CN110004108A - 基于三维剪切空间的新型动物细胞培养放大方法 - Google Patents

基于三维剪切空间的新型动物细胞培养放大方法 Download PDF

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Abstract

本发明基于三维剪切空间的新型动物细胞培养放大方法，包括如下步骤：(1)首先通过CFD方法定量分析了不同规模反应器内的剪切环境，并通过激光粒子测速仪PIV方法进行了验证；(2)然后根据实验室细胞培养结果确定了剪切参数可用于表征反应器内的剪切环境，并将其作为放大标准；(3)进而根据不同规模反应器内Spodoptera frugiperdaSf9活细胞量与三个特征剪切的关联分析，建立了最优的三维剪切率操作空间；(4)根据建立的剪切率与叶端速度的关联式将剪切率操作空间转换为搅拌转速可操作空间，并在不同规模反应器上进行了实验验证，最终成功实现了细胞从实验规模到生产规模的放大。

Description

基于三维剪切空间的新型动物细胞培养放大方法
技术领域
本发明涉及一种动物细胞培养放大方法，尤其是剪切敏感型细胞放大方法。
背景技术
动物细胞在蛋白表达和修饰方面具有较强的优势，其悬浮培养是一种高效生产抗体、疫 苗和蛋白类药物的培养方式，其中基于昆虫细胞的表达平台如昆虫杆状病毒表达***(BEVS) 广泛应用于疫苗的生产。然而，动物细胞培养在生产放大过程中随着反应器规模和结构的变 化，反应器内的传质、混合和剪切等环境会发生较大的变化。为此，相关学者提出了很多放 大方法，包括理论分析法、半理论法、因次分析法和经验法。Tescione等在进行CHO细胞放 大研究的过程中发现采用不同的放大策略，如单位体积功率(P/V)，体积氧传质系数(kLa)和 氧传递速率(OTR)，最终细胞生长情况差异很大。在进行干细胞培养过程中，Borys等研究 了七种常用的放大策略(平均速度、平均剪切率、平均能量耗散率、雷诺数、叶端速度、功 率输入和最大剪切率)对过程的影响，结果发现不同方法计算得到的搅拌转速相差很大，细 胞生长和聚集状态也产生巨大差异。在放大过程中反应器内的流体力学特性(包括传质、混 合和剪切等)表现出强烈的结构和规模相关性，传统的基于单一参数相似的放大方法通常无 法实现反应器内关键流场特性的一致。大量研究表明，反应器内的流场特性或流体力学特性 是影响细胞生理代谢主要因素，维持关键流体力学参数的相似有望成为一种高效的生物过程 放大方法。
昆虫细胞对剪切非常敏感，尤其是转染病毒以后，因此通气和搅拌引起的剪切环境变化 通常是导致放大失败的主要原因。由于剪切难于定量描述，很多学者采用间接的剪切参数如 搅拌桨叶端速度、能量耗散率、单位体积功率输入(P/V)、能量耗散率/循环时间函数(EDCF)、 最大或平均剪切率等作为放大标准[14-17]。然而，大量研究表明反应器内的剪切环境具有高度 非均一性，对于搅拌式生物反应器而言，桨叶区域的剪切率通常比罐体区高几个数量级。因 此，单一的剪切参数很难表征反应器内的剪切环境。如何定量描述实验规模反应器内的剪切 环境并将其在大规模反应器中进行重现是实现生产放大的关键所在。
定量描述生物反应器内的剪切环境的方法包括理论分析法、实验法和数值模拟法。通过 理论分析，大量研究将反应器内的平均剪切率与搅拌转速、通气速率以及流变特性进行关联。 然而，理论分析法只适用于某些特定的标准状况(如特定的反应器结构和搅拌结构)，且只能 对平均或最大的剪切率进行评估。而通过基于粒子成像测速(PIV)或激光多普勒测速(LDV) 的实验方法可获取反应器内的流场信息，进而计算得到局部的剪切信息。Wu等通过理论分 析和LDV实验建立了反应器内的剪切率与搅拌桨流量准数的经验关联式。一些学者也建立了 定量化剪切率的实验装置并用于研究哺乳动物细胞和昆虫细胞对剪切的敏感性。此外，也有 学者提出采用间接的实验方法或参数(如比氧消耗速率)来表征剪切对细胞的损伤。然而，实 验研究方法仅适用于实验规模的反应器，而剪切率对反应器结构具有很强依赖性，实验室获 得的数据无法用于大规模反应器内剪切率的评估。