CN110051663B - 5α-环氧土木香内酯在抗多药耐药肿瘤方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，提供了桉烷内酯化合物5α‑环氧土木香内酯(5α‑epoxyalantolactone)的一种新用途，具体为在抗多药耐药性肿瘤细胞方面的应用。本发明中5α‑环氧土木香内酯不仅具有逆转肿瘤多药耐药的作用，而且对多药耐药肿瘤细胞具有较好的杀伤作用。本发明的有益效果是：5α‑环氧土木香内酯对人多药耐药性肿瘤细胞具有显著的细胞毒作用，并且可以增强癌细胞对化疗药物的敏感性，从而增强药物疗效，有望开发为新型的特异性针对多药耐药肿瘤的逆转剂药物。

Description

5α-环氧土木香内酯在抗多药耐药肿瘤方面的应用
技术领域
本发明涉及一种从中药有效成分 中提取对多药耐药肿瘤细胞具有杀伤作用的新化合物的方法，属于天然产物药理活性和分离与提纯天然原料药方法。本发明还涉及该化合物的制备方法。本发明还涉及该化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
癌症已成为严重危害人类健康且难以治愈的疾病之一，是仅次于心血管疾病的人类第二大杀手。随着人类生存环境和生活习性的改变，在不良的外部环境和一些不利因素作用下，肿瘤的发病率正在逐步上升。肿瘤细胞中多药耐药(multidrug-resistance，MDR)的存在被认为是癌症化疗失败的主要原因。其中，产生多药耐药现象的原因主要来自于肿瘤细胞内ABC转运蛋白的高表达，转运蛋白将药物排出细胞从而降低胞内抗癌药物的有效浓度，并且使癌细胞对多种药物产生交叉耐药性，是限制癌症化学疗法有效性的重大障碍。
中药在肿瘤治疗中的应用由来已久，中草药具有成本低、毒性低、靶点多的优点，从植物中寻找高效低毒的抗肿瘤活性成分已成为国内外学者共同关注的热点。世界上从高等植物中筛选出的抗癌活性成分己达万种，另外动物、海洋生物中也存在有大量的抗癌活性成分，为恶性肿瘤的治疗开辟了广阔的天地。大量的研究工作证明天然植物中具有抗肿瘤作用的活性成分非常多，所以筛选天然抗肿瘤药倍受人们重视。从天然药物中研制开发新的抗癌药物具有广阔前景。
我们首次发现，本发明中的桉烷内酯化合物5α-环氧土木香内酯(5α-epoxyalantolactone, JWR3-1-6)能够剂量依赖性的抑制肿瘤细胞，特别是多药耐药肿瘤细胞的生长，并且体外实验显示出其具有较强的逆转肿瘤多药耐药的活性，为寻找新的有效的抗肿瘤药物开辟了一条新的途径。
该化合物从菊科植物大花金挖耳的甲醇提取物中分离纯化而得，其分离纯化步骤参见文献：Xie C,Sun L,Meng L,Wang M,Xu J,Bartlam M,Guo Y.Sesquiterpenes fromCarpesium macrocephalum inhibit Candida albicans biofilm formation anddimorphism.Bioorg Med Chem Lett,2015,25(22):5409-5411.该化合物亦分布于土木香和藏木香等植物中。
发明内容
本发明的目的在于公开了桉烷内酯化合物5α-环氧土木香内酯在逆转肿瘤多药耐药，特异性杀伤多药耐药性肿瘤细胞方面的应用，以满足临床治疗多药耐药肿瘤性疾病的需要。
本发明进一步公开了桉烷内酯化合物5α-环氧土木香内酯在制备肿瘤多药耐药逆转剂中的新用途。
本发明更进一步公开了桉烷内酯化合物5α-环氧土木香内酯在制备特异性杀伤多药耐药肿瘤细胞的药物方面的应用。
本发明提供了如下式(Ⅰ)的具有抗肿瘤活性的桉烷内酯化合物5α-环氧土木香内酯在制备抗恶性肿瘤药物方面的应用:
Figure BDA0002025814710000021
附图说明
图1为桉烷内酯化合物5α-环氧土木香内酯的结构式；
图2为桉烷内酯化合物5α-环氧土木香内酯(JWR3-1-6)对P-gp转运蛋白外排功能的影响实验图；
图3为桉烷内酯化合物5α-环氧土木香内酯对MRP转运蛋白外排功能的影响实验图；
图4为桉烷内酯化合物5α-环氧土木香内酯对BCRP转运蛋白外排功能的影响实验图；
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例一：荧光外排法进行逆转肿瘤细胞多药耐药研究。
荧光外排法：Rhodamine 123(一种P-gp的荧光底物)用于监测JWR 3-1-6存在下P-gp 的外排活性。将处于对数生长期的Hela细胞和其耐药细胞株Hela/ddp细胞接种于96孔板中，接种密度约为每孔1×104个细胞，每孔加200μL含有10％胎牛血清的DMEM培养基。 96孔板外周一圈36个孔不加细胞，只加PBS。将96孔板置于37℃，5％CO2培养96h。
(一)JWR3-1-6对P-gp转运蛋白外排功能的影响：
1.细胞铺板
将细胞以1×104/孔的密度接种至96孔板，96孔板外周一圈36个孔不加细胞，只加PBS。每孔加200μL含有10％胎牛血清的DMEM培养基，将96孔板置于37℃，5％CO2培养96h。2.加逆转剂标准品、待测样品和荧光染料
(1)将逆转剂标准品Verapamil配制成2mM的储液，染料Rhodamine 123配制成 50μg/ml的储液，待测样品JWR3-1-6配制成10mM的储液；
(2)标准品加5μL，待测样品加1μL(工作浓度达到每孔50μM)，37℃，5％CO2，孵育15min；
(3)荧光染料Rhodamine 123均加8μL，使其工作浓度达到2μg/ml，37℃，5％CO2，孵育4h；
每个样品设置三个复孔，实验重复三次。具体加样方式如表1：
表1
Figure BDA0002025814710000031
3.检测
