CN110028587B - 用于调节血糖和脂质的增效型双功能蛋白 - Google Patents

用于调节血糖和脂质的增效型双功能蛋白 Download PDF

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Abstract

本发明涉及调节血糖和脂质的增效型双功能蛋白，所述增效型双功能蛋白包含人GLP‑1类似物和人FGF21。本发明一方面提供了所述增效型双功能蛋白的制备方法，另一方面还提供了所述增效型双功能蛋白在制备治疗2型糖尿病、肥胖、血脂异常、脂肪肝病和/或代谢综合征药物中的用途。本发明提供的增效型双功能蛋白能够在体内协同地调节血糖和脂质水平，满足2型糖尿病患者降血糖、缓解肝脏脂肪变性、减重及改善循环脂质代谢紊乱的多重需求。

Description

用于调节血糖和脂质的增效型双功能蛋白
技术领域
本发明涉及GLP-1-FGF21增效型双功能蛋白及其药物组合物，还涉及所述增效型双功能蛋白在制备治疗2型糖尿病、肥胖、高脂血症、脂肪肝病和/或代谢综合征药物中的用途。
背景技术
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一种由哺乳动物肠道L细胞分泌的具有36个氨基酸的肠降血糖素，通过结合并激活GLP-1受体(GLP-1R)以依赖于葡萄糖的方式刺激胰岛β细胞分泌胰岛素，抑制胰岛α细胞释放胰高血糖素，发挥控制血糖的生物学效应，同时表现出抑制胃肠运动和控制食欲的生物学效应(Knudsen LB,J Med Chem,2004,4128-4134)。天然人GLP-1在体内易被二肽基肽酶IV(DDP-IV)灭活，使其半衰期短暂。毒蜥外泌肽(Exendin-4)从南非毒蜥唾液中提取而得，具有39个氨基酸，与人GLP-1氨基酸序列具有53％同源性，生物学活性类似，但Exendin-4氨基端第二位由Gly代替了人GLP-1中的Ala，使其一定程度上抵抗对DPP-IV的酶降解，从而延长体内循环半衰期。Exendin-4羧基端具有特殊的Trap-cage结构，使其与GLP-1受体结合亲和力显著高于人GLP-1(Neidigh JW等,Biochemistry,2001,40:13188–13200)，在等摩尔浓度下，Exendin-4表现出更强的促进胰岛β细胞释放胰岛素作用。上述两种稍有差异的血糖代谢调节物都已上市，最具代表性的分别是诺和诺德公司的利拉鲁肽和阿斯利康公司艾塞那肽，一天注射2-3次可有效控制2型糖尿病患者血糖水平。然而很高的注射频率导致了患者治疗成本大幅度上升，临床顺应性不高。为延长GLP-1及Exendin-4类似物的体内半衰期及生物利用度，目前已有将Fc片段或HSA融合技术应用于开发此类长效药物。目前已上市产品有礼来公司的杜拉鲁肽(Dulaglutide)和葛兰素史克公司的阿比鲁肽(Albiglutide)。临床表现最突出的是杜拉鲁肽，一种GLP-1 hIgG4 Fc融合蛋白——(Dulaglutide)，其平均半衰期长达90小时(中国专利CN1802386B)，临床适应症为2型糖尿病，推荐使用方法为每周皮下注射给药1次。临床研究表明杜拉鲁肽能有效控制糖尿病患者餐后血糖及糖化血红蛋白，并通过抑制食欲降低肥胖患者体重，但存在不同程度的胃肠道不良反应。流行病学调查显示大多数2型糖尿病患者伴有非酒精性脂肪肝病及脂质代谢紊乱症状(Radaelli MG等,J Endocrinol Invest,2017,s40618)。目前临床研究结果并不支持GLP-1或Exendin-4类似物具有独立于减重作用之外的治疗脂肪肝和高脂血症作用(Petit JM,Diabetes Metab,2017,43,2S28-2S33)，因此该类产品也不能完全满足2型糖尿病患者的全部治疗需求。
成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factors,FGFs)家族具有22个成员，7个亚家族，其中FGF19亚家族以内分泌方式发挥生理学活性，参与调控能量和胆酸内稳态、葡萄糖和脂质代谢，磷酸盐和维生素D内稳态(Moore DD等,Science,2007,316:1436-1438和Beenken等,Nature Reviews Drug Discover,2009,8:235)。FGF21是FGF19亚家族的成员之一，具有182个氨基酸，在体内，FGF21羧基端首先与辅助因子β-Klotho跨膜蛋白结合，氨基端再与FGFR结合，形成稳定的FGF21/β-Klotho/FGFR复合体，激活下游相关信号分子(YieJ等,FEBS Lett,2009,583(1):19-24和Micanovic R等,J Cell Physiol,2009,219(2):227-234)。FGF21生理学活性表现为不依赖于胰岛素的促进葡萄糖利用功能(Kharitonenkov A等,J Clin Invest,2005,115(6):1627-1635)、促胰岛素增敏(DuthchakPA等,Cell,2012,148,387-393)、抑制肝脏脂质新生、促进肝脏脂肪酸β氧化、降低血清甘油三酯水平(Xu J等,Diabetes,2009,58,250-259)；通过抑制肝脏SREBP-2合成，降低血清总胆固醇和低密度脂蛋白含量，从而缓解高胆固醇血症(Lin Z等,Circulation,2015,131,1861-1871)。
综上所述，FGF21对于代谢疾病如肥胖、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝及高脂血症表现出有益的代谢调节作用。同时，FGF21是FGF家族中目前发现的唯一没有促有丝***作用的细胞因子，大大降低其临床使用中可能的致癌性(Wu X等,Proc Natl Acad Sci USA,2010,170:14158-14163)。然而，由于其自身理化特性缺陷，天然FGF21很难被开发成治疗用生物制剂，主要原因包括：1、FGF21蛋白稳定性差，易被蛋白酶水解；2、FGF21构象不稳定，易发生聚集，增加了FGF21规模化生产中的难度；3、天然FGF21半衰期短，人FGF21在小鼠体内半衰期0.5-1小时，在食蟹猴体内半衰期2-3小时(Kharitonenkov A等,J Clin Invest,2005,115:1627-1635)。目前已有多种蛋白长效化技术被应用于延长重组FGF21的体内半衰期。例如，FGF21与PEG分子链接，增加分子量，降低肾小球滤过率，延长体内滞留时间(参见专利WO2005/091944,WO2006/050247,WO2008/121563和WO2012/066075)；FGF21与脂肪酸长链融合(能够结合血清白蛋白)(参见WO2010/084169和WO2012/010553)；或制备能与FGFR或FGFR/β-klotho复合物特异性结合的激动剂抗体模拟FGF21作用机制，来激活FGF/FGFR信号通路(参见WO2011/071783,WO2011/130417,WO2012/158704和WO2012/170438)；或通过与Fc片段融合也可改善FGF21半衰期(参见WO2004/110472,WO2005/113606,WO2009/149171,WO2010/042747,WO2010/129503,WO2010/129600,WO2013/049247,WO2013/188181和WO2016/114633)。目前尚无FGF21长效蛋白上市产品，但已有礼来公司的LY2405319、辉瑞公司的PF-05231023和百时施贵宝BMS986036三种长效FGF21蛋白处于临床试验阶段。其中LY2405319和PF-05231023对于2型糖尿病患者仅表现为减重，降低血清TG水平，对血糖控制并未表现出积极的治疗效果(Gaich G等,Cell Metab,2013,18:333-340和Dong JQ等,Br JClin Pharmacol,2015,80-1051-1063)。BMS986036在一项针对非酒精性脂肪肝的临床研究中表现出良好的治疗作用，但其并未对2型糖尿病患者开展血糖控制相关的试验研究。上述结果显示，单独使用FGF21长效蛋白尽管能够表现出减肥，治疗非酒精性脂肪肝及高脂血症等多方面药效学活性，但不能满足2型糖尿病患者治疗中最为关键的血糖控制要求。
最近有研究报道，联用GLP-1和FGF21在血糖控制方面具有协同效果。例如，CN102802657A公开了应用GLP-1和FGF21组合物能够协同地降低db/db小鼠血糖水平。但药物联用不仅增加患者的给药频率，降低患者对治疗的依从性，另一方面，也将大大增加治疗成本。另外，将GLP-1和FGF21融合制备的双功能蛋白也已有报道，为了解决FGF21体内易降解问题，研究者多在天然FGF21分子中引入相应突变，但这也必然会增加双功能蛋白潜在的免疫原性(WO2017/074123和CN104024273B)。另外，观察到的GLP-1的FGF21协同增效作用多体现在控制血糖方面，而对于其在其他代谢类疾病如肥胖、非酒精性脂肪肝及脂质代谢紊乱缺少与上市长效GLP-1类似物产品的治疗效果对比研究。上述研究的缺失可能包含以下方面的原因：(1)天然GLP-1或FGF21在体内都不稳定，两者中任何一个分子在体内不能保持结构上的完整和稳定，都不可能在功能上产生协同效应；(2)GLP-1和FGF21在融合成单一蛋白的过程中，需要最大程度维持各自的三维构象而不相互妨碍，才能实现功能上的协同，这在分子设计层面必须审慎对待；(3)GLP-1和FGF21的功能发挥都依赖于结合各自的受体，这几者在何种情况下达到动态平衡，需要大量体外和体内试验验证，目前已发表的专利或其他非专利文献均没有相关描述。
综上，本领域如果能开发一种稳定性增强的GLP-1-FGF21协同增效双功能蛋白药物，还能实现半衰期延长和免疫原性低的效果将能满足很多2型糖尿病患者需要解决的降血糖、缓解肝脏脂肪变性、减重及改善循环脂质代谢紊乱的多重需求。
发明内容
本发明旨在提供一种包含人GLP-1类似物和人FGF21在血糖和脂质调节方面具有协同增效的双功能蛋白、其制备方法及用途，同时解决天然GLP-1与FGF21结构不稳定、体内半衰期短等缺陷，保留GLP-1强力降血糖和FGF21在胰岛素增敏、减肥、脂肪肝和高胆固醇血症治疗上的生理学效应，并在一定程度上缓解GLP-1导致的胃肠道不良反应。
本发明一方面，提供了一种能够协同调节血糖和脂质的增效型双功能蛋白，所述增效型双功能蛋白自N端至C端依次含有人胰高血糖素样肽-1类似物(以下简写为GLP-1类似物)、连接肽1(以下简写为L1)、人成纤维细胞生长因子21(以下简写为FGF21)、连接肽2(以下简写为L2)和人免疫球蛋白Fc片段(以下简写为Fc片段)；其中，连接肽1仅由柔性肽组成；连接肽2由柔性肽和刚性肽组成，刚性肽又由至少1个刚性单元组成，且刚性单元包含人绒毛膜***β亚基羧基末端肽或其截短的序列。
