CN109999002A - 一种槲皮素纳米颗粒的制备方法及其在制备抗乳腺癌药物上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水溶性槲皮素纳米颗粒的制备方法及其在制备抗乳腺癌药物中的应用。这种纳米颗粒通过单步纳米沉淀法进行制备,是一种加载有槲皮素的PLGA/TPGS纳米颗粒,槲皮素与PLGA/TPGS之间是通过非共价作用结合的,这种纳米制剂具有水溶性好,载药量高,均匀和稳定的特征。另外,在乳腺癌的应用中具有良好的效果,这种纳米制剂比天然槲皮素更有效(大于十倍),通过这种纳米包裹大大提高了槲皮素对乳腺癌的药效,解决了单独的槲皮素在药物应用中水溶性差,容易被氧化而使体内功效丧失,并且所使用的剂量在生理学上是过高的等缺点,这将为治疗乳腺癌的药物开发提供新思路,具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及槲皮素,特别是涉及一种水溶性的槲皮素纳米颗粒的制备及其在制备抗乳腺癌上药物中的应用。
背景技术
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。近年来,其发病率呈现出显着的上升趋势。根据相关基因表达谱,乳腺癌可分为三种主要亚型。三阴性乳腺癌定义为乳腺癌细胞中缺乏三种受体,即***受体,孕激素受体和人表皮生长因子受体,三阴性乳腺癌约占所有乳腺癌的15~20%。不幸的是,三阴性乳腺癌具有高度异质性和极端攻击性,使其治疗成为一项艰巨的任务,导致死亡率高于其他两种类型。包括化疗,放射和手术切除等常规治疗,仅适用于早期和晚期三阴性乳腺癌肿瘤,因为尚未发现有效的三阴性乳腺癌分子靶标,甚至目前的标准化疗方案通常受到短期反应和耐药性的限制。由于新抗癌药物的发现是一个耗时且昂贵的过程,目前的研究不仅集中于抑制潜在的靶标,而且通过设计新的药物递送***来增强现有药物的抗癌潜力。
尿激酶型纤溶酶原激活物(尿激酶)是一种细胞外丝氨酸蛋白水解酶,血浆中的生理浓度约为2 ng / mL,半衰期为3~5分钟。尿激酶参与许多生理和病理过程,如伤口愈合,纤维蛋白降解,受精过程,炎症细胞迁移,血管外血肿消散,肿瘤细胞侵袭和转移。目前,尿激酶被作为乳腺癌的生物标志物之一,尿激酶激活细胞周围的纤溶酶原,降解肿瘤细胞的细胞外基质和基底膜,促进肿瘤细胞的侵袭和转移。并且,研究还表明,抑制尿激酶与其受体尿激酶受体之间的相互作用可以抑制肿瘤的侵袭和转移,这可能是抗癌药物开发的有效靶点。因此,尿激酶抑制剂的研究很好对癌症临床预后和抗癌转移的意义。
根据先前的研究,黄酮类和丝氨酸蛋白酶之间存在广泛的相互作用。其中,槲皮素与尿激酶结合,对尿激酶具有一定抑制作用(IC50 =7 μM)。槲皮素,也称为五羟黄酮(图1),是植物中衍生的类黄酮,存在于水果,蔬菜和谷物等植物中。黄酮类化合物具有广泛的生物活性,自古以来就被用于许多疾病和保健中作为中草药。然而,黄酮类化合物缺乏治疗特定疾病的特异性,单独使用黄酮类化合物的抗肿瘤作用通常是远非令人满意。因此,需要深入研究它们的结构和功能。在我们以前的工作中,我们已经测定了槲皮素与尿激酶结合的复合物晶体结构,并初步了解了槲皮素对水解酶抑制的分子机制。我们发现槲皮素以与传统尿激酶抑制剂(例如苯胍)不同的结合方式与尿激酶相互作用。槲皮素的主要药效基团是儿茶酚基团,其与尿激酶底物识别袋中的189位的天冬氨酸相互作用。然而,为了进一步阐明槲皮素对乳腺癌细胞的抗侵袭和迁移作用,且槲皮素还存在一些问题需要解决,例如水溶性差,氧化敏感性导致功效丧失,所用剂量在生理上无法获得等。因为PLGA具有生物降解性、持续释放功效以及包封生物活性分子的长期稳定性,PLGA与大多数其他类型的递送***相比显示出更加有利的性能。TPGS是另一种众所周知的生物相容性和两亲性聚合物,广泛用于纳米粒子表面涂层中以改善包封效率。因此,在本研究中,我们将槲皮素包裹在PLGA/ TPGS纳米颗粒(Qu-NPs)中,以获得具有高载药量的均匀且稳定的纳米颗粒。结果表明,槲皮素纳米粒大大提高了槲皮素对三阴性乳腺癌细胞增殖,迁移和侵袭的抑制作用。本研究将为三阴性乳腺癌治疗的药物开发提供新思路,并且提供了一种药效增强的槲皮素纳米粒的制备方法。
