CN106518762A

CN106518762A - 一种检测细胞内质网中甲醛的荧光探针

Info

Publication number: CN106518762A
Application number: CN201610943579.4A
Authority: CN
Inventors: 林伟英; 唐永和; 徐安; 刘展榕; 徐高平
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2016-11-02
Filing date: 2016-11-02
Publication date: 2017-03-22

Abstract

本发明提供了一种检测细胞内质网中甲醛的荧光探针，其化学名称为：4 ‑ 肼基 ‑ N ‑ (2 ‑ 氨基乙基 ‑ 4 ‑ 甲基苯磺酰胺基)萘酰亚胺。简称：Na ‑ FA ‑ ER。本发明还公开了该探针在荧光检测和生物成像领域的性质和功能。本发明提供的荧光探针，随着甲醛浓度的增加，探针溶液荧光呈现逐渐增强的态势。因此，该探针对于体内和体外环境中的甲醛的传感检测具有较好的应用价值，对于甲醛的防治工作也具有一定的贡献。

Description

一种检测细胞内质网中甲醛的荧光探针

技术领域

本发明主要应用于生物体内和体外环境中甲醛含量的检测，属于有机小分子荧光探针领域。

背景技术

甲醛又名蚁醛，其日常生产生活中用途广泛，其在合成树脂、表面活性剂、塑料、橡胶、皮革、造纸、染料、制药、农药、照相胶片、***、建筑材料等行业都有广泛应用。然而，甲醛虽然有“万能化工原料”的美誉，却也是一个不折不扣的健康杀手。很多证据都表明，如果人类长期接触甲醛将会导致一系列疾病，例如阿兹海默症、癌症、中风和流产等。可以说，甲醛是一把双刃剑，若能及时检测出体内和环境中的甲醛，对于人类社会发展将具有重要的意义。因此，一直以来甲醛荧光分子探针领域都是人们研究的热点。这将对防治甲醛中毒，以及评估细胞、组织和活体内的甲醛产生、代谢途径和甲醛的生理功能的研究具有重要意义。

内质网是细胞内膜面积最大的细胞器，在其高度折叠的膜表面上富含丰富的酶，对与生物体正常的生命活动具有重要的意义。而在病变状态下，内质网的膜面积以及形态会发生很大改变，从而直接影响脱甲基化酶的产生，而使内质网中的甲醛含量发生改变。本发明旨在发明一种能快速检测内质网甲醛含量的探针，这也将对研究内质网产生甲醛的机理具有重要意义。

目前，国内外已报道德甲醛检测方法主要有分光光度法、电化学检测法、气相色谱法、液相色谱法、传感器法等，但是这些检测方法往往偏重领域不同，有些甚至操作繁琐，应用不便，并且测试过程中还会对样品进行不可修复的破坏。因此，发展一种简单快捷、灵敏、高效的测试甲醛含量的方法尤为重要。荧光探针具有广泛性、高灵敏性和专一性等优点而受到广泛关注。

发明内容

甲醛作为人类日常生活中的一种常见污染物，随着生活水平的提高，人类也越来越重视甲醛对其日常生活质量的影响，因此发明一种快速简洁的检测方法已经成为大家研究的一个热点方向。为了应对这种需求，本发明要解决的问题是提供一种检测甲醛的荧光探针(Na - FA - ER) 。本发明探针通过荧光成像技术可用于检测细胞内内质网中的甲醛。

本发明所述的检测甲醛的荧光探针，该荧光探针命名为4 -肼基- N - (2 -氨基乙基- 4 - 甲基苯磺酰胺基)萘酰亚胺，简称Na - FA - ER，其化学结构式如式 ( ) 所示：

（）

上述检测甲醛的荧光探针 (Na - FA - ER) 的制备方法是：

制备化合物 (3) ：在合适大小的反应容器中，向其中加入甲苯，加入乙二胺 (1)，对甲苯磺酰氯 (2)，加热回流合成化合物N - (2 - 氨基乙基) - 4 - 甲基本磺酰胺 (3)。

制备化合物 (5) ：在合适大小的反应容器中，加入1, 8 - 4 - 溴萘二甲酸酐(4)，乙醇，N - (2 - 氨基乙基) - 4 - 甲基本磺酰胺 (3)，加热回流生成4 - 溴 - N -(2 –氨基乙基 - 4 - 甲基苯磺酰胺基)萘酰亚胺 (5)。

制备Na - FA - ER ：在合适大小的反应容器中，加入4 - 溴 - N - (2 - 氨基乙基 - 4 - 甲基苯磺酰胺基)萘酰亚胺(5)，后加入乙醇，搅拌状态下加入水合肼 (6)，后加热回流生成化合物4 - 肼基 - N - (2 - 氨基乙基 - 4 - 甲基苯磺酰胺基)萘酰亚胺(7)，简称：Na - FA - ER。