其中，所述“GLP-1类似物”是指人GLP-1(如SEQ ID NO：1所示)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加获得的且能够保持GLP-1活性的其类拟物、融合肽及衍生物。例如，所述GLP-1类似物包括但不限于序列表中SEQ ID NO：2，3，4或5所示的氨基酸序列。本发明一优选实施例中，所述GLP-1类似物如SEQ ID NO：2所示，本发明另一实施例中，所述GLP-1类似物如SEQ ID NO：5所示。
其中，所述“连接肽1(L1)”是位于GLP-1类似物和FGF21之间的、起连接作用的短肽。所述连接肽1优选非免疫原性的，并且在GLP-1类似物和FGF21之间产生足够的距离，使相互之间的位阻效应降至最低，以不影响或严重影响GLP-1类似物和FGF21的正确折叠和空间构象。技术人员可按照本领域常规方法设计连接肽。较佳地，使用含有2个或更多个氨基酸构成的柔性肽，且选自下列几种氨基酸：Gly(G)、Ser(S)、Ala(A)和Thr(T)；更优选地，所述连接肽1包含G和S残基。连接肽的长度对双功能蛋白的活性非常重要，优选地由5-30个氨基酸组成。本发明一优选实施例中，所述连接肽1的氨基酸序列为GGGGGGGSGGGGSGGGGS。
其中，所述“FGF21”是包含去除了1-28位氨基酸前导肽的SEQ ID NO：6所示序列；或包含去除了1-28位氨基酸前导肽且具有G141S或L174P取代的SEQ ID NO：6所示的同等型序列。本发明的一优选实施例中，所述FGF21包含去除了1-28位氨基酸前导肽且具有L174P取代的SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
其中，所述“连接肽2(L2)”是位于FGF21和Fc片段之间的、起连接作用的短肽。所述连接肽由柔性肽和刚性肽组成，其中，所述柔性肽含有2个或更多个选自Gly(G)、Ser(S)、Ala(A)和Thr(T)的氨基酸残基组成。优选地，所述柔性肽包含G和S残基。对本发明而言，优选地，所述柔性肽氨基酸组成的结构通式为(GS)a(GGS)b(GGGS)c(GGGGS)d，其中a，b，c和d是大于或等于0的整数，且a+b+c+d≥1。
本发明的一些实施例中，所述L2包含的柔性肽选自如下序列：
(i)GGGGS；
(ii)GSGGGSGGGGSGGGGS；
(iii)GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；
(iv)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；
(v)GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS；
(vi)GGSGGSGGSGGS。
其中，组成连接肽2(L2)的所述刚性肽由一个或更多个刚性单元组成，且所述刚性单元选自由人绒毛膜***β亚基羧基末端第113至145位氨基酸所组成的全长或截短的序列(以下称CTP刚性单元)；具体地，所述CTP刚性单元包含SEQ ID NO：7或其截短的序列。
优选地，所述CTP刚性单元包含至少2个糖基化位点；例如，本发明的一优选实施例中，所述CTP刚性单元包含2个糖基化位点，示例性地，所述CTP刚性单元包含SEQ ID NO：7N端的10个氨基酸，即SSSS*KAPPPS*；或所述CTP刚性单元包含SEQ ID NO：7C端的14个氨基酸，即S*RLPGPS*DTPILPQ；又如，另一实施例中，所述CTP刚性单元包含3个糖基化位点，示例性地，所述CTP刚性单元包含SEQ ID NO：7N端的16个氨基酸，即SSSS*KAPPPS*LPSPS*R；再如，另一实施例中，所述CTP刚性单元包含4个糖基化位点，示例性地，所述CTP刚性单元含28、29、30、31、32或33个氨基酸并开始于人绒毛膜***β亚基的第113、114、115、116、117或118位，终止于第145位。具体地，所述CTP刚性单元包含SEQ ID NO：7N端的28个氨基酸，即SSSS*KAPPPS*LPSPS*RLPGPS*DTPILPQ。在本文中，*代表糖基化位点。每种可能性都代表本发明的独立实施方式。
示例性地，本发明所述L2包含的CTP刚性单元可优选地包含如下序列：
(i)CTP1：SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ；
(ii)CTP2：PRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ；
(iii)CTP3：SSSSKAPPPS；
(iv)CTP4：SRLPGPSDTPILPQ；
(v)CTP5：SSSSKAPPPSLPSPSR。
在另一些实施例中，本发明提供的CTP刚性单元与天然CTP氨基酸序列至少70％同源；在另一些实施例中，本发明提供的CTP刚性单元与天然CTP氨基酸序列至少80％同源；在另一些实施例中，本发明提供的CTP刚性单元与天然CTP氨基酸序列至少90％同源；在另一些实施例中，本发明提供的CTP刚性单元与天然CTP氨基酸序列至少95％同源。
本发明一些实施例中，L2包含2，3，4或5个上述CTP刚性单元。如本发明的一实施例中，所述增效型双功能蛋白的L2包含2个CTP3刚性单元：SSSSKAPPPSSSSSKAPPPS(CTP3-CTP3，或表示为(CTP3)2)。
其中，所述“Fc片段”选自人免疫球蛋白IgG、IgM、IgA及其变体的Fc片段；更优选自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4及其变体的Fc片段，其中，所述人IgG Fc变体(表示为vFc)包含位于野生型人IgG Fc中的至少一种氨基酸修饰，且Fc变体无裂解性，并显示出极小的Fc-介导的不良副作用(ADCC和CDC效应)和/或与FcRn受体的结合亲和力增强；最优选地，人IgG Fc变体选自下组：
(i)vFcγ1：含有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的人IgG1绞链区、CH2和CH3区域(如SEQ ID NO：8所示氨基酸序列)；
(ii)vFcγ2-1：含有Pro331Ser突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域(如SEQ IDNO：9所示氨基酸序列)；
(iii)vFcγ2-2：含有Thr250Gln和Met428Leu突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域(如SEQ ID NO：10所示氨基酸序列)；
(iv)vFcγ2-3：含有Pro331Ser、Thr250Gln和Met428Leu突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域(如SEQ ID NO：11所示氨基酸序列)。
(v)vFcγ4：含有Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4绞链区、CH2和CH3区域(如SEQ ID NO：12所示氨基酸序列)。
本发明所提供的Fc变体包含但不限于(i)～(v)中所述5种变体，还可以是IgG同种亚型间两类功能变体突变位点的组合或叠加，如上述(iv)中所述变体即是由(ii)和(iii)中的突变位点相叠加所获得的新的IgG2Fc的组合变体。
本发明所述增效型双功能蛋白中的Fc变体(vFc)，它含有人IgG如人IgG1、IgG2和IgG4的绞链区、CH2和CH3区域。这种CH2区域在228、234、235和331位(由EU计数***确定)含有氨基酸突变。据信这些氨基酸突变能降低Fc的效应子功能。人IgG2不结合FcγR，但显示出极弱的补体活性。具有Pro331Ser突变的Fcγ2变体应比天然Fcγ2的补体活性更低，而且依旧是FcγR非结合子。IgG4Fc在激活补体级联中有缺陷，且它与FcγR的结合亲和力比IgG1低约一个数量级。与天然Fcγ4相比，具有Ser228Pro和Leu235Ala突变的Fcγ4变体应表现出最小的效应子功能。具有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的Fcγ1也表现出比天然Fcγ1降低的效应子功能。这些Fc变体都比天然人IgG Fc更适于制备FGF21及其类似物双功能蛋白。而250和428位(由EU编号体系确定的位置)含有氨基酸突变，使得Fc区与新生儿受体FcRn的结合亲和力增加，从而进一步延长半衰期(Paul R等,J Biol Chem,2004,279:6213–6216)；上述两类功能的变体相互组合或叠加，获得新的组合变体，使其效应子功能降低的同时且延长了其半衰期。本发明所述Fc变体包含却不局限于上述几个位点的突变，也可引入其它位点的替换使得Fc具有降低的效应子功能和/或与FcRn受体的结合力增强，同时还不会致使Fc变体功能/活性降低或引起不良的构象变化，常见的突变位点可以参见Shields RL等,J Biol Chem,2001,276(9):6591-604。
本发明的一优选实施例中，所述增效型双功能蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示。本发明的另一优选实施例中，所述增效型双功能蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示。
本发明所述的增效型双功能蛋白是糖基化的；优选地，所述双功能蛋白是通过在哺乳动物细胞中表达而实现糖基化的；更优选地，所述双功能蛋白是通过在中国仓鼠卵巢细胞中表达而实现糖基化的。
根据本发明的另一个方面，提供一种编码上述增效型双功能蛋白的DNA。本发明的一优选实施例中，所述增效型双功能蛋白的DNA序列如SEQ ID NO：14所示。
根据本发明的再一个方面，提供一种载体。该载体包含上述DNA。
根据本发明的再一个方面，提供一种宿主细胞。该宿主细胞包含上述载体，或者转染了上述载体。
在本发明的具体实施方式中，宿主细胞是CHO的衍生细胞株DXB-11。
根据本发明的再一个方面，提供一种药物组合物。该药物组合物包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，以及有效量的上述增效型双功能蛋白。
根据本发明的另一方面提供了一种从哺乳动物细胞系(如CHO衍生的细胞系)制备或生产所述增效型双功能蛋白的方法，包含以下步骤：
(a)将编码上述增效型双功能蛋白的DNA引入哺乳动物细胞；
(b)筛选步骤(a)中在其生长培养基中每24小时期间内，表达超过20μg/106个细胞的高产量细胞株；
(c)培养步骤(b)筛选获得的细胞株；
(d)收获步骤(c)得到的发酵液，纯化增效型双功能蛋白。
优选地，所述步骤(a)中的哺乳动物细胞为CHO细胞；更优选为CHO衍生细胞系DXB-11。
根据本发明的再一个方面，提供所述增效型双功能蛋白在制备治疗与FGF21相关疾病和GLP-1相关疾病，以及其他代谢的、内分泌的和心血管疾病的药物中的用途，包括肥胖、1型和2型糖尿病、胰腺炎、血脂异常、非醇型脂肪肝病、非醇型脂肪性肝炎、胰岛素耐受、高胰岛素血症、葡萄糖不耐受、高血糖、代谢综合征、急性心肌梗塞、高血压、心血管病、动脉粥样硬化、外周动脉病、中风、心脏衰竭、冠心病、肾病、糖尿病并发症、神经病、胃轻瘫、与胰岛素受体的严重失活突变相关的病症；优选地，所述疾病包括肥胖、1型和2型糖尿病、血脂异常、非醇型脂肪肝病、非醇型脂肪性肝炎、代谢综合征。