发明内容
槲皮素能够以微摩尔效力抑制乳腺癌生物标志物之一的尿激酶型纤溶酶原激活物(尿激酶),尿激酶受体尿激酶但是单独的槲皮素药效不强,专一性不高,而且还存在水溶性差,容易被氧化而使体内功效丧失,并且所使用的剂量在生理学上是过高的等缺点。
本发明的一个目的在于提供一种新型药效增强的纳米颗粒,其不仅结构稳定,并且还包括无毒性基本材料和非共价地结合制备。本发明的另一个目的在于提供一种采用有效的纳米包裹技术,制备新型药效增强的槲皮素纳米颗粒,与单独槲皮素相比,提高其对三阴性乳腺癌细胞增殖,迁移和侵袭的抑制作用。为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种包裹槲皮素抗癌药物的纳米制剂,以槲皮素为原料药,以聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA,维生素E聚乙二醇琥珀酸酯TPGS为载药辅料,组成成分包括:槲皮素 2~3.5 mg,聚乳酸-羟基乙酸共聚物 24~42 mg,维生素E聚乙二醇琥珀酸酯120~160 mg,乙醇溶液21~28mL,有机溶剂 2.5~4.5 mL和蒸馏水20~25 mL;其中,所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物中聚乳酸与羟基乙酸的质量百分数之比为75:25。
所述槲皮素、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和维生素E聚乙二醇琥珀酸酯的质量比为:槲皮素:聚乳酸-羟基乙酸共聚物:维生素E聚乙二醇琥珀酸酯=1:12:36。
所述有机溶剂包括丙酮、甲醇、DMSO、DMF中的一种。
所述乙醇溶液的浓度为2%-20% v/v。
一种包裹槲皮素抗癌药物的纳米制剂的制备方法,通过单步纳米沉淀法进行制备;具体包括如下步骤:
(1)将聚乳酸-羟基乙酸共聚物搅拌溶解在有机溶剂中,再加入槲皮素搅拌溶解;
(2)将维生素E聚乙二醇琥珀酸酯加入到乙醇溶液中,4-60℃水浴中搅拌加速溶解,得到溶液Ⅱ;
(3)取2 mL步骤(1)制备得到的溶液Ⅰ,向其中逐滴加入10 mL步骤(2)制备得到的溶液Ⅱ,搅拌30分钟后,再滴入8 mL超纯水继续搅拌30分钟,得到粗品;
(4)将步骤(3)粗品离心除去沉淀,离心去沉淀的条件为1000~10000 rpm离心1~60min,剩下的上清液通过不断补加蒸馏水离心,用10kDa截留率的过滤器过滤洗涤槲皮素纳米粒;然后通过动态光散射法测量纳米颗粒的粒径和ζ电位;
(5)将制备的槲皮素纳米颗粒溶液加入质量百分比浓度为2~10%的冻干保护剂冻干干燥,所述冻干保护剂包括甘露醇。
步骤(1)-(5)中搅拌速度均为500~1000 rpm。
进一步地,将制备得到的包裹槲皮素抗癌药物的纳米制剂应用于制备治疗乳腺癌的药物中。
本发明的有益效果在于:
(1)本发明的药效增强的抗乳腺癌纳米颗粒的特征在于:用无毒的PLGA/TPGS对槲皮素的非共价封装以及槲皮素自身对乳腺癌的药效显著提高,并且没有结构上的变化;
(2)PLGA/TPGS没有毒性,防止引入毒性物质对正常细胞有毒性作用;
(3)本发明通过无结构改变而保持槲皮素抗癌药物的性质,从而防止槲皮素对尿激酶的抑制作用降低;
(4)提升非共价键结合到纳米颗粒的槲皮素的主动抗肿瘤药效;
