CN109996873A - 移植用细胞群及其制造方法 - Google Patents

移植用细胞群及其制造方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109996873A
CN109996873A CN201780071865.9A CN201780071865A CN109996873A CN 109996873 A CN109996873 A CN 109996873A CN 201780071865 A CN201780071865 A CN 201780071865A CN 109996873 A CN109996873 A CN 109996873A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
gene
transplanting
ala
base sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780071865.9A
Other languages
English (en)
Inventor
万代道子
高桥政代
山崎优
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Sumitomo Pharma Co Ltd
Original Assignee
Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd
RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd, RIKEN Institute of Physical and Chemical Research filed Critical Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd
Publication of CN109996873A publication Critical patent/CN109996873A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/062—Sensory transducers, e.g. photoreceptors; Sensory neurons, e.g. for hearing, taste, smell, pH, touch, temperature, pain
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
    • A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/70—Web, sheet or filament bases ; Films; Fibres of the matrix type containing drug
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0607—Non-embryonic pluripotent stem cells, e.g. MASC
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0621—Eye cells, e.g. cornea, iris pigmented cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Acoustics & Sound (AREA)

Abstract

本发明的目的在于提供适合于视网膜组织的移植的细胞群及其制造方法。本发明提供一种移植用细胞群及其制造方法，该移植用细胞群包含双极细胞调控基因进行了改造的视网膜系细胞。

Description

移植用细胞群及其制造方法
技术领域
本发明涉及移植用细胞群及其制造方法。
背景技术
近年来，有在小鼠生物体的正常视网膜中移植适当分化阶段的视细胞祖细胞时可功能性成活的报道(非专利文献1)，显示出对视网膜色素变性等视细胞的变性疾病进行移植治疗的可能性。
已报道了很多由多能干细胞通过自组装培养向立体视网膜组织的分化诱导方法，能够制造具有层结构的立体视网膜组织并进行移植。例如，报道了由多能干细胞得到多层的视网膜组织的方法(非专利文献2和专利文献1)；在包含Wnt信号转导通路抑制剂的无血清培养基中形成均匀的多能干细胞的聚集体，将所得到的聚集体在基底膜制品的存在下进行悬浮培养后，在血清培养基中进行悬浮培养，由此得到多层的视网膜组织的方法(非专利文献3和专利文献2)；以及将多能干细胞的聚集体在包含BMP信号转导通路激动剂的培养基中进行悬浮培养，由此得到视网膜组织的方法(非专利文献4和专利文献3)等。此外，将由多能干细胞分化诱导的视网膜组织移植于对象时，一方面有之后移植片成活并分化成熟的报道，另一方面也有移植片的功能性成活不充分的报道(非专利文献5)。
另一方面，报道了若干种参与生物体中的视网膜组织中所含的视网膜系细胞的产生或分化的基因。
例如有下述报道：ISL1(胰岛素基因增强子结合蛋白；Insulin gene enhancerprotein 1，Islet-1)基因在胰、心脏、神经等中表达，在视网膜特异性的ISL1基因缺失小鼠中，在生物体内杆状双极细胞、锥体双极细胞、无长突细胞、神经节细胞发生变性死亡(非专利文献6)。
另外有下述报道：BHLHE23(碱性螺旋-环-螺旋家族成员23；basic helix-loop-helix family，member e23)基因在胰、脑、视网膜等中表达，在BHLHE23基因缺失小鼠中，在生物体内杆状双极细胞发生变性死亡(非专利文献7)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2011/055855号
专利文献2：国际公开第2013/077425号
专利文献3：国际公开第2015/025967号
非专利文献
非专利文献1：Nature,444,203-207,(2006)
非专利文献2：Nature,472,51-56,(2011)
非专利文献3：Cell Stem Cell,10(6),771-785,(2012)
非专利文献4：Nature Communications,6,6286,(2015)
非专利文献5：Stem Cell Reports,2,662-674,(2014)
非专利文献6：J Neurosci,27(46),12707-20,(2007)
非专利文献7：Neuron,43(6),779-93,(2004)
发明内容
发明所要解决的问题
本发明所要解决的问题在于提供适合于视网膜组织的移植的移植用细胞群及其制造方法。
用于解决课题的方法
本发明人发现，通过减少移植片的视网膜组织中的双极细胞，可改善视网膜组织移植后的功能性成活。即，本发明人为了解决上述问题进行了反复研究，结果发现，与具有野生型基因组的视网膜系细胞相比，后述的具有双极细胞调控基因进行了改造的基因组的视网膜系细胞虽然无法充分地分化成熟为双极细胞，但能够没有问题地分化成熟为视细胞；通过将包含上述视网膜系细胞的移植用细胞群(视网膜组织等)用于移植，移植片来源的视细胞与宿主侧的双极细胞的接触比例提高，能够改善该视网膜组织移植后的功能性成活，从而完成了本发明。
即，本发明涉及下述发明。
[1]一种移植用细胞群，其包含双极细胞调控基因进行了改造的视网膜系细胞。
[2]如上述[1]所述的移植用细胞群，其为细胞悬浮液或细胞聚集体的形态。
[3]如上述[1]或[2]所述的移植用细胞群，其中，上述双极细胞调控基因为编码转录调控因子的基因。
[4]如上述[3]所述的移植用细胞群，其中，上述双极细胞调控基因为选自由ISL1基因和BHLHE23基因组成的组中的一个或多个基因。
[5]如上述[4]所述的移植用细胞群，其中，上述ISL1基因具有下述(1)或(2)所表示的碱基序列：
(1)序列号1、4或7所表示的碱基序列；
(2)具有在序列号1、4或7所表示的碱基序列中一个或多个碱基发生缺失、添加、***或置换而得到的碱基序列、并且编码相对于序列号3、6或9所表示的氨基酸序列具有80％以上的序列一致性的蛋白质的碱基序列，该碱基序列编码符合下述(a)～(c)中至少一个条件的蛋白质：
(a)具有DNA结合能力、
(b)具有对基因的转录进行调控的功能、
(c)能够被特异性地识别由序列号3、6或9所表示的氨基酸序列构成的蛋白质的抗体所识别。
[6]如上述[4]或[5]所述的移植用细胞群，其中，上述BHLHE23基因具有下述(1)或(2)所表示的碱基序列：
(1)序列号10或13所表示的碱基序列；
(2)具有在序列号10或13所表示的碱基序列中一个或多个碱基发生缺失、添加、***或置换而得到的碱基序列、并且编码相对于序列号12或15所表示的氨基酸序列具有80％以上的序列一致性的蛋白质的碱基序列，该碱基序列编码符合下述(a)～(c)中至少一个条件的蛋白质：
(a)具有DNA结合能力、
(b)具有对基因的转录进行调控的功能、
(c)能够被特异性地识别由序列号12或15所表示的氨基酸序列构成的蛋白质的抗体所识别。
[7]如上述[1]～[6]中任一项所述的移植用细胞群，其中，上述双极细胞调控基因的改造包括该基因的缺失。
[8]如上述[1]～[7]中任一项所述的移植用细胞群，其中，上述视网膜系细胞来源于多能干细胞。
[9]如上述[8]所述的移植用细胞群，其中，上述多能干细胞为诱导性多能干细胞或胚胎干细胞。
[10]如上述[1]～[9]中任一项所述的移植用细胞群，其中，上述视网膜系细胞包含选自由视网膜祖细胞、视细胞祖细胞和视细胞组成的组中的一种或多种细胞。
[11]如上述[10]所述的移植用细胞群，其中，上述视网膜系细胞包含选自Chx10阳性细胞、Crx阳性细胞和恢复蛋白阳性细胞中的一种或多种细胞。
[12]如上述[10]或[11]所述的移植用细胞群，其中，在上述移植用细胞群中，视网膜祖细胞、视细胞祖细胞和视细胞的细胞数的合计为总细胞数的10％以上。
[13]如上述[10]～[12]中任一项所述的移植用细胞群，其中，上述视细胞、或者移植后由上述视网膜祖细胞或上述视细胞祖细胞诱导的视细胞的、移植后的功能性成活率得到改善。
[14]一种培养物，其为移植用细胞群的培养物，其包含：
(1)上述[1]～[13]中任一项所述的移植用细胞群；和
(2)用于维持上述移植用细胞群的存活能力所需要的介质。
[15]一种包含视网膜系细胞的移植用细胞群的制造方法，其包括下述工序(1)和(2)：
(1)对多能干细胞的双极细胞调控基因进行改造，在体外得到包含上述双极细胞调控基因进行了改造的上述多能干细胞的细胞群的工序；
(2)在体外将工序(1)中得到的包含上述多能干细胞的细胞群分化诱导成上述视网膜系细胞，得到包含上述视网膜系细胞的移植用细胞群的工序。
[16]如上述[15]所述的制造方法，其中，包含上述视网膜系细胞的移植用细胞群为细胞悬浮液或细胞聚集体的形态。
[17]如上述[15]或[16]所述的制造方法，其中，上述双极细胞调控基因为编码转录调控因子的基因。
[18]如上述[17]所述的制造方法，其中，上述双极细胞调控基因为选自由ISL1基因和BHLHE23基因组成的组中的一个或多个基因。
[19]如上述[18]所述的制造方法，其中，上述ISL1基因具有下述(1)或(2)所表示的碱基序列：
(1)序列号1、4或7所表示的碱基序列；
(2)具有在序列号1、4或7所表示的碱基序列中一个或多个碱基发生缺失、添加、***或置换而得到的碱基序列、并且编码相对于序列号3、6或9所表示的氨基酸序列具有80％以上的序列一致性的蛋白质的碱基序列，该碱基序列编码符合下述(a)～(c)中至少一个条件的蛋白质：
(a)具有DNA结合能力、
(b)具有对基因的转录进行调控的功能、
(c)能够被特异性地识别由序列号3、6或9所表示的氨基酸序列构成的蛋白质的抗体所识别。
[20]如上述[18]或[19]所述的制造方法，其中，上述BHLHE23基因具有下述(1)或(2)所表示的碱基序列：
(1)序列号10或13所表示的碱基序列；
(2)具有在序列号10或13所表示的碱基序列中一个或多个碱基发生缺失、添加、***或置换而得到的碱基序列、并且编码相对于序列号12或15所表示的氨基酸序列具有80％以上的序列一致性的蛋白质的碱基序列，该碱基序列编码符合下述(a)～(c)中至少一个条件的蛋白质：
(a)具有DNA结合能力、
(b)具有对基因的转录进行调控的功能、
(c)能够被特异性地识别由序列号12或15所表示的氨基酸序列构成的蛋白质的抗体所识别。
[21]如上述[15]～[20]中任一项所述的制造方法，其中，上述双极细胞调控基因的改造包括该基因的缺失。
[22]如上述[15]～[21]中任一项所述的制造方法，其中，上述多能干细胞为诱导性多能干细胞或胚胎干细胞。
[23]如上述[15]～[22]中任一项所述的制造方法，其中，上述视网膜系细胞包含选自由视网膜祖细胞、视细胞祖细胞和视细胞组成的组中的一种或多种细胞。
[24]如上述[23]所述的制造方法，其中，上述视网膜系细胞包含选自Chx10阳性细胞、Crx阳性细胞和恢复蛋白阳性细胞中的一种或多种细胞。
[25]如上述[23]或[24]所述的制造方法，其中，在包含上述视网膜系细胞的移植用细胞群中，视网膜祖细胞、视细胞祖细胞和视细胞的细胞数的合计为总细胞数的10％以上。
[26]如上述[23]～[25]中任一项所述的制造方法，其中，上述视细胞、或者移植后由上述视网膜祖细胞或上述视细胞祖细胞诱导的视细胞的、移植后的功能性成活率得到改善。
[27]一种基于视网膜组织的损害的疾病或视网膜组织的损伤状态的治疗方法，其包括将有效量的上述[1]～[13]中任一项所述的移植用细胞群移植于需要移植的对象。
[28]一种用于治疗基于视网膜组织的损害的疾病或视网膜组织的损伤状态的药物组合物，其含有上述[1]～[13]中任一项所述的移植用细胞群作为有效成分。
[29]如上述[28]所述的药物组合物，其为细胞片的形态。
[30]一种基于视网膜组织的损害的疾病或视网膜组织的损伤状态的治疗药，其含有上述[1]～[13]中任一项所述的移植用细胞群。
[31]如上述[30]所述的治疗药，其为细胞片的形态。
发明效果
根据本发明，能够提供适合于视网膜组织的移植的移植用细胞群及其制造方法。
附图说明
图1是示出移植Bhlhb4基因功能缺失的小鼠iPS细胞来源的视网膜组织后40～50天后的移植部位的杆状双极细胞、无长突细胞和水平细胞的比例的图。
图2是示出移植Bhlhb4基因功能缺失的小鼠iPS细胞来源的视网膜组织后40～50天后或90～100天后的宿主杆状双极细胞与移植视细胞的接触长度的比例的图。
图3是示出移植ISL1基因功能缺失的小鼠iPS细胞来源的视网膜组织后40～50天后的移植部位的杆状双极细胞、无长突细胞和水平细胞的比例的图。
图4是示出移植Bhlhb4基因或ISL1基因功能缺失的小鼠iPS细胞来源的视网膜组织后第30天～第50天的移植部位的宿主双极细胞与移植视细胞的突触连接的照片。
图5是对Bhlhb4基因或ISL1基因功能缺失的小鼠iPS细胞来源的视网膜组织(分化诱导开始后第29天的组织)进行免疫染色后的共聚焦显微镜照片。
图6A是示出(上层)用于使ISL1基因功能缺失的CRISPR/Cas9***的设计的示意图、(中层)对ISL1基因的缺失进行确认的琼脂糖凝胶电泳的照片和(下层)所建立的人ES细胞株(ISL1基因缺失株)的照片。
图6B是示出被CRISPR/Cas9***切断的ISL1基因的部位的图。
图7A是示出使ISL1基因功能缺失的人ES细胞株分化成视网膜的照片。
图7B是示出ISL1基因功能缺失的人ES细胞株来源的视网膜中的视细胞祖细胞的存在的照片。
图7C是示出ISL1基因功能缺失的人ES细胞株来源的视网膜中不表达ISL1蛋白的照片。
图8是示出ISL1基因功能缺失的人ES细胞株来源的视网膜在移植于视网膜变性大鼠后成活的照片。
图9A是示出移植使ISL1基因功能缺失的人ES细胞株分化而得到的视网膜后240～260天后的移植部位的双极细胞和无长突细胞的比例的照片。
图9B是示出移植使ISL1基因功能缺失的人ES细胞株分化而得到的视网膜后240～260天后的移植部位的双极细胞和无长突细胞的比例的图。
具体实施方式
1.关于包含视网膜系细胞的移植用细胞群