与现有产品相比，本发明的所述增效型双功能蛋白具有众多的突出优势，下面以本发明优选的双功能蛋白FP4I-2来具体阐明：
1、延长体内半衰期，在体内维持更长时间的降血糖活性。C57BL/6小鼠上开展的糖耐量结果表明，单次给予FP4I-2后144h，仍然表现出良好的促进葡萄糖利用能力，明显优于已上市的GLP-1类似物利拉鲁肽和艾塞那肽及天然的FGF21。与GLP-1-Fc融合蛋白杜拉鲁肽相比，FP4I-2在2型糖尿病模型小鼠体内表现出的控制血糖作用也更为优异。
2、更好的生物安全性和耐受性。杜拉鲁肽首次给药后会诱发严重的胃肠道不良反应。在db/db小鼠中，首次给予FP4I-2的小鼠相对于给予杜拉鲁肽的小鼠24小时摄食量显著升高，表明增效型双功能蛋白FP4I-2可有效缓解胃肠道不良反应所诱发的食欲不振症状。
3、增效型双功能蛋白表现出良好的脂肪肝治疗作用。与杜拉鲁肽相比，FP4I-2能显著减少db/db小鼠肝脏质量，改善肝功能，且该方面的功能改善不依赖于GLP-1相关的摄食抑制，充分体现出FGF21的生理学活性。相对于天然FGF21，FP4I-2的体内功能半衰期显著延长，在动物模型中FP4I-2的给药频率为每周2次，将提高临床可行性。
4、FGF21的C末端序列对其活性至关重要，现有技术报道的双蛋白多采用FGF21N末端融合，自由的C末端更有利于保持其活性，但FGF21C-末端还含有蛋白酶水解位点，极易发生降解，暴露的C末端更易受蛋白酶攻击而降解，为了解决这个问题，现有技术都避免使用天然的FGF21，而是引入相应的突变以改善其稳定性，但这也必然会增加双蛋白潜在的免疫原性。而本发明构建的双功能蛋白，采用天然的FGF21，并且在其C末端连接了Fc片段。本发明提供的双功能蛋白不仅具有显著延长的体内循环半衰期，而且在血糖、脂质调节方面都具有协同效果，这说明我们构建的双功能蛋白较好地保持了两个活性分子的功能且具有极强的稳定性，这得益于FGF21与Fc变体间采用的新型连接肽，该连接肽由柔性肽和CTP刚性肽所组成，CTP刚性单元含有多个O-糖基侧链，能形成相对稳定的立体构象，可以有效地将FGF21与Fc隔离开，从而最大限度地降低Fc带来的位阻效应，使FGF21保持了较佳的生物学活性。另外，CTP刚性单元糖基侧链的保护作用可以掩盖FGF21酶解位点，降低它对蛋白酶的敏感性，达到稳定蛋白的目的。
5、对Fc进行突变，只保留Fc的长循环半衰期特性，降低或消除ADCC和CDC效应(例如，P331S)，从而增加了用药安全性。另外，与新生儿受体(FcRn)结合亲和力增强的Fc变体(例如，T250Q/M428L)可以进一步延长增效型双功能蛋白的半衰期。
发明详述
人GLP-1类似物
本文所用术语“人GLP-1类似物”是指人GLP-1(如SEQ ID NO：1所示)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加获得的能够保持人GLP-1活性的其类拟物、融合肽及衍生物。例如，所述人GLP-1类似物包括但不限于序列表中SEQ ID NO：2，3，4或5所示的氨基酸序列。
人FGF21
本文所用术语“人FGF21”是指野生型人FGF21多肽。
野生型FGF21蛋白的序列可获自UNIPROT数据库，登录号为Q9NSA1。前体蛋白由209个氨基酸组成，包括信号肽(氨基酸1-28)和成熟蛋白(氨基酸29-209)。
尤其从US2001012628A1可得知在成熟蛋白中具有Pro替代Leu(在本发明中如SEQID NO：13中第47-227位所示)的野生型FGF21同等型(isoform)或等位形式(allelicform)；另一种野生型FGF21同等型具有Ser替代Gly(本发明SEQ ID NO：6的第141位的Gly被Ser取代或替换)。
从WO2003/011213可得知具有较短信号肽(本发明中SEQ ID NO：6第23位Leu丢失)的另一种同等型(参见WO2003/011213公布中的SEQ ID NO：2，具有27个氨基酸残基的信号肽)。
本发明中，野生型FGF21包含SEQ ID NO：6及L174P或G141S取代同等型去除前导肽后所示成熟蛋白部分序列(氨基酸29-209)；另外，还包括这些序列之前添加了上述27或28个氨基酸信号肽的前体蛋白全长序列。
hCG-β羧基末端肽(CTP)
CTP是一段来自人绒毛膜***(hCG)的β-亚基羧基末端的短肽。四种与生殖相关的多肽类激素促卵泡激素(FSH)、***(LH)、促甲状腺素(TSH)和绒毛膜***(hCG)含有相同的α-亚基和各自特异的β-亚基。与其它三种激素相比，hCG体内半衰期明显延长，这主要来源于其β-亚基上特有的羧基末端肽(CTP)(Fares FA等,Proc NatlAcad Sci USA,1992,89:4304-4308)。天然的CTP含有37个氨基酸残基，具有4个O-糖基化位点，终端是唾液酸残基。带负电、高度唾液酸化的CTP能够抵抗肾脏对其的清除作用，从而延长蛋白在体内的半衰期。然而，本发明人创造性地将由至少一个CTP刚性单元组成的刚性肽与适当长度的柔性肽连接，共同作为连接肽2，用于连接FGF21与Fc片段。
本发明人发现，FGF21的N端和C端序列对其功能发挥极为关键，且FGF21空间构象复杂、脆弱，使它自身稳定性差，易降解且易聚合，再与融合配体连接，其位阻效应会对其正确折叠造成干扰，使其活性显著下降甚至丧失，或更易产生聚合体。通过在FGF21与Fc变体间增加CTP刚性单元，相当于增加了一段刚性连接肽。一方面，保证了N-端融合的FGF21不会影响Fc变体与FcRn的结合位点，从而影响半衰期；另外Fc的Protein A结合位点对于制备工艺中纯化步骤很重要，连接CTP刚性单元保证N-端融合的FGF21也不会“罩住”它与proteinA的结合位点。再一方面，CTP刚性单元的添加也使得约25KD大小的Fc片段不会干扰N-端融合的FGF21的正确折叠，造成其生物学活性/功能的下降或丧失。这可能解释为具有多个糖基侧链的CTP刚性多肽，相对于(GGGGS)n这类柔性连接肽的无规则卷曲，它可以形成稳定的立体构象，这种“阻隔”作用促使FGF21和Fc段独立折叠形成正确的三维构象而互不影响各自的生物活性。再一方面，CTP糖基侧链的保护作用可以降低连接肽对蛋白酶的敏感性，使增效型双功能蛋白不易在连接区被降解。此外，CTP来源于天然人hCG，不具有免疫原性，因而相对于非天然编码的氨基酸序列更适宜用作连接肽。
IgG Fc变体
非裂解性Fc变体
Fc元件来源于免疫球蛋白IgG的恒定区Fc片段，它在消灭病原体的免疫防御中起重要作用。Fc介导的IgG的效应子功能发挥通过两种机制：(1)与细胞表面Fc受体(FcγRs)结合，由吞噬作用或裂解作用或杀伤细胞通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)途径消化病原体，或(2)与第一补体成分C1的C1q结合，引发补体依赖性细胞毒性(CDC)途径，从而裂解病原体。在四种人IgG亚型中，IgG1和IgG3能有效结合FcγRs，IgG4与FcγRs的结合亲和力较低，而IgG2与FcγRs的结合低得难以测定，所以人IgG2几乎没有ADCC效应。此外，人IgG1和IgG3还能有效结合C1q而激活补体级联反应。人IgG2与C1q结合相对弱，而IgG4不与C1q结合(Jefferis R等,Immunol Rev,1998,163:59-76)，所以人IgG2 CDC效应也较弱。显然，没有一种天然IgG亚型是非常适合构建GLP-1-FGF21双功能蛋白的。为了得到不具效应子功能的非裂解性Fc，最有效方法是对Fc片段上补体、受体结合域突变改造，调节Fc与相关受体的结合亲和力，降低或消除ADCC和CDC效应，只保留Fc的长循环半衰期特性，而不产生细胞毒性。更多的非裂解性Fc变体所包含突变位点可以参见Shields RL等,J Biol Chem,2001,276(9):6591-604或中国发明专利CN 201280031137.2。
与新生儿受体(FcRn)结合亲和力增强的Fc变体
IgG的血浆半衰期取决于它与FcRn的结合，一般它们在pH6.0时结合，在pH7.4(血浆pH)时解离。通过对两者结合位点的研究，改造IgG上与FcRn结合的位点，使之在pH6.0时结合能力增加。已经证明对于结合FcRn重要的人Fcγ结构域的一些残基的突变可增加血清半衰期。已报道T250、M252、S254、T256、V308、E380、M428和N434中的突变可增加或降低FcRn结合亲和力(Roopenian等,Nat Rview Immunology,2007,7:715-725)。韩国专利号KR 10-1027427公开了具有增加的FcRn结合亲和力的曲妥珠单抗(赫赛汀，Genentech)变体，并且这些变体包含选自257C、257M、257L、257N、257Y、279Q、279Y、308F和308Y的一个或更多个氨基酸修饰。韩国专利公开号KR 2010-0099179提供了贝伐单抗(阿瓦斯汀，Genentech)变体并且这些变体包含N434S、M252Y/M428L、M252Y/N434S和M428L/N434S的氨基酸修饰，显示增加的体内半衰期。此外，Hinton等也发现T250Q和M428L 2个突变体分别使与FcRn的结合增加3和7倍。同时突变2个位点，则结合增加28倍。在恒河猴体内，M428L或T250QM/428L突变体显示血浆半衰期增加2倍(Paul R.Hinton等,J Immunol,2006,176:346-356)。更多的与新生儿受体(FcRn)结合亲和力增强的Fc变体所包含突变位点可以参见中国发明专利CN201280066663.2。此外，有研究对五种人源化抗体的Fc段进行T250Q/M428L突变不仅改善了Fc与FcRn的相互作用，且在随后的体内药代动力学试验中，发现以皮下注射方式给药，Fc突变抗体与野生型抗体相比药代动力学参数有所改善，如体内暴露量增加，清除率降低，皮下生物利用度提高(Datta-Mannan A等,MAbs.Taylor&Francis,2012,4(2):267-273)。
术语“FGF21-相关病症”、“GLP-1-相关病症”包括肥胖、1型和2型糖尿病、胰腺炎、血脂异常、非醇型脂肪肝病、非醇型脂肪性肝炎、胰岛素耐受、高胰岛素血症、葡萄糖不耐受、高血糖、代谢综合征、急性心肌梗塞、高血压、心血管病、动脉粥样硬化、外周动脉病、中风、心脏衰竭、冠心病、肾病、糖尿病并发症、神经病、胃轻瘫、与胰岛素受体的严重失活突变相关的病症。