(5)由于本发明纳米制剂结构的稳定性,因此保持了被动抗肿瘤药效提升性质,从而提供了一种具有显著提高槲皮素抗肿瘤药效和药物递送的药效增强的抗乳腺癌纳米颗粒。
附图说明
图1示出的是由实施例1,3的方法制备的药效增强的抗乳腺癌纳米颗粒中槲皮素的化学结构式。
图2示出的是由实施例1的方法制备的药效增强的抗乳腺癌纳米颗粒中槲皮素纳米粒的粒径分布和ζ电位,并确定纳米粒子的均匀性和稳定性。(A)槲皮素纳米粒的粒径强度分布图。(B)槲皮素纳米粒的ζ电位分布。
图3示出的是由实施例2的方法制备的纯PLGA/TPGS纳米粒的粒径分布和ζ电位。(A)纯PLGA / TPGS纳米颗粒的粒径强度分布图。(B)纯PLGA / TPGS纳米颗粒的ζ电位分布图。
图4示出的是紫外分光光度法测定槲皮素纳米粒中槲皮素的含量。(A)确定槲皮素的最大吸收波长。最佳测量波长为370 nm。(B)绘制槲皮素的标准曲线。 线性回归方程y =0.04273x-0.01083,R2 = 0.9962。
图5示出的是单独槲皮素对一系列细胞的毒性作用的比较。(A)小鼠乳腺癌细胞(4T1),(B)人乳腺癌细胞(MCF-7),(C)人乳腺癌细胞(MDA-MB231),(D)人胚肺成纤维细胞(HELF)。
图6示出的是槲皮素和槲皮素纳米粒对一系列细胞的细胞毒性作用。(A)人乳腺癌细胞(MDA-MB231),(B)小鼠乳腺癌细胞(4T1),(C)人胚肺成纤维细胞(HELF)。
图7示出的是槲皮素和槲皮素纳米粒对乳腺癌细胞迁移的抑制作用。(A)小鼠乳腺癌细胞(4T1)和(B)人乳腺癌细胞(MDA-MB231)。
图8示出的是槲皮素和槲皮素纳米粒对乳腺癌细胞侵袭的抑制作用。(A)小鼠乳腺癌细胞(4T1)和人乳腺癌细胞(MDA-MB231)细胞分别在单独槲皮素和槲皮素纳米粒作用下的侵袭图像。(B)和(C)分别是侵入到下室的4T1和MDA-MB231细胞的定量图。
图9 示出的是槲皮素纳米粒对乳腺癌细胞的作用示意图。
具体实施方式
为更好地理解本发明,以下结合实施例对本发明做进一步说明,但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
实施例1
一种药效增强的抗乳腺癌纳米颗粒的制备方法,包括如下步骤:
(1)首先将聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)溶解在丙酮中得到浓度为9.6 mg/mL的PLGA溶液,然后加入槲皮素溶解,使溶液中槲皮素的终浓度为0.8 mg/mL,得到溶液Ⅰ;
(2)用体积分数4%乙醇的水溶液溶解维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS),制备浓度为5.76 mg/mL的TPGS溶液,并在37℃水浴中搅拌加速溶解,得到溶液Ⅱ;
(3)溶解完全后,取2 mL溶液Ⅰ,向其中逐滴加入10 mL溶液Ⅱ,搅拌30分钟后,滴入 8mL超纯水继续搅拌30min,得到粗品;
(4)接着用3000 rpm对该粗品离心15分钟,剩下的上清液通过使用离心过滤器(10KDa)洗涤槲皮素纳米粒以除去剩余的有机溶剂和未包封的游离药物。然后通过动态光散射(DLS)法测量纳米颗粒的粒径和ζ电位,将制备的槲皮素纳米颗粒溶液冻干干燥,得到水溶性的槲皮素纳米颗粒(槲皮素纳米粒)。
实施例2
不包裹槲皮素单纯PLGA/TPGS纳米粒的制备方法,包括如下步骤:
(1)首先将聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)溶解在丙酮中,使其浓度为9.6 mg/mL,得到溶液Ⅰ;