本发明的一个方式提供包含双极细胞调控基因进行了改造的视网膜系细胞的移植用细胞群。与具有野生型基因组的视网膜系细胞相比，双极细胞调控基因进行了改造的视网膜系细胞虽然无法充分分化和成熟为双极细胞，但能够没有问题地分化成熟为视细胞。因此，通过将包含上述视网膜系细胞的移植用细胞群用于移植，移植片来源的视细胞与宿主侧的双极细胞的接触比例提高，能够改善该视网膜组织移植后的功能性成活。以下进行详细说明。
1-1.移植用细胞群
本发明中的“移植用细胞群”是指为了移植而准备的、用于移植的细胞群。
本发明中的“细胞群”是指存在两个以上的同一种类或不同种类的细胞的群。优选细胞群存在于培养基等介质中。细胞群包括细胞悬浮液和细胞聚集体，优选为细胞悬浮液或细胞聚集体的形态。
本发明中的“细胞悬浮液”是指以悬浮状态包含同一种类或不同种类的多个细胞的介质。悬浮状态是指优选大多数(例如50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上或95％以上)的存在于介质中的细胞相互解离、不发生持续性物理接触而存在的状态。存在于介质中的细胞的一部分(例如50％以下、40％以下、30％以下、20％以下、10％以下或5％以下)细胞可以以细胞聚集体等形式存在。
关于本发明中的“细胞聚集体”(Cell Aggregate)，只要是多个细胞彼此粘附而形成块则没有特别限定，例如是指分散在培养基等介质中的细胞会集而形成的块。细胞聚集体包括组织和细胞片。
本发明中的“细胞片”是指由至少在二维方向上具有生物学结合的单个或多个细胞构成的单层或多层的结构体。细胞片可以通过使用镊子、刀、剪刀等从贴壁培养的细胞或细胞聚集体中切出而容易地制作。
本发明中的“组织”是指具有形态或性质均匀的一种细胞或形态或性质不同的多种细胞以一定的模式立体地配置而成的结构的细胞群的结构体。作为组织，可以列举例如视网膜组织。
本发明中的“视网膜组织(Retinal tissue或Retinal organoid)”是指生物体视网膜中构成各视网膜层的一种或多种视网膜系细胞以层状立体地排列的组织。各细胞是否为构成某一视网膜层的细胞可以利用公知的方法、例如有无细胞标志物的表达或细胞标志物的表达程度等来进行确认。
本发明中的“视网膜层”是指构成视网膜的各层，具体而言，可以列举视网膜色素上皮层、视细胞层、外界膜、外颗粒层、外网层、内颗粒层、内网层、神经节细胞层、神经纤维层和内界膜。
本发明中的“视细胞层”是指作为视网膜层的一种、且包含大量(例如：以存在于视细胞层中的视细胞核的数目计为70％以上、优选为80％以上、更优选为90％以上)视细胞(视杆细胞、视锥细胞)的视网膜层。
1-2.视网膜系细胞
本发明中的“视网膜系细胞(Retinal cell)”是指生物体视网膜中构成各视网膜层的细胞或其祖细胞。具体而言，包括视细胞(视杆细胞、视锥细胞)、水平细胞、无长突细胞、中间神经元、视网膜神经节细胞(神经节细胞)、双极细胞(杆状双极细胞、锥体双极细胞)、米勒胶质细胞(Muller glial cell)、视网膜色素上皮细胞(RPE)、睫状体边缘带细胞、它们的祖细胞(例如：视细胞祖细胞、双极细胞祖细胞等)、视网膜祖细胞等细胞，但不限于这些。
“成熟的视网膜系细胞”是指视细胞(视杆细胞、视锥细胞)、水平细胞、无长突细胞、中间神经元、视网膜神经节细胞(神经节细胞)、双极细胞(杆状双极细胞、锥体双极细胞)、米勒胶质细胞、视网膜色素上皮细胞(RPE)、睫状体边缘带细胞等分化的细胞。“未成熟的视网膜系细胞”是指确定将分化为成熟的视网膜系细胞的祖细胞(例如：视细胞祖细胞、双极细胞祖细胞、视网膜祖细胞等)。
视细胞祖细胞、水平细胞祖细胞、双极细胞祖细胞、无长突细胞祖细胞、视网膜神经节细胞祖细胞、米勒胶质祖细胞、视网膜色素上皮祖细胞分别是指确定将分化为视细胞、水平细胞、双极细胞、无长突细胞、视网膜神经节细胞、米勒胶质细胞、视网膜色素上皮细胞的祖细胞。
本发明中的“视网膜祖细胞”是指可能分化为视细胞祖细胞、水平细胞祖细胞、双极细胞祖细胞、无长突细胞祖细胞、视网膜神经节细胞祖细胞、米勒胶质祖细胞、视网膜色素上皮祖细胞等任意一种未成熟的视网膜系细胞的祖细胞，并且最终能够分化为视细胞(视杆细胞、视锥细胞)、水平细胞、双极细胞、无长突细胞、视网膜神经节细胞、米勒胶质细胞、视网膜色素上皮细胞等任意一种成熟的视网膜系细胞的祖细胞。
视网膜系细胞的存在可以通过有无视网膜系细胞的标志物(以下有时称为“视网膜系细胞标志物”)的表达来确认。本领域技术人员可以容易地确认视网膜系细胞标志物的表达的有无、或者细胞群或组织中的视网膜系细胞标志物阳性细胞的比例。例如，可以通过下述方法来确认：利用使用市售抗体的流式细胞术、免疫染色等方法求出特定的视网膜系细胞标志物阳性细胞的数目，并将其除以总细胞数。
作为视网膜系细胞标志物，可以列举在视网膜祖细胞中表达的Rx(也称为“Rax”)、PAX6和Chx10、在视细胞祖细胞中表达的Crx和Blimp1、在双极细胞中表达的Chx10、PKCα和L7、在视网膜神经节细胞中表达的TuJ1和Brn3、在无长突细胞中表达的钙视网膜蛋白、在水平细胞中表达的钙结合蛋白、在成熟视细胞(视杆细胞和视锥细胞)中表达的恢复蛋白、在视杆细胞中表达的Nrl和视紫红质、在视锥细胞中表达的Rxr-gamma、S-视蛋白(S-Opsin)和M/L-视蛋白(M/L-Opsin)、在米勒胶质细胞中表达的GS和GFAP、在视网膜色素上皮细胞中表达的RPE65和Mitf、在睫状体边缘带细胞中表达的Rdh10和SSEA1等蛋白质。
“阳性细胞”是指在细胞表面上或细胞内表达特定标志物的细胞。例如，“Chx10阳性细胞”是指在核内表达Chx10蛋白质的细胞。
1-3.双极细胞调控基因
本发明中的“双极细胞调控基因”是指下述基因：在视网膜祖细胞、双极细胞祖细胞和/或双极细胞中表达，参与双极细胞的分化、成熟、存活、增殖、代谢或与视细胞形成突触的功能，但不参与视细胞的分化、成熟、存活、增殖、代谢和功能。因此，通过对双极细胞调控基因进行改造，能够准备出引起双极细胞的分化不全、变性死亡、功能不全等、但视细胞保持正常功能的视网膜祖细胞等。优选双极细胞调控基因为在双极细胞祖细胞和/或双极细胞中表达、在视网膜祖细胞、视细胞祖细胞和视细胞中未确认到表达的基因。
在一个方式中，双极细胞调控基因是指下述基因：在双极细胞祖细胞和/或双极细胞中表达，参与双极细胞的成熟，但不参与视细胞的分化、成熟、存活、增殖、代谢和功能。优选双极细胞调控基因为在双极细胞祖细胞和/或双极细胞中表达、在视网膜祖细胞、视细胞祖细胞和视细胞中未确认到表达的基因。“双极细胞的成熟”是指由双极细胞祖细胞向双极细胞进行分化，能够与视细胞形成突触。关于双极细胞的成熟，可以利用免疫组织学分析、流式细胞术等方法对作为双极细胞标志物的Chx10蛋白质、PKCα蛋白质、L7等的表达进行确认。
在一个方式中，双极细胞调控基因包括编码参与上述功能(双极细胞的分化、成熟、存活、增殖、代谢或与视细胞形成突触的功能)的转录因子的基因，转录因子具体而言为使该功能维持或亢进的转录因子。双极细胞调控基因优选为编码转录因子的基因。
转录因子包含具有参与转录调控的功能的区域(结构域)。例如，转录因子包含特征性的DNA结合区域(同源异形域(homeodomain)、锌指结构域(zinc finger domain)、碱性亮氨酸拉链结构域(basic leucine zipper domain)、碱性螺旋-环-螺旋结构域(basic-helix-loop-helix domain)等)。在一个方式中，转录因子进一步包含转录调控辅因子结合结构域。因此，本领域技术人员可以根据例如是否包含特征性的DNA结合区域来判断特定的基因是否为编码转录因子的基因。
本领域技术人员可以利用公知的方法对在视网膜祖细胞、双极细胞祖细胞和/或双极细胞中表达的基因进行鉴定。在一个方式中，可以在胚胎期或成体期利用基因表达分析(例如微阵列分析)和/或组织学分析(例如免疫染色分析、原位杂交法)对在双极细胞或视网膜祖细胞中表达的基因进行检测。
本领域技术人员可以利用公知的方法或公知的信息对参与双极细胞的分化、成熟、存活、增殖、代谢或与视细胞形成突触的功能、但不参与视细胞的分化、成熟、存活、增殖、代谢和功能的基因进行鉴定。在一个方式中，在利用基因导入法(例如电穿孔法、脂质体转染法)制作的基因改造细胞株和/或基因改造动物中对上述基因对双极细胞的分化、成熟、存活、增殖、代谢或与视细胞形成突触的功能、以及视细胞的分化、成熟、存活、增殖、代谢和功能带来的效果进行验证即可。
作为具体的一个方式，可以通过基因表达分析(例如微阵列分析)对在视网膜祖细胞、双极细胞祖细胞或双极细胞中表达的基因进行筛选，利用公知的信息(针对ISL1基因等的基因序列的同源性、功能、保守的功能结构域等)挑选出参与上述功能的基因作为双极细胞调控基因的候选基因。作为优选方式，挑选出在双极细胞祖细胞或双极细胞中表达、但在视细胞祖细胞和视细胞中不表达的基因作为双极细胞调控基因的候选基因。另外，作为另一优选方式，挑选出编码转录因子的基因作为双极细胞调控基因的候选基因。编码转录因子的基因可以利用上述保守的结构域等来挑选。也可以将这些双极细胞调控基因的候选基因的挑选方法进行组合。例如，可以挑选出在双极细胞祖细胞或双极细胞中表达但在视细胞祖细胞和视细胞中不表达的、编码转录因子的基因作为双极细胞调控基因的候选基因。
此外，例如，可以通过由对所挑选的基因进行了改造的多能干细胞制造视网膜组织并进行组织学分析来验证其为双极细胞调控基因。
作为双极细胞调控基因，可以列举例如参与双极细胞的成熟的ISL1基因和BHLHE23基因等编码在双极细胞中表达的转录因子的基因、以及与这些基因具有实质上相同的碱基序列的基因，但不限定于这些。
本发明中的“具有实质上相同的碱基序列的基因”是指下述基因：编码与具有特定序列号所表示的碱基序列的基因所编码的蛋白质具有实质上相同的功能的蛋白质，并且与特定序列号所表示的碱基序列具有约80％以上(优选约85％以上、约90％以上、约95％以上)的序列一致性的基因；或者包含编码与特定序列号所表示的氨基酸序列具有约80％以上(优选约85％以上、约90％以上、约95％以上)的序列一致性的蛋白质的碱基序列的基因。即使在不符合本定义的情况下(例如序列一致性小于80％)，已知为直系同源、亚型、同种型或突变体且具有实质上相同的功能的基因也包含在“具有实质上相同的碱基序列的基因”中。
本发明中，“实质上相同的功能”是指例如从生理学方面或药理学方面来看其性质在定性上是相同的，功能的程度、蛋白质的分子量等量的要素可以不同。
本发明中的碱基序列或氨基酸序列的“序列一致性”是指使用该技术领域中公知的数学算法将两个碱基序列进行比对时的最佳比对(优选该算法是为了进行最佳比对而可考虑向序列中的一者或两者引入空位的算法)中的、相同碱基或氨基酸相对于重叠的全部碱基序列或全部氨基酸序列的比例(％)。本领域技术人员可以容易地确认碱基序列或氨基酸序列的“序列一致性”。例如，可以使用NCBI BLAST(国家生物技术信息中心基本本地比对搜索工具，National Center for Biotechnology Information Basic Local AlignmentSearch Tool)。
本发明中的“直系同源”是指来源于由进化***上的同一祖先派生而来的、相似性高的不同动物种的基因或蛋白质。
本发明中的“亚型”是指基因的同源性高、具有相似的功能的蛋白质组。
本发明中的“同种型”是指蛋白质的立体结构不同、但具有实质上相同的功能的基因或蛋白质。多个同种型可能为来源于同一DNA的剪接变体，也可能来源于不同的DNA。
本发明中的“突变体”是指下述基因：编码与具有特定序列号所表示的碱基序列的基因所编码的蛋白质具有实质上相同的功能的蛋白质，并且具有一个或多个碱基发生缺失、添加、***或置换而得到的碱基序列。
本领域技术人员可以根据例如http://www.ncbi.nlm.nih.gov中记载的基因的碱基序列来判断特定的基因是否为“具有实质上相同的碱基序列的基因”。
本说明书中，“基因”是指染色体上存在的、编码特定蛋白质的区域(为包含起始密码子至终止密码子的区域，可以包含内含子)及其前后的区域(启动子、增强子、沉默子、终止子等区域)的碱基序列。其前后的区域的范围根据基因而有所不同，例如为50bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、1000bp、2000bp。即，基因的改造不仅包括编码特定蛋白质的区域的改造，也包括其前后的区域的改造。
以下，对ISL1基因和BHLHE23基因进行说明。
ISL1(胰岛素基因增强子结合蛋白；Insulin gene enhancer protein 1、ISL LIMhomeobox 1、Islet-1)基因为公知的基因。作为ISL1基因，可以列举具有序列号1(Genbank登录号：3670(NC_000005.10))所表示的碱基序列、或与其实质上相同的碱基序列的基因。另外，包含含有序列号1所示的碱基序列中包含的外显子部分的碱基序列(例如序列号2所示的碱基序列(Genbank登录号：NM_002202.2))和与该外显子部分实质上相同的碱基序列作为外显子的基因也属于ISL1基因的范畴。与序列号2所表示的碱基序列的第549位～第1598位对应的碱基序列所编码的ISL1蛋白具有序列号3(Genbank登录号：NP_002193.2)所表示的氨基酸序列。包含编码序列号3所表示的氨基酸序列和与其实质上相同的氨基酸序列的碱基序列作为外显子的基因也属于ISL1基因的范畴。
作为人ISL1基因的直系同源基因，已知具有序列号4(Genbank登录号：16392(NC_000079.6))所表示的碱基序列的小鼠ISL1基因。具有序列号4所表示的碱基序列或与其实质上相同的碱基序列的基因也属于ISL1基因的范畴。另外，包含含有序列号4所示的碱基序列中包含的外显子部分的碱基序列(例如序列号5所示的碱基序列(Genbank登录号：NM_021459.4))和与其实质上相同的碱基序列作为外显子的基因也属于ISL1基因的范畴。与序列号5所表示的碱基序列的第267位～第1316位对应的碱基序列所编码的小鼠ISL1蛋白具有序列号6(Genbank登录号：NP_067434.3)所表示的氨基酸序列。包含编码序列号6所表示的氨基酸序列和与其实质上相同的氨基酸序列的碱基序列作为外显子的基因也属于ISL1基因的范畴。
作为人ISL1基因的人亚型，已知具有序列号7(Genbank登录号：64843(NC_000015.10))所表示的碱基序列的人ISL2基因。具有序列号7所表示的碱基序列或与其实质上相同的碱基序列的基因也属于ISL1基因的范畴。另外，包含含有序列号7所示的碱基序列中包含的外显子部分的碱基序列(例如序列号8所示的碱基序列(Genbank登录号：NM_145805))和与其实质上相同的碱基序列作为外显子的基因也属于ISL1基因的范畴。与序列号8所表示的碱基序列的第161位～第1240位对应的碱基序列所编码的ISL2蛋白具有序列号9(Genbank登录号：NP_665804.1)所表示的氨基酸序列。包含编码序列号9所表示的氨基酸序列和与其实质上相同的氨基酸序列的碱基序列作为外显子的基因也属于ISL1基因的范畴。
“具有与序列号1实质上相同的碱基序列的基因”是指：编码与具有序列号3所表示的氨基酸序列的蛋白质具有实质上相同的功能的蛋白质的基因，并且是该基因与序列号1所表示的碱基序列、或者该基因的外显子与序列号2所表示的碱基序列具有约80％以上(优选约85％以上、约90％以上、约95％以上)的序列一致性的基因、或者包含编码相对于序列号3所表示的氨基酸序列具有约80％以上(优选约85％以上、约90％以上、约95％以上)的序列一致性的蛋白质的碱基序列的基因。
“具有与序列号4实质上相同的碱基序列的基因”是指：编码与具有序列号6所表示的氨基酸序列的蛋白质具有实质上相同的功能的蛋白质的基因，并且是该基因与序列号4所表示的碱基序列、或者该基因的外显子与序列号5所表示的碱基序列具有约80％以上(优选约85％以上、约90％以上、约95％以上)的序列一致性的基因、或者包含编码相对于序列号6所表示的氨基酸序列具有约80％以上(优选约85％以上、约90％以上、约95％以上)的序列一致性的蛋白质的碱基序列的基因。