近年来，计算流体力学方法(CFD)广泛 应用于反应器流场特性研究，与上述两种方法相比，其具有很强的扩展性和经济性。此外， CFD方法可以获取反应器三维空间内的剪切信息，有利于各项剪切参数的统计分析。Liu等 采用基于欧拉-拉格朗日的CFD方法分析了Carthamustinctorius L.细胞在反应器内经历的剪 切环境并成功模拟了细胞在复杂的剪切环境下的死亡和生长情况。Collignon等通过大涡CFD 模拟的方法建立了细胞的死亡与EDCF(描述细胞经历的剪切力大小和频率)的关联式。然 而，这些方法主要集中在研究剪切与细胞损伤之间的关系，而没有提出完善的剪切敏感型细 胞放大方法。
发明内容
本发明的目的是提出了一种基于剪切环境相似的动物细胞培养放大方法，以克服上述现 有技术的不足。本发明的具体技术方案是：
基于三维剪切空间的新型动物细胞培养放大方法，包括如下步骤：
(1)首先通过CFD方法定量分析了不同规模反应器内的剪切环境，并通过PIV方法进行了验证；
(2)然后根据实验室细胞培养结果确定了三个特征剪切参数可用于表征反应器内的 剪切环境，并将其作为放大标准；
(3)进而根据不同规模反应器内Spodoptera frugiperdaSf9活细胞量与三个特征剪切的 关联分析，建立了最优的三维剪切率操作空间；
(4)根据建立的剪切率与叶端速度的关联式将剪切率操作空间转换为搅拌转速可操 作空间，并在不同规模反应器上进行了实验验证，最终成功实现了Spodopterafrugiperda Sf9细胞从实验规模到生产规模的放大。
进一步的，所述反应器是7.5-1000L的反应器。
进一步的，所述的从实验规模到生产规模的放大是从7.5-42L到30-1000L的放大。
本发明有益效果是：昆虫杆状病毒表达***(BEVS)广泛应用于各种疫苗的生产，然而 昆虫细胞对剪切的高度敏感性常常阻碍其生产过程的放大。为此，本研究提出了一种基于三 维剪切空间的动物细胞培养放大方法。首先，本文通过计算流体力学方法(CFD)对实验规 模(7.5L和42L)和生产规模(30L，90L，350L和1000L)反应器内的剪切环境进行了定量 分析，并通过激光粒子测速仪(PIV)对结果进行了验证，进而建立反应器内的各项剪切参数 (包括桨区剪切率、罐区剪切率、平均剪切率和最大剪切率)与搅拌桨叶端速度的定量关系 式。通过实验获取的Spodoptera frugiperda Sf9细胞培养结果与罐内剪切参数的关联分析，发 现单一的剪切参数无法成功实现培养过程的生产放大，而采用三个特征剪切参数，即桨区剪 切率、罐区剪切率和平均剪切率可以在三个维度上建立剪切率的最优操作空间，当反应器内 的三个特征参数位于该空间内，则可实现细胞培养过程的放大。基于这一方法，根据得到的 剪切率与叶端速度的关联式，建立了生产规模反应器最优的搅拌转速操作空间，并在各级生 产规模反应器上进行了验证，最终在1000L反应器上成功实现放大，细胞生长速率和活细胞 量与小试实验一致(最终活细胞数约700×106cells/mL)。该放大策略有望应用于其他剪切敏 感型细胞的生产放大过程。
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
附图说明
图1是采用的六种反应器基本结构，其中7.5L和42L用于实验研究,30～1000L用于生产。
图2用于PIV实验的反应器结构，其中(A，三个不同高度处的圆点表示速度对比的取样点)、 速度云图对比结果(B，左半边为PIV结果，右半边为CFD模拟结果)和不同高度处局部速 度对比结果(C-E)。
图3.CFD模拟与经验公式计算得到的平均剪切率对比。
图4.模拟得到的不同反应器内剪切率(SSR)与搅拌桨叶端速度的关系，其中(A：象耳型 (EE)桨区剪切率，加入30L推进式桨叶(APP)作为对比；B：三斜叶型(PBT)桨区剪 切率；C：推进式桨叶(APP)桨区剪切率；D：罐体剪切率；E：整体平均剪切率；F：最大 剪切率)。
图5.最大剪切率的分布情况分析，其中(A：象耳型桨叶EE；B：推进式桨叶APP；C：组合 型桨叶APP+PBT)。
