺接种眠起后的家蚕五龄幼虫(江苏宿迁市三棵树蚕种场)，第五天大部分幼虫出现典型病毒感染症状，剪幼虫腹足收集蚕血淋巴，加0.5％(w/v)抗氧化剂八羟基喹啉，-80℃保存备用。

取10 mL蚕血淋巴12,000 rpm 离心10 min。分别取上清和沉淀，加入2×loading buffer，60℃金属浴30 min，制成蛋白样品，以正常蚕血淋巴作为阴性对照进行SDS-PAGE和Western Blotting鉴定。结果表明，融合蛋白基因rhTNFR-Fc在家蚕幼虫血淋巴中获得了成功表达(见图9 A、图9 B)。

实施例6：家蚕五龄幼虫血淋巴中rhTNFR-Fc融合蛋白的纯化

预处理：取出实施例5中的蚕血淋巴置于冰上融化，待完全溶解后，按1:1的体积比加入预冷的PBS溶液 (pH7.4)；于4℃，15,000 g，离心30 min，9层医用纱布过滤去除脂类物质，留取滤液，再次于4℃，15,000 g，离心30 min，9层医用纱布过滤，反复三次；将滤液预冷的PBS溶液 (pH7.4)稀释后，用0.1 μm 的膜包进行超滤以去除部分色素，收集流出液；将流出液转移到10 kDa超滤管内进行截留浓缩。

凝胶过滤层析纯化：用PBS作为流动相，冲洗AKTAexplorer蛋白纯化***及上样环，30 min后，OD₂₈₀检测基线洗平后，切换到Superdex^TM200层析柱位，以1.5 mL/min 的流速平衡柱子，报警压力为 0.5 Mpa；用2.5 ml注射器吸取2 mL 预处理的浓缩液，除去气泡后，手动上样，设定程序开始运行，将流速调整为1 mL/min；插好收集管，按管自动收集峰(见图10)；对图10上5个峰尖对应收集管的蛋白用2×上样buffer制备蛋白样，进行SDS-PAGE检测和Western Blotting分析(见图11 A、图11 B)。

rProtein A亲和层析纯化：取适量Protein A 填料，装入空柱，用10倍柱体积的平衡液（pH 7.4的PBS溶液）平衡层析柱；根据凝胶过滤层析纯化后的峰图(见图10)和Western Blotting (见图11 B)分析结果，将1^#和2^#及其附近的几管样品分别合并，调整pH以及离子浓度后，缓慢加入层析柱；室温孵育10 min，反复上样3次；用10倍柱体积以上的洗涤液（pH 7.4的PBS溶液）洗涤非特异性结合的杂蛋白，至流出液无蛋白检出；加入2倍柱体积的甘氨酸（pH3.0），静置5分钟后收集洗脱液，重复三次；收集洗脱液后，立即用2/5洗涤液体积的Tris缓冲液（pH8.0）中和，使用Millipore蛋白浓缩管切换到PBS缓冲液；加入0.02% NaN₃，进行BCA蛋白定量后，-80℃保存；分别取25μL纯化前和纯化后的蛋白与2×上样buffer混合均匀，60℃煮半小时，以制备蛋白样品，进行SDS-PAGE检测和Western Blotting分析(见图12 A、图12B)。

实施例7：纯化后rhTNFR-Fc融合蛋白的质谱分析

将三批实施例6中纯化得到的目的蛋白样品，用10 kDa的超滤管进行浓缩后，用益赛普(上海中信国健药业股份有限公司)作对照，分别与2×上样buffer混合均匀，60℃煮半小时，以制备蛋白样品，进行SDS-PAGE鉴定(见图13)。BCA蛋白定量后得知，我们从350 mL发病蚕血淋巴中纯化得到融合蛋白60 mg，计算出蚕血淋巴中融合蛋白的平均含量为0.17 mg/mL。发现在PVDF膜上35 kDa和45 kDa之间总有一条带，后质谱鉴定结果为降解的IgG的Fc段。

用干净的刀片从SDS-PAGE胶上割下目的条带，去离子水轻轻清洗两遍，放入干净的EP管中，做好标记，送到南开大学泰达学院生物技术公司进行MALDI-TOF-MS分析(见图14、图15 A及图15 B)，根据protein score C.I.%大于95%为鉴定标准，两个已知融合蛋白片段TNFR 75和IgG的Fc段的分值分别为99.994%和100%，可基本确定纯化的蛋白为目的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