“具有与序列号7实质上相同的碱基序列的基因”是指：编码与具有序列号9所表示的氨基酸序列的蛋白质具有实质上相同的功能的蛋白质的基因，并且是该基因与序列号7所表示的碱基序列、或者该基因的外显子与序列号8所表示的碱基序列具有约80％以上(优选约85％以上、约90％以上、约95％以上)的序列一致性的基因、或者包含编码相对于序列号9所表示的氨基酸序列具有约80％以上(优选约85％以上、约90％以上、约95％以上)的序列一致性的蛋白质的碱基序列的基因。
据报道，ISL1蛋白为同源异形域型的转录因子，具有LIM1和LIM2这两个LIM结构域以及Lhx3结合结构域，并且具有DNA结合结构域，其参与双极细胞的成熟。
因此，“与具有序列号3所表示的氨基酸序列的蛋白质具有实质上相同的功能”是指具有与DNA结合的能力，并具有正向或负向调控基因的转录的功能。
作为“具有与序列号1、4或7所表示的碱基序列实质上相同的碱基序列的基因”、即ISL1基因，具体而言，可以列举下述(1)或(2)：
(1)序列号1、4或7所表示的碱基序列；
(2)具有在序列号1、4或7所表示的碱基序列中一个或多个碱基发生缺失、添加、***或置换而得到的碱基序列，并且编码相对于序列号3、6或9所表示的氨基酸序列具有80％以上的序列一致性的蛋白质的碱基序列，该碱基序列编码符合下述中至少一个条件的蛋白质：
(a)具有DNA结合能力、
(b)具有对基因的转录进行调控的功能、
(c)能够被特异性地识别由序列号3、6或9所表示的氨基酸序列构成的蛋白质的抗体所识别。
在此，关于“一个或多个碱基发生缺失、添加、***或置换而得到的碱基序列”，作为一例，可以列举通过缺失、添加、***或置换而相对于缺失、添加、***或置换之前的碱基序列具有80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列一致性的碱基序列。作为“一个或多个碱基”的具体个数，例如为1～100个、1～50个、1～30个、1～10个、1～几(2、3、4或5)个。缺失、添加、***或置换可以多种组合。
本发明的一个方式中，ISL1基因对于人而言为位于染色体上“5q11.1”或“15q24.3”的基因，对于小鼠而言为位于染色体上“13D2.3”的基因。本领域技术人员可以基于例如http://www.ncbi.nlm.nih.gov中记载的基因的碱基序列来判断其他动物种中的ISL1基因(直系同源)的染色***置。
ISL1基因优选为人ISL1基因或小鼠ISL1基因。
BHLHE23(碱性螺旋-环-螺旋家族；basic helix-loop-helix family，membere23)基因为公知的基因。作为BHLHE23基因，可以列举具有序列号10(Genbank登录号：128408(NC_000020.11))所表示的碱基序列或与其实质上相同的碱基序列的基因。另外，包含含有序列号10所示的碱基序列中包含的外显子部分的碱基序列(例如序列号11所示的碱基序列(Genbank登录号：NM_080606))和与其实质上相同的碱基序列作为外显子的基因也属于人BHLHE23基因的范畴。序列号11所表示的碱基序列的第262位～第987位的碱基所编码的BHLHE23蛋白为具有序列号12(Genbank登录号：NP_542173.2)所表示的氨基酸序列的蛋白质。包含编码序列号12所表示的氨基酸序列和与其实质上相同的氨基酸序列的碱基序列作为外显子的基因也属于BHLHE23基因的范畴。
作为人BHLHE23基因的直系同源基因，已知具有序列号13(Genbank登录号：140489(NC_000068.7))所表示的碱基序列的小鼠BHLHE23基因(Bhlhb4基因)。具有序列号13所表示的碱基序列或与其实质上相同的碱基序列的基因也属于BHLHE23基因的范畴。另外，包含含有序列号13所示的碱基序列中包含的外显子部分的碱基序列(例如序列号14所示的碱基序列(Genbank登录号：NM_080641.5))和与其实质上相同的碱基序列作为外显子的基因也属于BHLHE23基因的范畴。序列号14所表示的碱基序列的第158位～第829位的碱基所编码的小鼠Bhlhb4蛋白具有序列号15(Genbank登录号：NP_542372.2)所表示的氨基酸序列。包含编码序列号15所表示的氨基酸序列和与其实质上相同的氨基酸序列的碱基序列作为外显子的基因也属于BHLHE23基因的范畴。
“具有与序列号10实质上相同的碱基序列的基因”是指：编码与具有序列号12所表示的氨基酸序列的蛋白质具有实质上相同的功能的蛋白质的基因，并且是该基因与序列号10所表示的碱基序列、或者该基因的外显子与序列号11所表示的碱基序列具有约80％以上(优选约85％以上、约90％以上、约95％以上)的序列一致性的基因、或者包含编码相对于序列号12所表示的氨基酸序列具有约80％以上(优选约85％以上、约90％以上、约95％以上)的序列一致性的蛋白质的碱基序列的基因。
“具有与序列号13实质上相同的碱基序列的基因”是指：编码与具有序列号15所表示的氨基酸序列的蛋白质具有实质上相同的功能的蛋白质的基因，并且是该基因与序列号13所表示的碱基序列、或者该基因的外显子与序列号14所表示的碱基序列具有约80％以上(优选约85％以上、约90％以上、约95％以上)的序列一致性的基因、或者包含编码相对于序列号15所表示的氨基酸序列具有约80％以上(优选约85％以上、约90％以上、约95％以上)的序列一致性的蛋白质的碱基序列的基因。
据报道，BHLHE23蛋白为碱性螺旋-环-螺旋型的转录因子，具有DNA结合结构域和螺旋-环-螺旋结构域，其参与双极细胞的成熟。
因此，“与具有序列号12所表示的氨基酸序列的蛋白质具有实质上相同的功能”是指具有与DNA结合的能力，并具有正向或负向调控基因的转录的功能。
作为“具有与序列号10或13所表示的碱基序列实质上相同的碱基序列的基因”、即BHLHE23基因，具体而言，可以列举下述(1)或(2)：
(1)序列号10或13所表示的碱基序列；
(2)具有在序列号10或13所表示的碱基序列中一个或多个碱基发生缺失、添加、***或置换而得到的碱基序列，并且编码相对于序列号12或15所表示的氨基酸序列具有80％以上的序列一致性的蛋白质的碱基序列，该碱基序列编码符合下述中至少一个条件的蛋白质：
(a)具有DNA结合能力、
(b)具有对基因的转录进行调控的功能、
(c)能够被特异性地识别由序列号12或15所表示的氨基酸序列构成的蛋白质的抗体所识别。
在此，关于“一个或多个碱基发生缺失、添加、***或置换而得到的碱基序列”，作为一例，可以列举通过缺失、添加、***或置换而相对于缺失、添加、***或置换之前的碱基序列具有80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列一致性的碱基序列。作为“一个或多个碱基”的具体个数，例如为1～100个、1～50个、1～30个、1～10个、1～几(2、3、4或5)个。缺失、添加、***或置换可以多种组合。
本发明的一个方式中，BHLHE23基因为位于人染色体上的“20q13.33”、或位于小鼠染色体上的“2103.34cM”的基因。本领域技术人员可以基于例如http://www.ncbi.nlm.nih.gov中记载的基因的碱基序列来判断其他动物种中的BHLHE23基因(直系同源)的染色***置。
BHLHE23基因优选为人BHLHE23基因或小鼠BHLHE23基因。
1-4.基因改造
本发明中的“基因改造”和“基因的改造”是指通过对特定基因进行一个或多个碱基的添加、***、缺失、置换等，使由特定基因编码的mRNA或蛋白质的表达或功能消失或减弱。即，基因改造包括基因的缺失。只要使由特定基因编码的蛋白质的表达或功能消失或减弱，进行添加、***、缺失、置换等的碱基的个数和碱基的位置(也包括增强子、启动子、内含子等)以及基因改造的方法没有限定。
作为本发明的一个方式，双极细胞调控基因的改造也包括在维持双极细胞调控基因(例如ISL1基因或BHLHE23基因)的增强子和启动子的同时，将编码其下游的蛋白质的序列(外显子和内含子)置换为特殊序列。特殊序列包括例如***基因、存活调控基因、增殖调控基因、分化调控基因和代谢调控基因(以下有时称为“***基因等”)；或者编码能够抑制双极细胞调控基因的表达的微小RNA、包含与双极细胞调控基因相同或同源性的核酸序列的反义RNA和双极细胞调控基因的非编码RNA的基因(以下有时称为“微小RNA基因等”)等。作为***基因等，可以列举凋亡诱导因子等的基因。作为微小RNA基因等，可以列举编码针对其他双极细胞调控基因的微小RNA等的基因。通过在双极细胞调控基因的启动子下表达这些基因，还能够进行例如双极细胞特异性的细胞死亡的诱导或与被置换的基因不同的双极细胞调控基因的表达抑制。即，由于在双极细胞被诱导的过程中表达双极细胞调控基因，因此在表达双极细胞调控基因的时期***到同一增强子和启动子的下游的***基因等进行表达，由此能够将双极细胞引向细胞死亡。另外，通过表达微小RNA基因等，能够抑制双极细胞调控基因的mRNA的功能。
需要说明的是，关于特殊序列，可以置换为多能干细胞的内源性的双极细胞调控基因本身，也可以在维持该双极细胞调控基因的状态下导入到多能干细胞的基因组中双极细胞调控基因的增强子和启动子的下游。这种情况下，只要是特殊序列可发挥功能的位置，则导入位置没有特别限定。优选在不置换该双极细胞调控基因本身的情况下导入特殊序列。
在一个方式中，作为基因改造，可以列举该基因实质上不再发挥功能的基因组编辑。作为“实质上不再发挥功能的基因组编辑”，可以列举该基因成为突变型、失去野生型所具有的功能的突变的导入(例如移框等无义突变等)；该基因的表达量减少之类的基因组编辑等。
在一个方式中，作为“基因的表达量减少之类的基因组编辑”，可以列举对基因组中的基因的表达量调控序列进行改造等。作为该表达量调控序列，可以列举增强子和/或启动子。例如，基因的增强子和/或启动子存在于双极细胞调控基因的上游序列、下游序列和/或基因内(例如内含子区域)。
本发明中的“基因缺失”和“基因的缺失”是指通过使特定基因缺失碱基，使由特定基因编码的蛋白质的表达或功能消失或减弱。只要使由特定基因编码的蛋白质的表达或功能消失或减弱，缺失的碱基的个数和碱基的位置(也包括增强子、启动子、内含子等)以及基因缺失的方法没有限定。例如，在小鼠和人的ISL1基因的情况下，通过使第一外显子和第二外显子缺失，可以使该基因缺失；在小鼠Bhlhb4基因的情况下，通过使包含蛋白翻译区的起始密码子的前后的序列(例如约150个碱基)缺失，可以使该基因缺失。例如，通过使一部分外显子(例如第一外显子或第二外显子)缺失、或者使包含蛋白翻译区的起始密码子的多个碱基(1个碱基～蛋白翻译区的全部碱基、例如10～500个碱基、100～300个碱基或约150个碱基)缺失，可以使该基因。
本发明中，可以对初始化祖细胞、多能干细胞或视网膜系细胞进行基因改造。作为得到进行了基因改造的视网膜系细胞的方法，可以列举由进行了基因改造的多能干细胞(包括对进行了基因改造的体细胞进行初始化而得到的多能干细胞)进行分化诱导的方法、以及对视网膜系细胞进行基因改造的方法。优选对多能干细胞进行基因改造。
本发明中的“进行了基因改造的多能干细胞”是指在维持多能分化性的限度内进行了基因改造的多能干细胞。在一个方式中，“进行了基因改造的多能干细胞”是指在维持多能分化性和增殖能力(自身复制能力)的限度内进行了基因改造的多能干细胞。
本发明中，被改造的基因为双极细胞调控基因，但也可以进一步对其他基因进行改造。作为一个方式，可以列举出于确认特定细胞的存在的目的而用编码荧光蛋白的基因置换特定的细胞标志物基因等，但不限定于此。
进行了基因改造的多能干细胞或视网膜系细胞例如可以通过使用同源重组技术来制作。染色体上的靶基因的改造可以使用小鼠胚胎操作实验指南(Manipulating theMouse Embryo,A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港实验室出版社(1994)；基因靶向实用方法(Gene Targeting,A Practical Approach)，牛津大学出版社的IRL出版社(1993)；生物手册系列8，基因靶向，使用胚胎干细胞的突变小鼠的制作，羊土社(1995)等中记载的方法进行。
具体而言，例如，可以分离包含要改造的靶基因的基因组DNA，使用分离出的基因组DNA，制作用于对靶基因进行同源重组的靶向载体。将所制作的靶向载体导入干细胞，选择出在靶基因与靶向载体之间发生了同源重组的细胞，由此制作染色体上的基因进行了改造的干细胞。
作为分离包含靶基因的基因组DNA的方法，可以列举分子克隆实验指南，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)；或最新分子生物学操作手册(Current Protocols inMolecular Biology)，约翰·威利父子出版公司(1987-1997)等中记载的公知的方法。也可以通过使用基因组DNA文库筛选***(Genome Systems制)、Universal Genome Walker试剂盒(CLONTECH制)等来分离包含靶基因的基因组DNA。也可以使用编码靶蛋白的多核苷酸来代替基因组DNA。该多核苷酸可以通过利用PCR法对相应的多核苷酸进行扩增来获得。
用于对靶基因进行同源重组的靶向载体的制作和同源重组体的高效挑选可以按照基因靶向实用方法(Gene Targeting,A Practical Approach)，牛津大学出版社的IRL出版社(1993)；生物手册系列8，基因靶向，使用胚胎干细胞的突变小鼠的制作，羊土社(1995)；等中记载的方法进行。靶向载体可以使用替换型或***型中的任意一种。作为挑选方法，可以使用阳性选择、启动子选择、阴性选择或多聚A选择等方法。
作为从挑选出的细胞株中选择目标同源重组体的方法，可以列举针对基因组DNA的Southern杂交法、PCR法等。
另外，也可以通过基因组编辑来制造进行了基因改造的多能干细胞或视网膜系细胞。基因组编辑(Genome Editing)是指利用锌指***、CRISPR/Cas9***和类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nucleases；TALEN)等技术进行基因特异性的破坏或报告基因的敲入等的基因改造技术。
在锌指***中，使用由通常称为锌指基序的与DNA特异性结合的结构域和限制性酶FokI构成的人工嵌合蛋白质，识别靶基因并进行切割。两个人工嵌合蛋白质与相近的靶序列结合时，DNA切割结构域形成二聚体，将DNA切断。被切断的DNA通过同源重组或非同源性末端连接被修复，此时目的基因被进行改造。
在CRISPR/Cas9基因组编辑***中，通常将Cas9(DNA切割酶)的表达载体或mRNA或者Cas9蛋白与在聚合酶III启动子等的调控下表达向导RNA的表达载体或向导RNA本身导入到细胞中。向导RNA可以是靶基因组序列的互补RNA(crRNA)与tracrRNA的融合RNA。在靶基因组序列的3’末端存在前间区序列邻近基序(PAM-序列NGG)时，Cas9使DNA双链解离，向导RNA识别靶序列并将两条链切断，在切断部位被修复的过程中导入突变。
类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effectornuclease，TALEN)是使用植物病原菌黄单胞菌(Xanthomonas spp.)所生产的TAL效应物的***。TALEN通常为TAL效应物的DNA结合结构域与FokI核酸酶的DNA切割结构域融合而成的人工核酸酶。DNA结合结构域由34个氨基酸残基的重复序列构成，一个重复序列识别靶DNA的一个碱基。重复序列中的第12、13位的氨基酸残基被称为重复可变的双氨基酸残基(repeat variable di-residues，RVD)，由该序列决定靶碱基。通过以两组TALEN分子在基因组上的特定序列上彼此相向的方式设计TALEN，TALEN对在靶序列上发生FokI结构域的二聚体化，显示出核酸酶活性。被切断的DNA双链通过细胞内在的机制被修复，在该过程中导入突变。在利用TALEN进行基因组编辑的情况下，将TALEN的表达载体或mRNA导入到细胞内。
1-5.多能干细胞
