CN110049778A

CN110049778A - 减少冻干多肽重构时间的方法和制剂

Info

Publication number: CN110049778A
Application number: CN201780076096.1A
Authority: CN
Inventors: C·M·黑恩斯; J·E·洛马; F·J·利姆; I·A·E·萨拉加
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2016-12-22
Filing date: 2017-12-21
Publication date: 2019-07-23
Also published as: US20190389974A1; JP2020503316A; IL267439A; TWI783958B; WO2018119312A1; BR112019012686A2; IL267439B2; JP2023012465A; AR110431A1; TW201827078A; WO2018119312A8; MX2019007433A; CA3044686A1; AU2017382281A1; KR20190099212A; US11377505B2; KR102579836B1; EP3558366A1; US20220298263A1; IL267439B

Abstract

本发明涉及用于减少冻干的多肽的重构时间的方法和制剂。

Description

减少冻干多肽重构时间的方法和制剂

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年12月22日提交的美国临时申请号62/438,232的权益，该临时申请通过引用整体并入本文作为参考。

发明领域

本发明涉及用于减少冻干多肽的重构时间的方法和制剂。

发明背景

用于药物或其他用途的生物分子通常是冻干的，其中水在冷冻并置于真空下之后从液体组合物中被除去。通常，冻干通过去除水(因为许多生物化学降解是水解的)和通过降低***的整体移动性(因为侧链和分子的动态移动是化学和物理降解事件发生所必需的)来改善多肽组合物的稳定性。随后在使用前将冻干的多肽重构，通常在与冻干和储存它们极为相同的容器或小瓶中进行。短的重构时间是优选的，特别是在重构冻干的药物多肽组合物(例如抗体组合物)的情况下。

冻干药物产品的高浓度和高剂量(例如克量)带来独特的加工和处理挑战，包括长冻干循环和通常长的重构时间。(参见，例如American Pharmaceutical Review，13(2010)，pp.31-3234-38)。控制生物分子的重构时间的一种方法是降低蛋白质浓度，从而增加填充体积。然而，该方法可能不适用于高剂量制剂，其中增加填充体积将需要每剂量使用多个小瓶。在这种情况下，需要替代的冻干制剂和方法。

已显示在冻干制剂中存在叔丁醇(TBA)可改善少量或低剂量(例如，毫克量)生物分子的重构时间(参见，例如，美国专利申请公开号US 2014/0044717；Nail等人(2002)JPharmSci.第91卷；Degobert等人(2016)Drying Technology；Yong等人(2009)Int JPharmaceutics，371：71-81；Teagarden和Baker(2002)Eur J PharmaSci 15：115-133；Vessot和Andrieu(2012)Drying Technology(2012)30：377-385)。

然而，在含有大量蛋白质(例如克数量)或具有高蛋白质浓度的多肽制剂中，TBA在生物分子的冻干制剂中的共溶剂***的应用及其对重构时间和多肽稳定性的影响尚未得到充分表征。

因此，需要用于大的用量和浓度的冻干生物分子的方法和制剂(即，高浓度、高剂量)多肽组合物，包括抗体组合物，其提供减少的或快速的重构时间以及维持生物分子的完整性和稳定性。本发明通过提供用于减少冻干多肽的重构时间的方法和制剂满足了这种需求，其中所述方法和制剂维持冻干多肽的完整性和稳定性，特别是对于高浓度和/或高剂量制剂的冻干抗体组合物。

发明概述

本发明提供了用于减少冻干多肽(例如冻干抗体组合物)的重构时间的方法和制剂。

在一个实施方案中，本发明提供减少冻干多肽组合物的重构时间的方法，其中该方法包括制备包含该多肽的液体组合物，将叔丁醇(TBA)加入到液体组合物中以形成液体多肽/TBA混合物，冷冻液体多肽/TBA混合物，冻干液体多肽/TBA混合物以形成冻干的多肽组合物，并用稀释剂重构冻干的多肽组合物，其中重构在TBA存在下冻干的多肽的时间少于重构在不存在TBA下冻干的相同量的相同多肽的时间。在一些实施方案中，加入液体多肽组合物以形成液体多肽/TBA混合物的TBA的量约为0.5％-约20％体积。在其他实施方案中，加入液体多肽组合物以形成液体多肽/TBA混合物的TBA的量选自0.5％、1％、2.5％、5％、7.5％、10％、12.5％、15％、17.5％和20％体积。在其他实施方案中，加入液体多肽组合物以形成液体多肽/TBA混合物的TBA的量约为1％-约20％体积，约1％-约10％体积，约1％-约5％体积，约5％-约20％体积，或约5％-约10％体积。在一个实施方案中，在冷冻液体多肽/TBA混合物之前立即将TBA加入到包含多肽的液体组合物中。在某些实施方案中，所述多肽是抗体。在一些实施方案中，所述多肽是抗体，并且所述方法包含在将TBA加入液体组合物之前制备包含抗体和糖的液体组合物，所述糖与糖∶抗体的摩尔比为至少约360∶1。

在一个实施方案中，本发明提供了用于减少冻干抗体组合物的重构时间的方法，其中该方法包含制备包含该抗体的液体组合物，将叔丁醇(TBA)加入到液体组合物中以形成液体抗体/TBA混合物，冷冻液体抗体/TBA混合物，冻干液体抗体/TBA混合物以形成冻干的抗体组合物，并用稀释剂重构冻干的抗体组合物，其中重构在TBA存在下冻干的抗体的时间少于重构在不存在TBA下冻干的相同量的时相同抗体的时间。在一些实施方案中，加入液体多肽组合物以形成液体多肽/TBA混合物的TBA的量约为0.5％-约20％体积。在其他实施方案中，加入液体多肽组合物以形成液体多肽/TBA混合物的TBA的量选自0.5％、1％、2.5％、5％、7.5％、10％、12.5％、15％、17.5％和20％体积。在其他实施方案中，加入液体多肽组合物以形成液体多肽/TBA混合物的TBA的量约为1％-约20％体积，约1％-约10％体积，约1％-约5％体积，约5％-约20％体积，或约5％-约10％体积。在一些实施方案中，该方法包含在将TBA加入液体组合物之前制备包含抗体和糖的液体组合物，其中糖∶抗体的摩尔比为至少约360∶1。在一个实施方案中，在冷冻液体多肽/TBA混合物之前立即将TBA加入到包含多肽的液体组合物中。在一个实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一个实施方案中，抗体是人单克隆抗体。在一个实施方案中，抗体是人源化单克隆抗体。在一个实施方案中，抗体是嵌合抗体。在一个实施方案中，抗体是抗体片段。在一个实施方案中，抗体是双特异性抗体。在一个实施方案中，抗体是抗体-药物缀合物(例如，免疫缀合物)。

在一个实施方案中，本发明提供了用于减少冻干多肽组合物的重构时间的方法，其中该方法包含制备包含所述多肽的液体组合物，其中多肽在包含该多肽的液体组合物中的浓度约为10mg/ml-约150mg/ml，向液体组合物中加入叔丁醇(TBA)以形成液体多肽/TBA混合物，冷冻液体多肽/TBA混合物，冻干液体多肽/TBA混合物以形成冻干的多肽组合物，并且用稀释剂重构冻干的多肽组合物，其中重构在TBA存在下冻干的多肽的时间少于重构在TBA不存在下冻干的相同量的相同多肽的时间。在一些实施方案中，多肽在包含该多肽的液体组合物中的浓度约为10mg/ml-约250mg/ml、约25mg/ml-约250mg/ml、约50mg/ml-约250mg/ml、约100mg/ml-约250mg/ml、约150mg/mml-约250mg/ml、约25mg/ml-约100mg/ml、约50mg/ml-约100mg/ml、约25mg/ml-约125mg/ml、或约50mg/ml-约125mg/ml。在一些实施方案中，多肽在包含该多肽的液体组合物中的浓度约为25mg/ml、约40mg/ml、约50mg/ml、约60mg/ml、约70mg/ml、约100mg/ml、约125mg/ml、约150mg/ml、约200mg/ml、或约250mg/ml。在某些实施方案中，所述多肽是抗体。在一些实施方案中，向液体多肽组合物中加入以形成液体多肽/TBA混合物的TBA的量约为0.5％-约20％体积。在一些实施方案中，所述多肽是抗体，且所述方法包含制备液体组合物，其包含至少约360∶1的糖∶抗体的摩尔比，然后向液体组合物中加入TBA。

在一个实施方案中，本发明提供了用于减少冻干多肽组合物的重构时间的方法，其中该方法包含制备包含所述多肽的液体组合物，其中多肽在包含该多肽的液体组合物中的量约为150mg-约11克，向液体组合物中加入叔丁醇(TBA)以形成液体多肽/TBA混合物，冷冻液体多肽/TBA混合物，冻干液体多肽/TBA混合物以形成冻干的多肽组合物，并且用稀释剂重构冻干的多肽组合物，其中重构在TBA存在下冻干的多肽的时间少于重构在不存在TBA下冻干的相同量的相同多肽的时间。在一些实施方案中，多肽在包含该多肽的液体组合物中的量约为150mg、约250mg、约500mg、约750mg、约1克、约2克、约3克、约4克、约5克、约6克、约7克、约8克、约9克、约10克、或约11克。在一些实施方案中，多肽在包含该多肽的液体组合物中的量约为150mg-11克。在一些实施方案中，多肽在包含该多肽的液体组合物中的量为约150mg-约1克、约500mg-约1克、约500mg-约5克、约1克-约5克、约1克-约10克、或约5克-约10克。在一些实施方案中，多肽在包含该多肽的液体组合物中的量大于11克。在某些实施方案中，所述多肽是抗体。在一些实施方案中，加入到液体多肽组合物中以形成液体多肽/TBA混合物的TBA的量为约0.5％-约20％体积。在一些实施方案中，所述多肽是抗体，并且所述方法包含在将TBA加入液体组合物之前，制备包含抗体和糖的液体组合物，其中糖∶抗体的摩尔比至少约为360∶1。