图6.不同操作条件下剪切参数与最终活细胞密度的关系。其中(蓝色圆点表示活细胞密度较 理想的操作条件，红色圆点表示活细胞密度较低的操作条件；水平虚线表示理想的活细胞密 度阈值；两条垂直虚线表示放大标准的边界)。
图7.建立的三维操作空间(黑色线框组成的立方体区域)和各实验操作点的分布(红色圆点 表示较差的操作条件，蓝色圆点表示较好的操作条件，绿色圆点表示生产放大使用的操作点； 圆点旁边的两组数字分别表示反应器规模和搅拌转速)。
图8.各规模反应器在不同搅拌转速下的细胞生长情况，其中(A：小型反应器；B：较大规模 反应器)。
图9.Spodoptera frugiperda Sf9细胞在低剪切环境，其中(A，1000L-30rpm)和适宜剪切环境 下(B，1000L-48rpm)的细胞形态(均为84h取样镜检结果)。
具体实施方式
1.基于三维剪切空间的新型动物细胞培养放大方法，包括如下步骤：
(1)首先通过CFD方法定量分析了不同规模反应器内的剪切环境，并通过PIV方法进行了 验证；
(2)然后根据实验室细胞培养结果确定了三个特征剪切参数可用于表征反应器内的剪切环 境，并将其作为放大标准；
(3)进而根据不同规模反应器内Spodoptera frugiperdaSf9活细胞量与三个特征剪切的关联分 析，建立了最优的三维剪切率操作空间；
(4)根据建立的剪切率与叶端速度的关联式将剪切率操作空间转换为搅拌转速可操作空间， 并在不同规模反应器上进行了实验验证，最终成功实现了Spodopterafrugiperda Sf9细胞从实 验规模到生产规模的放大。
2.材料和方法
2.1生物反应器结构
本发明用到六种规模(7.5-1000L)的搅拌式生物反应器，其基本结构见图1。两个实验 规模的反应器(7.5L和42L)均装有一个三叶“象耳型”搅拌桨(EE)，其中42L桨叶相对位置偏上。30L反应器装有一个三叶推进式搅拌桨(APP)。其他反应器采用相同的搅拌桨型式，均包含一个三叶推进式搅拌桨(APP)和一个三斜叶搅拌桨(PBT)，搅拌桨直径均不同。
2.2细胞培养方法
本发明用到的重组杆状病毒表达***为Spodoptera frugiperda Sf9，保存于无血清培养基 Sf900Ⅱ(Invitrogen，USA)。首先在摇瓶中进行预培养，培养温度为28℃，摇床转速60rpm， 培养至指数生长期后接入到实验规模7.5L发酵罐，然后进一步扩大到42L。在工业生产中， 摇瓶种子首先接入到30L发酵罐中，然后逐级扩大到1000L(30L-90L-350L-1000L)。各发酵 罐接种后的初始细胞密度均为80×106cells/mL。培养过程中搅拌转速恒定，通过四气控制系 统维持溶氧水平不低于40％。活细胞计数采用台盼蓝染色法进行，每个样品检测三次。
2.3 CFD模拟方法
在进行昆虫细胞培养过程中，Weidner等发现气泡尺寸并不是影响细胞损伤的关键因素， 细胞损伤主要与气液界面大小相关。由于本研究采用的通气量很低(<0.1vvm)，气含率和气 液界面均较小，此外通气引起的剪切率也很难定量分析，因此在进行CFD模拟的过程中将发 酵体系简化为单相流。由于Sf900Ⅱ培养基较稀，流变特性与水相近，因此模拟采用的介质 用水代替。反应器内的流场特性采用商业化的CFD软件ANSYS CFX 15.0(ANSYSInc.,USA) 进行分析。反应器网格采用ANSYS ICEM CFD 15.0(ANSYS Inc.,USA)进行划分，均为非结 构化的四面体网格，桨叶区域的网格进行局部加密，总网格数约100万。每种反应器模拟了 五种搅拌转速，对应的桨叶叶端速度范围为0.3-1.5m/s，最小的搅拌雷诺数为21000，即流动 达到完全湍流状态。湍流的模拟采用标准的k-ε模型对湍流方程进行封闭，桨叶的旋转采用 多重参考系(MRF)方法进行描述。采用时间平均的NS方程对动量和连续性方程进行描述。 本发明根据CFD模拟得到的速度分量Ux、Uy、和Uz对剪切率(SSR)进行计算，方程如下：
模拟过程中监测计算残差和桨叶的扭矩，当残差小于10-4且桨叶扭矩稳定则认为迭代过 程收敛。求解运算在5个节点组成的96核曙光服务器(Sugon Co.,Ltd.,China)上进行。
2.4 PIV实验方法