上述Na - FA - ER的制备反应式如下：

。

本发明所述的甲醛荧光探针Na - FA - ER检测方向是环境及生物体内质网靶向甲醛的检测。

如上所述荧光探针Na - FA - ER能灵敏的专一识别甲醛，并通过抑制a-PET效应增强荧光的方式来实现对甲醛的识别。

本发明所述检测甲醛的荧光探针Na - FA - ER本身具有较弱的黄色荧光，这是由于肼基本身作为一个供电子基团，其自身两对孤独电子对整个荧光分子基团产生a-PET效应而淬灭分子的荧光或者使得探针分子荧光减弱。当探针与甲醛分子作用后，化合物Na -FA - ER上的肼基与甲醛发生缩合反应，转变成亚甲基肼结构，使得其a - PET效应受到抑制，导致荧光强度明显增加。

识别机理如下：

。

通过实验证实，当加入甲醛以后，探针溶液的荧光强度显著增强，该结果也证实了其在生物学荧光成像领域应用的潜在价值。

附图说明

图1：探针Na - FA - ER的核磁谱图（氢谱和碳谱）；

图2：探针Na - FA - ER的紫外吸收光谱；

图3：探针Na - FA - ER对甲醛的选择性检测；

图4：探针Na - FA - ER与甲醛作用的滴定实验；

图5：探针Na - FA - ER与甲醛相互作用的动力学实验；

图6：探针Na - FA - ER的外源性甲醛细胞成像实验；

图7：探针Na - FA - ER的内源性甲醛细胞成像实验；

图8：探针Na - FA – ER的共定位细胞成像实验。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制，实施例中化合物的号码对应上述方案中化合物的号码。

实施例1

化合物N - (2 - 氨基乙基) - 4 - 甲基本磺酰胺(3)的合成：

。

在25 mL圆底烧瓶中，在40 ℃条件下向甲苯(5mL)中缓慢对乙二胺(1) 1 mmol，在充分搅拌的情况下加入对甲苯磺酰氯(2) 1.0 mmol，加热回流3 - 4 h后，冷却至室温，向反应中加入5ml 1M的HCl水溶液，抽滤除掉滤渣，滤液用NaOH中和至析出大量白色固体为止，减压抽滤，固体真空干燥，得固体N - (2 - 氨基乙基) - 4 - 甲基本磺酰胺(3)。产率：72 %。产物不经过纯化，直接进行下一步反应。

化合物4 - 溴 - N - (2 - 氨基乙基 - 4 - 甲基苯磺酰胺基)萘酰亚胺(5) 的合成：

。

在25 mL的圆底烧瓶中，加入化合物N - (2 - 氨基乙基) - 4 - 甲基苯磺酰胺(3) 0.5 mmol与1, 8 - 4 -溴萘二甲酸酐(4) 0.5 mmol混合，向其中加入2 mL乙醇并回流搅拌，冷却至室温，将反应体系置于-5 ℃环境中，有大量固体析出，减压过滤，滤饼用乙醇洗涤2 - 3次，真空干燥，得到化合物4 - 溴 - N - (2 - 氨基乙基 - 4 - 甲基苯磺酰胺基)萘酰亚胺 (5)。产率：75 %。产物不经过纯化，直接进行下一步反应。

化合物4 - 肼基 - N - (2 - 氨基乙基 - 4 - 甲基苯磺酰胺基)萘酰亚胺(7)的合成：

。

在25 mL圆底烧瓶中，加入4 - 溴 - N - (2 - 氨基乙基 - 4 - 甲基苯磺酰胺基)萘酰亚胺(5) 0.3 mmol，水合肼(2) 0.1 mL，再加入乙醇 3 mL，加热回流2 - 3 h后，冷却至室温，减压过滤，滤饼用乙醇洗涤2 - 3次，真空干燥，经乙醇重结晶，得淡黄色4 - 肼基 - N - (2 - 氨基乙基 - 4 - 甲基苯磺酰胺基)萘酰亚胺(7)。产率：85 %。探针Na - FA- ER的核磁谱图如图1所示。

¹H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.15 (s, 1H), 8.61 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.37(d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.25 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.72 (t, J = 6.2 Hz, 1H),7.66-7.56 (m, 3H), 7.24 (d, J = 8.5 Hz, 3H), 4.69 (s, 2H), 4.07 (t, J = 6.7Hz, 2H), 3.03 (dd, J ₁ = 13.2 Hz, J ₂= 6.5 Hz, 2H), 2.25 (d, J = 15.8 Hz, 3H).¹³C NMR (101 MHz, DMSO) δ 164.31, 163.39, 153.68, 142.91, 137.99, 134.67,130.99, 129.93, 129.89, 128.70, 126.86, 124.51, 122.19, 118.87, 107.78,104.40, 40.76, 40.59, 40.38, 40.17, 39.96, 39.75, 39.54, 39.33, 39.20, 21.36。