在一个实施方案中，本发明提供了用于减少冻干多肽组合物的重构时间的方法，其中该方法包含制备包含所述多肽的液体组合物，向液体组合物中加入叔丁醇(TBA)以形成液体多肽/TBA混合物，冷冻液体多肽/TBA混合物，冻干液体多肽/TBA混合物以形成冻干的多肽组合物，并且用稀释剂重构冻干的多肽组合物，其中重构在TB存在下冻干的多肽的时间少于重构在不存在TBA下冻干的相同量的相同多肽的时间，其中重构在TBA存在下冻干的多肽组合物的时间与重构在不存在TBA下冻干的相同量的相同多肽组合物的时间相比减少约40％-约95％。在一些实施方案中，构在TBA存在下冻干的多肽的时间与重构在不存在TBA下冻干的相同量的相同多肽的时间相比减少50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约50％-约60％、约60％-约70％、约70％-约80％、约80％-约90％或约90％-约95％。在一些实施方案中，所述多肽是抗体并且该方法包含在将TBA加入液体组合物之前制备包含抗体和糖的液体组合物，其中糖∶抗体的摩尔比为至少约360∶1。

在本发明的一些实施方案中，将所述液体多肽/TBA混合物在小瓶、注射器(包括双室注射器)或药筒中冻干。在一些实施方案中，将所述液体多肽/TBA混合物在玻璃小瓶中冻干。在一些实施方案中，小瓶为6cc小瓶、10cc小瓶、15cc小瓶、20cc小瓶、50cc小瓶、或100cc小瓶。在一些实施方案中，玻璃小瓶为6cc小瓶、10cc小瓶、15cc小瓶、20cc小瓶、50cc小瓶、或100cc小瓶。在一些实施方案中，小瓶具有0.1ml、0.3ml、0.5ml、1ml、2ml、2.5ml、5ml、10ml、20ml、25ml、50ml或100ml的容量或填充体积。在一些实施方案中，玻璃小瓶具有0.1ml、0.3ml、0.Sml、1ml、2ml、2.5ml、5ml、10ml、20ml、25ml、50ml或100ml的容量或填充体积。

在一些实施方案中，在一定的条件下进行重构冻干的多肽组合物，其中在真空下重构冻干的多肽组合物。在一些实施方案中，本发明提供了减少冻干的多肽组合物的重构时间的方法，其中该方法包含：制备包含所述多肽的液体组合物，向液体组合物中加入叔丁醇(TBA)以形成液体多肽/TBA混合物，冷冻液体多肽/TBA混合物，冻干液体多肽/TBA混合物以形成冻干的多肽组合物，并且用稀释剂重构冻干的多肽组合物，其中重构冻干的多肽组合物是在冻干的多肽组合物处于真空下的条件下进行，并且其中进一步重构在TBA存在下冻干的多肽的时间少于重构在TBA不存在下冻干的相同量的相同多肽的时间。在一些实施方案中，真空是深度真空。在一些实施方案中，真空是部分真空。在某些实施方案中，真空度低于100托。在某些实施方案中，真空度低于50托。在某些实施方案中，真空度在100毫托至50托之间。在一个实施方案中，真空度为100毫托。在一些实施方案中，所述多肽是抗体，并且所述方法包含在将TBA加入液体组合物之前，制备包含抗体和糖的液体组合物，其中糖∶抗体的摩尔比为至少约360∶1。

在一些实施方案中，使用振荡器(例如机械振荡器)进行重构冻干的多肽组合物。在一个实施方案中，本发明提供了用于减少冻干多肽组合物的重构时间的方法，其中该方法包含制备包含所述多肽的液体组合物，向液体组合物中加入叔丁醇(TBA)以形成液体多肽/TBA混合物，冷冻液体多肽/TBA混合物，冻干液体多肽/TBA混合物以形成冻干的多肽组合物，并且通过使用振荡器用稀释剂重构冻干的多肽组合物，其中重构在TBA存在下冻干的多肽的时间少于重构在不存在TBA下冻干的相同量的相同多肽的时间。在一些实施方案中，将小瓶或容器放置在振荡器上。在一些实施方案中，所述多肽是抗体，并且该方法包含在将TBA加入到液体组合物之间，制备包含抗体和糖的液体组合物，其中糖∶抗体的摩尔比为至少约360∶1。

在一些实施方案中，在冻干的多肽组合物处于真空下并使用振荡器的条件下进行重构冻干的多肽组合物。在一个实施方案中，本发明提供了用于减少冻干多肽组合物的重构时间的方法，其中该方法包含制备包含所述多肽的液体组合物，向液体组合物中加入叔丁醇(TBA)以形成液体多肽/TBA混合物，冷冻液体多肽/TBA混合物，冻干液体多肽/TBA混合物以形成冻干的多肽组合物，并且通过使用振荡器用稀释剂重构冻干的多肽组合物，其中重构冻干的多肽组合物在冻干的多肽组合物处于真空下的条件下进行，并且其中重构在TBA存在下冻干的多肽的时间少于重构在TBA不在下冻干的相同量的相同多肽的时间。在一些实施方案中，真空是深度真空。在一些实施方案中，真空是部分真空。在某些实施方案中，真空度低于100托。在某些实施方案中，真空度低于50托。在某些实施方案中，真空度在100毫托至50托之间。在一个实施方案中，真空度为100毫托。在一些实施方案中，所述多肽是抗体，并且该方法包含在将TBA加入到液体组合物之前制备包含抗体和糖的液体组合物，其中糖∶抗体的摩尔比至少为约360∶1。

本发明提供了适合于冻干的液体多肽制剂。在一些实施方案中，本发明提供了适合于冻干的液体多肽制剂，其中所述制剂包含多肽、稀释剂和TBA，其中重构在TBA存在下冻干的多肽的时间少于重构在不存在TBA下冻干的相同量的相同多肽的时间。在一些实施方案中，液体制剂中TBA的量约为0.5-20％体积。在一些实施方案中，液体制剂中TBA的量选自0.5％、1％、2.5％、5％、7.5％、10％、12.5％、15％、17.5％和20％体积。在其他的实施方案中，加入到液体多肽组合物中以形成液体多肽/TBA混合物的TBA的量约为1％-约20％体积、约1％-约10％体积、约1％-约5％体积、约5％-约20％体积、或约5％-约10％体积。在一个实施方案中，在冷冻液体多肽/TBA混合物之前，即刻将TBA加入到包含多肽的液体组合物中。在某些实施方案中，所述多肽是抗体。在一些实施方案中，所述多肽是抗体，并且所述制剂还包含糖，量为糖∶抗体的摩尔比至少约为360∶1。

本发明提供冻干多肽组合物，其中所述冻干多肽组合物通过下列步骤生产：制备包含所述多肽的液体组合物，向液体组合物中加入叔丁醇(TBA)以形成液体多肽/TBA混合物，冷冻液体多肽/TBA混合物，冻干液体多肽/TBA混合物以形成冻干的多肽组合物，其中在用稀释剂重构冻干的多肽组合物时，重构在TBA存在下冻干的多肽的时间少于重构在TBA不存在下冻干的相同量的相同多肽的时间。在一些实施方案中，液体制剂中TBA的量在约0.5％-约20％体积。在一些实施方案中，液体制剂中TBA的量选自0.5％、1％、2.5％、5％、7.5％、10％、12.5％、15％、17.5％和20％体积。在另外的实施方案中，加入到液体多肽组合物中以形成液体多肽/TBA混合物的TBA的量约为1％-约20％体积、约1％-约10％体积、约1％-约5％体积、约5％-约20％体积、或约5％-约10％体积。在一个实施方案中，在冷冻液体多肽/TBA混合物之前，即刻将TBA加入到包含多肽的液体组合物中。在某些实施方案中，所述多肽是抗体。在某些实施方案中，将TBA加入到多肽制剂中对于多肽的完整性或稳定性没有影响。在一些实施方案中，所述多肽是抗体，并且所述冻干多肽组合物通过在将TBA加入液体组合物之前制备包含所述抗体和所述糖的液体组合物来生产，糖的量为糖∶抗体的摩尔比至少约为360∶1。

在一个实施方案中，本发明提供了用于减少冻干抗体组合物的重构时间的方法，其中该方法包含制备包含抗体和糖的液体组合物，其中糖∶抗体的摩尔比为至少约360∶1，加入叔丁醇(TBA)至液体组合物形成液体抗体/TBA混合物，其中液体抗体/TBA混合物中TBA的量在约5％-20％体积之间，冷冻液体抗体/TBA混合物，冻干液体抗体/TBA混合物以形成冻干抗体组合物，用稀释剂重构冻干的抗体组合物，其中重构在TBA存在下冻干的抗体的时间少于重构在不存在TBA下冻干的相同量的相同抗体的时间。在一些实施方案中，加入液体抗体组合物形成液体抗体/TBA混合物的TBA的量选自5％、7.5％、10％、12.5％、15％、17.5％和20％体积。在一些实施方案中，加入液体抗体组合物形成液体抗体/TBA混合物的TBA的量约为5％-6％体积。在另外的实施方案中，加入液体抗体组合物形成液体抗体/TBA混合物的TBA的量约为5％-约10％体积。在一个实施方案中，冷冻液体抗体/TBA混合物之前即刻将TBA加入到包含抗体的液体组合物中。在某些实施方案中，抗体是全长抗体。在一个实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一个实施方案中，抗体是人单克隆抗体。在一个实施方案中，抗体是人源化单克隆抗体。在一个实施方案中，抗体是嵌合抗体。在一个实施方案中。抗体是抗体片段。在一个实施方案中，抗体是抗原结合片段，例如Fv、Fab、Fab′、Fab’-SH、F(ab′)2；双特异抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和来自抗体片段的多特异性抗体。在一个实施方案中，抗体是双特异性抗体。在一个实施方案中，抗体是抗体-药物缀合物(例如免疫缀合物)。在一些实施方案中，所述糖是蔗糖或海藻糖。在某些实施方案中，向液体组合物中加入TBA对抗体的完整性或稳定性没有影响。