本发明流场验证采用的PIV实验平台与之前的报道相同，主要由激光发射器(Leamtech， Nd：YAG，200mJ，15Hz)、PIV相机(PCO2000，2048×2048pixels)、同步器以及Vidpiv 4.7 数据处理软件组成。此外，本研究加入了一个轴编码器对搅拌桨叶的角度进行锁定，从而获 取角度解析的PIV实验数据。PIV流场测定用的反应器为42L亚克力透明罐，装有两个象耳 型搅拌桨(EE)，基本结构见图2A。流场测定区域为两个挡板中间的垂直平面。由于搅拌轴 的遮挡和罐底的反光，测定区域仅包含半个罐体直筒区域。详细的实验放大和数据处理方法 可参见现有技术的文献。
3.结果与讨论
3.1 PIV实验对CFD模型的验证
本发明通过42L反应器内的PIV流场测定实验对CFD模型进行验证，实验采用的搅拌 转速为50rpm。对比分析PIV实验与CFD方法得到的速度云图可以看出，两种方法获取的流 场非常相近，反应器一侧整体形成一个较大的轴向循环(图2B)。为进一步对比分析反应器内局部速度，选择了反应器轴向三个不同高度处的局部平均速度进行对比分析(图2C-E)。 从结果可以看出，模拟得到的桨叶排出区峰值速度略高于实验值，其他位置的平均速度与实 验值非常相近。Singh等研究也表明k–ε湍流模型与其他模型(SST，SSG–RSM和SAS-SST) 相比可以更好的预测湍动能大小，但其预测得到的桨叶区域的速度会偏高。Liu等同样发现k–ε 湍流模型预测得到的桨叶区峰值速度会偏高。Wu等指出，即使采用高精度的大涡模拟方法， 模拟得到的桨区峰值速度也会偏高。通过统计分析发现，实验数据与模拟得到的数据无显著 性差异(Z＝0.29m、0.21m和0.11m处的p值分别为0.346、0.192和0.259，T-test)。由此可 见，本发明采用的CFD方法模拟得到的流场数据具有足够的精度，用速度场计算得到的剪切 率也是可信的。
3.2剪切环境的定量分析结果
本发明采用实验验证后的CFD方法对不同规模反应器内的流场情况进行了分析并得到 剪切相关信息。通过模拟不同搅拌转速下的剪切强度，可建立操作变量(如搅拌转速，叶端 速度等)与剪切参数之间的关联式。为进一步验证模拟的准确性，本发明将模拟得到的单层 搅拌桨条件下的平均剪切率与文献报道的经验公式计算得到的平均剪切率进行了对比分析， 计算方法如下：
其中为平均剪切率(s-1)，NQ为无量纲的轴向流量准数，可通过轴向流速计算得到[34]，N 为搅拌转速(s-1)。
模拟得到的7.5L和42L反应器象耳型搅拌桨(EE)的流量准数(NQ)为分别为0.4和0.5， 而30L反应器推进式桨叶(APP)的流量准数为0.3。由于7.5L反应器的搅拌桨叶面积相对 较小(主要因为叶片和轮毂的连接件相对较长)，因此其流量准数较42L反应器略小。Zhu等 报道的EE桨叶的流量准数较高(～0.7),，主要是因为其采用的搅拌桨结构(叶片角度，叶片的 轮毂的连接件长度)和罐体型式(是否有挡板)与本发明存在较大差异。从图3可以看出， 模拟得到的平均剪切率与经验公式计算得到的结果非常接近，且平均剪切率与搅拌转速呈较 好的线性关系，与文献报道也相同，说明模拟得到的剪切率比较可靠。本研究还发现，尽管 7.5L和42L反应器采用了非常相似的搅拌型式(仅安装位置存在较大差异)，但最终得到的 平均剪切率却相差较大，而采用传统的经验公式(将平均剪切率仅仅与搅拌转速进行关联) 计算得到的两种反应器的平均剪切率会相同。由此可见，平均剪切率不仅与桨叶型式有关， 反应器规模或桨叶安装位置对其均会产生影响。
本发明进一步将不同剪切参数与叶端速度进行了关联分析，包括搅拌区域的剪切率(用 impeller SSR或SSRimp表示)、罐体区剪切率(除去桨叶区域的部分，用tank SSR或SSRtank表示)、整体平均剪切率(所有区域的平均值，用average SSR或SSRavg表示)和最大剪切率 (用maximum SSR或SSRmax表示)，关联式如下：
SSRt＝KstUT (3)