本发明中，“干细胞”是指具有分化能力和维持了分化能力的增殖能力(特别是自身复制能力)的未分化的细胞。干细胞中，根据分化能力，包括多能干细胞(pluripotentstem cell)、专能干细胞(multipotent stem cell)、单能干细胞(unipotent stem cell)等亚群。“多能干细胞”是指能够在体外进行培养、并且具有能够分化成属于三胚层(外胚层、中胚层、内胚层)和/或胚胎外组织的全部细胞谱系的能力(多能分化性(pluripotency))的干细胞。“专能干细胞”是指具有可分化成两种以上的组织或细胞而非所有种类的组织或细胞的能力的干细胞。“单能干细胞”是指具有可分化成特定的组织或细胞的能力的干细胞。
多能干细胞可以由受精卵、克隆胚胎、生殖干细胞、组织内干细胞、体细胞等进行诱导。作为多能干细胞，可以列举胚胎干细胞(ES细胞：Embryonic stem cell)、胚胎生殖细胞(EG细胞：Embryonic germ cell)、诱导性多能干细胞(iPS细胞：induced pluripotentstem cell)等。由间充质干细胞(mesenchymal stem cell；MSC)得到的Muse细胞(多系分化持续应激细胞，Multi-lineage differentiating stress enduring cell)和由生殖细胞(例如睾丸)制作的GS细胞也包含在多能干细胞中。胚胎干细胞在1981年初次建立，1989年以后也应用于基因敲除小鼠的制作。在1998年建立了人胚胎干细胞，也开始应用于再生医学。胚胎干细胞可以通过将内部细胞块在饲养细胞上或包含LIF(白血病抑制因子)的培养基中进行培养来制造。胚胎干细胞的制造方法例如记载在WO96/22362、WO02/101057、US5843780、US6200806、US6280718等中。胚胎干细胞可以从规定的机构获得，另外也可以购入市售品。例如，人胚胎干细胞KhES-1、KhES-2和KhES-3可以从京都大学再生医科学研究所获得。人胚胎干细胞Rx::GFP株(KhES-1株来源)可以从国立研究开发法人理化学研究所获得。小鼠胚胎干细胞EB5细胞株和D3细胞株分别可以从国立研究开发法人理化学研究所和ATCC获得。
作为胚胎干细胞之一的核移植胚胎干细胞(ntES细胞)可以由将体细胞的核移植到去除核后的卵子中制作的克隆胚胎来建立。
EG细胞可以通过将原始生殖细胞在包含mSCF、LIF和bFGF的培养基中培养来制造(Cell,70:841-847,1992)。
本发明中的“诱导性多能干细胞”是指通过利用公知的方法等将体细胞初始化(reprogramming，重编程)而诱导了多能性的细胞。具体而言，可以列举通过选自包含Oct3/4、Sox2、Klf4、Myc(c-Myc、N-Myc、L-Myc)、Glis1、Nanog、Sall4、Lin28和Esrrb等的初始化基因组中的多个基因的组合中的任一者的表达将成纤维细胞或外周血单核细胞等分化的体细胞初始化而诱导了分化多能性的细胞。作为优选的初始化因子的组合，可以列举(1)Oct3/4、Sox2、Klf4和Myc(c-Myc或L-Myc)、(2)Oct3/4、Sox2、Klf4、Lin28和L-Myc(StemCells,2013；31:458-466)。
诱导性多能干细胞在2006年由山中等人在小鼠细胞中建立(Cell,2006,126(4),pp.663-676)。2007年在人成纤维细胞中也建立了诱导性多能干细胞，与胚胎干细胞同样地具有多能性和自身复制能力(Cell,2007,131(5),pp.861-872；Science,2007,318(5858),pp.1917-1920；Nat.Biotechnol.,2008,26(1),pp.101-106)。
除了利用基于基因表达的直接初始化来制造的方法以外，诱导性多能干细胞还可以通过化合物的添加等由体细胞进行诱导(Science,2013,341,pp.651-654)。
另外，也可以获得已建株的诱导性多能干细胞，例如，由京都大学建立的201B7细胞、201B7-Ff细胞、253G1细胞、253G4细胞、1201C1细胞、1205D1细胞、1210B2细胞、1231A3细胞等人诱导性多能性细胞株可以从京都大学获得。作为已建株的诱导性多能干细胞，例如，由京都大学建立的Ff-I01细胞和Ff-I14细胞可以从京都大学获得。
作为制造诱导性多能干细胞时使用的体细胞，没有特别限定，可以列举组织来源的成纤维细胞、血细胞系细胞(例如外周血单核细胞(PBMC)、T细胞)、肝细胞、胰细胞、肠上皮细胞、平滑肌细胞等。
制造诱导性多能干细胞时，在通过几种基因的表达进行初始化的情况下，用于使基因进行表达的手段没有特别限定。作为上述手段，可以列举使用病毒载体(例如逆转录病毒载体、慢病毒载体、仙台病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体)的感染法、使用质粒载体(例如质粒载体、附加型载体)的基因导入法(例如磷酸钙法、脂质体转染法、重组人纤维连接蛋白片段(RetroNectin)法、电穿孔法)、使用RNA载体的基因导入法(例如磷酸钙法、脂质体转染法、电穿孔法)、蛋白质的直接注入法(例如使用针的方法、脂质体转染法、电穿孔法)等。
诱导性多能干细胞可以在存在饲养细胞的条件下或不存在饲养细胞的条件下(无饲养细胞)来制造。在存在饲养细胞的条件下制造诱导性多能干细胞时，可以利用公知的方法在未分化维持因子存在下制造诱导性多能干细胞。作为在不存在饲养细胞的条件下制造诱导性多能干细胞时使用的培养基，没有特别限定，可以使用公知的胚胎干细胞和/或诱导性多能干细胞的维持培养基、或者用于在无饲养细胞的条件下建立诱导性多能干细胞的培养基。作为用于在无饲养细胞的条件下建立诱导性多能干细胞的培养基，可以列举例如Essential 8培养基(E8培养基)、Essential 6培养基、TeSR培养基、mTeSR培养基、mTeSR-E8培养基、稳定Essential 8培养基、StemFit培养基等无饲养细胞培养基。制造诱导性多能干细胞时，例如，可以通过在无饲养细胞条件下使用仙台病毒载体将Oct3/4、Sox2、Klf4和Myc这四个因子基因导入到体细胞中来制作诱导性多能干细胞。
本发明中使用的多能干细胞优选为胚胎干细胞或诱导性多能干细胞，更优选为诱导性多能干细胞。
本发明中使用的多能干细胞为哺乳动物的多能干细胞，优选为啮齿类(例如小鼠、大鼠)或灵长类(例如人、猴)的多能干细胞，更优选为人或小鼠多能干细胞，进一步优选为人iPS细胞或人ES细胞。
作为专能干细胞，可以列举造血干细胞、神经干细胞、视网膜干细胞、间充质干细胞等组织干细胞(也称为组织性干细胞、组织特异性干细胞或体性干细胞)。
2.关于移植用细胞群的培养物
本发明的一个方式提供一种培养物，其为移植用细胞群的培养物，包含(1)上述移植用细胞群和(2)用于维持上述移植用细胞群的存活能力所需要的介质。
本发明中的“培养物(culture)”是指包含用于维持存活能力所需要的介质和细胞群、并可以包含进一步添加的生物学物质或由细胞群产生的生物学物质的液体。作为生物学物质，包括例如细胞因子、趋化因子等，但不限定于这些。
作为本发明中的“用于维持存活能力所需要的介质”，可以列举培养基、生理学缓冲溶液等，只要包含视网膜祖细胞等视网膜系细胞的细胞群可存活则没有特别限定，本领域技术人员可以适当选择。作为一例，可以列举以动物细胞的培养中通常使用的培养基作为基础培养基而制备的培养基。作为基础培养基，可以列举例如BME培养基、BGJb培养基、CMRL 1066培养基、Glasgow MEM(GMEM)培养基、改良的MEM锌选择培养基、IMDM培养基、Medium 199培养基、Eagle MEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基、F-12培养基、DMEM/F12培养基、IMDM/F12培养基、火腿培养基、RPMI 1640培养基、Fischer’s培养基或它们的混合培养基等、能够在动物细胞的培养中使用的培养基。
3.关于包含视网膜系细胞的移植用细胞群的制造方法
本发明的一个方式为一种包含视网膜系细胞的移植用细胞群的制造方法，其包括下述工序(1)和(2)：
(1)对多能干细胞的双极细胞调控基因进行改造，在体外得到包含双极细胞调控基因进行了改造的多能干细胞的细胞群的工序；
(2)在体外将工序(1)中得到的包含多能干细胞的细胞群分化诱导成视网膜系细胞，得到包含视网膜系细胞的移植用细胞群的工序。
本说明书中，“对多能干细胞的双极细胞调控基因进行改造”也包括下述方式：在初始化祖细胞中对双极性细胞调控基因进行改造后，将初始化祖细胞初始化，由此制作具有进行了改造的双极细胞调控基因的多能干细胞。
本领域技术人员可以利用公知的方法对工序(1)中得到的细胞群进行保存。被保存的细胞群为用于得到双极细胞调控基因进行了改造的视网膜系细胞的原材料或制造中间体。作为本发明的一个方式，提供双极细胞调控基因进行了改造的视网膜系细胞的原材料或制造中间体。
作为对工序(1)中得到的细胞群进行保存的方法的示例，可以列举冷冻保存。冷冻保存的方法只要是通常作为对细胞进行冷冻保存的方法而公知的方法则没有特别限定。例如，可以将工序(1)中得到的细胞群悬浮在包含DMSO、甘油等防冻剂的培养基中进行冷冻保存。另外，也可以使用市售的细胞冷冻保存液[StemCellBanker(Zenoaq公司、注册商标)]。通过冷冻保存，能够将细胞群长期保存。
作为本发明的一个方式，提供作为用于得到双极细胞调控基因进行了改造的视网膜系细胞的原材料或制造中间体的、包含双极细胞调控基因进行了改造的多能干细胞的细胞群的主细胞库或工作细胞库。
即，工序(1)中得到的细胞经过扩大培养后，进行冷冻保存，可以制作主细胞库。也可以进一步通过对由主细胞库融解的细胞进行扩大培养而制作工作细胞库。制作主细胞库和工作细胞库时，优选细胞的传代数较少。
在此，“主细胞库”是指通过扩大培养使全部作为制造用细胞种子的基础的种细胞株增殖、并分装到多个安瓿瓶中而得到的细胞库。另外，“工作细胞库”是指通过扩大培养使由一个或多个主细胞库复苏的细胞增殖、并分装到多个安瓿瓶中而得到的细胞库。
作为本发明的一个方式，提供一种双极细胞调控基因进行了改造的视网膜系细胞的原材料或制造中间体(例如，包含双极细胞调控基因进行了改造的多能干细胞的细胞群的主细胞库)的制造方法，其包括下述工序(i)～(iii)：
(i)对多能干细胞的双极细胞调控基因进行改造，在体外得到上述双极细胞调控基因进行了改造的多能干细胞的细胞群的工序；
(ii)通过培养使工序(i)中得到的多能干细胞的细胞群增殖的工序；
(iii)对工序(ii)中得到的多能干细胞的细胞群进行冷冻保存的工序。
也可以将冷冻保存的双极细胞调控基因进行了改造的多能干细胞的细胞群(包括主细胞库或工作细胞库)融解后提供给工序(2)。本领域技术人员可以利用公知的方法将冷冻细胞融解。非冷冻或冷冻或冷冻后再融解的双极细胞调控基因进行了改造的多能干细胞的细胞群也是本发明的一个方式。
即，本发明的另一个方式为一种包含视网膜系细胞的细胞群的制造方法，其包括下述工序(iv)和(v)：
(iv)将冷冻保存的、双极细胞调控基因进行了改造的多能干细胞的细胞群融解的工序；
(v)在体外将工序(iv)中得到的包含多能干细胞的细胞群分化诱导成视网膜系细胞，得到包含视网膜系细胞的移植用细胞群的工序。
以下，对工序(1)和(2)详细进行说明。
3-1.关于工序(1)
作为工序(1)中的多能干细胞，优选可以列举iPS细胞或ES细胞。
在此，对于iPS细胞或ES细胞的制造方法没有特别限定，可以如上所述利用本领域技术人员公知的方法来制造。优选在不存在饲养细胞的条件下(无饲养细胞)进行制造。
本发明中，“在不存在饲养细胞的条件下(无饲养细胞)进行制造”是指在不存在饲养细胞的条件下进行培养。不存在饲养细胞的条件下可以列举例如未添加饲养细胞的条件或实质上不含饲养细胞(例如，饲养细胞数相对于总细胞数的比例为3％以下、优选为0.5％以下)条件。
工序(1)中，可以根据需要进行多能干细胞的维持培养或扩大培养。维持培养或扩大培养可以利用本领域技术人员公知的方法来实施，优选在无饲养细胞条件下进行。
上述多能干细胞的维持培养或扩大培养中使用的培养基只要能够进行维持培养或扩大培养则没有限定。在无饲养细胞条件下，为了能够进行未分化维持培养，使用包含未分化维持因子的培养基，已经开发和市售有多种合成培养基，可以使用这些培养基。可以列举例如Essential 8(Life Technologies公司制)培养基、S-medium(DS PharmaBiomedical公司制)、StemPro(Life Technologies公司制、注册商标)、hESF9(Proc NatlAcad Sci U S A.2008Sep 9；105(36):13409-14)、mTeSR1(STEMCELL Technologies公司制)、mTeSR2(STEMCELL Technologies公司制)、TeSR-E8(STEMCELL Technologies公司制)、StemFit(味之素公司制、注册商标)。
工序(1)中的基因改造可以如上所述利用本领域技术人员公知的方法来实施。
本领域技术人员可以为了使双极细胞调控基因的表达或功能消失或减弱而决定如何对双极细胞调控基因进行改造。
作为用于使双极细胞调控基因的表达或功能消失或减弱的一个方式，可以列举双极细胞调控基因的基因缺失，在该方式中，使双极细胞调控基因的碱基序列的一部分或全部缺失。作为碱基序列的部分缺失，可以列举使包含转录起始密码子的区域或对蛋白质的功能而言重要的区域部分缺失。为了挑选基因缺失的多能干细胞，例如也可以利用药剂耐性基因或荧光蛋白对双极细胞调控基因的碱基序列的一部分或全部进行置换。
本领域技术人员可以容易地确认基因进行了改造。作为一个方式，可以列举Southern印迹法、PCR(聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction)法、测序法等。
本领域技术人员可以对进行了基因改造的多能干细胞进行挑选。作为一个方式，可以列举下述方法：在基因改造时导入新霉素耐性基因等药剂耐性基因或编码GFP等荧光蛋白的基因，利用药剂或GFP的荧光对进行了基因改造的细胞进行挑选。
工序(1)中得到的进行了基因改造的多能干细胞在移至工序(2)之前，只要维持其存活状态和多能分化性，可以进行维持培养、扩大培养、保存或其他处理。
维持培养、扩大培养和保存可以利用上述方法等本领域技术人员公知的方法来实施。
在使用冷冻保存的双极细胞调控基因进行了改造的多能干细胞的情况下，可以用将该冷冻细胞融解的工序置换工序(1)。
本领域技术人员可以利用公知的方法将冷冻保存的细胞融解，并供于工序(2)。一个方式中，可以在冷冻保存的细胞的融解后进行该细胞的维持培养或扩大培养。
3-2.关于工序(2)
对于由工序(1)中得到的细胞群得到包含视网膜系细胞的移植用细胞群的方法的具体例进行说明。作为上述工序(2)的分化诱导方法，可以列举例如WO2011/055855、WO2012/173207、WO2013/077425、WO2015/025967、WO2016/063985、WO2016/063986、PLoSOne.2010Jan 20；5(1):e8763.、Stem Cells.2011Aug；29(8):1206-18.、Proc Natl AcadSci USA.2014Jun 10；111(23):8518-23、Nat Commun.2014Jun10；5:4047中公开的方法，但不限定于这些，也可以供于利用本领域技术人员公知的方法将双极细胞调控基因进行了改造的多能干细胞分化诱导成包含视网膜系细胞的移植用细胞群或视网膜组织的其他方法。
作为工序(2)的一个方式，可以通过下述工序(A)～(C)得到包含视网膜系细胞的细胞聚集体。
(A)：通过将工序(1)中得到的进行了基因改造的多能干细胞的细胞群在包含Wnt信号转导通路抑制剂的无血清培养基中进行悬浮培养而形成多能干细胞的细胞聚集体的工序；
(B)：将工序(A)中得到的细胞聚集体在包含基底膜制品的无血清培养基中进行悬浮培养的工序；
(C)：将工序(B)中得到的细胞聚集体在血清培养基中进行悬浮培养的工序。
本方法也公开在例如WO2013/077425中，更详细地，可以参考WO2013/077425。
本发明中的“无血清培养基”是指不含有无调整或未纯化的血清的培养基。本发明中，只要不含有无调整或未纯化的血清，混入有纯化的血液来源成分或动物组织来源成分(例如增殖因子)的培养基也包含在无血清培养基中。