(2)用体积分数4%乙醇的水溶液溶解维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS),制备浓度为5.76 mg/mL的TPGS溶液,并在37℃水浴中搅拌加速溶解,得到溶液Ⅱ;
(3)溶解完全后,取2 mL溶液Ⅰ,向其中逐滴加入10 mL溶液Ⅱ,搅拌30分钟后,滴入 8mL超纯水继续搅拌30 min,得到粗品;
(4)接着用3000 rpm对该粗品离心15分钟,剩下的上清液通过使用离心过滤器(10KDa)洗涤槲皮素纳米粒以除去剩余的有机溶剂和未包封的游离药物。然后通过动态光散射(DLS)法测量纳米颗粒的粒径和ζ电位。
实施例3
一种药效增强的抗乳腺癌纳米颗粒的制备方法,包括如下步骤:
(1)首先将聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)溶解在丙酮中得到浓度为9.6 mg/mL的PLGA溶液,然后加入槲皮素溶解,使溶液中槲皮素的终浓度为0.8 mg/mL,得到溶液Ⅰ;
(2)用体积分数4%乙醇的水溶液溶解维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS),制备浓度为5.76 mg/mL的TPGS溶液,并在37℃水浴中搅拌加速溶解,得到溶液Ⅱ;
(3)溶解完全后,取2 mL溶液Ⅰ,向其中逐滴加入10 mL溶液Ⅱ,搅拌30分钟后,滴入 8mL超纯水继续搅拌30 min,得到粗品;
(4)42℃旋蒸来除去步骤(3)剩余的有机溶剂和未包封的游离药物。然后通过动态光散射(DLS)法测量纳米颗粒的粒径和ζ电位,将制备的槲皮素纳米颗粒溶液冻干干燥,得到水溶性的槲皮素纳米颗粒(槲皮素纳米粒)。
实施例4:粒径分布与ζ电位测量
实施例1中槲皮素纳米粒和实施例2中纯PLGA/TPGS纳米粒的粒径和ζ电位测试在25℃室温下进行,平行测定三次,槲皮素纳米粒的平均粒径约为195 d.nm,分散系数约为0.095,ζ电位约为-20 mV,结果见图2;纯PLGA/TPGS纳米粒的平均粒径约为173.6 d.nm,分散系数约为0.073,ζ电位约为-22.5 mV,结果见图3,相对于实施例2中的纯PLGA/TPGS纳米粒,实施例1中槲皮素纳米粒的平均粒径提高了31 d.nm左右,分散系数PDI均小于0.1,表现出良好的单分散性。基于上述包封率和载药量,我们得出结论,该纳米制剂是一种具有较高载药量的稳定纳米粒子。
实施例5:槲皮素纳米粒包封率与载药量的测定
分别用甲醇制备槲皮素标准品溶液和槲皮素供试品溶液,前者稀释10倍,后者稀释20倍后用酶标仪在200~800 nm范围内扫描,并以甲醇溶液为空白调零溶液,根据槲皮素供试品溶液与槲皮素标准品溶液的最大吸收波峰,确定测定槲皮素纳米粒溶液的最大吸收波长(370 nm),结果见图4A。用甲醇溶液配制不同浓度的标准槲皮素溶液,同样以甲醇溶液为调零溶液,在确定的最大吸收波长370 nm下,测定各自的吸光度,最后根据所得的数据绘制标准曲线,拟合线性回归方程,y = 0.04273×x-0.01083,R2 = 0.9962(图4B)。根据以下公式计算包封率(Entrapment Efficiency,EE)和载药量(Drug Loading,DL):
;
。
该纳米制剂的载药量计算为(3.2±0.3)%,包封率为(48.5±5.5)%。 结合上述的粒径和ζ电位,我们得出结论,该纳米制剂是一种具有较高载药量的稳定纳米粒子。
实施例6:细胞毒性实验
方案:将细胞接种到96孔板(10,000个细胞/孔)中,24小时后,根据浓度梯度分别用野生型槲皮素和槲皮素纳米粒处理乳腺癌细胞。48小时后,吸出96孔板中的培养基并用PBS洗涤。 然后向每个孔中加入100 μL MTT。4小时后,吸出96孔板中的MTT溶液,向各孔中加入100 μL DMSO溶液。在振荡器上孵育30分钟后,用酶标仪在490 nm处测量吸光度,结果见图5。