其中KS,i为模型系数(m-1)，主要与搅拌桨和罐体结构相关，下标i表示imp、tank、avg和 max，UT搅拌桨叶端速度(m/s)。图4描述了不同规模反应器内的各项剪切参数与叶端速度 之间的关系。显然，当采用相同的搅拌桨或相同的搅拌桨组合时，在相同叶端速度条件下， 随着反应器规模的增大所有剪切参数均逐渐减小。而采用的搅拌桨不同时，剪切率变化情况 会有所不同。例如，30L反应器的Tank SSR和overall averaged SSR明显低于42L和90L反 应器(图4D和4E)。然而，不同规模反应器内的最大剪切率无明显的规律(图4F)，主要是 因为最大剪切对搅拌桨型式具有很强的依赖性。通过分析最大剪切率的分布情况(图5)可 以看出，占反应器总体积约0.01％的最大剪切率主要集中在桨叶边缘或桨叶附近的特殊狭小 结构处(如叶片与轮毂的连接轴，图5A)。大量研究表明，细胞经历高剪切区域的概率是比 较低的，且经历的时间短，最大剪切率并不是引起细胞损伤的最关键因素。
表1列出了方程3经过回归分析得到的模型参数KS,i的值，所有模型回归分析的相关系 数(R2)都接近0.99。本发明提出的模型可用于其他相似反应器内剪切相关参数的定量分析， 对于剪切敏感型细胞的放大研究提供了重要的参考数据。
表1.剪切相关参数的回归系数
3.2放大关键因素的分析
表2.不同操作条件下最高活细胞密度
对于Spodoptera frugiperda Sf9细胞，其进行工业化放大的理想活细胞密度(viable cell density)应大于600×106cells/mL。本发明首先在各种规模的反应器上研究了不同搅拌转速下 细胞的生长情况，最终活细胞密度结果见表2。通过小试规模的优化研究，确定了7.5L、30L 和42L反应器的最佳搅拌转速，然而对于90L到1000L的大规模反应器，采用常规的优化方 法逐步确定各级反应器的最佳搅拌转速是极不经济的。由于该细胞培养过程全程溶氧控制在40％以上，且昆虫细胞的代谢通常很慢(比氧消耗速率为1-10mmol/109cells/day，比葡萄糖 消耗速率为1-4mmol/109cells/day)[37]，因此氧传递和混合并不是影响Spodoptera frugiperda Sf9细胞放大的关键因素，放大成功的关键在于放大过程中剪切率的控制。
本发明通过CFD方法获取了各操作条件下反应器内与剪切相关的各项参数，包括桨区剪 切率(impeller SSR)、罐区剪切率(tank SSR)、整体平均剪切率(average SSR)、最大剪切 率(maximum SSR)、叶端速度(tip velocity)和单位体积功率(P/V)，并将其对最终的活细 胞密度进行作图(见图6)。通过分析可以看出，无论以何种剪切参数作为放大标准，活细胞 密度大于600×106cells/mL的操作条件下(图6区域Ⅰ中的蓝色圆点)建立的剪切可操作区域 (图6中两个垂直线区域)均包含活细胞密度较低的操作点(图6区域Ⅱ中的红色圆点)，特 别是采用最大剪切率、叶端速度和单位体积功率作为放大标准时，区域Ⅱ中包含的较差结果 更多，即单一的剪切参数不能作为放大标准。造成这一结果的主要原因是反应器内的剪切环 境是极不均匀的，单一的剪切参数并不能准确描述反应器内真实的剪切环境。
3.3三维剪切操作空间放大标准的提出
由于反应器内的剪切环境具有高度非均一性，传统的一维剪切参数很难准确描述反应器 内的剪切环境，用其作为放大标准也就无法成功实现细胞培养过程的放大。由此，本发明提 出采用反应器内的三个特征剪切参数(即桨区剪切率SSRimp，罐区剪切率SSRtank和整体平均 剪切率SSRavg)作为剪切敏感型细胞的放大标准，该标准有助于将小试的剪切环更加准确的复 制到大规模反应器中。在本发明研究的案例中，罐区的剪切率SSRtank与整体平均剪切率SSRavg接近，然而当采用相对尺寸较大的桨叶时，两者的差异会较大，因此为了扩大该方法的适用 性，本发明未采用二维的剪切操作空间，而是选取三维的剪切操作空间作为放大标准。该三 维操作空间的边界由活细胞密度大于600×106cells/mL的操作条件下得到的SSRimp、SSRtank和SSRavg的变化范围确定，为了增加该方法的冗余性，本发明将各个维度的边界在现有数据 的基础上扩大20％。图7为采用该方法建立的剪切率操作空间(黑色方框区域)，可以看出该 空间内包含所有活细胞量大于600×106cells/mL的操作条件，而将活细胞量较低的操作条件全 部排出在外。结合表2数据还可以看出，当操作点偏离该操作空间越远时，活细胞密度越低。