“与胰岛素受体严重失活性突变相关的病症”描述了患有胰岛素受体(或其直接下游的可能蛋白)突变对象中的病况，所述突变导致严重的胰岛素耐受，但通常没有2型糖尿病中常见的肥胖。在许多方面，患有这些病况对象表现出1型糖尿病和2型糖尿病的综合症状。因而受累对象按严重程度递增基本分为若干类别，包括：A型糖尿病抗性、C型胰岛素抗性(AKA HAIR-AN综合征)、Rabson-Mendenhall综合征，Donohue氏综合征或矮怪病(Leprechaunism)。这些病症与非常高的内源性胰岛素水平相关，导致血糖水平升高。因而受累对象还存在多种与“胰岛素毒性”相关临床特征，包括雄激素过多、***(PCOS)、多毛症和黑棘皮病(皮肤褶皱过度生长和色素沉积)。
“糖尿病并发症”是由慢性高血糖引起的身体其它部位的功能障碍如糖尿病肾病、糖尿病神经病变、糖尿病足(足部溃疡和循环低下)和眼部病变(视网膜病)。糖尿病还增加心脏病以及骨和关节病症风险。糖尿病的其它长期并发症包括皮肤问题、消化问题、性功能障碍和牙齿与牙龈问题。
“代谢综合征”(metabolic syndrome,MS)是多种代谢成分异常聚集的病理状态，包括：(1)腹部肥胖或超重；(2)动脉粥样硬化血脂异常，如高甘油三酯(TG)血症及高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)低下；(3)高血压；(4)胰岛素抗性和/或葡萄糖耐量异常。有些标准中还包括微量白蛋白尿、高尿酸血症及促炎症状态(C-反应蛋白)增高及促血栓状态(纤维蛋白原增高和纤溶酶原抑制物-1)增高。
“血脂异常”是脂蛋白代谢病症，包括脂蛋白过度生产或缺陷。血脂异常可以表现为血液中总胆固醇、低密度脂蛋白(LDL)胆固醇和甘油三酯浓度升高，和高密度脂蛋白(HDL)胆固醇浓度减少。
“非醇型脂肪肝病(NAFLD)”是与醇消耗无关的肝病，其特征是肝细胞脂肪变性。
“非醇型脂肪性肝炎(NASH)”是与醇消耗无关的肝病，其特征是肝细胞脂肪变性，伴随小叶内炎症和纤维化。
“动脉粥样硬化”是血管病，其特征是在大型和中型动脉的内膜上不规则分布的脂类沉积物，导致动脉管腔变窄，并最终发展为纤维化和钙化。
附图说明
图1、显示了根据本发明实施例的在PCDNA3.1表达载体内SpeI/EcoRI片段的双功能蛋白FP4I-2的核苷酸序列及推导的氨基酸序列，由α1微球蛋白前导肽(1-19)、GLP-1类似物(20-47)、L1(48-65)、FGF21成熟蛋白(66-246)、L2(247-301)和IgG2Fc(302-524)构成。
图2a、GLP-1-FGF21双功能蛋白FP4I-2的还原SDS-PAGE电泳图。
图2b、GLP-1-FGF21双功能蛋白FP4I-2的SEC-HPLC图谱。
图3a、GLP-1-FGF21双功能蛋白FP4I-1和FP4I-2单次注射16h后糖耐量实验曲线(means±SEM，n＝8)。
图3b、GLP-1-FGF21双功能蛋白FP4I-1和FP4I-2单次注射16h后糖耐量实验iAUC(means±SEM，n＝8)；统计学差异标记注释：与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
图4a、GLP-1-FGF21双功能蛋白FP4I-1和FP4I-2单次注射96h后糖耐量实验曲线(means±SEM，n＝8)。
图4b、GLP-1-FGF21双功能蛋白FP4I-1和FP4I-2单次注射96h后糖耐量实验iAUC(means±SEM，n＝8)；统计学差异标记注释：与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
图5a、GLP-1-FGF21双功能蛋白FP4I-1和FP4I-2单次注射144h后糖耐量实验曲线(means±SEM，n＝8)。
图5b、GLP-1-FGF21双功能蛋白FP4I-1和FP4I-2单次注射144h后糖耐量实验iAUC(means±SEM，n＝8)；统计学差异标记注释：与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
图6a、Exendin4-FGF21双功能蛋白FP4I-3单次注射16h后糖耐量实验曲线(means±SEM，n＝8)。
图6b、Exendin4-FGF21双功能蛋白FP4I-3单次注射16h后糖耐量实验iAUC(means±SEM，n＝8)；统计学差异标记注释：与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与杜拉鲁肽组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。
图7a、Exendin4-FGF21双功能蛋白FP4I-3单次注射96h后糖耐量实验曲线(means±SEM，n＝8)。
图7b、Exendin4-FGF21双功能蛋白FP4I-3单次注射96h后糖耐量实验iAUC(means±SEM，n＝8)；统计学差异标记注释：与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与杜拉鲁肽组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。
图8a、Exendin4-FGF21双功能蛋白FP4I-3单次注射144h后糖耐量实验曲线(means±SEM，n＝8)。
图8b、Exendin4-FGF21双功能蛋白FP4I-3单次注射144h后糖耐量实验iAUC(means±SEM，n＝8)；统计学差异标记注释：与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与杜拉鲁肽组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。
图9、GLP-1-FGF21双功能蛋白FP4I-1和FP4I-2对db/db小鼠首次给药后24h摄食量的影响(means±SEM，n＝6)；统计学差异标记注释：与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与杜拉鲁肽组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。
图10、GLP-1-FGF21双功能蛋白FP4I-1和FP4I-2多次给药对db/db小鼠糖化血红蛋白值的影响(means±SEM，n＝6)；统计学差异标记注释：与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与杜拉鲁肽组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。
图11、GLP-1-FGF21双功能蛋白FP4I-1和FP4I-2多次给药对db/db小鼠累积摄食量的影响(means±SEM，n＝6)；统计学差异标记注释：与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与杜拉鲁肽组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。
图12、GLP-1-FGF21双功能蛋白FP4I-1和FP4I-2对高脂饲料诱导的肥胖小鼠体重的影响(means±SEM，n＝7)；统计学差异标记注释：与肥胖对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与杜拉鲁肽组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与FP4I-1组相比，&P＜0.05，&&P＜0.01。
图13、GLP-1-FGF21双功能蛋白FP4I-1和FP4I-2对高脂饲料诱导的肥胖小鼠肝质量的影响(means±SEM，n＝7)；统计学差异标记注释：与肥胖对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与杜拉鲁肽组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。
图14、GLP-1-FGF21双功能蛋白FP4I-1和FP4I-2对高脂饲料诱导的肥胖小鼠肝脏甘油三酯含量的影响(means±SEM，n＝7)；统计学差异标记注释：与肥胖对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与杜拉鲁肽组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。
图15、GLP-1-FGF21双功能蛋白FP4I-1和FP4I-2对高脂饲料诱导的肥胖小鼠血清甘油三酯含量的影响(means±SEM，n＝7)；统计学差异标记注释：与肥胖对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与杜拉鲁肽组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与FP4I-1组相比，&P＜0.05，&&P＜0.01。
图16、GLP-1-FGF21双功能蛋白FP4I-1和FP4I-2对高脂饲料诱导的肥胖小鼠血清总胆固醇含量的影响(means±SEM，n＝7)；统计学差异标记注释：与肥胖对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与杜拉鲁肽组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。
图17、GLP-1-FGF21双功能蛋白FP4I-1和FP4I-2对高脂饲料诱导的肥胖小鼠血清低密度脂蛋白含量的影响(means±SEM，n＝7)；统计学差异标记注释：与肥胖对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与杜拉鲁肽组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明增效型双功能蛋白通常由生物合成的方法制备。根据本发明所述的核苷酸序列，本技术领域人员可方便地用各种已知方法制得本发明的编码核酸。这些方法例如但不限于：PCR，DNA人工合成等，具体的方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。作为本发明的一种实施方式，可通过分段合成核苷酸序列再进行重叠延伸PCR的方法来构建本发明的编码核酸序列。
本发明还提供了一种表达载体，包含编码本发明的增效型双功能蛋白的序列以及与之操作性相连的表达调控序列。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。
表达载体可采用市售的例如但不限于：pcDNA3、pIRES、pDR和pUC18等可用于真核细胞***表达的载体。本领域技术人员可以根据宿主细胞来选择合适的表达载体。
根据已知空载表达载体的酶切图谱，本领域技术人员可按照常规方法通过限制性酶剪切与拼接，将本发明的增效型双功能蛋白的编码序列***合适的限制性位点，制得本发明的重组表达载体。
本发明还提供了表达本发明增效型双功能蛋白的宿主细胞，其中含有本发明的增效型双功能蛋白的编码序列。所述的宿主细胞优选的是真核细胞，例如但不限于CHO、COS细胞、293细胞和RSF细胞等。作为本发明的优选方式，所述的细胞是CHO细胞，其可良好地表达本发明的增效型双功能蛋白，可获得结合活性良好，稳定性良好的增效型双功能蛋白。