结果:为了确定槲皮素对乳腺癌细胞的抑制作用,我们首先用不同的乳腺癌细胞系进行细胞生长实验,包括人ER阳性MCF-7细胞,小鼠三阴性4T1细胞和人三阴性MDA-MB231细胞。并且人胚肺成纤维细胞(HELF)细胞也用作对照细胞系。用含有不同浓度的槲皮素的培养液培养细胞72小时,并在指定的时间点进行MTT测定。MTT测定结果显示,即使高浓度的槲皮素对这些细胞的毒性作用也比较弱,且特异性较低,这限制了槲皮素的实际应用(图5)。因此,我们研究了槲皮素纳米粒对上述细胞的细胞毒性作用。与单独的槲皮素相比发现槲皮素纳米粒对MDA-MB231和4T1的抑制作用得到极大改善(图6A和B),并且槲皮素纳米粒对正常细胞HELF的细胞毒性也没有显著增加(图6C),这不仅充分证明纳米制剂对槲皮素药效具有增强的影响,增加对三阴性乳腺癌细胞增殖的抑制作用,而且还表明槲皮素纳米粒对MDA-MB231的抑制作用优于4T1。
实施例7:细胞划痕愈合实验
方案:将细胞以5×105个细胞/孔的密度接种在12孔板中。在24小时后用白色移液管尖端刮擦汇合的单层细胞,并用PBS洗涤以除去漂浮的细胞。然后将细胞分别与不同浓度(0 μM,5 μM,10 μM,50 μM)的槲皮素和槲皮素纳米粒槲皮素纳米粒孵育,并在0,12和24小时捕获细胞迁移到划痕中的图像。结果见图7。
结果:除了不受控制的生长之外,恶性肿瘤还能够侵入周围的正常组织,然后通过淋巴或循环***扩散到全身。为了研究槲皮素和槲皮素纳米粒槲皮素纳米粒对细胞运动性的影响,用移液管尖端刮擦汇合的细胞层,并分别用不同浓度的槲皮素和槲皮素纳米粒处理指定的时间。如图7所示,与未处理组相比,槲皮素和槲皮素纳米粒均可显著抑制4T1和MDA-MB231细胞的迁移。比较槲皮素和槲皮素纳米粒在相同浓度和时间点的作用,结果表明,槲皮素纳米粒对4T1和MDA-MB231细胞的迁移抑制作用强于单独的槲皮素。此外,槲皮素和槲皮素纳米粒比4T1细胞更强烈地抑制MDA-MB231细胞的迁移的作用比4T1细胞更强。这些结果表明,槲皮素通过PLGA / TPGS纳米颗粒包封极大地增强了槲皮素对人三阴性乳腺癌细胞迁移的特异性和抑制作用。
实施例8:Transwell侵袭实验
方案:对于迁移实验,将5×104无血清培养基中的细胞置于具有8 μm孔细胞培养***物的Transwell可渗透支持物的上室中。对于侵袭测定,***物的上室用100 μL稀释50倍的BD基质胶包被,并使其在培养箱中固化。接下来,在基质胶上进行基底膜水合,并将无血清DMEM培养基中的5×104细胞加入上室,并分别用不同浓度的槲皮素和槲皮素纳米粒处理。将含有10%FBS的DMEM培养基加入到24孔板的下室中。将细胞在二氧化碳细胞培养箱(37℃,5% CO 2)中孵育24小时。然后,用棉签除去残留在膜上侧的细胞,将迁移或侵入的细胞在甲醇中固定20分钟,用结晶紫染色20分钟,在显微镜下拍照,结果见图8A。最后用33%醋酸将细胞上的结晶紫洗脱下来,通过使用酶标仪在570nm处测量洗脱溶液的OD值,结果见图8B&C。
结果:为了进一步研究槲皮素纳米粒是否比单独的槲皮素更有效地抑制三阴性乳腺癌细胞的侵袭,我们在4T1和MDA-MB231细胞中进行了transwell侵袭测定。如图8A所示,与未处理组相比,4T1和MDA-MB231细胞穿透基质胶并进入下室的细胞数随着槲皮素浓度的增加而逐渐降低。此外,值得注意的是,5 μM的槲皮素纳米粒治疗组中只有少数细胞侵入下室,而10 μM时几乎没有细胞侵袭。用33%乙酸溶液洗脱膜下侧面细胞上的结晶紫,在570nm处测量其吸光度并绘图。对于4T1细胞,与0 μM对照组相比,10μM单独的槲皮素处理使细胞侵袭率降低至80.96%,P值为1.9×10-5,而用10μM 槲皮素纳米粒处理可降低细胞侵袭率降低至23.67%,P值为5.4×10-8。