作为该无血清培养基，可以使用市售的添加有适量(例如以体积百分比计为约0.5％～约30％、优选为约1％～约20％)的KSR(Life Technologies公司制、商品名)的无血清培养基。
Wnt信号转导通路抑制剂只要能够抑制由Wnt介导的信号转导则没有特别限定。例如，CKI-7(N-(2-氨基乙基)-5-氯异喹啉-8-磺酰胺)、IWR-1-endo(IWR1e)等为公知的Wnt信号转导通路抑制剂，可以适当获得市售品等。作为Wnt信号转导通路抑制剂，优选使用IWR1e。
所使用的Wnt信号转导通路抑制剂的浓度只要是形成多能干细胞的聚集体的浓度即可。例如在IWR1e的情况下，以约0.1μM～约100μM、优选约1μM～约10μM、更优选约3μM的浓度添加到培养基中。
Wnt信号通路抑制剂可以在悬浮培养开始前添加到无血清培养基中，另外也可以在悬浮培养开始后几天以内(例如5天以内)添加到无血清培养基中。优选Wnt信号通路抑制剂在悬浮培养开始后5天以内、更优选3天以内、最优选在悬浮培养开始的同时添加到无血清培养基中。另外，优选在添加有Wnt信号通路抑制剂的状态下悬浮培养至悬浮培养开始后第18天、更优选悬浮培养至悬浮培养开始后第12天。
作为形成聚集体的实验性操作，可以列举例如使用小孔的板(96孔板)或Micropore等将细胞圈在小空间内的方法、通过使用小的离心管进行短时间离心而使细胞凝聚的方法等。
形成细胞聚集体时的多能干细胞的细胞数只要是能够形成干细胞的均匀聚集体的细胞数则没有特别限定。例如在使用96孔微孔板的情况下，添加以每孔为约1×103细胞～约5×104细胞、优选为约3×103细胞～约3×104细胞、更优选为约5×103细胞～约2×104细胞、最优选为约9×103细胞的方式制备的液体，将板静置，使其形成细胞聚集体。
本领域技术人员可以基于细胞聚集体的尺寸和细胞数、宏观的形态、由组织染色分析得到的微观的形态及其均匀性、分化和未分化标志物的表达及其均匀性、分化标志物的表达调控及其同期性、以及分化效率的聚集体间的重现性等来判断形成了多能干细胞的聚集体。
作为基底膜制品，是指包含在其上接种具有基底膜形成能力的所期望的细胞并进行培养的情况下具有对上皮细胞样的细胞形态、分化、增殖、运动、功能表达等进行调控的功能的基底膜构成成分的制品。在此，“基底膜构成成分”是指在动物的组织中存在于上皮细胞层与***层等之间的呈薄膜状的细胞外基质分子。基底膜制品例如可以通过将经由基底膜粘附在支撑体上的具有基底膜形成能力的细胞使用具有该细胞的脂质溶解能力的溶液、碱溶液等除去来制作。作为优选的基底膜制品，可以列举包含作为基底膜成分市售的商品(例如Matrigel(以下有时称为“Matrigel”))或作为基底膜成分公知的细胞外基质分子(例如层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、内动蛋白等)的基底膜制品。
作为所使用的基底膜制品的量，例如在使用Matigel的情况下，以培养基的体积为基准，可以列举优选为1/20～1/200的量、更优选为约1/100的量。基底膜制品可以在干细胞的培养开始时已经添加到培养基中，但优选在悬浮培养开始后5天以内、更优选在悬浮培养开始后2天以内添加到无血清培养基中。
血清可以使用例如牛血清、小牛血清、胎牛血清、马血清、小马血清、胎马血清、兔血清、小兔血清、胎兔血清和人血清等哺乳动物的血清等。
血清的添加在悬浮培养开始后第7天以后、更优选在第9天以后、最优选在第12天进行。血清按照以体积百分比计为约1％～约30％、优选为约3％～约20％、更优选为约10％(例如5％～15％)的浓度进行添加。
作为工序(2)的另一个方式，可以通过包括下述工序(D)、(E)和(F)的方法得到包含视网膜系细胞的细胞聚集体。
(D)：在不存在饲养细胞的条件下将工序(1)中得到的、双极细胞调控基因进行了改造的多能干细胞在包含1)TGFβ家族信号转导通路抑制剂和/或Sonic Hedgehog信号转导通路激动剂、以及2)未分化维持因子的培养基中进行培养的工序；
(E)：通过将在工序(D)中培养的、双极细胞调控基因进行了改造的多能干细胞在无血清培养基中进行悬浮培养而形成细胞聚集体的工序；
(F)：将在工序(E)中得到的细胞聚集体在包含BMP信号转导通路激动剂的培养基中进一步进行悬浮培养的工序。
本方法也公开在例如WO2016/063985中，更详细地，可以参考WO2016/063985。
TGFβ家族信号转导通路抑制剂表示抑制TGFβ家族信号转导通路、即由Smad家族转导的信号转导通路的物质，具体而言，可以列举TGFβ信号转导通路抑制剂(例如SB431542、LY-364947、SB-505124、A-83-01等)、Nodal/Activin信号转导通路抑制剂(例如SB431542、A-83-01等)和BMP信号转导通路抑制剂(例如LDN193189、Dorsomorphin等)。这些物质有市售，可以获得。
Sonic Hedgehog(以下有时记作“Shh”)信号转导通路激动剂是能够增强由Shh介导的信号转导的物质。作为Shh信号转导通路激动剂，可以列举例如PMA(Purmorphamine)、SAG(Smoothened Agonist)等。
TGFβ家族信号转导通路抑制剂和Sonic Hedgehog信号转导通路激动剂的浓度只要是能够诱导向视网膜系细胞的分化的浓度即可。例如，SB431542通常以0.1～200μM、优选以2～50μM的浓度使用。A-83-01通常以0.05～50μM、优选以0.5～5μM的浓度使用。LDN193189通常以1～2000nM、优选以10～300nM的浓度使用。SAG通常以1～2000nM、优选以10～700nM的浓度使用。PMA通常以0.002～20μM、优选以0.02～2μM的浓度使用。
工序(D)中的无饲养细胞条件下的多能干细胞的培养中，可以使用包含未分化维持因子的上述无饲养细胞培养基作为培养基。
工序(D)中的无饲养细胞条件下的多能干细胞的培养中，为了给多能干细胞提供替代饲养细胞的支架，可以使用适当的基质作为支架。作为能够用作支架的基质，可以列举层粘连蛋白(Nat Biotechnol28,611-615,(2010))、层粘连蛋白片段(Nat Commun 3,1236,(2012))、基底膜制品(Nat Biotechnol 19,971-974,(2001))、明胶、胶原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、内动蛋白、玻璃粘连蛋白蛋白(Vitronectin)等。
工序(D)中的多能干细胞的培养时间只要是能够提高在工序(E)中形成的细胞聚集体的质量的范围则没有特别限定，通常为0.5～144小时。一个方式中，培养时间优选为2～96小时、更优选为6～48小时、进一步优选为12～48小时、更进一步优选为18～28小时(例如24小时)。
无血清培养基的准备和细胞聚集体的形成可以与上述同样地实施。
一个方式中，在工序(E)中使用的培养基包含Sonic Hedgehog信号转导通路激动剂。作为Sonic Hedgehog信号转导通路激动剂，可以以上述浓度使用上述物质。SonicHedgehog信号转导通路激动剂优选从悬浮培养开始时起包含在培养基中。可以在培养基中添加ROCK抑制剂(例如Y-27632)。培养时间例如为12小时～6天。
BMP信号转导通路激动剂是能够增强由BMP介导的信号转导通路的物质。作为BMP信号转导通路激动剂，可以列举例如BMP2、BMP4或BMP7等BMP蛋白、GDF7等GDF蛋白、抗BMP受体抗体或BMP部分肽等。BMP2蛋白、BMP4蛋白和BMP7蛋白例如可以由R&D Systems公司获得，GDF7蛋白例如可以由和光纯药获得。
作为所使用的培养基，可以列举例如添加有BMP信号转导通路激动剂的无血清培养基或血清培养基(优选为无血清培养基)。无血清培养基、血清培养基可以如上准备。
BMP信号转导通路激动剂的浓度只要是能够诱导向视网膜系细胞的分化的浓度即可。例如在人BMP4蛋白的情况下，以约0.01nM～约1μM、优选约0.1nM～约100nM、更优选约1nM～约10nM、进一步优选约1.5nM(55ng/mL)的浓度添加到培养基中。
BMP信号转导通路激动剂在工序(D)的悬浮培养开始起约24小时后以后添加到培养基中即可，例如在悬浮培养开始后几天以内(例如15天以内)添加到培养基中即可。优选BMP信号转导通路激动剂在悬浮培养开始后第1天～第15天之间、更优选在第1天～第9天之间、最优选在第3天添加到培养基中。
上述工序(A)～工序(F)中的培养温度、CO2浓度等培养条件可以适当设定。培养温度例如为约30℃～约40℃、优选为约37℃。另外，CO2浓度例如为约1％～约10％、优选为约5％。
通过改变上述工序(C)或工序(F)中的培养期间，能够制造各种分化阶段的视网膜系细胞。即，能够制造以各种比例包含未成熟的视网膜系细胞(例如视网膜祖细胞、视细胞祖细胞)和成熟的视网膜系细胞(例如视细胞)的视网膜系细胞。通过延长工序(C)或工序(F)的培养期间，能够增加成熟的视网膜系细胞的比例。
也可以通过将利用上述方法得到的视网膜系细胞的细胞聚集体在存在或不存在BMP信号转导通路激动剂的条件下、在包含Wnt信号转导通路激动剂和/或FGF信号转导通路抑制剂的无血清培养基或血清培养基中培养约3天至约6天的期间，然后在不含Wnt信号转导通路激动剂和FGF信号转导通路抑制剂的无血清培养基或血清培养基中培养约30天～约60天来制造睫状体边缘带样结构体。
睫状体边缘带样结构体是与睫状体边缘带类似的结构体。作为“睫状体边缘带(ciliary marginal zone；CMZ)”，可以列举例如作为生物体视网膜中存在于视网膜组织(具体而言为神经视网膜)与视网膜色素上皮的边界区域的组织、且包含视网膜的组织干细胞(视网膜干细胞)的区域。睫状体边缘带也称为睫状体缘(ciliary margin)或视网膜缘(retinal margin)。已知睫状体边缘带对于视网膜祖细胞或分化细胞向视网膜组织的供给、以及视网膜组织结构的维持等发挥重要的作用。作为睫状体边缘带的标志物基因，可以列举例如Rdh10基因(阳性)、Otx1基因(阳性)和Zic1(阳性)。
作为Wnt信号转导通路激动剂，只要是能够增强由Wnt介导的信号转导的物质则没有特别限定。作为具体的Wnt信号转导通路激动剂，可以列举例如GSK3β抑制剂(例如6-溴靛玉红-3’-肟(BIO)、CHIR99021、Kenpaullone)。例如在CHIR99021的情况下，以约0.1μM～约100μM、优选约1μM～约30μM的浓度添加。
作为FGF信号转导通路抑制剂，只要是能够抑制由FGF介导的信号转导的物质则没有特别限定。作为FGF信号转导通路抑制剂，可以列举例如SU-5402、AZD4547、BGJ398等。例如在SU-5402的情况下，以约0.1μM～约100μM、优选约1μM～约30μM、更优选约5μM的浓度添加。
利用上述方法能够制造双极细胞调控基因进行了改造的视网膜系细胞，但不限定于这些方法。
在通过工序(2)得到的包含视网膜系细胞的移植用细胞群中，视网膜祖细胞、视细胞祖细胞和视细胞的细胞数的合计可以为总细胞数的10％以上(优选为20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上或90％以上)。另外，在继续进行通过工序(2)得到的包含视网膜系细胞的移植用细胞群的培养的情况下(例如在工序(2)开始120天以后)、或者在将通过工序(2)得到的包含视网膜系细胞的移植用细胞群移植到生物体内的情况下，在体外或移植后的受体的视网膜中，形成神经视网膜层，构成神经视网膜层的细胞增多。在该阶段，视网膜祖细胞、视细胞祖细胞和视细胞的细胞数的合计可以为总细胞数的30％以上(优选为40％以上或50％以上)，双极细胞祖细胞、锥体双极细胞和杆状双极细胞的细胞数的合计可以为总细胞数的30％以下(优选为20％以下、10％以下或5％以下)。另外，双极细胞的细胞数相对于无长突细胞的细胞数的比例减少(例如70％以下、60％以下、50％以下)。
作为本发明的一个方式，视网膜祖细胞为Chx10阳性细胞、视细胞祖细胞为Crx阳性细胞、视细胞为恢复蛋白阳性细胞。
本领域技术人员可以利用公知的方法测定工序(2)中得到的细胞群中的视网膜祖细胞、视细胞祖细胞和视细胞的比例。作为一个方式，可以利用免疫染色或流式细胞术等方法测定Chx10阳性细胞、Crx阳性细胞、恢复蛋白阳性细胞的含有比例。
本领域技术人员可以利用公知的方法、例如上述方法来确认双极细胞调控基因的改造得以维持。
未分化成双极细胞、或者双极细胞发生了变性死亡可以利用例如免疫染色或流式细胞术等方法通过有无双极细胞标志物PKCα、Chx10等的表达来确认。
双极细胞发生了功能障碍可以利用免疫组织学分析或电生理学分析等方法来确认，例如在无法观察到与视细胞的突触连接或神经放电的情况下，可以判断为双极细胞发生了功能障碍。
另外，正常视细胞的诱导可以利用例如免疫染色或流式细胞术等方法通过有无作为视细胞标志物的恢复蛋白等的表达来确认。
上述细胞的有无和它们的比例也可以由移植后的组织来确认。
4.关于包含视网膜系细胞的移植用细胞群的移植
利用上述方法等制造的包含视网膜系细胞的移植用细胞群可以移植于需要移植的对象(例如哺乳动物)，通过该移植，能够改善对象的视功能。作为可成为对象的哺乳动物，可以列举例如人、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、猫、狗、绵羊、猪、牛、马、山羊、猴等。
包含视网膜系细胞的移植用细胞群可以以细胞聚集体的形态进行移植。另外，也可以使用镊子、刀、剪刀等将通过本发明的制造方法得到的视网膜组织切碎成适当的大小，制成片剂(细胞片)后进行移植。可以列举例如根据视细胞变性的区域的面积，移植一片至多片从一个细胞聚集块上切出的细胞片(例如直径300μm、高度50μm)。本领域技术人员可以根据其发生变性死亡的区域的面积来选择细胞片的片数。此外，也可以对所制造的视网膜系细胞进行酶处理或吹打等操作，以细胞悬浮液的形态进行移植。
包含视网膜系细胞的移植用细胞群优选在制备成药物组合物的基础上进行移植。
细胞悬浮液的移植例如通过使用注射针移植到视网膜下的方法来实施。细胞片的移植例如通过将眼球的一部分切开、通过切开部位将细胞片移植到损伤部位或病变部位来实施。
移植后成活的未成熟视网膜系细胞的至少一部分在对象的生物体内(眼内)的环境下分化诱导为成熟的视网膜系细胞。在此，“移植后诱导的视细胞”是指在对象的眼内由移植后成活的视网膜祖细胞或视细胞祖细胞分化诱导的视细胞。
在此，本发明中的“成活”是指移植后的细胞在生物体内长时间(例如30天以上、60天以上、90天以上)存活并贴附停留在脏器内。
本发明中的“功能性成活”是指移植后的细胞成活、在生物体内发挥出原本的功能的状态。
视细胞的原本的功能是在生物体内与双极细胞接触而形成突触，将由视细胞转换得到的电信号传递至双极细胞。因此，本发明中的“视细胞的功能性成活”是指移植后的视细胞(包括移植后诱导的视细胞)以与宿主侧的双极细胞接触而形成突触、由视细胞转换得到的电信号经由该突触传递至双极细胞的状态成活。视细胞与双极细胞形成了突触可以通过对视细胞侧的突触标志物(例如Ctbp2,Basoon、Cacna1f、ELFN1)、或双极细胞侧的突触标志物(例如mGluR6、Cacna1s、TRPM1)进行染色来确认。具体而言，可以利用免疫染色等方法，通过恢复蛋白阳性细胞(视细胞)与PKCα阳性细胞(双极细胞)的接触面中的上述突触标志物的染色来确认突触形成。本发明中，也可以将移植片的视细胞层与宿主侧的包含双极细胞的视网膜层接触的状态视为视细胞的功能性成活(Stem Cells,31,1149-1159,(2013))。
本发明中的“接触”是指细胞彼此物理性地接近、暗示出突触连接的状态。
本发明中的“接触率”是指移植的视网膜组织的视细胞层与宿主侧的包含双极细胞的视网膜层接触的长度相对于移植的视网膜组织的长径的比例。
本发明中的“功能性成活率”是指移植的细胞中实现功能性成活的细胞的比例。移植后的视细胞的功能性成活率可以由上述接触率求出。
通过移植利用本发明的方法制造的包含视网膜系细胞的移植用细胞群，移植后的视细胞(包括移植后诱导的视细胞)的功能性成活率为10％以上、优选为20％以上、更优选为40％以上、进一步优选为50％以上、特别优选为60％以上。