在一个实施方案中，本发明提供了用于减少冻干抗体组合物的重构时间的方法，其中该方法包含制备包含抗体和糖的液体组合物，其中糖∶抗体的摩尔比为至少约360∶1，其中抗体在包含抗体的液体组合物的浓度约为10mg/ml-约250mg/ml，向液体组合物中加入叔丁醇(TBA)以形成液体抗体/TBA混合物，其中液体抗体/TBA混合物中TBA的量约为5％-20％体积，冷冻液体抗体/TBA混合物，冻干液体抗体/TBA混合物以形成冻干的抗体组合物，并用稀释剂重构冻干的抗体组合物，其中重构在TBA存在下冻干的抗体的时间少于重构在TBA不存在下冻干的相同量的相同抗体的时间。在一些实施方案中，加入到液体抗体组合物中以形成液体抗体/TBA混合物的TBA的量约为5％-6％体积。在一些实施方案中，包含抗体的液体组合物中抗体的浓度约为25mg/ml-约250mg/ml、约50mg/ml-约250mg/ml、约100mg/ml-约250mg/ml、约150mg/mml-约250mg/ml、约25mg/ml-约100mg/ml、约50mg/ml-约100mg/ml、约25mg/ml-约125mg/ml、或约50mg/ml-约125mg/ml。在一些实施方案中，包含抗体的液体组合物中抗体的浓度约为25mg/ml、约40mg/ml、约50mg/ml、约60mg/ml、约70mg/ml、约100mg/ml、约125mg/ml、约150mg/ml、约200mg/ml、或约250mg/ml。在一些实施方案中，所述糖是蔗糖或海藻糖。在某些实施方案中，向液体组合物中加入TBA对抗体的完整性或稳定性没有任何影响。

在一个实施方案中，本发明提供了用于减少冻干抗体组合物的重构时间的方法，其中该方法包含制备包含抗体和糖的液体组合物，其中糖∶抗体的摩尔比为至少约360∶1，其中抗体在包含抗体的液体组合物的量约为150mg-约11克，向液体组合物中加入叔丁醇(TBA)以形成液体抗体/TBA混合物，其中液体抗体/TBA混合物中TBA的量约为5％-20％体积，冷冻液体抗体/TBA混合物，冻干液体抗体/TBA混合物以形成冻干的抗体组合物，并用稀释剂重构冻干的抗体组合物，其中重构在TB存在下冻干的抗体的时间少于重构在不存在TBA的情况下冻干相同量的相同抗体的时间。在一些实施方案中，加入到液体抗体组合物中以形成液体抗体/TBA混合物的TBA的量约为5％-6％体积。在一些实施方案中，包含抗体的液体组合物中抗体的浓度约为150mg、约250mg、约500mg、约750mg、约1克、约2克、约3克、约4克、约5克、约6克、约7克、约8克、约9克、约10克、或约11克。在一些实施方案中，包含抗体的液体组合物中抗体的浓度约为150mg-约1克、约500mg-约1克、约500mg-约5克、约1克-约5克、约1克-约10克、或约5克-约10克。在一些实施方案中，包含抗体的液体组合物中抗体的量大于11克。在一些实施方案中，所述糖是蔗糖或海藻糖。在某些实施方案中，向液体组合物中加入TBA对抗体的完整性或稳定性没有任何影响。

在一个实施方案中，本发明提供了用于减少冻干抗体组合物的重构时间的方法，其中该方法包含制备包含抗体和糖的液体组合物，其中糖∶抗体的摩尔比为至少约360∶1，加入叔丁醇(TBA)至液体组合物形成液体抗体/TBA混合物，其中液体抗体/TBA混合物中TBA的量约为5％-20％体积，冷冻液体抗体/TBA混合物，冻干液体抗体/TBA混合物以形成冻干抗体组合物，并且用稀释剂重构冻干的抗体组合物，其中重构在TBA存在下冻干的抗体的时间少于重构在不存在TBA下冻干的相同量的相同抗体的时间，其中重构在TBA存在下冻干的冻干抗体组合物的时间与重构在不存在TBA下冻干的相同量的相同抗体组合物的时间相比减少约40％-约95％。在一些实施方案中，加入至液体抗体组合物以形成液体抗体/TBA混合物的TBA的量约为5％-6％体积。在一些实施方案中，重构在TBA存在下冻干的冻干抗体组合物的时间与重构在不存在TBA下冻干的相同量的相同抗体组合物的时间相比减少约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约50％-约60％、约60％-约70％、约70％-约80％、约80％-约90％或约90％-约95％。在一些实施方案中，所述糖是蔗糖或海藻糖。在某些实施方案中，向液体组合物中添加TBA完全不影响抗体的完整性或稳定性。

在本发明的一些实施方案中，将液体抗体/TBA混合物在小瓶、注射器(包括双室注射器)或药筒中冻干。在一些实施方案中，将液体抗体/TBA混合物在玻璃小瓶中冻干。在一些实施方案中，小瓶为6cc小瓶、10cc小瓶、15cc小瓶、20cc小瓶、50cc小瓶或100cc小瓶。在一些实施方案中，小瓶具有0.1ml、0.3ml、0.5ml、1ml、2ml、2.5ml、5ml、10ml、20ml、25ml、50ml或100ml的容量或填充体积。

在一些实施方案中，在一定的条件下进行重构冻干的抗体组合物，其中在真空下重构冻干的抗体组合物。在一些实施方案中，本发明提供了减少冻干的抗体组合物的重构时间的方法，其中该方法包含制备包含抗体和糖的的液体组合物，其中抗体与糖的摩尔比至少约为360∶1，向液体组合物中加入叔丁醇(TBA)以形成液体抗体/TBA混合物，其中液体抗体/TBA混合物中TBA的量约为5％-20％体积，冷冻液体抗体/TBA混合物，冻干液体抗体/TBA混合物以形成冻干的抗体组合物，并用稀释剂重构冻干的抗体组合物，其中重构冻干的抗体组合物在冻干的抗体组合物处于真空的条件下进行，并且其中进一步重构在TBA存在下冻干的抗体的时间少于重构在TBA不存在下冻干的相同量的相同抗体的时间。在一些实施方案中，加入液体抗体组合物以形成液体抗体/TBA混合物的TBA的量约为5％-6％体积。在一些实施方案中，真空是深度真空。在一些实施方案中，真空是部分真空。在某些实施方案中，真空度低于100托。在在某些实施方案中，真空度在100毫托至50托之间。在一个实施方案中，真空度为100毫托。

在一些实施方案中，重构冻干的抗体组合物使用振荡器、例如机械振荡器进行。在一个实施方案中，本发明提供了减少冻干的抗体组合物的重构时间的方法，其中该方法包含制备包含抗体和糖的的液体组合物，其中抗体与糖的摩尔比至少约为360∶1，向液体组合物中加入叔丁醇(TBA)以形成液体抗体/TBA混合物，其中液体抗体/TBA混合物中TBA的量约为5％-20％体积，冷冻液体抗体/TBA混合物，冻干液体抗体/TBA混合物以形成冻干的抗体组合物，并通过使用振荡器、用稀释剂重构冻干的抗体组合物，其中重构在TBA存在下冻干的抗体的时间少于重构在TBA不存在下冻干的相同量的相同抗体的时间。在一些实施方案中，将小瓶或容器置于振荡器上。在一些实施方案中，加入到液体抗体组合物中以形成液体抗体/TBA混合物的TBA的量约为5％-6％体积。

在一些实施方案中，在一定的条件下进行重构冻干的抗体组合物，其中冻干的抗体组合物处于真空中并且使用振荡器。在一个实施方案中，本发明提供了减少冻干的抗体组合物的重构时间的方法，其中该方法包含制备包含抗体和糖的的液体组合物，其中抗体与糖的摩尔比至少约为360∶1，向液体组合物中加入叔丁醇(TBA)以形成液体抗体/TBA混合物，其中液体抗体/TBA混合物中TBA的量约为5％-20％体积，冷冻液体抗体/TBA混合物，冻干液体抗体/TBA混合物以形成冻干的抗体组合物，并通过使用振荡器、用稀释剂重构冻干的抗体组合物，其中重构冻干的抗体组合物在冻干的抗体组合物处于真空的条件下进行，并且其中进一步重构在TBA存在下冻干的抗体的时间少于重构在TBA不存在下冻干的相同量的相同抗体的时间。在一些实施方案中，真空是深度真空。在一些实施方案中，真空是部分真空。在某些实施方案中，真空度低于100托。在某些实施方案中，真空度低于50托。在某些实施方案中，真空度在100毫托至50托之间。在一个实施方案中，真空度为100毫托。在一些实施方案中，加入到液体抗体组合物中以形成液体抗体/TBA混合物的TBA的量约为5％-6％体积。

本公开的方法的步骤可以由一个人或实体执行，或者这些步骤可以由多个人或多个实体执行。这些步骤可以由多个人或多个实体在一个人或一个实体的指导下执行。例如，一个人或实体可以制备包含多肽和糖的液体组合物，并且在冷冻液体多肽/TBA混合物之前，不同的人或实体可以将TBA添加到液体组合物中以形成液体多肽/TBA混合物。在另一个实例中，一个人或实体可冻干液体多肽/TBA混合物以形成冻干的多肽组合物，并且不同的人或实体可用稀释剂重构冻干的多肽组合物。

因此，在一个方面，本发明提供了用于减少冻干多肽或抗体组合物的重构时间的方法，其中该方法包含将叔丁醇(TBA)添加到包含该多肽或抗体和糖的液体组合物中，其中多肽或抗体和糖的摩尔比为至少约360∶1以形成液体多肽或抗体/TBA混合物，其中TBA在液体多肽或抗体/TBA混合物中的量约为5％-20％体积，冷冻液体多肽或抗体/TBA混合物，冻干液体多肽或抗体/TBA混合物以形成冻干的多肽或抗体组合物，并用稀释剂重构冻干的多肽或抗体组合物，其中重构在TBA存在下冻干的多肽或抗体的时间少于重构在没有TBA存在冻干的相同量的相同多肽的时间。在一些实施方案中，TBA在液体多肽或抗体/TBA混合物的量约为5％-6％体积。

