CN110041315A - 一种检测细胞凋亡的荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

把本发明公开了一种区分死活细胞的比率型荧光探针，其化学结构式为：。该荧光探针在健康的活细胞中，荧光探针I具有蓝色和红色双发射；在凋亡细胞中，探针仅具有红光发射。从而利用红蓝双通道比值实现了对细胞凋亡的检测。该探针区分死活细胞准确度高，毒性低，且合成原料易得，工艺简单，在检测细胞凋亡中有广泛的应用前景。

Description

一种检测细胞凋亡的荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于有机小分子荧光探针领域，具体涉及一种比率型荧光探针及其在检测细胞凋亡上的应用。
背景技术
区分检测死活细胞在生物学、医药科学及相关领域中有着重要的意义。在生物学中，区分检测死活细胞是研究细胞凋亡过程的重要工具；在医药领域，区分检测死活细胞、统计细胞存活率是确认药物药效和细胞毒性的最直接方法。因此，能够区分检测死活细胞的试剂是生命科学领域的重要研究工具，能够促进生命科学的发展，具有广阔的商业化前景。
到目前为止，人们对死活细胞的检测依赖于能够区分死活细胞的试剂。首先，通过直接观察细胞形态，人们很难清楚的判断细胞状态。另外，对细胞存活率做统计学研究时，也需要能够对死活细胞给出区分信号的试剂。目前区分死活细胞的试剂分为比色型和荧光型两种。比色型试剂的代表是MTT和CCK-8等四唑盐类化合物。这些化合物本身具有短波且微弱的吸收光谱，可以被活细胞中的线粒体膜电位直接或间接的还原为具有长波、强吸收的甲瓒，因此通过测量其吸光度，可以实现对活细胞存活率的量化。与其相比，荧光型探针具有更加广泛的应用。利用荧光型探针，我们可以在显微镜下实时、原位的观测单个细胞状态，对生命科学研究有着更大的促进作用。目前商品化及文献中报道的区分死活细胞的探针多为只能标记死细胞或活细胞的探针，因此实验操作中不可避免的不均匀染色会带来很大的干扰。因此，为避免干扰，给出更加准确的结果，需要给出区分标记死活细胞的荧光探针，然而这类探针目前鲜有报导。
发明内容
针对目前区分死活细胞的探针多为只能标记死细胞或活细胞的探针的问题，本发明提供一种检测细胞凋亡的荧光探针，响应速度快、抗干扰能力强。
本发明的另一目的是提供一种上述荧光探针在检测细胞凋亡的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种区分死活细胞的比率型荧光探针，其化学结构式如式（I）所示：
式（I）。
上述荧光探针I的制备方法，包括以下步骤：
化合物1和化合物2在四氢吡咯催化下于乙醇中反应，分离、提纯即得荧光探针I。
所述化合物1与化合物2的物质的量比为1:1。所述反应时间为24 h。
所述分离、提纯步骤为将反应后析出的固体过滤，在乙醇中重结晶即得纯净的荧光探针I。
一种上述荧光探针I在检测细胞凋亡中的应用。
本发明的机理如下：
本发明提供的荧光探针I在健康的活细胞中，具有蓝色和红色双发射；在凋亡细胞中，仅具有红光发射。利用红蓝双通道比值可实现对细胞凋亡的检测。
本发明具有以下优点：
本发明提供的检测细胞凋亡的比率型荧光探针I，在健康的活细胞中，具有蓝色和红色双发射；在凋亡细胞中，探针仅具有红光发射，区分死活细胞准确度高，毒性低，且合成原料易得，工艺简单。
附图说明
图1为荧光探针I的1H NMR谱；
图2为荧光探针I的1C NMR谱；
图3为荧光探针I的HRMS谱；
图4为荧光探针I染色活细胞和固定细胞的对照图；
图5为荧光探针I染色活细胞和凋亡细胞的对照图；
图6为荧光探针I的毒性测试。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 荧光探针I的合成与表征
将化合物1（2 mmol）和化合物2（2 mmol）加入圆底烧瓶中，加入5mL乙醇作溶剂，并搅拌均匀。加入少量四氢吡咯做催化剂，室温搅拌反应24h，反应完成后有固体析出，过滤并在乙醇中重结晶可得到纯净产品，即为荧光探针I，收率为51%。荧光探针的结构通过核磁共振氢谱（1H NMR）、碳谱（13C NMR）和高分辨率质谱（HRMS）进行表征；氢谱和碳谱在CF3COOD/DMSO-d 6 （V/V=1:1）溶液中测得，质谱在甲醇溶液测得。其1H NMR谱、1C NMR谱、HRMS谱如图1、图2和图3。