本发明还提供一种用重组DNA制备本发明增效型双功能蛋白的方法，其步骤包括：
1)提供编码增效型双功能蛋白的核酸序列；
2)将1)的核酸序列***到合适的表达载体，获得重组表达载体；
3)将2)的重组表达载体导入合适的宿主细胞；
4)在适合表达的条件下培养转化宿主细胞；
5)收集上清液，并纯化增效型双功能蛋白产物。
将所述编码序列导入宿主细胞可采用本领域的多种已知技术，例如但不限于：磷酸钙沉淀，原生质体融合，脂质体转染，电穿孔，微注射，反转录法，噬菌体转导法，碱金属离子法。
有关宿主细胞的培养和表达可参见Olander RM Dev Biol Stand,1996,86:338。可通过离心去除悬浮液中的细胞和残渣，收集清液。可通过琼脂糖凝胶电泳技术进行鉴定。
可将上述制备获得的增效型双功能蛋白纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上呈单一条带。例如，当重组蛋白为分泌表达时，可以采用商品化的超滤膜来分离所述蛋白，例如Millipore、Pellicon等公司产品，首先将表达上清浓缩。浓缩液可采用凝胶层析的方法进一步加以纯化，或采用离子交换层析的方法纯化。例如阴离子交换层析(DEAE等)或阳离子交换层析。凝胶基质可为琼脂糖、葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白纯化的基质。Q-或SP-基团是较为理想的离子交换基团。最后，还可用羟基磷灰石吸附层析，金属螯合层析，疏水相互作用层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)等方法对上述纯化产物进一步精制纯化。上述所有纯化步骤可利用不同的组合，最终使蛋白纯度达到基本均一。
可利用含有所述双功能蛋白的特异性抗体、受体或配体的亲和层析柱对表达的双功能蛋白进行纯化。根据所使用的亲和柱的特性，可利用常规的方法，如高盐缓冲液、改变pH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合性多肽。可选择地，所述的双功能蛋白的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，6-His或8-His等。这些标签可用于对双功能蛋白进行纯化。
实施例1、增效型双功能蛋白表达质粒的构建
编码α1微球蛋白前导肽、GLP-1类似物、L1、FGF21成熟蛋白、L2(包括柔性肽单元和刚性肽单元)和人IgG Fc变体的基因序列都是人工优化过的CHO细胞偏爱密码子，全长序列经化学合成方法获得。为了便于将目的片段***表达载体的特定位点，在所合成的片段5’和3’端各有一个限制性酶切位点，分别为SpeI和EcoRI。验证后的增效型双功能蛋白基因用SpeI和EcoRI酶切，然后***到经PCDNA3.1改造后的质粒PXY1A1相应酶切位点间，得到了融合基因表达质粒(图1示例性地列出了增效型双功能蛋白FP4I-2的核苷酸序列及翻译的氨基酸序列)。该质粒含巨细胞病毒早期启动子，它是哺乳动物细胞高水平表达外源基因所需的增强子。该质粒还含有选择性标记物，从而在细菌中可以具有卡那霉素抗性，而在哺乳动物细胞中可以具有G418抗性。另外，当宿主细胞是DHFR基因表达缺陷型时，PXY1A1表达载体含有小鼠的二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，从而在存在氨甲蝶呤(MTX)时能共扩增融合基因和DHFR基因(参见美国专利US 4,399,216)。
我们构建了多种包含GLP-1和FGF21的增效型双功能蛋白，本发明示例性地例举其中三种FP4I-1、FP4I-2和FP4I-3，它们的氨基酸组成如表1所示(L1和L2分别由下划线标注，Fc变体中突变氨基酸以方框标注)。
表1、各增效型双功能蛋白的氨基酸组成
Figure BDA0001544902560000191
Figure BDA0001544902560000201
实施例2、增效型双功能蛋白在转染细胞系中的表达
将重组表达载体质粒转染入哺乳动物宿主细胞系，以表达增效型双功能蛋白。为了稳定高水平的表达，优选的宿主细胞系是DHFR酶缺陷型CHO-细胞(参见美国专利US 4,818,679)，本实施例中宿主细胞选取CHO衍生细胞株DXB11。一种优选的转染方法是电穿孔，也可以使用其它方法，包括磷酸钙共沉降、脂转染。在电穿孔中，用设置为300V电场和1500μFd电容的Gene Pulser电穿孔仪(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)，在比色杯内的5×107个细胞中加入50μg高纯度的表达质粒。在转染两天后，将培养基改成含0.6mg/mL G418的生长培养基。用抗人IgG Fc的ELISA分析方法，筛选对选择用药具有抗性的转染子。也可用抗人FGF21或抗人GLP-1的ELISA进行增效型双功能蛋白表达量的定量。通过极限稀释96孔培养板，亚克隆产生高水平增效型双功能蛋白的孔。
为了实现增效型双功能蛋白较高水平的表达，宜用受MTX药物抑制的DHFR基因进行共扩增。在含有递增浓度MTX的生长培养基中，用DHFR基因共扩增转染的增效型双功能蛋白基因。极限稀释DHFR表达阳性的亚克隆，逐步加压并筛选出能在高达6μM MTX培养基中生长的转染子，测定其分泌率，筛选出高表达外源蛋白的细胞系。将分泌率超过约10(较佳地约20)μg/106(即百万)个细胞/24小时的细胞系使用无血清培养基的进行适应性悬浮培养，然后再用条件培养基纯化增效型双功能蛋白。
实施例3、增效型双功能蛋白的纯化与定性
本实施例中示例性地描述了FP4I-2纯化和定性方法。细胞培养上清经过高速低温离心、0.22μm除菌过滤等澄清处理，后续经过protein A亲和、阴离子交换和疏水三步层析进行纯化，具体方法如下：第一步捕获采用protein A亲和层析，平衡液为PBS缓冲液，洗脱液为pH 3.5的柠檬酸盐缓冲液，洗脱的目的蛋白接着用1M Tris溶液中和。中间纯化选择高分辨率阴离子交换填料Q Sepharose HP(GE公司)去除残留杂质蛋白。采用结合模式，用20mM Tris-HCl，0.2M NaCl，pH 7.5溶液淋洗，用20mM Tris-HCl，0.3M NaCl，pH 7.5溶液洗脱。精纯步骤选择Butyl Sepharose FF(GE公司)去除聚体，利用FP4I-2单体与聚体的疏水性不同，疏水弱的单体直接流穿，而疏水性强的聚体结合到介质上，选择疏水层析的流穿模式，平衡液为PBS缓冲液。
目的蛋白产物的定性分析结果见图2a和图2b。FP4I-2单链理论分子量约53KD，因含糖基化位点，在还原条件下，SDS-PAGE电泳显示FP4I-2单链分子实际大小约在70KD。FP4I-1和-3采用同样的方法获得目的蛋白。
实施例4、增效型双功能蛋白单次注射对C57BL/6小鼠葡萄糖利用率的影响
选取SPF级别、8周龄雄性C57BL/6J小鼠(购自北京华阜康生物科技股份有限公司)。饲养环境：温度22-25℃，相对湿度45-65％，照明时间12h/d。适应性饲养1周后，小鼠按体重随机分为对照组、杜拉鲁肽120nmol/kg组、FP4I-2120nmol/kg组和FP4I-1 120nmol/kg组(n＝7)。给药组小鼠皮下注射相应药物溶液，对照组小鼠皮下注射PBS缓冲液。注射后各组小鼠禁食16h，开展糖耐量实验。检测小鼠空腹血糖值，腹腔注射2g/kg葡萄糖溶液，检测注射葡萄糖15min、30min、60min、90min和120min后的血糖值，梯形法计算曲线下基线上增加面积(iAUC)。给药后96h和144h，各组小鼠继续开展糖耐量实验，方法同上。数据以均数±标准误(means±SEM)形式表示，采用SPSS18.0统计软件分析数据。正态分布，多组间均数差异采用单因素方差分析，方差齐性采用LSD检验，方差不齐采用Dunnet T3检验；非正态性分布采用非参数检验，P<0.05表示具有显著性统计学差异。
从图3a和图3b可知，以给予PBS缓冲液的对照组作为参照，给药后16h，FP4I-1和FP4I-2显著改善小鼠葡萄糖利用水平(P<0.01)。从图4a和图4b可知，给药后96h，FP4I-1和FP4I-2还能显著改善小鼠葡萄糖利用水平(P<0.01)。从图5a和图5b可知，给药后144h，FP4I-1和FP4I-2仍然表现出改善小鼠葡萄糖利用水平(P<0.05)。该实验结果说明在体内葡萄糖水平突发性升高情况下，本发明提供的GLP-1-FGF21双功能蛋白能够通过促进胰岛素释放和分泌，迅速调节体内葡萄糖恢复至正常生理水平，且具有长效性，可应用于治疗胰岛素绝对或相对不足导致的糖尿病及其并发症的治疗。给予FP4I-1和FP4I-2后同时禁食16h，小鼠并未出现低血糖的休克或死亡症状，表明该双功能蛋白不会导致类似于胰岛素引起的低血糖反应。
同时，按上述方法测定Exendin4-FGF21双功能蛋白FP4I-3葡萄糖利用活性。将C57BL/6小鼠按体重分为对照组、杜拉鲁肽组和FP4I-3组。各给药组皮下给予120nmol/kg药物溶液，对照组给予PBS缓冲液。于注射后16h、96h、144h进行糖耐量实验。如图6a和图6b所示，给药后16h，与对照组相比，FP4I-3显著改善小鼠葡萄糖利用水平(P<0.01)，但明显弱于杜拉鲁肽(P<0.01)。从图7a和图7b可知，给药后96h，FP4I-3显著改善小鼠葡萄糖利用水平(P<0.01)，但显著低于杜拉鲁肽组(P<0.01)。如图8a和图8b所示，给药后144h，FP4I-3改善小鼠葡萄糖利用能力消失(P＞0.05)。
从上述FP4I-3动物体内降糖表现可知Exendin-4并未预期地与FGF21形成协同效应，它对血糖的调节作用显著弱于长效GLP-1类似物——杜拉鲁肽，且功能半衰期也较杜拉鲁肽明显缩短。而本发明优选的GLP-1-FGF21型双功能蛋白FP4I-2和FP4I-1在体内具有较强稳定性，不易被降解失活，相对于Exendin4-FGF21型双功能蛋白FP4I-3其体内药效学活性维持时间更长。以上结果表明，双功能蛋白中的GLP-1类似物、FGF21以及Fc片段这三个功能部件的组合方式并不是随机的、任意的，其中GLP-1类似物的选择、连接肽的结构、以及融合的次序，甚至是糖基化的差异都会不同程度地影响到双功能蛋白的构象是否正确、稳定，从而最终决定其各活性分子间在功能上是否相互协同、以及半衰期能否被有效延长。
实施例5、增效型双功能蛋白对db/db小鼠血糖控制作用的实验研究
8周龄雄性db/db小鼠，购买于上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲养环境：温度22-25℃，相对湿度45-65％，照明时间12h/d。适应性单只每笼饲养1周后，按体重、血糖值和摄食量水平随机分为4组：对照组、杜拉鲁肽组、FP4I-1组、FP4I-2组(n＝7)。对照组皮下注射PBS缓冲液，其余各组皮下注射120nmol/kg相应的药物溶液，每周给药2次，共给药8次。记录各只小鼠每天的摄食量。末次给药周期后，各组小鼠禁食16小时，摘眼球取全血，取5μl全血用于糖化血红蛋白检测。数据以均数±标差