另一方面，本发明提供了用于减少冻干多肽或抗体组合物的重构时间的方法，其中该方法包含将叔丁醇(TBA)加入到包含多肽或抗体和糖的液体组合物中，其中多肽或抗体和糖的摩尔比为至少约360∶1以形成液体多肽或抗体/TBA混合物，其中TBA在液体多肽或抗体/TBA混合物中的量约为5％-20％体积，冷冻液体多肽或抗体/TBA混合物，并冻干液体多肽或抗体/TBA混合物以形成冻干多肽或抗体组合物，其中冻干的多肽或抗体组合物随后用稀释剂重构，其中重构在TBA存在下冻干的多肽或抗体的时间少于重构在没有TBA的情况下冻干的相同量的相同多肽或抗体的时间。在一些实施方案中，TBA在液体多肽或抗体/TBA混合物中的量约为5％-6％体积。

本发明提供了适合于冻干的液体抗体制剂。在一些实施方案中，本发明提供了适合于冻干的液体抗体制剂，其中所述制剂包含抗体、糖、稀释剂和TBA，其中所述液体制剂中TBA的量在约5％-20％体积，其中液体制剂中糖的量为糖∶抗体的摩尔比至少约360∶1，并且其中重构在BA存在下冻干的抗体的时间为少于重构在不存在TBA下冻干的相同量的相同抗体的时间。在一些实施方案中，液体制剂中TBA的量选自5％、7.5％、10％、12.5％、15％、17.5％和20％体积。在其他实施方案中，加入液体抗体组合物以形成液体抗体/TBA混合物的TBA的量约为5％-约10％体积。在一些实施方案中，液体制剂中TBA的量约为5％-6％体积。在一个实施方案中，在冷冻液体抗体/TBA混合物之前，将TBA加入到包含抗体的液体组合物中。在一些实施方案中，所述糖是蔗糖或海藻糖。在某些实施方案中，液体抗体制剂中TBA的存在对抗体的完整性或稳定性没有影响。

本发明提供冻干的抗体组合物，其中通过下列步骤生产冻干的抗体组合物：制备包含抗体和糖的液体组合物，所述液体组合物的糖∶抗体的摩尔比为至少约360∶1，加入叔丁醇(TBA)至液体组合物形成液体抗体/TBA混合物，其中TBA在液体抗体/TBA混合物中的量约为5％-20％体积，冷冻液体抗体/TBA混合物，冻干液体抗体/TBA混合物以形成冻干的抗体组合物，其中在用稀释剂重构冻干的抗体组合物时，重构在TBA存在下冻干的抗体的时间少于重构在不存在TBA下冻干的相同量的相同抗体的时间。在一些实施方案中，液体制剂中TBA的量选自5％、7.5％、10％、12.5％、15％、17.5％和20％体积。在其他实施方案中，加入到液体抗体组合物中以形成液体抗体/TBA混合物的TBA的量约为5％-约10％体积。在一些实施方案中，加入到液体抗体组合物中以形成液体抗体/TBA混合物的TBA的量约为5％-约6％体积。在一个实施方案中，在冷冻液体抗体/TBA混合物之前即刻将TBA加入到包含抗体的液体组合物中。在一些实施方案中，所述糖是蔗糖或海藻糖。在某些实施方案中，向液体组合物中加入TBA对液体组合物或冻干的抗体组合物中抗体的完整性或稳定性没有影响。

附图简述

图1举出了显示用于包含0％、0.5％、1％、5％和20％(v/v)叔丁醇的冻干的抗体制剂的重构时间的数据。

图2举出了显示用于6cc小瓶中包含冻干的0％、5％和10％(v/v)叔丁醇的2.5ml冻干的抗体制剂的重构时间的数据。

图3举出了显示用于50cc小瓶中包含冻干的0％、1％、5％、10％和20％(v/v)的25ml冻干的抗体制剂的重构时间的数据。

图4举出了显示真空对100cc小瓶中包含冻干的0％、5％和10％(v/v)叔丁醇的60ml冻干的抗体制剂的影响的数据。

图5举出了显示振荡器对100cc小瓶中包含冻干的0％、5％和10％(v/v)叔丁醇的100ml冻干的抗体制剂的影响的数据。

图6举出了显示真空和振荡器对100cc小瓶中包含冻干的0％、5％和10％(v/v)叔丁醇的100ml冻干的抗体制剂的影响的数据。

图7举出了显示真空、振荡器以及真空和振荡器对100cc小瓶中包含0％或5％(v/v)叔丁醇的100ml冻干抗体制剂的重构时间的影响的数据。

图8A和8B举出了显示如通过尺寸排阻色谱法(SEC)测定的在2-8℃或30℃下包含0％、1％、5％、10％和20％(v/v)叔丁醇的抗体制剂的7天稳定性分析的数据。

图9举出了显示如通过IEC测定的在2-8℃或30℃下包含0％、1％、5％、10％和20％(v/v)叔丁醇的抗体制剂的7天稳定性分析的数据。

图10A和10B举出了显示在50℃下冻干抗体制剂的4个月稳定性分析的数据，这些制剂由包含0％、5％或10％(v/v)叔丁醇的预冻干液体抗体混合物产生。通过SEC测量单体百分比。图10显示了mAb1的结果，图10显示了mAb1的结果。图10B显示mAb2的结果。

发明详述

本发明特别地提供了多肽制剂，冻干制剂，制备冻干制剂的方法，以及可用于减少冻干多肽的重构时间的方法和制剂。

定义

术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的抗原结合活性。

“抗体片段”是指分子非完整抗体的分子，其包含结合完整抗体结合的抗原的完整抗体的一部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2；双特异抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

术语“嵌合”抗体是指抗体，其中重链和/或轻链的一部分衍生自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分衍生自不同来源或物种。

抗体的“类”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五种主要类型的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。相当于不同类免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。

术语“全长抗体”，“完整抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用，其是指具有与天然抗体结构基本相似的结构或具有含有如本文所定义的Fc区的重链的抗体。

“人抗体”是具有氨基酸序列的人抗体，所述氨基酸序列相当于人或人细胞产生的抗体或源自利用人抗体库或其他人体编码序列的非人体来源的抗体的氨基酸序列。人抗体的这种定义特异性地排除了包含非人体抗原结合残基的人源化抗体。

“人源化”抗体是指嵌合抗体，其包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在某些实施方案中，人源化抗体包含基本上所有可变结构域的至少一个且典型地为两个，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)相当于非人抗体的那些，并且全部或基本上所有的FR均相当于人抗体的那些。人源化抗体任选地可以包含至少部分源自人抗体的抗体恒定区。抗体的“人源化形式”，例如非人抗体是指进行过人源化的抗体。

“免疫缀合物”是与一种或多种异源分子缀合的抗体，包括但不限于细胞毒性剂。

“抗体-药物缀合物”是与一种或多种异源分子缀合的抗体，包括但不限于细胞毒性剂。

“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养动物(例如牛、绵羊、猫、狗和马)，灵长类动物(例如人类和非人的灵长类，例如猴子)，家兔和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，所述个人或受试者是人。

“分离的”抗体是与其天然环境的成分分离的抗体。在一些实施方案中，正如通过例如电泳(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如离子交换或反相HPLC))测定的，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度。有关抗体纯度评估方法的综述，参见，例如Flatman等人J.Chromatogr.B 848：79-87(2007)。

本文使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同源抗体群体获得的抗体，即，包含该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除外可能的变体抗体，例如含有天然存在的抗体突变或在单克隆抗体制备的产生过程中产生，这些变体通常以少量存在。与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同源性的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过各种技术制备，包括但不限于杂交方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文描述了用于制备单克隆抗体的这类方法和其他示例性方法。

“裸抗体”是指未与异源部分(例如细胞毒性部分)或放射性标记缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。

“天然抗体”是指天然存在的具有不同结构的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚化糖蛋白，由二硫键连接的两条相同的轻链和两条相同的重链组成。从N末端到C末端，每个重链具有可变区(VH)，也称为可变重链结构域或重链可变结构域，接着是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N末端到C末端，每个轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，然后是恒定轻链(CL)结构域。基于其恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可以被指定为两种类型中的一种，称为kapp(κ)和lambd(λ)。

术语“药物制剂”是指制剂，其形式使得其中所含活性成分的生物活性有效，并且不含有对制剂施用的个体具有不可接受的毒性的其它成分。

“药学上可接受的载体”是药物制剂中非活性成分的成分，它们对个体无毒性。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂、低温保护剂(例如蔗糖、海藻糖)或防腐剂。药学上可接受的载体或稀释剂包括无菌注射用水。

如本文所用，“重构时间”及其变化形式是指冻干分子以液体形式溶解和/或悬浮所需的时间期限。例如，重构时间包括但不限于冻干后干燥(即冻干)的多肽颗粒或饼状物悬浮在水或缓冲液中所需的时间。“减少”重构时间及其变化形式是指与在第二制剂和/或条件下冻干的相同多肽的相同量并悬浮在相同的液体中相比，在第一制剂和/或条件下冻干的多肽以悬浮于液体中的量所需的时间更少。

如本文所用，术语“饼状物”或“冻干饼状物”或“冻干饼状物”是指冷冻干燥的(即冻干)多肽组合物或制剂。

如本文所用，“治疗”(及其变化形式，例如“治疗”或“治疗”)是试图改变所治疗个体的自然病程的临床干预，并且可以在预防或在临床病理学过程中进行。治疗的理想效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、症状的缓解，疾病的任何直接或间接病理后果的减少、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或缓解疾病状态、以及缓解或预后改善。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延缓疾病的发展或减缓疾病的进展。

药物制剂

通过将具有期望纯度的这种抗体与一种或多种任选的药学上可接受的载体(Remington′s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.Ed.(1980))混合，制备本文所述抗体的药物制剂，为冻干制剂或水溶液的形式。药学上可接受的载体通常在所用剂量和浓度下对接受者无毒，包括但不限于：缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯己双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚，丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子如钠；金属配合物(例如锌-蛋白质配合物)；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药学上可接受的载体还包括间质药物分散剂，例如可溶性中性-活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(Baxter International，Inc.)。某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20，描述于美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中。在一个方面，sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。

示例性的冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958中。水性抗体制剂包括美国专利号6,171,586和WO2006/044908中描述的那些，后者制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲剂。在某些实施方案中，本发明的抗体制剂包含液体抗体组合物和TBA，其中在冻干前将TBA加入液体抗体组合物中。在一些方面，本发明的抗体制剂包含选自如下的液体抗体组合物中的TBA的量：0.5％、1％、2.5％、5％、7.5％、10％、12.5％、15％、17.5％和20％体积。在另外的实施方案中，液体抗体组合物中的TBA的量约为1％-约20％体积、约1％-约10％体积、约1％-约5％体积、约5％-约20％体积、或约5％-约10％体积。