上述建立的剪切率三维操作空间对放大过程中的三个剪切参数进行了限制，通过前文提 出的剪切参数与搅拌桨叶端速度的关联式(方程3)可以将剪切率操作空间转化为搅拌转速 操作空间，即搅拌转速最佳范围。计算得到的各反应器最佳搅拌转速范围见表3，总体来看 随着反应器规模的增大，最佳搅拌转速逐渐降低。最佳搅拌转速与反应器规模并没有明显的 线性关系，由此可见采用传统的方法很难确定合适的搅拌转速。而采用本发明提出的三维参 数放大方法可较准确的预测大规模反应器较佳的搅拌转速，并将其可操作范围降低到10rpm 以内，对于放大过程具有很好的指导意义。
表3.通过剪切操作空间计算得到的搅拌转速可操作范围以及实验验证点
3.4新型放大方法的实验验证
根据三维放大策略计算得到的最优搅拌转速(表3)，在不同规模的反应器上进行了 Spodoptera frugiperda Sf9细胞的培养实验，培养过程中的活细胞密度见图8。从结果可以看 出不同剪切环境下细胞生长速率相差很大，细胞密度最高超过700×106cells/mL，而最低可少 于200×106cells/mL。本发明最终分别选取60rpm、55rpm和48rpm在90L、350L和1000 L反应器上对该放大方法进行了验证，而分别选取50rpm、40rpm和30rpm条件下的结果作 为对照。与对照相比，采用该放大策略得到的工业规模反应器(90L，350L和1000L)内细 胞生长速率和最终细胞浓度均显著提高，活细胞密度在110h均达到700×106cells/mL(图8B)， 与小试研究结果非常接近。对比分析1000L反应器在30rpm和48rpm条件下得到的细胞形态 图可以看出(图9)，在较低的转速条件下(即较低的剪切率)部分细胞聚集成团，而在48rpm 条件下细胞分散较均匀。结果表明，在过低的剪切环境下，细胞结团会阻碍营养物质的传质， 从而影响细胞的生长，最终导致活细胞密度较低。可以预见，若搅拌转速超过三维剪切空间 的上限则会对细胞造成损伤，镜检会发现细胞碎片，然而出于实验成本考虑，并未在1000L 反应器上做该破坏性实验。基于优化的三维剪切操作空间，本研究将小试获取的剪切环境信 息在生产规模进行了重现，并成功实现了Spodoptera frugiperda Sf9细胞的生产放大。
4.结论
为了解决剪切敏感型动物细胞的生产放大问题，本发明提出了一种基于三维剪切操作空 间的放大方法。首先通过计算流体力学方法对实验规模和生产规模反应器内的剪切环境进行 了定量研究，并通过PIV实验对结果进行了验证，进而建立了反应器内各项剪切参数与搅拌 桨叶端速度的定量关系式。文献计算得到的平均剪切率与模拟得到的结果非常接近，进一步 验证了模拟的准确性。通过细胞培养结果与反应器内各项剪切参数的关联分析，发现单一的 剪切参数均无法成功实现放大，而采用三个特征剪切参数SSRimp、SSRtank和SSRavg可较准确 的描述反应器内的剪切环境，并根据其建立一个三维的剪切率操作空间，该空间可将所有较 差的实验结果排除在外，而将所有较好的实验结果包含在内，以此三维剪切率操作空间作为 放大标准，可保证放大过程中三个特征剪切参数与小试一致。根据该放大标准以及剪切率与 搅拌转速的关联式计算得到生产规模反应器最佳的搅拌转速范围。最后在生产规模反应器上 进行了Spodoptera frugiperda Sf9细胞的放大实验，细胞生长速率和最终细胞密度均显著提高， 达到了小试实验水平(细胞密度约700×106cells/mL)，成功验证了这种放大方法的可行性。
总结，本发明提出了一种基于三维剪切操作空间的动物细胞放大方法(三个维度上的剪 切相似原理)，并成功应用到Spodoptera frugiperda Sf9细胞的生产放大(从7.5L实验规模到 1000L生产规模)。这种放大方法对于指导剪切敏感型细胞的生产放大具有重要意义，并可进 一步推广到类似的剪切敏感型细胞的生产放大过程中。

Claims (5)