实施例2

系列浓度梯度的甲醛荧光探针Na - FA - ER的紫外吸收实验检测

配置含有5% DMSO的PBS缓冲液作为检测母液，在调试好紫外吸收分光光谱仪后，分别加入不同浓度的甲醛探针溶液，定容至2mL，摇匀后进行紫外吸收检测（λ = 600 ~ 200nm），并建立了紫外吸收强度与不同浓度甲醛探针的曲线图（见图2）。由图2可以看出，随着甲醛探针浓度的增加，曲线在λ = 455 nm左右的吸收峰逐渐增加，且增长趋势比较均匀。

实施例3

内质网甲醛荧光探针Na - FA - ER对各种活性小分子的选择性实验

溶液准备：配置10 mL 浓度为40 mM醛酮类、各种常规离子、氨基酸、活性氧氮类物质的PBS缓冲溶液；配置5 mL浓度为1 mM该探针的DMSO溶液。

加入10 μL探针母液、90 μL DMSO并分别加入各类醛酮的PBS溶液使其最终浓度达到40 μM，分别加入各类常规离子和氨基酸的PBS缓冲溶液是最终浓度达到5 mM，分别加入各类活性氧类物质的PBS缓冲液使其最终浓度达到100 μM，用PBS缓冲液定容至2 mL，摇匀并用荧光分光光度计进行荧光强度检测(λ_ex = 445 nm, λ_em = 543 nm)，随后建立荧光强度与不同粒子(醛酮、氨基酸、常规阴离子和阳离子以及活性氧氮类)的曲线图，从所有谱线中选取λ = 543 nm处的荧光强度数据，并根据此数据做出该甲醛探针对不同离子(包括甲醛)的选择性条形图（见图3）。其中，激发波长为445 nm；探针的浓度：5 μM，测试离子以及氨基酸的浓度为5 mM，活性氧的浓度为100 μM，醛酮化合物的浓度为40 μM。加入的离子分别为：探针、乙二醛、甲基乙二醛、丙酮酸钠、对羟基苯甲醛、三氯乙醛、乙醛、对硝基苯甲醛、丙酮、次氯酸钠、过氧化氢、过氧化叔丁基、过氧化叔丁醇、N - 乙酰基甘氨酸、N - 乙酰基 -L - 半胱氨酸、一氧化氮、D - 高半胱氨酸、氯化镁、硫酸钠、亚硝酸钠、亚硫酸氢钠、硫氢化钠、L - 精氨酸、氯化钙、甲醛。

实施例4

不同浓度的甲醛对荧光探针Na - FA - ER的荧光滴定实验

溶液准备：配置100 mM甲醛的水溶液100 mL；配置1 mM的该甲醛探针DMSO溶液5 mL。

配制探针浓度为5 μM PBS缓冲溶液(5 % DMSO)，分别加入不同浓度的甲醛溶液(0- 500 μM)作用完全，然后进行荧光滴定检测(λ_ex = 445 nm, λ_em = 543 nm)，建立荧光滴定谱图(见图4)，经过检测发现，当甲醛浓度达到500 μM时，荧光强度达到饱和。

实施例5

内质网甲醛荧光探针Na - FA - ER与甲醛作用的动力学检测

将10 μL探针母液、90 μL DMSO加入到5 mL EP管中，然后向其分别加入不同体积的甲醛溶液，待用PBS缓冲溶液稀释后使甲醛浓度分别达到1 μM、2 μM、5 μM、10 μM、25 μM、50 μM、100 μM、250 μM、500 μM、750 μM。随后进行该探针的动力学检测(λ_ex = 445 nm, λ_em= 543 nm)，每分钟测试一次，一共检测30 min，待测试结束后，建立该探针的荧光强度与时间的动力学曲线(如图5)。随着检测体系中甲醛浓度的增加，饱和时间也随之减少，最快饱和时间大约为10 min。

实施例6

内质网甲醛荧光探针Na - FA - ER的外源性甲醛细胞成像测试

将密度为3 × 10⁵个/mL的HeLa细胞接种到成像35 mm培养皿中，在CO₂培养箱（温度为37 ℃，5 % CO₂）中培养，待细胞贴壁后，分成几组实验组进行培养：(1) 空白HeLa细胞组；(2) HeLa细胞外加40 μM甲醛孵育30 min；(3) HeLa细胞外加40 μM甲醛孵育30 min后再外加5 μM探针孵育30 min；待培养结束后，用PBS缓冲液冲洗细胞2 ~ 3次，用尼康荧光共聚焦显微镜分别拍摄这三组条件下培养的HeLa细胞的荧光照片，发现第 (3) 组的HeLa细胞发出强烈荧光。(结果见图6)。其中，激发波长：488 nm，发射波段：500 - 550 nm。其中：a )HeLa细胞的明场图； b ) HeLa细胞的荧光图；c ) 为a和b的叠加图； d ) HeLa细胞与甲醛共孵育的明场图； e ) HeLa细胞与甲醛共孵育的明场图；f ) 为d和e的叠加图；g ) HeLa细胞与探针和甲醛共孵育的明场图；h ) HeLa细胞与探针和甲醛共孵育的荧光图；i )为g和h的叠加图。标尺：20 μm。