将96孔板从培养箱中拿出，每孔用200μL预冷PBS洗两遍，弃去PBS，在全波长多功能酶标仪上检测，λ激发光＝480nmλ发射光＝550nm。
4.实验结果
如图2所示，实验结果表明，50μM JWR3-1-6能够较为显著的提高细胞内Rho123的积累量，即JWR3-1-6具有逆转P-gp转运蛋白外排的功能。
(二)JWR3-1-6对MRP转运蛋白外排功能的影响：
1.细胞铺板
将细胞以1×104/孔的密度接种至96孔板，96孔板外周一圈36个孔不加细胞，只加PBS。每孔加200μL含有10％胎牛血清的DMEM培养基，将96孔板置于37℃，5％CO2培养96h。2.加逆转剂标准品、待测样品和荧光染料
(1)将逆转剂标准品MK571配制成2mM的储液，染料BCECF-AM配制成1mM的储液，待测样品JWR3-1-6配制成10mM的储液；
(2)标准品加2μL，待测样品加0.4μL(工作浓度达到每孔20μM)，37℃，5％CO2，孵育15min；
(3)荧光染料BCECF-AM均加0.2μL，使其工作浓度达到1μM，37℃，5％CO2，孵育 4h；
每个样品设置三个复孔，实验重复三次。具体加样方式如表2：
表2
Figure BDA0002025814710000041
3.检测
将96孔板从培养箱中拿出，每孔用200μL预冷PBS洗两遍，弃去PBS，在全波长多功能酶标仪上检测，λ激发光＝488nmλ发射光＝535nm。
4.实验结果
如图3所示，实验结果表明，50μM JWR3-1-6能够较为显著的提高细胞内BCECF-AM的积累量，即JWR3-1-6具有逆转MRP转运蛋白外排的功能。
(三)JWR3-1-6对BCRP转运蛋白外排功能的影响：
1.细胞铺板
将细胞以1×104/孔的密度接种至96孔板，96孔板外周一圈36个孔不加细胞，只加PBS。每孔加200μL含有10％胎牛血清的DMEM培养基，将96孔板置于37℃，5％CO2培养96h。2.加逆转剂标准品、待测样品和荧光染料
(1)将逆转剂标准品Ko143配制成200μM的储液，染料Hoechst33342配制成50μg/ml的储液，待测样品JWR3-1-6配制成10mM的储液；
(2)标准品加1μL，待测样品加0.02μL(工作浓度达到每孔1μM)，37℃，5％CO2，孵育15min；
(3)荧光染料Hoechst33342均加4μL，使其工作浓度达到1μg/ml，37℃，5％CO2，孵育4h；
每个样品设置三个复孔，实验重复三次。具体加样方式如表3：
表3
Figure BDA0002025814710000042
Figure BDA0002025814710000051
3.检测
将96孔板从培养箱中拿出，每孔用200μL预冷PBS洗两遍，弃去PBS，在全波长多功能酶标仪上检测，λ激发光＝347nmλ发射光＝483nm。
4.实验结果
如图4所示，实验结果表明，50μM JWR3-1-6能够较为显著的提高细胞内Hoechst33342 的积累量，即JWR3-1-6具有逆转BCRP转运蛋白外排的功能。
实施例二：JWR 3-1-6对人***耐药细胞株Hela/ddp的毒性作用。
将处于对数生长期的Hela细胞和其耐药细胞株Hela/ddp细胞接种于96孔板中，接种密度约为每孔3 000个细胞，每孔体积为100μL。在培养24h后，将JWR 3-1-6(10mM)经DMSO稀释成不同浓度梯度后，按照设定的药物浓度梯度(0-50μM)加入Hela和Hela/ddp细胞中，继续培养24h。培养结束后每孔加入CCK-8溶液10μL，继续培育4h。用酶标仪在450nm处测定各孔OD值，记录结果。以细胞存活率对剂量作图求IC50值。
实验结果显示，Hela和Hela/ddp细胞经过JWR 3-1-6处理之后，Hela细胞株对JWR3-1-6的IC50值为6.4±1.46μM，Hela/ddp细胞株对JWR 3-1-6的IC50值为3.2±0.51μM。说明JWR 3-1-6对人***耐药细胞株Hela/ddp具有较显著的毒性作用，而且其对敏感细胞的毒性明显低于耐药细胞。说明该化合物有很好的利用耐药肿瘤细胞的附带敏感性(collateral sensitivity)的活性，能够有效的杀伤多药耐药的肿瘤细胞。该化合物是很好的先导化合物，可以用于开发新型的特异性杀伤多药耐药肿瘤细胞的化疗药物。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.结构式如下式(I)的桉烷内酯化合物5α-环氧土木香内酯在制备人***多药耐药细胞Hela-ddp的多药耐药逆转剂中的应用
Figure FDA0003617627830000011
。
2.结构式如下式(I)的桉烷内酯化合物5α-环氧土木香内酯在制备抗人***多药耐药细胞Hela-ddp的药物方面的应用
Figure FDA0003617627830000012
。
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Synthesis and Antiproliferative Activity of Conjugates of Anthracycline Antibiotics with Sesquiterpene Lactones of the Elecampane;A. V. Semakov等;《Russian Journal of Bioorganic Chemistry》;20181231;第44卷(第5期);第538–546页，尤其是第541页表1 *
旋覆花属植物化学成分及生物活性的研究进展;张馨予等;《国际药学研究杂志》;20081231;第35卷(第6期);第433-440、450页 *

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