生物信息学分析结果表明（见图16），具有22个氨基酸残基组成的信号肽。去除信号肽后，基因片段1407 bp，编码467个氨基酸残基，预测分子量为51.238 kDa。融合蛋白rhTNFR-Fc由人75 kDa TNFα受体蛋白的胞外区与人IgG1的Fc段构成的融合蛋白二聚体，由934个氨基酸构成，每条肽链含467个氨基酸，2条多肽链通过半胱氨酸残基形成二硫键成为等二聚体，相对分子量为150 kDa。家蚕杆状病毒表达***中表达的融合蛋白rhTNFR-Fc在SDS PAGE胶和PVDF膜上显示，单体均在55kDa，略大于预测分子量51.238 kDa，凝胶过滤层析峰图显示，1^#和2^#峰蛋白大小约为148 kDa左右，这些结果表明，家蚕杆状病毒表达***中表达的融合蛋白rhTNFR-Fc多以二聚体形式存在，且可能存在糖基化等翻译后修饰。

以上所述，仅为本发明的实施例，应当指出，对于本技术中的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术特征的前提下，还可以做若干的改进和润饰，这些润饰和改进也应属于本发明的专利保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津耀宇生物技术有限公司

<120> 表达重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白基因的家蚕重组杆状病毒及其制备方法

<130> 122503-I-CP-TJYU

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1473

<212> DNA

<213> 重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白基因

<400> 1

atggcctccaggctgaccctgctgaccctcctgctgctgctgctggctggggatagagcctcctcattgcccgcccaggtggcatttacaccctacgccccggagcccgggagcacatgccggctcagagaatactatgaccagacagctcagatgtgctgcagcaaatgctcgccgggccaacatgcaaaagtcttctgtaccaagacctcggacaccgtgtgtgactcctgtgaggacagcacatacacccagctctggaactgggttcccgagtgcttgagctgtggctcccgctgtagctctgaccaggtggaaactcaagcctgcactcgggaacagaaccgcatctgcacctgcaggcccggctggtactgcgcgctgagcaagcaggaggggtgccggctgtgcgcgccgctgcgcaagtgccgcccgggcttcggcgtggccagaccaggaactgaaacatcagacgtggtgtgcaagccctgtgccccggggacgttctccaacacgacttcatccacggatatttgcaggccccaccagatctgtaacgtggtggccatccctgggaatgcaagcatggatgcagtctgcacgtccacgtcccccacccggagtatggccccaggggcagtacacttaccccagccagtgtccacacgatcccaacacacgcagccaactccagaacccagcactgctccaagcacctccttcctgctcccaatgggccccagccccccagctgaagggagcactggcgacgaacctaagtcctgcgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcacgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgatga

<210> 2

<211> 489

<212> PRT

<213> 重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白

<400> 2

Met Ala Ser Arg Leu Thr Leu Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ala Gly Asp Arg Ala Ser Ser Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr

20 25 30

Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr

35 40 45

Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly

50 55 60

Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys

65 70 75

Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val

80 85 90

Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val

95 100 105

Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys

110 115 120

Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg

125 130 135

Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala

140 145 150

Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala

155 160 165

Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg

170 175 180

Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser

185 190 195

Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala

200 205 210

Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln

215 220 225

His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser

230 235 240

Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr

245 250 255

Gly Asp Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

260 265 270

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

275 280 285

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

290 295 300

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

305 310 315

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

320 325 330

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

335 340 345

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

350 355 360

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

365 370 375

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

380 385 390

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

395 400 405

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

410 415 420

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

425 430 435

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

440 445 450

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

455 460 465

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

470 475 480

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys ter ter

485 489

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 引物

<400> 3

TGCGAATTCATGGCCTCCAGGCTGAC

26

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物

<400> 4

ACGCTCGAGTCATCATTTACC

21

Claims

1.一种表达重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白基因的家蚕重组杆状病毒，其特征在于，该病毒含有重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白基因。

2.如权利要求1所述的家蚕重组杆状病毒，其特征在于，所述重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.一种权利要求1或2所述家蚕重组杆状病毒的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白基因的合成；

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括：

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括：

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)具体包括：

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)具体包括：

8.一种权利要求1所述家蚕重组杆状病毒表达的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

9.一种权利要求8所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)将权利要求1-2任一所述的家蚕重组杆状病毒感染家蚕BmN细胞进行病毒扩增，并做细胞中表达产物的鉴定；

(3)从步骤(2)收集的蚕血中纯化出权利要求8所述融合蛋白。