在一些实施方案中，本公开的抗体组合物和制剂包含抗体和糖，其中糖∶抗体的摩尔比为至少约360∶1。在一些实施方案中，糖∶抗体的摩尔比为至少约360∶1、至少约380∶1、至少约400∶1、至少约420∶1、至少约440∶1、至少约460∶1、至少约480∶1、或至少约500∶1，包括这些数字之间的每个值。在一些实施方案中，该比例在约360∶1-约500∶1之间。糖可以是蔗糖或海藻糖或本领域已知的任何其他糖，以在冻干过程中改善蛋白质的稳定性。如本文所用，用于计算抗体与海藻糖的重量比的制剂中海藻糖的重量基于无水海藻糖(MW342.30)的量。如果使用其他形式的海藻糖(例如，二水合海藻糖)，则制剂中海藻糖的重量应由具有相同摩尔浓度的二水合海藻糖的重量换算。当计算糖∶抗体的摩尔比时，可以假定抗体的分子量为150kDa。

本文的制剂还可含有一种以上的活性成分，这些活性成分对于所治疗的具体适应症是必需的，优选那些具有互补活性且被此不产生不利影响的活性成分。这些活性成分适合以有效达到预期目的的量组合存在。

可以制备缓释制剂。适合的缓释制剂的实例包括包含抗体的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质是成形制品的形式，例如薄膜或微囊。

用于体内施用的制剂通常是无菌的。例如，易于通过经无菌滤膜过滤进行灭菌。

本发明尤其提供了多肽制剂、冻干制剂和减少冻干多肽组合物的重构时间的方法。冻干方法和技术在本领域中是众所周知的。通常，冻干过程如下：将溶解的物质(例如，生物分子、多肽)在其最终包装或储存容器(例如，小瓶、注射器或药筒)中在低温(例如，-60℃)下冷冻。冻干或冷冻干燥是这样一种过程，其中在将产品冷冻并置于真空下之后从产品中除去水，使冰直接从固体变为蒸气而不通过液相。该过程涉及三个独立且相互依赖的过程：冷冻、初级干燥(升华)和二次干燥(解吸)。结果是干燥冻干饼状物(即干燥的冻干饼状物)，其结构，包括其密度、孔径、总孔体积和表面积由生产控制(例如，稀释剂、温度、真空强度、干燥条件、冷冻条件等)。通过适当的储存，冻干的生物分子和多肽典型地保持稳定2或3年。

冻干容器包括例如小瓶、注射器或药筒。许多不同尺寸的冻干容器是可商购的，其中许多是由玻璃制成。用于冻干的小瓶尺寸包括但不限于6cc小瓶、10cc小瓶、15cc小瓶、20cc小瓶、50cc小瓶、100cc小瓶等。还可获得各种容量(或填充量)的冻干小瓶，包括具有容量或填充量0.1ml、0.3ml、0.5ml、1ml、2ml、2.5ml、5ml、10ml、20ml、25ml、50ml、100ml的小瓶等。

本发明提供一种减少冻干多肽组合物的重构时间的方法，该方法包含：(a)制备包含所述多肽的液体组合物，(b)将叔丁醇(TBA)加入液体中组合物形成液体多肽/TBA混合物，(c)冷冻液体多肽/TBA混合物，(d)冻干液体多肽/TBA混合物以形成冻干的多肽组合物(即冻干多肽饼状物)，(e)用稀释剂重构冻干的多肽组合物，其中重构在TBA存在下冻干的多肽的时间小于重构相同量的在不存在TBA的情况下冻干的相同多肽的时间。

本发明提供用于减少冻干多肽组合物的重构时间的方法和制剂，其中在冻干前将TBA加入到包含该多肽的液体组合物中。在某些实施方案中，加入到包含多肽的液体组合物中的TBA的量约为0.5％体积-约20％体积、约1％体积-约20％体积、约1％体积-约10％体积、约1％体积-约5％体积、约5％体积-约20％体积、约5％体积-约10％体积、或约10％体积-约20％体积。

在其他的实施方案中，加入到包含多肽的液体组合物中的TBA的量约为0.5％、1％、2.5％、5％、7.5％、10％、12.5％、15％、17.5％或20％体积。在一个实施方案中，加入到包含多肽的液体组合物中的TBA的量约为5％-6％体积。在一个实施方案中，加入到包含多肽的液体组合物中的TBA的量约为5％体积。在一个实施方案中，加入到包含多肽的液体组合物中的TBA的量为4.5％、4.6％、4.7％、4.8％、4.9％、5％、5.1％、5.2％、5.3％、5.4％、5.5％、5.6％、5.7％、5.8％、5.9％、6％、6.1％或6.2％。在一个实施方案中，加入到包含多肽的液体组合物中的TBA的量约为10％体积。在一个实施方案中，加入到包含多肽的液体组合物中的TBA的量约为20％体积。

本发明的方法和制剂可有效减少不同浓度的多肽的重构时间，特别是有用和有效地减少高浓度多肽组合物的重构时间。例如，本发明提供了通过在冻干前将TBA加入包含该多肽的液体组合物中而有效减少冻干多肽组合物的重构时间的方法和制剂，其中包含该多肽的液体组合物具有高多肽浓度。在某些实施方案中，多肽在包含该多肽的液体组合物中的浓度约为10mg/ml-250mg/ml。在某些实施方案中，多肽在包含该多肽的液体组合物中的浓度约为25mg/ml-约250mg/ml、约50mg/ml-约250mg/ml、约100mg/ml-约250mg/ml、约150mg/mml-约250mg/ml、约25mg/ml-约100mg/ml、约50mg/ml-约100mg/ml、约25mg/ml-约125mg/ml、或约50mg/ml-约125mg/ml。在一些实施方案中，多肽在包含该多肽的液体组合物中的浓度约为25mg/ml、约40mg/ml、约50mg/ml、约60mg/ml、约70mg/ml、约100mg/ml、约125mg/ml、约150mg/ml、约200mg/ml、或约250mg/ml。

本发明的方法和制剂可有效减少不同量和用量多肽的重构时间。例如，本发明提供了通过在冻干前将TBA加入到包含该多肽的液体组合物中而有效减少冻干多肽组合物的重构时间的方法和制剂，其中包含该多肽的液体组合物具有大用量或大量的多肽。在某些实施方案中，多肽在包含该多肽的液体组合物中的量约为150mg-约11克。在某些实施方案中，多肽在包含该多肽的液体组合物中的量(并且在冻干后)约为150mg、约250mg、约500mg、约750mg、约1克、约2克、约3克、约4克、约5克、约6克、约7克、约8克、约9克、约10克、或约11克。在一些实施方案中，多肽在包含该多肽的液体组合物中的量大于11克。

旋转或摇动冻干容器可以进一步改善冻干多肽的重构时间。在本发明的一些实施方案中，通过在冻干容器中向冻干的多肽中加入稀释剂并使容器旋转(周期性地或连续地)直至冻干的多肽溶解或悬浮在稀释剂中来进行冻干的多肽重构。在本发明的其他实施方案中，通过向冻干容器中的冻干多肽添加稀释剂并将容器置于振荡器(例如，机械振荡器)上并摇动冻干容器直至冻干的多肽溶解或悬浮在稀释剂中来重构冻干的多肽。

在真空下重构多肽可改善冻干多肽的重构时间。在本发明的一些实施方案中，将包含冻干多肽的冻干容器在重构期间维持在真空下。在一个实施方案中，包含冻干多肽的冻干容器在重构期间处于完全真空下。在某些实施方案中，包含冻干多肽的冻干容器在重构期间低于100托。在某些实施方案中，包含冻干多肽的冻干容器在重构期间低于50托。在某些实施方案中，包含冻干多肽的冻干容器处于100毫托至50托之间。在一个实施方案中，包含冻干多肽的冻干容器处于100毫托。

本发明提供了通过本发明方法生产的冻干多肽组合物。在一些实施方案中，本发明提供了冻干多肽组合物，其中该冻干多肽组合物通过下列步骤生产：制备包含所述多肽的液体组合物，向液体组合物中加入叔丁醇(TBA)以形成液体多肽/TBA混合物，冷冻液体多肽/TBA混合物，冻干液体多肽/TBA混合物以形成冻干的多肽组合物，其中在用稀释剂重构冻干的多肽组合物时，在TBA存在下重构冻干的多肽的时间少于重构在不存在TBA下冻干的相同量的相同多肽的时间。在某些实施方案中，冻干的多肽组合物是包含该多肽的冻干饼状物。

本发明提供了通过本发明的方法制备的液体多肽组合物。在一些实施方案中，本发明提供了液体多肽组合物，其中该液体多肽组合物通过下列步骤生产：制备包含所述多肽的液体组合物来生产，并且向液体组合物中加入叔丁醇(TBA)以形成液体多肽/TBA混合物，其中在液体多肽/TBA混合物形成冻干的多肽组合物并随后用稀释剂重构冻干的多肽组合物时，重构在TBA存在下冻干的多肽的时间少于重构在不存在TBA下冻干的相同量的相同多肽的时间。

在本公开的一些实施方案中，将TBA添加至包含抗体和糖的液体组合物中对液体抗体/TBA混合物、冻干抗体组合物或适合于冻干的液体抗体制剂中的抗体的完整性或稳定性没有影响，其中糖∶抗体的摩尔比为至少约360∶1，其中TBA在液体抗体/TBA混合物中的量在约为5％-20％体积。在此类实施方案中，抗体在储存于液体组合物或冻干组合物中时基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性。优选地，本文提供的组合物和制剂中的抗体基本上保持其物理和化学稳定性及其在储存时的生物活性。通常基于制剂的预期贮存期限来选择储存期。用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术可在本领域中获得，并在例如Peptide and Protein Drug Delivery，247-301，Vincent Lee Ed.，MarcelDekker，Inc.，New York，N.Y.，Pubs.(1991)and Jones，A.Adv.Drug Delivery Rev.10：29-90(1993)中综述。可以在所选温度下测定在选定时间期限内的稳定性。