移植后的视细胞(包括移植后诱导的视细胞)的成活率和/或功能性成活率越高，移植后的视功能的改善效果越高。
因此，本发明提供移植后的视细胞(包括移植后诱导的视细胞)的成活率和/或功能性成活率的改善方法。
5.药物组合物
本发明提供一种药物组合物，其包含有效量的利用上述制造方法制造的包含视网膜系细胞的移植用细胞群。移植用细胞群的有效量根据给药目的、给药方法和给药对象的状况(性别、年龄、体重、病情等)而不同，例如以细胞数计可以设定为1×105个～1×107个(例如1×105个、1×106个或1×107个)。
药物组合物包含有效量的利用本发明的制造方法制造的上述移植用细胞群、和作为药物可接受的载体。
作为药物可接受的载体可以使用生理性的水性溶剂(生理盐水、缓冲液、无血清培养基等)。根据需要，可以在药物组合物中配合在移植医疗中在包含所移植的组织或细胞的药物中通常使用的防腐剂、稳定剂、还原剂、等渗剂等。
本发明的药物组合物可以通过将利用上述制造方法制造的上述移植用细胞群悬浮在适当的生理性水性溶剂中而以细胞悬浮液的形式进行制造。根据需要，也可以添加冻存剂将上述移植用细胞群冷冻保存，在使用时解冻，用缓冲液清洗后用于移植医疗。
也可以使用镊子、刀、剪刀等将利用本发明的制造方法得到的包含移植用细胞群的视网膜组织切碎成适当的大小，制成片剂。
另外，利用本发明的制造方法得到的移植用细胞群也可以通过在进行分化诱导的工序(2)中进行贴壁培养而成形为片状，制成作为细胞片的片剂。
本发明的药物组合物作为基于视网膜系细胞的损害的疾病的治疗药是有用的。
6.治疗药和治疗方法
利用本发明的制造方法制造的包含视网膜系细胞的移植用细胞群对于基于视网膜组织的损害(包括视网膜祖细胞或视网膜系细胞的损害)的疾病的移植医疗是有用的。因此，本发明提供一种基于视网膜组织的损害的疾病的治疗药，其包含利用本发明的制造方法制造的包含视网膜系细胞的移植用细胞群。另外，本发明还提供包括将该治疗药以悬浮液或片剂的形态给药(移植)于患者的治疗方法。作为基于视网膜组织的损害的疾病的治疗药、或者为了在该视网膜组织的损伤状态下补充相应的损伤部位，可以使用利用本发明的制造方法制造的包含视网膜系细胞的移植用细胞群。通过对需要移植的、基于视网膜组织的损害的疾病、或者视网膜组织的损伤状态的患者移植利用本发明的制造方法制造的包含视网膜系细胞的移植用细胞群，补充该视网膜系细胞或受到损害的视网膜组织本身，能够治疗基于视网膜组织的损害的疾病或视网膜组织的损伤状态。作为基于视网膜组织的损害的疾病，可以列举例如作为眼科疾病的、黄斑变性症、老年性黄斑变性、视网膜色素变性、青光眼、角膜疾病、视网膜脱落、中心性浆液性脉络膜视网膜病变、锥体营养不良、锥体-杆体营养不良等。作为视网膜组织的损伤状态，可以列举例如视细胞发生变性死亡的状态等。
移植医疗中，由组织相容性抗原的差异引起的排斥反应经常成为问题，通过使用由移植的受体的体细胞建立的多能干细胞(例如诱导性多能干细胞)，能够克服该问题。即，本发明的优选方式中，通过使用由受体的体细胞建立的多能干细胞(例如诱导性多能干细胞)作为多能干细胞，制造对于该受体而言为免疫学上自体的视网膜组织或视网膜系细胞，并将其移植于该受体。
另外，也可以利用由与受体免疫相容(例如HLA型或MHC型相容)的他人的体细胞建立的多能干细胞(例如诱导性多能干细胞)来制造allo(异体)的视网膜组织或视网膜系细胞，并将其移植于该受体。
实施例
以下列举实施例详细地对本发明进行说明，但本发明并不限定于这些实施例。
实施例1：移植Bhlhb4基因功能缺失的小鼠iPS细胞来源的视网膜组织、使移植组织中的杆状双极细胞减少的示例
依据Nature biotechnology,26(2),215-24,(2008)中记载的方法对由Nrl::eGFP小鼠建立的具有Nrl::eGFP报告基因的小鼠iPS细胞(Stem Cells,31,1149-1159,(2013)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103,pp.3890-3895,(2006))进行未分化维持培养。
作为使Bhlhb4基因(BHLHE23基因的小鼠直系同源基因)的功能缺损的方法，使用CRISPR/Cas9***。通过使SpCas9和靶序列sgRNA(序列号16：ccgagctcaagtcgctgtcg、序列号17：cgcgccttggtgagaaggcg)在细胞内表达，能够对靶序列部位进行切割。利用电穿孔法(商品名：Nucreofector，Lonza公司制)将***有SpCas9和靶序列的质粒导入到小鼠iPS细胞中。在小鼠iPS细胞中导入CRISPR/Cas9以及***有以使包含Bhlhb4基因的起始密码子的区域缺失的方式设计的gRNA和嘌呤霉素耐性基因的质粒。使用嘌呤霉素对导入细胞进行选择，挑取集落，由此建立Bhlhb4基因缺失株。可以通过PCR和琼脂糖凝胶电泳或者读取碱基序列信息来确认Bhlhb4基因的目标部位是否缺失。
作为向视网膜分化诱导的方法，使用对非专利文献2中记载的方法进行了改良的非专利文献5中记载的SFEBq法。分化诱导操作如下进行。首先，通过酶处理使小鼠iPS细胞分散为单个细胞后，以3000个细胞/孔在96孔板中进行悬浮培养。分化诱导开始后第0天～第1天在添加有AGN193109(0.1μM，Toronto Research Chemicals公司制)的培养基中培养上述细胞，然后在添加有AGN193109和低生长因子型Matrigel(2％v/v，BD Biosciences公司制)的培养基中将上述细胞培养至第8天。需要说明的是，“分化诱导开始后第N天”是指分化诱导开始N天后(N×24小时后)至即将经过N+1天((N+1)×24小时)之前为止的期间(以下相同)。作为培养基，使用G-MEM(5％KSR，0.1mM非必需氨基酸，1mM丙酮酸，0.1mM 2-巯基乙醇)。在分化诱导开始后第8天，使用No.11刀片从细胞块上切出视网膜前体组织的上皮结构突出为袋状而成的视泡，在40％O2、5％CO2环境下在DMEM/F12(N2补充剂，10％FBS，0.5μM全反式维甲酸，1mM L-牛磺酸)的培养基中进行悬浮培养。在分化诱导开始后第15天将立体视网膜切出，使用注射器移植到作为视细胞变性模型的rd1小鼠的视网膜下。在相当于移植后分化30-50天时对眼组织进行多聚甲醛固定(PFA固定)并进行蔗糖置换。使用低温恒温器，制作组织切片。使用抗PKCα抗体(商品名：兔抗蛋白激酶Cα抗体、Sigma公司制)、抗钙视网膜蛋白抗体(商品名：兔抗钙视网膜蛋白抗体、Millipore公司制)和抗钙结合蛋白抗体(商品名：单克隆抗钙结合蛋白-D-28K抗体、Sigma公司制)，通过免疫染色分别对组织切片中的杆状双极细胞、无长突细胞和水平细胞进行染色，评价移植后的移植片。
对于染色后的组织，使用共聚焦显微镜(商品名：TCS SP8、Leica公司制)进行荧光观察，考察移植片中的各细胞的比例。其结果可知，与移植未缺失Bhlhb4基因的视网膜组织的情况下相比，在移植缺失了Bhlhb4基因的视网膜组织的情况下，杆状双极细胞的比例显著减少(图1)。
实施例2：移植Bhlhb4基因功能缺失的小鼠iPS细胞来源的视网膜组织、提高与宿主杆状双极细胞的接触率的示例
依据Nature biotechnology,26(2),215-24,(2008)中记载的方法对由Nrl::eGFP小鼠建立的具有Nrl::eGFP报告基因的小鼠iPS细胞进行未分化维持培养。
作为向视网膜分化诱导的方法和移植方法，使用与实施例1同样的方法。在约相当于移植后分化40天和90天时，对眼组织进行PFA固定并进行蔗糖置换。使用低温恒温器，制作组织切片。使用抗PKCα抗体(商品名：兔抗蛋白激酶Cα抗体、Sigma公司制)，通过免疫染色对组织切片中的杆状双极细胞进行染色。
对于染色后的组织，使用共聚焦显微镜(商品名：TCS SP8、Leica公司制)进行荧光观察，考察宿主杆状双极细胞与eGFP阳性移植视细胞接触的部分的长度相对于移植片所存在的部分整体的长度的比率。其结果可知，与移植未缺失Bhlhb4基因的视网膜组织的情况下相比，在移植缺失了Bhlhb4基因的视网膜组织的情况下，与宿主杆状双极细胞接触的移植片来源的视细胞的比例显著增加(图2)。
实施例3：移植ISL1基因功能缺失的小鼠iPS细胞来源的视网膜组织、使移植组织中的杆状双极细胞、无长突细胞和水平细胞减少的示例
依据Nature biotechnology,26(2),215-24,(2008)中记载的方法对由Nrl::eGFP小鼠建立的具有Nrl::eGFP报告基因的小鼠iPS细胞进行未分化维持培养。
作为使ISL1基因的功能缺失的方法，使用CRISPR/Cas9***。在小鼠iPS细胞中，利用电穿孔法(Nucreofector，Lonza公司制)将CRISPR/Cas9以及***有以使ILS1基因的第一外显子和第二外显子缺失的方式设计的靶序列(序列号18：tcttcaatagcacgcgggaa、序列号19：tcctaagccataaagcgctt)和嘌呤霉素耐性基因的质粒导入到小鼠iPS细胞中。使用嘌呤霉素对导入细胞进行选择，挑取集落，由此建立ISL1基因缺失株。通过PCR和琼脂糖凝胶电泳或读取碱基序列信息来确认ISL1基因的目标部位是否缺失。
作为向视网膜分化诱导的方法，使用对非专利文献2中记载的方法进行了改良的非专利文献5中记载的SFEBq法。分化诱导操作如下进行。首先，通过酶处理使小鼠iPS细胞分散为单个细胞后，以3000个细胞/孔在96孔板中进行悬浮培养。分化诱导开始后第0天～第1天在添加有AGN193109(0.1μM)的培养基中培养上述细胞，然后在添加有AGN193109(0.1μM)和低生长因子型Matrigel(2％v/v)的培养基中将上述细胞培养至第8天。作为培养基，使用G-MEM(5％KSR，0.1mM非必需氨基酸，1mM丙酮酸，0.1mM 2-巯基乙醇)。在分化诱导开始后第8天，使用No.11刀片切出视泡，在40％O2、5％CO2环境下在DMEM/F12(N2补充剂，10％FBS，0.5μM全反式维甲酸，1mM L-牛磺酸)的培养基中进行悬浮培养。在分化诱导开始后第15天将立体视网膜切出，使用注射器移植到作为视细胞变性模型的rd1小鼠的视网膜下。在移植后第30～50天对眼组织进行PFA固定并进行蔗糖置换。使用低温恒温器，制作切片。使用抗PKCα抗体、抗钙视网膜蛋白抗体和抗钙结合蛋白抗体，通过免疫染色分别对切片中的杆状双极细胞、无长突细胞和水平细胞进行染色，评价移植后的移植片。
对于染色后的组织，使用共聚焦显微镜(Leica公司制)进行荧光观察，考察移植片中的各细胞的比例。其结果可知，与移植未缺失ISL1基因的视网膜组织的情况下相比，在移植缺失了ISL1基因的视网膜组织的情况下，杆状双极细胞的比例显著减少(图3)。
实施例4：移植双极细胞调控基因功能缺失的小鼠iPS细胞来源的视网膜组织、暗示移植组织中的宿主双极细胞与移植视细胞的突触连接的示例
依据Nature biotechnology,26(2),215-24,(2008)中记载的方法对由Nrl::eGFP小鼠建立的具有Nrl::eGFP报告基因的小鼠iPS细胞进行未分化维持培养。
作为使Bhlhb4基因或ISL1基因缺失的方法，使用与实施例1和3同样的方法。
作为向视网膜分化诱导的方法，使用对非专利文献2中记载的方法进行了改良的非专利文献5中记载的SFEBq法。分化诱导操作如下进行。首先，通过酶处理使小鼠iPS细胞分散为单个细胞后，以3000个细胞/孔在96孔板中进行悬浮培养。分化诱导开始后第0天～第1天在添加有AGN193109(0.1μM)的培养基中培养上述细胞，然后在添加有AGN193109(0.1μM)和在添加有Matrigel(2％v/v)的培养基中将上述细胞培养至第8天。作为培养基，使用G-MEM(5％KSR，0.1mM非必需氨基酸，1mM丙酮酸，0.1mM 2-巯基乙醇)。在分化诱导开始后第8天，使用No.11刀片切出视泡，在40％O2、5％CO2环境下在DMEM/F12(N2补充剂，10％FBS，0.5μM全反式维甲酸，1mM L-牛磺酸)的培养基中进行悬浮培养。在分化诱导开始后第15天将立体视网膜切出，使用注射器移植到作为视细胞变性模型的rd1小鼠的视网膜下。在移植后第30～50天对眼组织进行PFA固定并进行蔗糖置换。使用低温恒温器，制作切片。使用抗PKCα抗体和抗Ctbp2抗体，通过免疫染色分别对切片中的杆状双极细胞和视细胞的突触末端进行染色，评价移植后的移植片。
对于染色后的组织，使用共聚焦显微镜(Leica公司制)进行荧光观察，评价移植组织中的宿主双极细胞与移植视细胞的突触连接。其结果暗示，在移植缺失了BhlhB4和ISL1基因的视网膜组织时，可能与宿主的双极细胞进行突触连接(图4)。
实施例5：对由双极细胞调控基因的功能的缺失所致的杆状双极细胞、无长突细胞和水平细胞的减少进行评价的示例
依据Nature biotechnology,26(2),215-24,(2008)中记载的方法对由Nrl::eGFP小鼠建立的具有Nrl::eGFP报告基因的小鼠iPS细胞进行未分化维持培养。
作为使Bhlhb4基因或ISL1基因缺失的方法，使用与实施例1和3同样的方法。
作为向视网膜分化诱导的方法，使用对非专利文献2中记载的方法进行了改良的非专利文献5中记载的SFEBq法。分化诱导操作如下进行。首先，通过酶处理使小鼠iPS细胞分散为单个细胞后，以3000个细胞/孔在96孔板中进行悬浮培养。分化诱导开始后第0天～第1天在添加有AGN193109(0.1μM)的培养基中培养上述细胞，然后在添加有GN193109(0.1μM)和低生长因子型Matrigel(2％v/v)的培养基中将上述细胞培养至第8天。作为培养基，使用G-MEM(5％KSR，0.1mM非必需氨基酸，1mM丙酮酸，0.1mM 2-巯基乙醇)。在分化诱导开始后第8天，使用No.11刀片切出视泡，在40％O2、5％CO2环境下在DMEM/F12(N2补充剂，10％FBS，0.5μM全反式维甲酸，1mM L-牛磺酸)的培养基中进行悬浮培养。在分化诱导开始后第29天，对组织进行PFA固定并进行蔗糖置换，然后制作切片。通过免疫染色，使用抗视紫红质抗体(Sigma公司制)对成熟视细胞进行染色，使用抗PKCα抗体(Sigma公司制)对杆状双极细胞进行染色，使用抗ISL1抗体(商品名：Anti Islet 1抗体、DSHB公司制)对无长突细胞、水平细胞和双极细胞进行染色，使用抗恢复蛋白抗体(商品名：抗恢复蛋白抗体、Millipore公司制)对视细胞进行染色，使用抗Chx10抗体(商品名：抗Chx10抗体、Exalpha公司制)对双极细胞进行染色，使用抗GS抗体(商品名：抗GS抗体、Millipore公司制)和抗GFAP抗体(商品名：抗GFAP抗体、dako公司制)对米勒胶质细胞进行染色，使用共聚焦显微镜(TCS SP8、Leica公司制)进行荧光观察。
对于染色后的组织，使用共聚焦显微镜(Leica公司制)进行荧光观察，考察分化诱导后的视网膜组织中的各细胞的比例。其结果，缺失了Bhlhb4基因或ISL1基因的iPS细胞来源的聚集体(聚集块)与未缺失Bhlhb4基因和ISL1基因的聚集体同等地观察到Nrl阳性视杆细胞、视紫红质阳性的成熟视细胞、恢复蛋白阳性的视细胞、GS阳性和GFAP阳性的米勒胶质细胞。另一方面，PKCα阳性的杆状双极细胞、Chx10阳性的双极细胞和ISL1阳性细胞减少(图5)。由此可知，在将缺失了BhlhB4基因或ISL1基因的iPS细胞在分化为视网膜系细胞的条件下长期培养的情况下，对于视细胞和米勒胶质细胞没有影响，双极细胞和ISL1阳性细胞显著减少(图5)。
实施例6：建立使ISL1基因的功能缺失的人ES细胞株的示例
依据“Scientific Reports,4,3594(2014)”中记载的方法，将进行了基因改造使其具有Crx::Venus报告基因的人ES细胞(Kh-ES1株、非专利文献3)在无饲养细胞条件下进行培养。作为无饲养细胞培养基，使用StemFit培养基(商品名：AK03N、味之素公司制)，作为替代饲养细胞的支架，使用层粘连蛋白511-E8(商品名、NIPPI公司制)。