此外,与相同浓度的单独槲皮素处理组相比,用10μM 槲皮素纳米粒处理的细胞的细胞侵袭率显著降低(P = 1.7×10-8)(图8B)。对于MDA-MB231细胞,与0 μM对照组相比,5 μM单独的槲皮素孵育使细胞侵袭率降低至77.1%,P值为8.5×10-7,而用5 μM 槲皮素纳米粒孵育使细胞侵袭率降低至39.98%,P值为9.6×10-9。类似地,与用相同浓度的单独的槲皮素孵育相比,用5μM 槲皮素纳米粒孵育的细胞的细胞侵袭率显着降低(P = 1.2×10-7)(图8C)。这些结果表明,槲皮素和槲皮素纳米粒均可降低这两种三阴性乳腺癌细胞的侵袭率。最令人振奋的是,槲皮素纳米粒对4T1和MDA-MB231细胞侵袭的抑制作用远强于单独的槲皮素。槲皮素纳米粒对乳腺癌细胞的作用示意图如图9所示。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (7)
1.一种包裹槲皮素抗癌药物的纳米制剂,其特征在于,以槲皮素为原料药,以聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA,维生素E聚乙二醇琥珀酸酯TPGS为载药辅料,组成成分包括:槲皮素2~3.5 mg,聚乳酸-羟基乙酸共聚物24~42 mg,维生素E聚乙二醇琥珀酸酯120~160 mg,乙醇溶液21~28 mL,有机溶剂 2.5~4.5 mL和蒸馏水20~25 mL;其中,所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物中聚乳酸与羟基乙酸的质量百分数之比为75:25。
2.根据权利要求1所述包裹槲皮素抗癌药物的纳米制剂,其特征在于,所述槲皮素、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和维生素E聚乙二醇琥珀酸酯的质量比为:槲皮素:聚乳酸-羟基乙酸共聚物:维生素E聚乙二醇琥珀酸酯=1:12:36。
3.根据权利要求1所述包裹槲皮素抗癌药物的纳米制剂,其特征在于,所述有机溶剂包括丙酮、甲醇、DMSO、DMF中的一种。
4.根据权利要求1所述包裹槲皮素抗癌药物的纳米制剂,其特征在于,所述乙醇溶液的浓度为2%-20% v/v。
5.一种如权利要求1所述包裹槲皮素抗癌药物的纳米制剂的制备方法,其特征在于通过单步纳米沉淀法进行制备;具体包括如下步骤:
(1)将聚乳酸-羟基乙酸共聚物搅拌溶解在有机溶剂中,再加入槲皮素搅拌溶解;
(2)将维生素E聚乙二醇琥珀酸酯加入到乙醇溶液中,4-60℃水浴中搅拌加速溶解,得到溶液Ⅱ;
(3)取2 mL步骤(1)制备得到的溶液Ⅰ,向其中逐滴加入10 mL步骤(2)制备得到的溶液Ⅱ,搅拌30分钟后,再滴入8 mL超纯水继续搅拌30分钟,得到粗品;
(4)将步骤(3)粗品离心除去沉淀,离心去沉淀的条件为1000~10000 rpm离心1~60min,剩下的上清液通过不断补加蒸馏水离心,用10 kDa截留率的过滤器过滤洗涤槲皮素纳米粒;然后通过动态光散射法测量纳米颗粒的粒径和ζ电位;
(5)将制备的槲皮素纳米颗粒溶液加入质量百分比浓度为2~10%的冻干保护剂冻干干燥,所述冻干保护剂包括甘露醇。
6.根据权利要求5所述的包裹槲皮素抗癌药物的纳米制剂的制备方法,其特征在于步骤(1)-(5)中搅拌速度均为500~1000 rpm。
7.一种如权利要求1所述包裹槲皮素抗癌药物的纳米制剂在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。
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