在某些实施方案中，适合于冻干的液体抗体制剂在约40℃下稳定至少约1、2、3、4、5、6、7、14、21、28或以上天数。在某些实施方案中，液体抗体制剂在约40℃稳定至少约1、2、3、4、5、6、7、8或以上周。在某些实施方案中，液体抗体制剂在约25℃稳定至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或以上个月。在某些实施方案中，液体抗体制剂在稳定约5℃至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或以上个月。在某些实施方案中，液体抗体制剂在约-20℃或以下稳定至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或以上个月。此外，液体抗体制剂优选在冷冻(至例如-20℃、-40℃或-70℃)和液体抗体制剂解冻后例如在1、2、3、4或5个冷冻循环和解冻后是稳定的。

在某些实施方案中，冻干的抗体组合物在约25℃下稳定至少1、2、3、4、5、6、7、8或以上周，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或以上个月。在某些实施方案中，冻干的抗体组合物在约5℃下稳定至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或以上个月。在某些实施方案中，冻干的抗体组合物在约-20℃或以下稳定至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或以上年。

稳定性可以通过各种不同方式定性和/或定量评估，包括评估聚集体形成(例如使用尺寸排阻色谱法，通过测量浊度和/或通过目视检查)；通过使用阳离子交换色谱、图像毛细管等电聚焦(icIEF)或毛细管区带电泳评估电荷异质性；氨基末端或羧基末端序列分析；质谱分析；SDS-PAGE分析以比较还原和完整抗体；肽图(例如胰蛋白酶或LYS-C)分析；评估抗体的生物活性或抗原结合功能等；不稳定性可能涉及以下任何一种或多种：聚集、脱酰胺(例如Asn脱酰胺)、氧化(例如Met氧化)、异构化(例如Asp异构化)、剪切/水解/断裂(例如铰链区断裂)、琥珀酰亚胺形成、未配对的半胱氨酸、N末端延伸、C、末端加工、糖基化差异等。

如果在目视检查颜色和/或透明度时或者如通过本领域已知的方法例如UV光散射或通过尺寸排阻色谱法测量的，没有显示任何迹象或非常少的聚集、沉淀和/或变性，则抗体“在组合物或药物制剂中保持其物理稳定性”。

如果在给定时间的化学稳定性使得抗体仍然保持其如下定义的生物活性，则抗体“在组合物或药物制剂中保持其化学稳定性”。例如，通过检测和定量化学改变形式的抗体来评估化学稳定性。化学改变可涉及尺寸修改(例如修剪)，其可使用例如尺寸排阻色谱、SDS-PAGE和/或基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱(MALDI/TOF MS)来评估。其他类型的化学改变包括例如通过离子交换色谱法或icIEF评估的电荷改变(例如由于脱酰胺作用而发生)。

例如，如果抗体在给定时间的生物活性如抗原结合测定中所确定的在制备组合物或药物制剂时显示的生物活性的约10％(在测定误差范围内)内，则抗体“在组合物或药物制剂中保留其生物活性”。抗体的其他“生物活性”测定在下文详述。

如本文所用，单克隆抗体的“生物活性，，是指抗体与抗原结合的能力。进一步包括抗体与抗原结合并产生可测量的生物反应，其可在体外或体内测量。这类活性可以是拮抗性的或激动性的。

抗体

本文提供了用于生产根据本发明配制的抗体的示例性技术。在一个实施方案中，抗体结合的抗原是生物学上重要的蛋白质并且将抗体施用于患有疾病或障碍的哺乳动物可以在该哺乳动物中导致治疗益处。然而，也关注针对非多肽抗原(例如肿瘤相关糖脂抗原；参见美国专利5,091,178)的抗体。

当抗原是多肽时，它可以是跨膜分子(例如受体)或配体，例如生长因子。示例性抗原包括分子，诸如肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；***；降钙素；促黄体激素；胰高血糖素；凝血因子如因子VIIIC、因子IX、组织因子(TF)和冯维勒布兰德因子；抗凝血因子如蛋白C；心钠素；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽；RANTES(通常在活化时调节T细胞表达和分泌)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，如人血清白蛋白；muellerian抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠***相关肽；微生物蛋白，如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，如CTLA-4；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；蛋白质A或D；类风湿因子；神经营养因子如骨源性神经营养因子(BDNF)，神经营养因子-3，-4，-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神经生长因子，例如NGF-b；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-b1、TGF-b2、TGF-b3、TGF-b4或TGF-b5；肿瘤坏死因子(TNF)如TNF-α或TNF-β；***I和II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，***结合蛋白；CD蛋白，如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22和CD40；***；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSFs)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(IL)，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9和IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，例如AIDS包膜的部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白，如CD1a1、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原如HER2、HER3或HER4受体；和任何上述多肽的片段。

本发明所包括的抗体的示例性分子靶标包括CD蛋白，例如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22、CD34和CD40；ErbB受体家族的成员，如EGF受体、HER2、HER3或HER4受体；B细胞表面抗原，如CD20或BR3；肿瘤坏死受体超家族成员，包括DR5；***干细胞抗原(PSCA)；细胞粘附分子，如LFA-1、Mac1、p150.95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、α4/β7整联蛋白和αv/β3整联蛋白，包括其α或β亚单位(例如抗-CD11a、抗-CD18或抗CD11b-抗体)；生长因子，如VEGF及其受体；组织因子(TF)；肿瘤坏死因子(TNF)，如TNF-α或TNF-β、α干扰素(α-IFN)；白细胞介素，如IL-8；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；蛋白C等。

任选地与其他分子缀合的可溶性抗原或其片段可用作产生抗体的免疫原。对于跨膜分子，例如受体，这些的片段(例如受体的胞外结构域)可用作免疫原。或者，表达跨膜分子的细胞可用作免疫原。这类细胞来自天然来源(例如癌细胞系)或可以是通过重组技术转化以表达跨膜分子的细胞。用于制备抗体的其他抗原及其形式对于本领域技术人员而言是显而易见的。

可以根据本发明配制的示例性抗体包括但不限于如下：抗ErbB抗体，包括抗HER2抗体(例如曲妥珠单抗(HERSTPT))或培妥珠单抗)；结合B细胞表面标志物的抗体，如CD20(例如利妥昔单抗和人源化2H7/奥瑞珠单抗)，CD22，CD40或BR3；结合IgE的抗体，包括可从Genentech商购的奥马珠单抗E26，HAE1，在其Fc区的第265位具有氨基酸取代的IgE抗体(US 2004/0191244 A1)，Hu-901，如WO2004/070011中的IgE抗体，或结合IgE上的小胞外区段的抗体，M1′(例如47H4v5；参见美国专利号8,071,097)，也参见Prest等人J.Immunol.151：2623-2632(1993)；国际公开号WO 95/19181；1998年2月3日授权的美国专利号5,714,338；1992年2月25日授权的美国专利号5,091,313；1993年3月4日公布的WO 93/04173；1999年1月14日公布的WO 99/01556；和美国专利号5,714,338；结合血管内皮生长因子(YEGF)(例如贝伐单抗)或VEGF受体的抗体；抗-IL-8抗体(St John等人Chest，103：932(1993)和国际公开号WO95/23865)；抗-PSCA抗体(WO01/40309)；抗-CD40抗体，包括S2C6及其人源化变体(WO00/75348)；抗-CD11a抗体，包括依法珠单抗(US专利号5,622,700，WO 98/23761，Steppe等人Transplant Intl.4：3-7(1991)和Hourmant等人Transplantation 58：377-380(1994))；抗-CD18抗体(美国专利号5,622,700，1997年4月22日授权，或如在1997年7月31日公布的WO97/26912)；抗-Apo-2受体抗体(1998年11月19日公布的WO 98/51793)；抗-TNF-α抗体，包括cA2和阿达木单抗CDP571和MAK-195(阿非莫单抗)(参见1997年9月30日授权的美国专利号5,672,347，Lorenz等人J.Immunol.156(4)∶1646-1653(1996))和Dhainaut等人Crit.CareMed.23(9)：1461-1469(1995))；抗-组织因子(TF)(1994年11月9日授权的欧洲专利号0 420937 B1)；抗-人α4β7整联蛋白(1998年2月19日公布的WO 98/06248)；抗-EGFR抗体，包括嵌合或人源化225抗体，1996年12月19日公布的WO96/40210；抗-CD3抗体，例如OKT3(1985年5月7日授权的美国专利号4,515,893)；抗-CD25或抗-tac抗体，例如CHI-621和(参见1997年12月2日授权的美国专利号5,693,762)；抗-CD4抗体，例如cM-7412抗体(Choy等人Arthritis Rheum 39(1)∶52-56(1996))；抗-CD52抗体，例如阿仑珠单抗(Riechmann等人Nature 332：323-337(1988)；抗-Fc受体抗体，例如针对FcyRI的M22抗体，如Graziano等人J.Immunol.155(10)：4996-5002(1995)；抗-癌胚抗原(CEA)抗体，例如hMN-14(Sharkey等人Cancer Res.55(23增刊)：5935s-5945s(1995)；针对乳腺上皮细胞的抗体包括huBrE-3，hu-Mc 3和CHL6(Ceriani等人Cancer Res.55(23)：5852s-5856s(1995)；和Richman等人Cancer Res.55(23增刊)：5916s-5920s(1995))；与结肠癌细胞结合的抗体，如C242(Litton等人EurJ.Immunol.26(1)：1-9(1996))；抗-CD38抗体，例如AT 13/5(Ellis等人J.Immunol.155(2)：925-937(1995))；抗-CD33抗体，例如Hu M195(Jurcic等人Cancer Res 55(23Suppl)：5908s-5910s(1995)和CMA-676或CDP771；抗-CD22抗体，例如LL2或LymphoCide(Juweid等人Cancer Res55(23增刊)：5899s-5907s(1995)；抗-EpCAM抗体，例如17-1抗-GpIIb/IIIa抗体，例如阿昔单抗或c7E3Fab抗-RSV抗体，例如MEDI-493抗-CMV抗体，例如抗-HIV抗体，例如PR0542；抗-肝炎抗体，例如抗-Hep B抗体抗-CA125抗体OvaRex；抗-独特型GD3表位抗体BEC2；抗-avP3抗体抗-人肾细胞癌抗体，例如ch-G250；ING-1；抗-人17-1抗体(3622W94)；抗-人结肠直肠肿瘤抗体(A33)；针对GD3神经节苷脂的抗-人黑素瘤抗体R24；抗-人鳞状细胞癌(SF-25)；和抗人白细胞抗原(HLA)抗体，例如Smart ID 10和抗-HLADR抗体Oncolym(Lym-1)；抗-CCR5(PRO 140)；ABT-325；ABT-308；ABT-147；抗-β7(etrolizumab)；抗-HER3/EGFR DAF(DLl If)；抗-白细胞介素6受体(IL6R)，例如托珠单抗抗-FluA(参见WO2014/078268)和抗-Abeta(参见WO2003/070760和WO2008/011348)等。