Figure BDA0001544902560000231
形式表示，采用SPSS 18.0统计软件分析数据。正态分布，多组间均数差异采用单因素方差分析，方差齐性采用LSD检验，方差不齐采用Dunnet T3检验；非正态性分布采用非参数检验，P<0.05表示具有显著性统计学差异。
如图9所示，与杜拉鲁肽组相比，首次给药后，FP4I-1组、FP4I-2组小鼠24小时内小鼠摄食量显著升高(P＜0.01)。结果表明GLP-1-FGF21增效型双功能蛋白可显著缓解长效GLP-1受体激动剂类药物首次给药后诱发的严重胃肠道不良反应症状。如图10所示，FP4I-1组、FP4I-2组、杜拉鲁肽均能显著降低db/db小鼠糖化血红蛋白值(P＜0.01)，且FP4I-1组和FP4I-2组小鼠糖化血红蛋白值显著低于杜拉鲁肽组(P＜0.05)。db/db小鼠是一种伴有严重的胰岛素耐受的自发性高血糖小鼠，本发明提供的GLP-1-FGF21增效型双功能蛋白在db/db小鼠的长期血糖控制方面表现出优于杜拉鲁肽的特性。根据实施例4数据，在促进胰岛素释放和分泌方面，GLP-1-FGF21增效型双功能蛋白并未显著优于杜拉鲁肽。天然FGF-21在糖钳实验中表现出良好的胰岛素增敏作用(Xu J等,Diabetes,2009,58:250-259)，而目前尚无直接证据表明杜拉鲁肽在体内具有胰岛素增敏作用。因此，综上所述，GLP-1-FGF21增效型双功能蛋白在血糖控制方面表现出的优越性应为GLP-1促进胰岛素分泌及释放和FGF21增强胰岛素敏感性协同作用的结果。如图11所示，在实验周期内，FP4I-1和FP4I-2组小鼠累积摄食量均显著高于杜拉鲁肽组小鼠(P＜0.05)，结果表明在排除摄食量干预因素的条件下，FP4I-1和FP4I-2组对2型糖尿病的血糖控制能力应更强于杜拉鲁肽。
实施例6、增效型双功能蛋白对高脂饮食诱导的肥胖小鼠减肥及脂肪肝、脂质代谢紊乱治疗作用的实验研究
8周龄C57BL/6小鼠，购买于上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲养环境：温度22-25℃，相对湿度45-65％，照明时间12h/d。适应性饲养1周后，取7只小鼠给予低脂饲料喂养(D12450B，Research diets)，其余小鼠给予高脂饲料喂养(D12451，Research diets)。40周后，将肥胖小鼠适应性饲养1周，单只每笼，之后按体重和周摄食量将肥胖小鼠随机分为：肥胖对照组、杜拉鲁肽组、肥胖饮食对照组、FP4I-1组和FP4I-2组(n＝7)。其中肥胖饮食对照组、FP4I-1组和FP4I-2组小鼠每日投食量与杜拉鲁肽组小鼠每日摄食量保持一致。肥胖对照组和肥胖饮食对照组皮下注射PBS缓冲溶液，各给药组皮下注射120nmol/kg相应的药物溶液，每6天给药1次，共计给药2次。记录实验开始前后各只小鼠体重。末次给药周期后，各组小鼠禁食16小时，眼眶取全血，2000×g离心15min，分离得血清。全自动生化分析仪检测血清脂质含量。分离肝脏组织，生理盐水洗净后滤纸吸干，称重。取相同部位约50mg肝脏组织，用Folch法检测肝脏组织中甘油三酯含量。结果以每mg肝脏组织中的甘油三酯含量表示。数据以均数±标准误(means±SEM)形式表示，采用SPSS18.0统计软件分析数据。正态分布，多组间均数差异采用单因素方差分析，方差齐性采用LSD检验，方差不齐采用Dunnet T3检验；非正态性分布采用非参数检验，P<0.05表示具有显著性统计学差异。
如图12～图17所示，对于高脂饲料诱导的肥胖小鼠，给予杜拉鲁肽治疗后，小鼠体重、肝质量、肝脏甘油三酯含量、血清甘油三酯、血清总胆固醇和血清低密度脂蛋白含量均显著降低(P＜0.01)。杜拉鲁肽会导致严重胃肠道不良反应并具有一定的神经中枢抑制食欲的作用，从而大幅度减少动物的摄食量。本实施例中，肥胖饮食对照组在每日给予与杜拉鲁肽组小鼠相同的摄食量后，上述指标同样显著降低，且与杜拉鲁肽组无显著性统计学差异(P＞0.05)。结果表明杜拉鲁肽的减重、缓解肝脏脂肪变性及调节脂质代谢紊乱的作用基本依赖于其对摄食的抑制作用，而不具备其它独立的治疗机制。FP4I-1组和FP4I-2组肥胖小鼠给予与杜拉鲁肽组小鼠相同的摄食量后，与杜拉鲁肽组相比，FP4I-2组肥胖小鼠的体重和血清甘油三酯水平显著降低(P＜0.01)，表明FP4I-2具有降低体内脂肪合成及促进脂肪代谢利用的功能，可应用于肥胖及肥胖引起的代谢综合征的治疗。
与杜拉鲁肽组相比，FP4I-2组小鼠肝脏质量和肝脏甘油三酯含量显著降低(P＜0.01或P＜0.05)，表明FP4I-2能有效地减少脂肪在肝脏组织的过度沉积，恢复肝脏功能，提示FP4I-2可应用于肝脏脂肪变性诱发的非酒精性脂肪肝，非酒精性脂肪肝炎，肝纤维化及肝硬化等多种肝脏疾病治疗。
与杜拉鲁肽组相比，FP4I-2组小鼠血清总胆固醇和血清低密度脂蛋白含量均明显减少(P＜0.01或P＜0.05)，提示FP4I-2可应用于高胆固醇血症及其诱发的高血压、冠心病、慢性心衰、脑梗塞和动脉粥样硬化等多种心脑血管疾病治疗。与杜拉鲁肽组相比，FP4I-1组小鼠小鼠体重、肝质量、肝脏甘油三酯含量、血清甘油三酯、血清总胆固醇和血清低密度脂蛋白均具有一定的下降趋势，但无统计学差异。
上述研究结果表明FP4I-1与FP4I-2可通过FGF21的生理学活性治疗肥胖、脂肪肝病及脂质代谢紊乱，不完全依赖于GLP-1类似物的摄食调节作用，且FP4I-2的治疗作用最为突出，明显优于杜拉鲁肽，可填补杜拉鲁肽临床治疗中的缺口。综上所述，FP4I-2的治疗靶点较杜拉鲁肽更为丰富，更符合临床多样化治疗的需求。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 安源生物科技（上海）有限公司
<120> 用于调节血糖和脂质的增效型双功能蛋白
<130> 2018.01
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> PRT
<213> 天然人GLP-1()
<400> 1
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30
<210> 2
<211> 28
<212> PRT
<213> GLP-1类似物1()
<400> 2
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys
20 25
<210> 3
<211> 31
<212> PRT
<213> GLP-1类似物2()
<400> 3
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
20 25 30
<210> 4
<211> 44
<212> PRT
<213> GLP-1类似物3()
<400> 4
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys
35 40
<210> 5
<211> 30
<212> PRT
<213> GLP-1类似物4()
<400> 5
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30
<210> 6
<211> 209
<212> PRT
<213> 天然FGF21()
<400> 6
Met Asp Ser Asp Glu Thr Gly Phe Glu His Ser Gly Leu Trp Val Ser
1 5 10 15
Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Gly Ala Cys Gln Ala His Pro Ile Pro
20 25 30
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr
35 40 45
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg
50 55 60
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu
65 70 75 80
Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val
85 90 95
Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
100 105 110
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
115 120 125
Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu
130 135 140
His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly
145 150 155 160
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu
165 170 175
Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
180 185 190
Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
195 200 205
Ser
<210> 7
<211> 33
<212> PRT
<213> hCG-β亚基 CTP(113-145)
<400> 7
Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro
20 25 30
Gln
<210> 8
<211> 227
<212> PRT
<213> vFcγ1氨基酸组成()
<400> 8
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Val Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 9
<211> 223
<212> PRT
<213> vFcγ2-1氨基酸组成()
<400> 9
Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val
1 5 10 15
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
20 25 30
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
35 40 45
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
50 55 60
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser
65 70 75 80
Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
85 90 95
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile
100 105 110
Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
115 120 125
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
130 135 140
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
145 150 155 160
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser
165 170 175
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
180 185 190
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
195 200 205
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 10
<211> 223
<212> PRT
<213> vFcγ2-2氨基酸组成()
<400> 10
Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val
1 5 10 15
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr
20 25 30
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
35 40 45
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
50 55 60
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser
65 70 75 80
Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
85 90 95
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
100 105 110
Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
115 120 125
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
130 135 140
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
145 150 155 160
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser
165 170 175
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
180 185 190
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu
195 200 205
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 11
<211> 223
<212> PRT
<213> vFcγ2-3氨基酸组成()
<400> 11
Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val
1 5 10 15
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr
20 25 30
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
35 40 45
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
50 55 60
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser
65 70 75 80
Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
85 90 95
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile
100 105 110
Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
115 120 125
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
130 135 140
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
145 150 155 160
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser
165 170 175
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
180 185 190
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu
195 200 205
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 12
<211> 229
<212> PRT
<213> vFcγ4氨基酸组成()
<400> 12
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 13
<211> 505
<212> PRT
<213> FP4I-2氨基酸组成()
<400> 13
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro
35 40 45
Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln
50 55 60
Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu
65 70 75 80
Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu
85 90 95
Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu
100 105 110
Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu
115 120 125
Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu
130 135 140
Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu
145 150 155 160
Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro
165 170 175
Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro
180 185 190
Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser
195 200 205
Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser
210 215 220
Tyr Ala Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser
245 250 255
Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro
260 265 270
Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Val Glu Cys Pro Pro Cys
275 280 285
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
290 295 300
Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
305 310 315 320
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
325 330 335
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
340 345 350
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His
355 360 365
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
370 375 380
Gly Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
385 390 395 400
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
405 410 415
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
420 425 430
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
435 440 445
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
450 455 460
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
465 470 475 480
Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
485 490 495
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
500 505
<210> 14
<211> 1380
<212> DNA
<213> FP4I-2核苷酸组成()
<400> 14