具体的人ES细胞的维持培养操作如下进行。首先，将达到亚汇合(培养面积的6成被细胞所覆盖的程度)的人ES细胞(KhES-1株)用PBS清洗后，使用TrypLE Select(商品名、Life Technologies公司制)分散为单个细胞。然后，将分散为单个细胞的人ES细胞接种到用层粘连蛋白511-E8包被的塑料培养皿中，在Y27632(ROCK抑制剂、10μM)存在下在StemFit培养基中在无饲养细胞条件下进行培养。在使用6孔板(IWAKI公司制、细胞培养用、培养面积9.4cm2)作为上述塑料培养皿的情况下，上述分散为单个细胞的人ES细胞的接种细胞数设定为每孔1.2×104细胞。接种1天后，将培养基更换为不含Y27632的StemFit培养基。之后，每1～2天一次用不含Y27632的StemFit培养基进行培养基更换。然后，在接种6天后，培养至达到亚汇合。
作为包含视网膜系细胞的移植用细胞群的制造方法的工序(1)中的CRISPR/Cas9***的导入例，进行以下的操作。首先，将达到亚汇合的人ES细胞用PBS清洗后，使用TrypLESelect分散为单个细胞并回收。然后，使用电穿孔法(商品名：Nucreofector、Lonza公司制)在人ES细胞中导入CRISPR/Cas9以及***有以使ISL1基因的第一外显子和第二外显子缺失的方式设计的gRNA(序列号20：CCAACTCCGCCGGCTTAAAT、序列号21：GGGAGGTTAATACTTCGGAG)和嘌呤霉素耐性基因的质粒。
将利用上述电穿孔法导入了质粒的人ES细胞接种到用层粘连蛋白511-E8包被的塑料培养皿(IWAKI公司制)中，在Y27632(ROCK抑制剂、10μM)存在下在StemFit培养基中在无饲养细胞条件下进行培养。在使用6孔板(IWAKI公司制、培养面积9.4cm2)作为上述塑料培养皿的情况下，上述单个分散的人ES细胞的接种细胞数设定为每孔1×103细胞。接种1天后，将培养基更换为不含Y27632的StemFit培养基。之后，每1天～2天一次用不含Y27632的StemFit培养基进行培养基更换。然后，培养至接种6天后或达到亚汇合1天前。向上述在无饲养细胞条件下培养的亚汇合1天前的人ES细胞中加入嘌呤霉素0.5ng/ml或0.4ng/ml，对质粒导入细胞进行挑选。挑取通过挑选后存活下来的集落并进行基因分析，由此建立ISL1基因缺失株(No.16株和No.19株、图6A的下层)。挑取时，利用TrypLE Select使其分散为单个细胞后，将其一半的量接种到用层粘连蛋白511-E8包被的塑料培养皿(IWAKI公司制)中，在Y27632(10μM)存在下在StemFit培养基中在无饲养细胞条件下进行培养。剩余一半的量作为基因分析用样品进行回收。
通过PCR和琼脂糖凝胶电泳(图6A的中层)、以及考察碱基序列信息(图6B)来确认挑取的集落的人ES细胞的ISL1基因的目标部位是否缺失。
实施例7：使ISL1基因功能缺失的人ES细胞株分化为视网膜的示例
将实施例6中制作的ISL1基因缺失人ES细胞(KhES-1株来源、No.16株和No.19株)在StemFit培养基中在无饲养细胞条件下培养至达到亚汇合1天前。将该亚汇合1天前的人ES细胞在SB431542(TGFβ信号转导通路抑制剂、5μM)和SAG(Shh信号转导通路激动剂、300nM)的存在下(Precondition处理)在无饲养细胞条件下培养1天。
将实施例6中制作的ISL1基因缺失人ES细胞用PBS清洗后，使用TrypLE Select进行细胞分散液处理，进一步通过吹打操作使其分散为单个细胞后，将分散为单个细胞的人ES细胞按照非细胞粘附性的96孔培养板(商品名：PrimeSurface 96孔V型底板，住友电木公司制)的每孔为1.2×104细胞的方式悬浮在100μL的无血清培养基中，在27℃、5％CO2的条件下进行悬浮培养。此时的无血清培养基(gfCDM+KSR)使用在F-12培养基与IMDM培养基的1:1混合液中添加10％KSR、450μM1-单硫代甘油和1×化学成分确定的脂质浓缩物而得到的无血清培养基。
在悬浮培养开始时(悬浮培养开始后第0天)，在上述无血清培养基中添加Y27632(ROCK抑制剂、终浓度20μM)和SAG(Shh信号转导通路激动剂、300nM或30nM)。在悬浮培养开始后第3天，添加不含Y27632和SAG、以终浓度1.5nM包含外源性人重组BMP4(商品名：重组人BMP-4、R&D公司制)的培养基50μL。
对于这样制备的细胞，在悬浮培养开始后第3、6、9、15和18天，使用倒置显微镜进行亮视野观察(图7A)。其结果可知，在ISL1基因功能缺失的人ES细胞株中也形成具有层结构的细胞聚集体(图7A)。
将该悬浮培养开始后第18天的聚集体转移到90mm的低粘附培养皿(住友电木公司制)中，在包含Wnt信号转导通路激动剂(CHIR99021、3μM)和FGF信号转导通路抑制剂(SU5402、5μM)的无血清培养基(在DMEM/F12培养基中添加1％N2补充剂而得到的培养基)中在37度、5％CO2下培养3～4天。然后，在90mm的低粘附培养皿(住友电木公司制)中在不含Wnt信号转导通路激动剂和FGF信号转导通路抑制剂的血清培养基(在DMEM/F12培养基中添加10％胎牛血清、1％N2补充剂、0.5μM维甲酸和100μM牛磺酸而得到的培养基)中长期培养。2～4天一次用上述血清培养基进行半量培养基更换。在悬浮培养开始后第64～65天，使用荧光显微镜对细胞进行观察(图7B)。其结果可知，在ISL1基因功能缺失的人ES细胞株中形成具有CRX阳性的视细胞祖细胞的立体视网膜(图7B)。
将以ISL1基因缺失的人ES细胞作为起始原料制作的、悬浮培养开始后第57、58和59天的细胞聚集体用4％PFA进行固定，制作冷冻切片。对于这些冷冻切片，使用抗ISL1抗体(商品名：Anti Islet-1Antibody、DSHB公司制)进行免疫染色。使用共聚焦荧光显微镜对这些免疫染色的切片进行观察。其结果可知，在由ISL1基因缺失的人ES细胞制作的细胞聚集体中，不表达ISL1蛋白(图7C)。
由这些结果可知，由ISL1基因功能障碍的人ES细胞株能够形成视网膜组织；另外，在ISL1基因功能障碍的人ES细胞株中，不表达ISL1蛋白。
实施例8：移植使ISL1基因功能缺失的人ES细胞株分化而得到的视网膜、并对其成活进行确认的示例
将实施例6中制作的ISL1基因缺失人ES细胞(KhES-1株来源)在StemFit培养基中在无饲养细胞条件下培养至达到亚汇合1天前。将该亚汇合1天前的人ES细胞在SB431542(TGFβ信号转导通路抑制剂、5μM)和SAG(Shh信号转导通路激动剂、300nM)的存在下(预处理)在无饲养细胞条件下培养1天。
将实施例6中制作的ISL1基因缺失人ES细胞用PBS清洗后，使用TrypLE Select进行分散处理，进一步通过吹打操作分散为单个细胞后，将分散为单个细胞的人ES细胞按照非细胞粘附性的96孔培养板(商品名：PrimeSurface 96孔V型底板，住友电木公司制)的每孔为1.2×104细胞的方式悬浮在100μL的无血清培养基中，在37℃、5％CO2的条件下进行悬浮培养。此时的无血清培养基(gfCDM+KSR)使用在F-12培养基与IMDM培养基的1:1混合液中添加10％KSR、450μM 1-单硫代甘油、1×化学成分确定的脂质浓缩物而得到的无血清培养基。
在悬浮培养开始时(悬浮培养开始后第0天)，在上述无血清培养基中添加Y27632(终浓度20μM)和SAG(Shh信号转导通路激动剂、300nM或30nM)。在悬浮培养开始后第3天，添加不含Y27632和SAG而包含人重组BMP4(商品名：重组人BMP-4、R&D公司制、终浓度1.5nM)的培养基50μL。
在这样制备的细胞的悬浮培养开始后第6天，除去培养基60μL，新添加90μL培养基。进一步在悬浮培养开始后第9、12和15天除去培养基85μL，新添加90μL的培养基。
将该悬浮培养开始后第18天的聚集体转移到90mm的低粘附培养皿(住友电木公司制)中，在包含Wnt信号转导通路激动剂(CHIR99021、3μM)和FGF信号转导通路抑制剂(SU5402、5μM)的无血清培养基(在DMEM/F12培养基中添加1％N2补充剂而得到的培养基)中在37℃、5％CO2下培养3～4天。然后，在90mm的低粘附培养皿(住友电木公司制)中在不含Wnt信号转导通路激动剂和FGF信号转导通路抑制剂的血清培养基(在DMEM/F12培养基中添加10％胎牛血清、1％N2补充剂、0.5μM维甲酸和100μM牛磺酸而得到的培养基)中长期培养。2～4天一次用上述血清培养基进行半量培养基更换。在悬浮培养开始后第58～65天，将立体视网膜切出，使用注射器移植到作为视细胞变性模型的视网膜变性大鼠的视网膜下。在移植后第1～2个月，使用荧光眼底装置(商品名：MicronIV、Phoenix research公司制)基于CRX::Venus的荧光对移植片的成活进行观察。其结果，在移植了ISL1基因缺失的视网膜组织的情况下，与移植未使ISL1基因缺失的视网膜组织的情况相比毫不逊色，视网膜组织在视网膜变性大鼠的视网膜下成活(图8)。由此可知，由ISL1基因缺失的人ES细胞分化诱导的视网膜组织在移植后成活。
实施例9：移植使ISL1基因功能缺失的人ES细胞株分化而得到的视网膜、并对双极细胞的比例减少进行确认的示例
将实施例6中制作的ISL1基因缺失人ES细胞(KhES-1株来源)在StemFit培养基中在无饲养细胞条件下培养至达到亚汇合1天前。将该亚汇合1天前的人ES细胞在SB431542(TGFβ信号转导通路抑制剂、5μM)和SAG(Shh信号转导通路激动剂、300nM)的存在下(Precondition处理)在无饲养细胞条件下培养1天。
将上述培养的ISL1基因缺失人ES细胞用PBS清洗后，使用TrypLE Select进行分散处理，进一步通过吹打操作分散为单个细胞后，将分散为单个细胞的人ES细胞按照非细胞粘附性的96孔培养板(商品名：PrimeSurface 96孔V型底板，住友电木公司制)的每孔为1.2×104细胞的方式悬浮在100μL的无血清培养基中，在37℃、5％CO2的条件下进行悬浮培养。此时的无血清培养基(gfCDM+KSR)使用在F-12培养基与IMDM培养基的1:1混合液中添加10％KSR、450μM 1-单硫代甘油、1×化学成分确定的脂质浓缩物而得到的无血清培养基。
在悬浮培养开始时(悬浮培养开始后第0天)，在上述无血清培养基中添加Y27632(终浓度20μM)和SAG(Shh信号转导通路激动剂、300nM或30nM)。在悬浮培养开始后第3天，添加不含Y27632和SAG而包含人重组BMP4(商品名：重组人BMP-4、R&D公司制、终浓度1.5nM)的培养基50μL。
在这样制备的细胞的悬浮培养开始后第6天，除去培养基60μL，新添加90μL培养基。进一步在悬浮培养开始后第9、12和15天除去培养基85μL，新添加90μL的培养基。
将该悬浮培养开始后第18天的聚集体转移到90mm的低粘附培养皿(住友电木公司制)中，在包含Wnt信号转导通路激动剂(CHIR99021、3μM)和FGF信号转导通路抑制剂(SU5402、5μM)的无血清培养基(在DMEM/F12培养基中添加1％N2补充剂而得到的培养基)中在37℃、5％CO2下培养3～4天。然后，在90mm的低粘附培养皿(住友电木公司制)中在不含Wnt信号转导通路激动剂和FGF信号转导通路抑制剂的血清培养基(在DMEM/F12培养基中添加10％胎牛血清、1％N2补充剂、0.5μM维甲酸和100μM牛磺酸而得到的培养基)中长期培养。2～4天一次用上述血清培养基进行半量培养基更换。在悬浮培养开始后第58～65天，将所得到的立体视网膜组织切出，使用注射器移植到作为视细胞变性模型的视网膜变性大鼠的视网膜下。在相当于移植后分化240～270天时对眼组织进行PFA固定并进行蔗糖置换。使用低温恒温器，制作组织切片。使用抗Nuclei抗体(商品名：抗Nuclei、Millipore公司制)、抗Chx10抗体(商品名：Chx10抗体、EX alpha公司制)和抗Pax6抗体(商品名：抗Pax6抗体、Covance公司制)，通过免疫染色分别对组织切片中的人细胞、双极细胞和无长突细胞进行染色，评价移植后的移植片。将未使Islet-1基因缺失(野生型)的视网膜组织和使Islet-1基因缺失的视网膜组织分别进行三切片染色，对一个切片进行两处拍摄。
对于染色后的组织，使用共聚焦显微镜(商品名：TCS SP8、Leica公司制)进行荧光观察，考察三切片各两处的、移植片中的人细胞来源的双极细胞和无长突细胞的比例。将其代表性的照片示于图9A。由图9A确认，与移植野生型视网膜组织的情况下相比，在移植了使Islet-1基因缺失的视网膜组织的情况下，Chx10阳性细胞(即双极细胞)的比例减少。另外，图9B中示出将其比例数值化而得到的图。由图9B也确认到同样的结果。即可知，与移植未使Islet-1基因缺失的视网膜组织的情况下相比，在移植了使Islet-1基因缺失的视网膜组织的情况下，无长突细胞(Am)相对于全部人细胞的比例基本不变，与此相对，双极细胞(Bp)相对于全部人细胞的比例减少。启示出：通过移植片来源(人来源)的双极细胞的比例的减少，移植片来源的视细胞与宿主侧(小鼠侧)的双极细胞的接触的比例提高，该视网膜组织的移植后的功能性成活改善。
产业上的可利用性
根据本发明，能够得到适合于移植的视网膜组织。
序列表
<110> 大日本住友制药株式会社（Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.）
国立研究开发法人理化学研究所（RIKEN）
<120> 移植用细胞群及其制造方法（Cell population for transplantation andmethod for producing same）
<130> FP17-0626-00
<150> JP2016-229355
<151> 2016-11-25
<150> JP2017-138142
<151> 2017-7-14
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 11607
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
gaaggaagag gaagaggagg agagggaggc cagagccaga acagcccggc agcccgagct 60
tcgggggaga acggcctgag ccccgagcaa gttgcctcgg gagccctaat cctctcccgc 120
tggctcgccg agcggtcagt ggcgctcagc ggcggcgagg ctgaaatatg ataatcagaa 180
cagctgcgcc gcgcgccctg cagccaatgg gcgcggcgct cgcctgacgt ccccgcgcgc 240
tgcgtcagac caatggcgat ggagctgagt tggagcagag aagtttgagt aagagataag 300
gaagagaggt gcccgagccg cgccgagtct gccgccgccg cagcgcctcc gctccgccaa 360
ctccgccggc ttaaattgga ctcctagatc cgcgagggcg cggcgcagcc gagcagcggc 420
tctttcagca ttggcaaccc caggggccaa tatttcccac ttagccacag ctccagcatc 480
ctctctgtgg gctgttcacc aactgtacaa ccaccatttc actgtggaca ttactccctc 540
ttacagatat gggagacatg ggagatccac caaaaagtaa gaggctattt taccttgtgg 600
ggctcggtgt gctgttcttg tgcggggttc tctctcaggc acaggctgag gtgccaaggg 660
ctctttggag ttggagtcat tgcctggaga aagagaaaag gtggcttttt cttgttgccg 720
ccacgcctgc atgcttactg tcggttctta tcttcgggaa actgattgta ccttgtgtgt 780