1H NMR (400 MHz, CF3COOD/DMSO-d 6) δ 8.77 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 8.35(dd, J = 9.1, 4.6 Hz, 2H), 8.22 (dd, J = 8.0, 1.5 Hz, 1H), 8.13 (dd, J = 8.7,7.1, 1H), 8.07 – 7.93 (m, 2H), 7.87 (dd, J = 16.0, 8.2 Hz, 3H), 7.64 (d, J =15.7 Hz, 1H), 7.51 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.19 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.97 – 6.73(m, 3H), 4.54 (s, 3H), 4.11 – 3.31 (m, 8H). 13C NMR (101 MHz, CF3COOD/DMSO) δ164.75, 162.70, 156.66, 156.16, 151.46, 147.35, 144.06, 143.47, 139.40,134.72, 131.07, 130.17, 129.96, 128.54, 127.62, 120.41, 118.65, 118.05,116.81, 115.81, 115.55, 114.61, 113.97, 113.78, 112.97, 102.27, 41.10, 38.72.HRMS (ESI): m/z, for C32H28N3O4 +, Calc., 518.2074, found, 518.2073。
实施例2 荧光探针I的细胞成像研究
（1）细胞培养、处理和染色
将密度为3×105 个/mL的HeLa细胞接种到灭菌的35 mm成像培养皿中，在CO2培养箱（温度为37 ℃，5% CO2）培养12 h，使细胞贴壁。用4%多聚甲醛处理贴壁细胞30 min得到死细胞样品。用10 μM的鱼藤酮处理细胞48 h得到凋亡细胞。配制浓度为2.5 mM的实施例所得荧光探针I的DMSO溶液为母液，向死活细胞培养皿中加入的荧光探针I母液，使其终浓度均为5 μM。分别在相同条件下继续培养1 h，然后将细胞培养液吸走，用培养基冲洗细胞3次，然后进行细胞成像实验。
（2）共聚焦显微镜成像
以405 nm和561 nm为激发波长，蓝光通道收集波长为425-475 nm，红光通道收集波长为570-620 nm，得到荧光图，如图5。从图5中我们可以看出，经荧光探针I染色后，活细胞中蓝光、红光通道有荧光；死细胞和凋亡中仅红通道有荧光。如图4和图5所示。因此可以通过荧光探针I红蓝双通道比值来观测细胞凋亡情况。
实施例4 荧光探针I的细胞毒性测试
将细胞密度为8000个/mL的HeLa细胞接种到96孔板的部分孔内，剩余孔则用PBS缓冲液填充，并在不同的条件下在CO2培养箱中孵育细胞。实验组为用含5 μM的实施例1所得荧光探针I的培养基孵育2 h、12 h和24 h后的细胞样品，对照组为不加染料的含细胞样品，空白组为PBS缓冲液样品。待孵育完成后，用新鲜的培养基换掉细胞培养液，并在每个培养孔中加入10μL的MTT，再孵育细胞4 h。孵育完成后，移除培养基，每孔加入200μL的DMSO，并用摇床晃动其10min以溶解甲瓒。使用酶标仪测试每个孔在570nm处的吸光度，细胞存活率可通过下述公式计算得到：
其中，Asample为实验组吸光度，Ac为对照组吸光度，Ab为空白组的吸光度。荧光探针I的培养基孵育2 h、12 h和24 h后，细胞存活率如图6所示。由图6可知，染色24 h后细胞存活率仍高达92%，说明探针的毒性很低。

Claims (4)

1.一种区分死活细胞的比率型荧光探针，其化学结构式为：
。
2.一种如权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
化合物1和化合物2在四氢吡咯催化下于乙醇中反应，分离、提纯即得荧光探针。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述分离、提纯步骤为将反应后析出的固体过滤，在乙醇中重结晶即得纯净的荧光探针。
4.一种如权利要求1所述的比率型荧光探针在检测细胞凋亡中的应用。
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