caccctattc ccgatagctc ccccctcctg cagttcggag gccaggtgag gcagcggtac 60
ctgtacaccg acgacgctca gcagaccgaa gctcacctgg agatcaggga ggatggaacc 120
gtcggcggag ctgctgacca gtcccccgag agcctgctgc agctgaaggc cctgaagccc 180
ggagtcatcc agatcctggg cgtgaagacc tcccggtttc tgtgtcagcg gcccgatgga 240
gccctgtacg gctccctgca ttttgacccc gaggcctgta gcttcaggga gctgctgctg 300
gaagacggct acaacgtgta ccagagcgaa gctcacggac tgcccctgca cctgcctggc 360
aacaaatccc ctcacaggga ccccgctccc aggggacctg ccaggttcct gcctctgccc 420
ggactgcctc ctgctcctcc cgaacctcct ggcatcctcg ctcctcagcc ccctgatgtc 480
ggcagcagcg accctctgtc catggtcggc cccagccaag gcaggagccc ttcctacgct 540
tccggatccg gtggcggtgg ctccggtgga ggcggaagcg gcggtggagg atcaggcggt 600
ggaggtagcg gcggaggcgg tagctccagc tctagtaaag ctccccctcc ttccctgccc 660
tcaccctcaa gactgcctgg accttccgac actcccatcc tgccacaggt ggagtgccct 720
ccatgtccag caccccctgt cgcaggtcca tctgtgttcc tgtttccacc caagcctaaa 780
gaccagctga tgatctcccg caccccagaa gtcacctgtg tggtcgtgga tgtgagccat 840
gaagaccccg aggtccagtt caattggtac gtggatggcg tcgaggtgca caacgctaag 900
acaaaaccta gagaagagca gttcaactct acctttcgcg tcgtgagtgt gctgacagtc 960
gtgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tataagtgca aagtgagcaa caaaggactg 1020
cctgcctcaa tcgaaaagac tatttccaag accaaaggac agccaagaga gccccaggtg 1080
tacaccctgc ctccaagccg cgaagagatg actaaaaatc aggtctctct gacctgtctg 1140
gtgaaggggt tttatcctag tgatatcgcc gtggaatggg agtcaaacgg tcagccagag 1200
aacaattaca agaccacacc ccctatgctg gacagcgatg ggtctttctt tctgtatagc 1260
aaactgacag tggacaagtc tcggtggcag cagggtaacg tcttctcttg cagtgtgctg 1320
cacgaagcac tgcacaatca ttacacccag aagtcactgt cactgagccc aggaaaatga 1380
<210> 15
<211> 500
<212> PRT
<213> FP4I-1氨基酸组成()
<400> 15
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro Ile
35 40 45
Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg
50 55 60
Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile
65 70 75 80
Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser
85 90 95
Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly
100 105 110
Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr
115 120 125
Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu
130 135 140
Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro
145 150 155 160
Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg
165 170 175
Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro Pro
180 185 190
Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser
195 200 205
Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr
210 215 220
Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Lys
245 250 255
Ala Pro Pro Pro Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Glu
260 265 270
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Ala
275 280 285
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
290 295 300
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
305 310 315 320
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
325 330 335
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
340 345 350
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
355 360 365
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
370 375 380
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
385 390 395 400
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
405 410 415
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
420 425 430
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
435 440 445
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
450 455 460
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
465 470 475 480
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
485 490 495
Ser Leu Gly Lys
500

Claims (12)

1.一种增效型双功能蛋白，其特征在于，所述增效型双功能蛋白的氨基酸序列如SEQID NO：13或15所示。
2.编码如权利要求1所述增效型双功能蛋白的DNA分子。
3.如权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子包含如SEQ ID NO：14所示的序列。
4.一种载体，其特征在于，包含如权利要求2或3所述的DNA分子。
5.一种宿主细胞，其特征在于，包含如权利要求4所述的载体，或者转染了权利要求2或3所述DNA分子的载体。
6.一种药物组合物，其特征在于，包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，以及有效剂量的如权利要求1所述的增效型双功能蛋白。
7.一种制备如权利要求1所述增效型双功能蛋白的方法，所述方法包括：
(a)将权利要求2或3所述编码增效型双功能蛋白的DNA序列引入哺乳动物细胞；
(b)筛选步骤(a)中在其生长培养基中每24小时期间内，表达超过20μg/106个细胞的高产细胞株；
(c)培养步骤(b)筛选到的细胞株，表达增效型双功能蛋白；
(d)收获步骤(c)中得到的发酵液，纯化增效型双功能蛋白。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)中的哺乳动物细胞为CHO细胞。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞为CHO衍生细胞系DXB-11。
10.如权利要求1所述的增效型双功能蛋白在制备用于治疗肥胖、1型或2型糖尿病、胰腺炎、血脂异常、非醇型脂肪肝病、胰岛素耐受、高胰岛素血症、葡萄糖不耐受、高血糖、代谢综合征、急性心肌梗塞、高血压、动脉粥样硬化、外周动脉病、中风、心脏衰竭、冠心病、肾病、糖尿病并发症、神经病、胃轻瘫或与胰岛素受体的严重失活突变相关的病症的药物中的用途。
11.如权利要求1所述的增效型双功能蛋白在制备用于治疗肥胖、1型或2型糖尿病、血脂异常、非醇型脂肪肝病或代谢综合征的药物中的用途。
12.如权利要求1所述的增效型双功能蛋白在制备用于治疗非醇型脂肪性肝炎或心血管病的药物中的用途。
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Denomination of invention: Synergistic bifunctional protein for regulating blood glucose and lipids

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