实施例

以下是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实施不同的另外的实施方案。

实施例1.用0-20％TBA重构2.5ml和25ml mAb饼状物

将纯化的单克隆抗体(mAb)溶液(mAb1和mAb2)在含有168mM蔗糖、20mM His-HCl、0.03％PS20的缓冲液中稀释至70mg/ml。将TBA温热至其熔点25℃以上，然后如下加入mAb样品中。将TBA直接加入到70mg/ml mAb溶液中，最终TBA浓度高达5％。对于具有最终TBA浓度为10％或20％(体积/体积)的样品，使用较高的mAb1初始浓度(90mg/mL)和mAb2(100mg/mL)，并在加入适量的TBA后，使用含有168mM蔗糖和0.03％PS20的20mM His缓冲液稀释至70mg/ml蛋白质，在最终的mAb溶液中得到10％TB或20％TBA(v/v)浓度。

然后将mAb/TBA混合物加入洗涤和去热原的Schott管小瓶中：6cc小瓶，2.5ml填充物；50cc小瓶，25ml填充物。用Daikyo D777-120mm莱奥塞子塞住小瓶。然后将小瓶装入实验室冷冻干燥器(Lyostar II，FTS Systems，Stone Ridge，NY或Lyostar III，SPScientific，Stone Ridge，NY)。

如下进行冻干。对于使用不受控制的成核实验，将小瓶在5℃平衡1小时。然后使隔板温度以-0.3℃/min的速率降至-35℃，并且保持在该温度下6小时。

对于使用受控成核的实验，将小瓶在-10℃下平衡2小时。用氮气将腔室加压至28.5psig，持续5分钟，然后在约2秒内减压。然后以-0.3℃/min的速率将搁板温度降至-35℃并在该温度下保持6小时。将给定实验中的所有小瓶样品在一个冷冻干燥器中固结用于干燥，以避免干燥行为中任何可能的冻干剂间变异性。初级干燥在-10℃的搁板温度下进行，室压为100毫托，直到皮拉尼真空计与电容压力计汇合。在20℃的搁板温度和100毫托的室压下进行二次干燥(以使干燥饼状物中的水分降低至0.5-2％的可接受水平)12小时。冻干后，将小瓶储存在5℃。

用无菌注射用水(稀释剂)重构冻干的单克隆抗体组合物，其量足以产生具有与冻干前的蛋白浓度相同的mAb蛋白浓度的溶液。向每个6cc小瓶中加入2.2ml无菌注射用水，该小瓶最初含有2.5ml填充物；向每个50cc小瓶中加入22ml无菌注射用水，其最初含有25ml填充物。在重构之前，使小瓶和无菌注射用水(重构稀释剂)在室温下平衡。

通过加入2.2ml注射用无菌水并旋转5秒，在6cc小瓶中重构mAb1；然后将小瓶以60rpm放置在轨道振荡器上，直到抗体溶液完全重构(即完全溶解)。通过加入2.2ml注射用无菌水并旋转5秒，在6cc小瓶中重构mAb2；之后，每10分钟手动旋转小瓶5秒，直到抗体溶液完全重构。通过加入22ml无菌注射用水并旋转5秒钟，在50cc小瓶中重构mAb1；之后，每10分钟将小瓶旋转5秒，直到抗体溶液完全重构。

在加入稀释剂后立即将含有用于手动重构的样品的小瓶旋转5秒，然后大约每十分钟旋转一次，直到通过目视检查确认剩余的固体溶解。偶尔停止搅拌以目视评估剩余的固体。

图1显示来自6cc小瓶(2.5ml填充物)的冻干mAb1的不同浓度的TBA对重构时间(分钟)的影响。如图1所示，在冻干前向抗体溶液中加入0.5％、1％、5％或20％TBA导致mAb1的重构时间减少。特别地，与无TBA处理的对照相比，添加5％TBA将冻干抗体的重构时间从大于20分钟减少至少于5分钟，重构时间减少约80％。

下面的表1显示了对于每个测试的TBA浓度、对于三个单独的6cc小瓶与上述实验相关的特定重构时间。

表1

图2显示来自6cc小瓶(2.5ml填充物)的冻干mAb2的不同浓度的TBA对重构时间(分钟)的影响。如图2所示，在冻干前向抗体溶液中添加5％或10％TBA导致mAb2的重构时间减少。特别地，添加5％TBA将冻干抗体的重构时间从大于20分钟减少至约7.5分钟。

图3显示来自50cc小瓶(25ml填充物)的冻干mAb1的不同浓度的TBA对重构时间(分钟)的影响。如图3所示，在冻干前向抗体溶液中加入1％、5％、10％或20％TBA导致mAb1的重构时间减少。特别地，添加5％TBA将冻干抗体的重构时间约70分钟减少至约27分钟。

总之，这些结果显示在冻干之前添加TBA至抗体溶液中导致重构时间减少。另外，这些结果表明，与用1％TBA、10％TBA或20％TBA获得的结果相比，5％TBA提供的重构时间减少最多。

实施例2.用TB和真空重构

如下检查冻干的mAb1在部分真空下与完全真空下与TBA组合对重构时间的影响。对于该研究，使用100cc小瓶，其含有60ml填充体积的mAb1，为70mg/ml。将TBA加入到mAb1溶液中至终浓度为5％或10％TBA。冻干后，将小瓶回填至100毫托(真空)或200托(部分真空对照)。

通过添加无菌注射用水将100cc小瓶中的冻干mAb1重构成原始的60ml填充体积，旋转5秒，之后每10分钟将小瓶旋转5秒直至抗体溶液完全重构(即完全溶解)。

图4显示在两种不同的真空条件(100毫托或200托)下，不同浓度的TBA(5％和10％TBA)对100cc小瓶中冻干的mAb1的重构时间的影响。如图4所示，在冻干前向抗体溶液中添加5％TBA或10％TBA导致100cc小瓶中mAb1的重构时间减少，填充体积为60ml，与分别含有2.5ml填充体积或25ml填充体积的6cc或50cc小瓶获得的结果一致。特别地，在200托的条件下，5％TBA或10％TBA的添加将重构时间从没有TBA的大于110分钟减少至至使用5％TBA的约60分钟和使用10％TBA的约80分钟。

当在100毫托条件下进行重构时，重构时间显著少。特别地，在100毫托的条件下，添加5％TBA或10％TBA将重构时间从没有TBA的约40分钟减少至使用5％TBA的约20分钟和使用10％TBA的约40分钟。

总之，这些结果表明，与单独使用TBA或真空相比，将TBA与真空组合显示出重构时间的更大的减少。

实施例3.在不同振荡器条件下用TBA重构

将使用或不使用振荡器与TBA组合进行重构对冻干的mAb1重构时间的影响检查如下。对于该研究，使用100cc小瓶，其含有60ml填充体积的mAb1，为70mg/ml。将TBA加入mAb1溶液中至终浓度为5％或10％TBA。

通过添加无菌注射用水将100cc小瓶中的冻干的mAb1重构成原始的60ml填充体积。在加入稀释剂后立即将含有用于手动重构的样品的小瓶旋转5秒，然后大约每十分钟旋转一次，直到通过目视检查确认剩余的固体溶解。在加入稀释剂后，用Novartis/Genentech500rpm Xolair Shaker(South SFrancisco，CA)搅拌含有用于通过振荡器重构的样品的小瓶。偶尔停止搅拌以目视评估剩余的固体。

图5显示当使用或不使用振荡器重构时，不同浓度的TBA(5％和10％TBA)对100cc小瓶中冻干的mAb1的重构时间的影响。如图5所示，在冻干前向抗体溶液中加入5％TBA或10％TBA导致mAb1在具有60ml填充体积的100cc小瓶中的重构时间减少。特别地，在对照(无振荡器)条件下，在冻干之前添加TBA将重构时间从没有TBA的大于110分钟减少至使用5％TBA的约60分钟和使用10％TBA的约80分钟。

当使用振荡器以500rpm进行重构时，重构时间显著减少。特别地，当用振荡器进行重构时，添加TBA将重构时间从没有TBA的约18分钟减少至使用5％TBA或10％TBA的约10分钟。

这些结果共同显示，TBA与振荡器联用表现出比使用单独的TBA更大的重构时间减少。

实施例4.用TBA、真空和振荡器重构

在摇动器与TBA组合的帮助下在真空(100毫托)下进行重构时对冻干的mAb1重构时间的影响如下进行检查。对于该研究，使用100cc小瓶，其含有60ml填充体积的mAb1，为70mg/ml。将TBA加入到mAb1溶液中至终浓度为5％或10％TBA。真空和振荡器条件如实施例3中所述。

图6显示当使用振荡器在100毫托下重构时，不同浓度的TBA(5％和10％TBA)对100cc小瓶中的冻干mAb1的重构时间的影响。如图6所示，对于含有60ml填充物且无TBA、无真空且无振荡器(每10分钟旋转5秒)的100cc小瓶，重构花费约110分钟。然而，真空、TBA和振荡器的添加显著地减少了重构时间到少于10分钟；这三个参数的组合使重构时间减少了95％以上。