实施例7

内质网甲醛荧光探针Na - FA - ER的内源性甲醛细胞成像测试

将密度为3 × 10⁵个/mL的HeLa细胞细胞接种到成像35 mm培养皿中，在CO₂培养箱（温度为37 ℃，5 % CO₂）中培养，待细胞贴壁后，分成几组实验组进行培养：(1) HeLa细胞外加100 μM亚硫酸氢钠孵育30 min；(2) HeLa细胞外加100 μM亚硫酸氢钠孵育30 min 后再外加5 μM探针孵育30 min； (3) HeLa细胞外加5 μM探针孵育30 min；待培养结束后，用PBS缓冲液冲洗细胞2 ~ 3次，用尼康荧光共聚焦显微镜分别拍摄这三组条件下培养的HeLa细胞的荧光照片，发现第 (3) 组的HeLa细胞细胞能够发出明显荧光信号。（结果见图7）。其中，激发波长：488 nm，发射波段：500 - 550 nm。其中：a ) HeLa细胞的明场图； b ) HeLa细胞的荧光图；c ) 为a和b的叠加图；d ) HeLa细胞与NaHSO₃共孵育的明场图； e ) HeLa细胞与NaHSO₃共孵育的荧光图； f ) 为d和e的叠加图；g ) HeLa细胞与探针共孵育的明场图；h) HeLa细胞与探针共孵育的荧光图；i )为g和h的叠加图；j ) HeLa细胞与探针和NaHSO₃共孵育的明场图；k ) HeLa细胞与探针和NaHSO₃共孵育的荧光图；l )为j和k的叠加图。标尺：20 μm。

实施例8

内质网甲醛荧光探针Na - FA - ER的共定位细胞成像测试

将密度为3 × 10⁵个/mL的癌细胞接种到成像35 mm培养皿中，在CO₂培养箱（温度为37℃，5 % CO₂）中培养，待细胞贴壁后，分成两组实验组进行培养：(1) 细胞与商品级内质网红色定位染料孵育15 min后再与5 μM探针孵育30 min；(2) 细胞与商品级内质网红色定位染料孵育15 min后，然后加入与40 μM甲醛孵育30 min，再与5 μM探针孵育30 min；待培养结束后，用PBS缓冲液冲洗细胞2 ~ 3次，用尼康荧光共聚焦显微镜分别拍摄这两组条件下培养的细胞的荧光照片，都可以发现该探针能够高度定位在细胞内质网上，并能够识别其中的甲醛。其中，第一组实验共定位系数为0.92，第二组实验共定位系数为0.95（结果见图8）。其中，激发波长：488 nm (绿色通道)和561 nm (红色通道)，发射波段：500 - 550 nm和625 – 675 nm。其中：通过细胞共定位成像实验测试我们可以看出探针具有良好的共定位效果。a )-d )为内源性性甲醛探针共定位实验成像图；e )-h )为外源性性甲醛探针共定位实验成像图。标尺：20 μm。

Claims

1.一种检测细胞内质网中甲醛的荧光探针，其特征在于，该荧光探针命名为4 -肼基-N - (2 -氨基乙基- 4 - 甲基苯磺酰胺基)萘酰亚胺，简称Na - FA - ER，其化学结构式如式 ()所示：

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2.一种根据权利要求1所述的检测细胞内质网中甲醛的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）在反应容器中，加入甲苯，乙二胺，对甲苯磺酰氯，加热回流合成化合物N - (2 -氨基乙基) - 4 - 甲基本磺酰胺；

2）在另一反应容器中，加入1, 8 - 4 - 溴萘二甲酸酐，乙醇，N - (2 - 氨基乙基) -4 - 甲基本磺酰胺，加热回流生成4 - 溴 - N - (2 – 氨基乙基 - 4 - 甲基苯磺酰胺基)萘酰亚胺；

3）再取另一反应容器，加入4 - 溴 - N - (2 - 氨基乙基 - 4 - 甲基苯磺酰胺基)萘酰亚胺，后加入乙醇，搅拌状态下加入水合肼，后加热回流生成化合物4 - 肼基 - N - (2- 氨基乙基 - 4 - 甲基苯磺酰胺基)萘酰亚胺，简称：Na - FA - ER。

3.权利要求1所述的荧光探针在检测细胞内质网中甲醛中的应用。