1.基于三维剪切空间的新型动物细胞培养放大方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)首先通过CFD方法定量分析了不同规模反应器内的剪切环境，并通过激光粒子测速仪PIV方法进行了验证；
(2)然后根据实验室细胞培养结果确定了剪切参数可用于表征反应器内的剪切环境，并将其作为放大标准；
(3)进而根据不同规模反应器内Spodoptera frugiperdaSf9活细胞量与三个特征剪切的关联分析，建立了最优的三维剪切率操作空间；
(4)根据建立的剪切率与叶端速度的关联式将剪切率操作空间转换为搅拌转速可操作空间，并在不同规模反应器上进行了实验验证，最终成功实现了Spodoptera frugiperdaSf9细胞从实验规模到生产规模的放大。
2.根据权利要求1所述的基于三维剪切空间的新型动物细胞培养放大方法，其特征在于，所述剪切参数是桨区剪切率、罐区剪切率、平均剪切率和最大剪切率。
3.根据权利要求2所述的基于三维剪切空间的新型动物细胞培养放大方法，其特征在于，所述的放大标准是剪切参数与搅拌桨叶端速度的定量关系式。
4.根据权利要求2所述的基于三维剪切空间的新型动物细胞培养放大方法，其特征在于，采用剪切参数桨区剪切率、罐区剪切率和平均剪切率在三个维度上建立剪切率的最优操作空间，当反应器内的三个特征参数位于该空间内，实现细胞培养过程的放大。
5.根据权利要求2所述的基于三维剪切空间的新型动物细胞培养放大方法，其特征在于，根据得到的剪切率与叶端速度的关联式，建立生产规模反应器最优的搅拌转速操作空间，实现生产放大。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114880943A (zh) * 2022-05-24 2022-08-09 安及义实业（上海）有限公司 一种基于数据库的生物反应器设计方法及***

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1483804A (zh) * 2002-09-20 2004-03-24 华东理工大学 用于动物细胞消化接种的试剂盒及其应用
WO2012097079A3 (en) * 2011-01-11 2013-06-06 Xcellerex, Inc. Linearly scalable single use bioreactor system

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1483804A (zh) * 2002-09-20 2004-03-24 华东理工大学 用于动物细胞消化接种的试剂盒及其应用
WO2012097079A3 (en) * 2011-01-11 2013-06-06 Xcellerex, Inc. Linearly scalable single use bioreactor system
CN103391994A (zh) * 2011-01-11 2013-11-13 艾克塞勒雷克斯公司 可线性缩放规模的单次使用的生物反应器***

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
夏建业: "搅拌生物反应器流场模拟研究及其在发酵过程中优化与放大中的应用", 《华东理工大学博士论文》 *
夏建业等: "生物反应器流场特性研究及其在生物过程优化", 《生物产业技术》 *
王晗等: "细胞剪切耐受性检测装置的设计、模拟及验证", 《化学工程》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114880943A (zh) * 2022-05-24 2022-08-09 安及义实业（上海）有限公司 一种基于数据库的生物反应器设计方法及***
CN114880943B (zh) * 2022-05-24 2023-02-03 安及义实业（上海）有限公司 一种基于数据库的生物反应器设计方法及***

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