使用5％TBA、真空和振荡器的组合，4.2gm蛋白质的重构时间从115分钟的平均值降低至5分钟，从而允许制备具有快速重构时间的高剂量生物分子制剂。

图7显示真空、振荡器以及真空和振荡器对100ml小瓶中包含0％或5％(v/v)叔丁醇的100ml冻干抗体制剂的重构时间的影响。

实施例5.液体稳定性研究

进行稳定性研究以检查TBA对mAb1在液体中的稳定性的影响。通过尺寸排阻色谱(SEC)和离子交换色谱(IEC)测量mAb1稳定性。将mAb1(70mg/ml)加入到含有0％TBA、1％TBA、5％TBA、10％TBA或20％TBA的50cc小瓶(25ml填充物)中。然后将小瓶在2-8℃或30℃下保持7天，在此期间通过SEC和IEC分析在第0天、第3天和第7天测定每种条件下抗体的稳定性。

使用Agilent 1100或1200HPLC(SantClara，CA)与Tosoh Biosciences TSKgel7.8mm ID×30cm L柱(South Sfrancisco，CA)进行SEC分析。使用Agilent 1200HPLC与DionexProPac WCX-10 BioLCTM 4x250mm分析柱(Sunnyvale，CA)进行IEC分析。

如图8A和8B所示，mAb1在2-8℃或30℃下的7天期间加入不同浓度的TBA时维持良好的稳定性，因为SEC分析显示在整个7天过程中维持单个峰的高百分比。图8B显示图8A中所示的示意图的扩展形式(即，图8B显示图8A的数据，不包括与20％TBA在30℃下的相关的数据)。

如图9所示，mAb1在2-8℃或30℃下的7天期间加入不同浓度的TBA时维持良好的稳定性，因为IEC分析表明，在整个7天过程中，所有情况中的主峰维持与对照相差无几。

这些结果共同表明，在TBA浓度低于20％(例如1％、5％、10％TBA)时，抗体的稳定性维持至少7天；然而，在20％TBA条件下观察到一些稳定性丧失。

实施例6.水分分析

检查冻干前TBA添加至mAb1或mAb2对冻干后干燥的mAb的水分水平的影响。如上所述，将mAb1和mAb2(均为70mg/ml)加入6cc小瓶中。将TBA加入mAb溶液中至终浓度为0％、5％或10％TBA。然后如上所述将样品冻干。冻干后，使用Mettler Toledo DL31 VolumetricKarl Fischer Titrator(Columbus，OH)测定冻干样品(即固态样品)的水分含量。

如下表2所示，TB的添加不影响冻干抗体制剂的水分水平。

表2

在不受控制的成核(UCN)和受控成核(CN)下，进一步检测使用不同浓度TBA(0％、5％、10％)的mAb1(50cc小瓶中40mg/ml)的水分含量。如下表3中所示，添加TBA不会影响使用标准冷冻技术(不受控制的成核)冻干的抗体制剂的水分水平。TBA的添加降低了使用受控成核冻干的抗体制剂的水分含量。

表3

如表1和表2中所示，向单克隆抗体制剂中添加TBA表明添加TBA对UCN饼状物的水分水平没有过大影响并且降低了CN饼状物中的水分水平。

实施例7.用于测定比表面积的BET分析

检查不同浓度的TBA对冻干的抗体饼状物结构的比表面积的影响。将mAb1和mAb2以70mg/ml与0％、5％或10％TBA一起加入6cc小瓶中并如上所述冻干。用QuantachromeQuadrasorb Evo自动化表面积和孔径分析仪(Boynton Beach，FL)进行比表面积测量。将样品在相对水分＜3％的手套箱中压碎并装入配衡的球管中。使用约100mg的样品大小。残留水的解吸在40℃下与强真空进行至少3小时。然后使用Krypton作为吸附物，在相对压力P/Po为0.05至0.24的条件下进行多点式Brunauer-Emmett-Teller(BET)分析。

下面的表4显示了比表面积(SSA)的结果是表示为m²/克的测定值。如下表4所示，在冻干前向抗体制剂中加入TB导致冻干饼状物的表面积增加。

表4

使用BET分析对具有不同浓度的TBA(0％、5％、10％)和不受控制的成核(UCN)和受控成核(CN)的mAb1(50cc小瓶中的40mg/m1)进一步检查表面。具有不受控制的成核(UCN)和受控成核(CN)的mAb1饼状物的孔径如下表5所示。

表5

BET分析表明TB的添加在孔径和冻干饼状物结构方面导致差异，这可能归因于在冷冻干燥过程中升华时TB形成垂直孔。(参见Nail，SL等人Freeze-Drying of tert-Butanol/Water Cosolvent Systems：A Case Report on Formation of Friable Freeze-Dried Powder of Tobramycin Sulfate.Journal of Pharmaceutical Sciences.第91卷，第4期，2002年4月.American Pharmacists Association.)

实施例8.冻干的抗体稳定性研究

进行稳定性研究以检查预冻干液体抗体/TBA混合物中TBA对随后冻干的抗体组合物中抗体稳定性的影响。通过尺寸排阻色谱法(SEC)测量稳定性。

在6cc小瓶中装入2.5mL含有70mg/mL抗体(mAb1或mAb2)、168mM蔗糖、20mM组氨酸HCl(pH 5.8)、0.028％聚山梨醇酯20和0、5或10％(v/v)TBA的制剂。将小瓶用保守的冻干循环冻干，并在50℃下温育超过4个月。每月取样并置于-20℃直至通过尺寸排阻色谱进行批量分析。图10显示了在每个月时间点维持在冻干的mAb1组合物中的百分比单体。图10B显示冻干的mAb2组合物的结果。

结果表明，在预冻干液体抗体/TBA混合物中存在5％TBA时，冻干的mAb在50℃下的加速降解仍然在冻干的mAbs的典型和可接受的范围内。如上所述，还显示该水平的TBA使冻干的mAb的重构时间最小化。因此，向预冻干液体抗体制剂中添加5％TBA，对于需要大(例如50或100cc)小瓶的高剂量冻干的mAb产品提供了优势，并且其中与较小体积的小瓶相比，重构时间可能显著更长。

Claims

1.用于减少冻干的抗体组合物的重构时间的方法，该方法包括：(a)制备液体组合物，其包含至少约360∶1的糖∶抗体的摩尔比的抗体与糖；(b)向液体组合物中添加叔丁醇(TBA)，以形成液体抗体/TBA混合物，其中TB在液体抗体/TBA混合物中的量为约5％-6％体积；(c)冷冻液体抗体/TBA混合物；(d)冻干液体抗体/TBA混合物，以形成冻干的抗体组合物；(e)用稀释剂重构冻干的抗体组合物，其中在TBA存在下冻干的抗体的重构时间少于用于在没有TBA存在下重构冻干的相同量的相同抗体的时间。

2.权利要求1的方法，其中液体抗体/TBA混合物中的TBA的量约为5％体积。

3.权利要求1的方法，其中糖∶抗体的摩尔比为约360∶1-约500∶1。

4.权利要求1的方法，其中在冷冻液体抗体/TBA混合物之前即刻将TBA加入到包含该抗体的液体组合物中。

5.权利要求1的方法，其中所述抗体是全长抗体。

6.权利要求1的方法，其中抗体在包含该抗体的液体组合中的浓度为约10mg/ml-约250mg/ml、约25mg/ml-约250mg/ml、约50mg/ml-约250mg/ml、约100mg/ml-约250mg/ml、约150mg/mml-约250mg/ml、约25mg/ml-约100mg/ml、约50mg/ml-约100mg/ml、约25mg/ml-约125mg/ml、或约50mg/ml-约125mg/ml。

7.权利要求1的方法，其中抗体在包含该抗体的液体组合物中的量为约150mg-11克。

8.权利要求1的方法，其中所述糖为蔗糖或海藻糖。

9.权利要求1的方法，其中液体抗体/TBA混合物是在玻璃小瓶中冻干的。

10.权利要求9的方法，其中所述玻璃小瓶为6cc小瓶、10cc小瓶、15cc小瓶、20cc小瓶、25cc小瓶、50cc小瓶或100cc小瓶。

11.权利要求9的方法，其中所述玻璃小瓶具有2.5ml、25ml、50ml或100ml的填充体积。

12.权利要求1的方法，其中重构在TBA存在下冻干的冻干的抗体组合物的时间比在重构没有TBA存在下冻干的相同量的相同抗体组合物的时间减少约40-95％。

13.权利要求1的方法，其中重构在TBA存在下冻干的冻干抗体组合物的时间比重构在没有TBA存在下冻干的相同量的相同抗体组合物的时间减少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％。

14.权利要求1的方法，其中重构在TBA存在下冻干的冻干抗体组合物的时间比重构在没有TBA存在下冻干的相同量的相同抗体组合物的时间减少约50-60％、约60-70％、约70-80％、约80-90％或约90-95％。

15.权利要求1的方法，其中重构冻干的抗体组合物是在冻干的抗体组合物处于真空下的条件下进行的。

16.权利要求15的方法，其中所述的真空低于100托、低于50托、或100毫托-50托。

17.权利要求15的方法，其中所述的真空为100毫托。

18.权利要求1的方法，其中冻干的抗体组合物的重构是使用振荡器进行的。

19.适合于冻干的液体抗体制剂，其中所述制剂包含抗体、糖、稀释剂和TBA，其中液体制剂中TBA的量约为5％-6％体积，其中液体制剂中的糖量为至少约360∶1的糖∶抗体的摩尔比，并且其中重构在TBA存在下冻干的抗体的时间少于重构在不存在TBA下冻干的相同量的相同抗体的时间。

20.权利要求19的液体抗体制剂，其中在该液体组合物中TBA的量为约5％体积。

21.冻干的抗体组合物，其中通过下列步骤生产冻干的抗体组合物：制备包含抗体和糖的液体组合物，其中糖∶抗体摩尔比为至少约360∶1，向液体组合物中加入叔丁醇(TBA)，以形成液体抗体/TBA混合物，其中液体制剂中TBA的量为约5％-6％体积，冷冻液体抗体/TBA混合物，冻干液体抗体/TBA混合物以形成冻干的抗体组合物，其中用稀释剂重构冻干的抗体组合物时，重构在TBA存在下冻干的抗体的时间少于重构没有TBA存在下冻干的相同量的相同抗体的时间。

22.权利要求21的冻干的抗体制剂，其中液体组合物中TBA的量为约5％体积。