gaattcgcct gtgtgccctc caaagctcta gctttctggt gctaagcggt gatttcctcc 840
tggggaatcc tgagctctcc gagaaggtta ttatgttgca aaggtctgcc tgcacagtca 900
atgcccagag atgtgaatta gcattagact tgcaaaagag aacgagtgac aactgtattt 960
atgcctgctc ttgctaacaa tatccagtcc tgtgtgctat ttaagagcgc gcttcacgga 1020
aaatatagac atccctgcgt tcacttaacg cttctagtca aaaccttttc tttgacttga 1080
cttatccata atctttccca atgattatag caaagaggaa gggggggggg agaaatacaa 1140
aatgagcggg tttgattgcg tgctaggcgt acaaatgtag actattccaa tctgcatttt 1200
acatatattc cacctccttt taaaaatgag tcaaggtttt gatggcacat ttcaattacc 1260
atcccaaagt gcaatgctct aaaaaaaaaa aaaaagaaag aaagaaagaa agaaaaaaac 1320
ctcccagagt acgccctata agagaacgac actaaaagtg tgtttatctc tgtaggaagt 1380
aaacggttag tcaatcatgt atttattttc atttcagaaa aacgtctgat ttccctatgt 1440
gttggttgcg gcaatcagat tcacgatcag tatattctga gggtttctcc ggatttggaa 1500
tggcatgcgg catgtttgaa atgtgcggag tgtaatcagt atttggacga gagctgtaca 1560
tgctttgtta gggatgggaa aacctactgt aaaagagatt atatcaggta tggcatttac 1620
acttctttct taattttgtg ggatttccct gaatctcccc actctttatg tattatttgg 1680
tgtggctttg tctttttgtg aagtttgcct cagtgtagtc atacaagcca aagttaccct 1740
gtacatgtgt taaaaaaatc aagctatgct gttcatttca ttctttagtt gagaaaaaca 1800
aaaaccctta acagtggtat tcataattcc ggggtattga ggcttgttta attactcttg 1860
gagtttatga tgcacaaatt attttcctct ttcaccctcc cccttacaaa acaaaatttt 1920
aaaaagatgg agaagtttgg atttttagct ttaaaatagg gttgattttt gttgtatagt 1980
gcagtgttct gtttgtttta gtccttttta aaattagtag cttacaaatt ctttggtggc 2040
atcaatgcaa taggtgaaat aaaagtttga ccgaagcatg tttagagatg tactttgaaa 2100
gagcgagtac aggtattgct ccttttattt ttggggtaag acctccttct gagaaaaatt 2160
taaaaccaac ctaaatattc cttggaaaaa acaccggaaa cttaatcttt ttaaatatta 2220
accctttggt gacatctaac tgtctcttct ttcttatctt atctgagctg atgaattaga 2280
gcagatcaaa ttgcccatca tctgtctacg aacaattggt atatttagat aattgaacag 2340
cttcctttct cacattaaaa tctggtaact gataaaatga gcgaattgtc caaattgaca 2400
agactgaaac aacataggaa ctttctgagt ttggttttgt tgttttggag agtttttgtt 2460
ttttttttcc tccaatttat tctgcaacac gttttgctaa tctcaagttt cctctgactt 2520
gtgtgtatgt atcagaaact ttgttttctg ccttagaaag ccagtagtct ctaaagaaaa 2580
ttgtattcat tttattaaca aacagaagag acatcagcat cattattatg ttaaataata 2640
gcaaaatatc actttttaaa tgtccggtgg ctattaacaa gtaattaatt agcttttgtt 2700
aggcaaatgg tttctggagc ttgagaactt ttattaaagt ttagttaaga tttaatatac 2760
agtcacagtt tgctcctgct cacttagtat ccagcatttt tttcttcttt tttaaaaatc 2820
atgacacaga gagtataatc ttggtagata aaattaacct ggttggggga ggttaatact 2880
tcggagaggg agtgaaagga agtaagggaa gtcggggtac aggaaggggg agggattttc 2940
taaattgttt ggtcaccgcc aaagtcaagt cttcacccta tgaaatggaa gatctcacat 3000
tgagtaggcg gagggaggaa aaacttttga gtccaccttc taacctctga caaatgagcg 3060
ttttcattgt ttactagatt ggtgtgtaaa cgcaagattc tagagaagga gagcccactt 3120
caggagtatc tttactgcta tggaaatagt attttgctca attgcacaca ggcttgcatg 3180
tgcctaattc tggatacaca catgtgtaga aggaactaat catttttacc ttctcttcac 3240
tctctctcaa ctctgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt aatcttgtag 3300
ttgtaaaagc agaacagact ggacagttag atttccacat ctctccttgg agaagcagga 3360
tgcctcctcc tgttatgtgg atcttttcct ctctcttcca ttctttctgt tcgtaggaat 3420
gccccagctt ctgttattcc tgaaagatgg agaaggggcc agggaagtgc agcctagatg 3480
gaacctataa agattgtccc ttggtaagga aaggccagga gtgagaaaga ccttagaagc 3540
gggtctttgc atttttttca ttctggtcat ggttttcaag aaaattgaaa tgaggtagat 3600
gattcagcaa cttgaaaaag attgagggaa cagacgcaga tttttttaaa aaaataataa 3660
tacaaggaag aatggagagg aaattttctg ttaacattgc tgcctgaaga aaatctttag 3720
ttggagaaag actggaaagt acttgtgcaa aaggagatgt ggaaactctc agaggtttca 3780
ttttgttatt ctgcttgttt atttgtgagt gtttgcaaac cgagtggggt gacaatcccc 3840
ttctcctacc tccttttttc ttggaaggag gactttttgt tgcagtttta gacatttcta 3900
gcagcagaaa ttgtgggata gggaagtgaa agtgttggtg tcggtggcca ccagagtctt 3960
tctggattcc ttcctgccaa gatctgcaag atcaacactg ggattgattg ctagagcagc 4020
agcccgagtt tggaacccat caatacattt tctgtggtac aagctaggtg ttttgagcta 4080
agagttacca actaagacag aggttcatcg gaaaggaaac gggagtaaaa gaaagggagg 4140
agggagggag gggaaaagag agatggggga aggaagagag acagggaagg agagagcagg 4200
gtttcatttc tgtccttctg tttccaactt ctgtttggaa atgctgttta cttggggcgt 4260
cttgcccggg atcttgggcc agggaagtgc cggcctgaag tgaccccctc ttcctgtact 4320
tctctccccg ctctgggccg cctccgctcc cccctccccc gcacaggttg tacgggatca 4380
aatgcgccaa gtgcagcatc ggcttcagca agaacgactt cgtgatgcgt gcccgctcca 4440
aggtgtatca catcgagtgt ttccgctgtg tggcctgcag ccgccagctc atccctgggg 4500
acgaatttgc gcttcgggag gacggtctct tctgccgagc agaccacgat gtggtggaga 4560
gggccagtct aggcgctggc gacccgctca gtcccctgca tccagcgcgg ccactgcaaa 4620
tggcaggtac tcctctgccc ggctcgggta ggcaggcgcc aggttaagcc agcctgtgtg 4680
ccagcggcca caacaactat ggtagctaca ggggtggtcg tagtgtttgc ctgcagttaa 4740
atgaagtgtt ctgtatgcaa tttgcgctgt gctctgctcc tttgcagcaa ggttcaatgc 4800
actcactgtc tcccttgatt ccccgagcac acctacaccg tctgtgtgtc tctatatggt 4860
tacacataaa tgtacaccac ttgtgtacac gtgtatacac acgcccaaac attacttcca 4920
gttcgctctg gcctccaaac cttggcttgc tgaaaacggg cttcagctcc cagccaggta 4980
ttctcctgct gcctaattaa aggggcggag ccccgggtcc ctggagcttc atcctttaac 5040
ccaatgaagg aagcttaggt ggcctgaagt catttagtct cccaaatcct ttttccttgt 5100
gagttgcttc acactcgaaa tttttttttt aattttttta tctttctgtg agagaacagg 5160
actgaaaaga tacagtttta aaaactgcag gccattgcac agagttgtaa tataaaactg 5220
tcaacaagct tatctgcagt aattgccttt taaagggagc ctgcttcttt aaatcattca 5280
ttctatatga tttggtgaga atttcatctt caggcccatg gttgtagctc taaattgacc 5340
ccataggtgt tggcctgacc ctagggggtt gtagaaggtg caggatttgt atcatgtaga 5400
taagaggact cattcccaag gaagaggagt ggaaacacag caaggttggc cgggaccaaa 5460
gcagtgggtt agaaggtgga cagtgtttcc aaacctgact tcctgccatg aatagatcta 5520
cccctttgca gttttaaagt atcaattccc actaaacact gaaggtgagg aaactatagc 5580
cctcccttac ccttctgcct tctggcagct ctaagaattc tgttcagggg gatttgtgac 5640
tagtttgcac cggggcacgg ctggggtggt gctcctgttc agtggagcct gcactctgct 5700
tgtggggaag cacagaggaa gctaaaatac cgagagggag gcgggggaca tctcccagcc 5760
accgtttatc tagagcctag gcagctcaac agagtttccg ttttccactg cttgggatca 5820
gcccatctca ggaacatcca tgtattacct tagatttaat actaagagca gggattggag 5880
atatggcaga aatagcgaat ctcttcagcc ccttcacatg actgtcctct cggactgaag 5940
ttcaaggcgt tctggcagag ttctcgacct tccccttgca gaagtccctg ctggtgtagt 6000
atttatggct gtcactgaag tgctctgcgt tcctttccct ggtaccctct gtggccttgg 6060
cccaagagaa aattctgatc ctggagaggg tggtaatcaa tgtaactggg gcccagtctg 6120
ggcacaagga aaggtgagaa tggaggagaa acagtgctga aaaatgccac ccctgctgtg 6180
aacaggggga cagactttga gacctgcttc ccttggctaa cactttgttg acacgaggag 6240
gggcgagtgc tgcgtttcag gccgggatta ctcagcaaag acctctgcag attagagagg 6300
aagattttat tctccctttc accctcttcg cccccacctc tgccgccccc tgctttgtgt 6360
gctgaggctg caaaccctag ccattgtcct gagtatctcg ggcgggcgag caagtaagcg 6420
ggcgggcggg cgggcaagcg agcgagcgag cgagcgcgcg accgcgggcg ggccggcaag 6480
cgagcctcca gcccagcgct cacggcgctc cttgccccgc agcggagccc atctccgcca 6540
ggcagccagc cctgcggccc cacgtccaca agcagccgga gaagaccacc cgcgtgcgga 6600
ctgtgctgaa cgagaagcag ctgcacacct tgcggacctg ctacgccgca aacccgcggc 6660
cagatgcgct catgaaggag caactggtag agatgacggg cctcagtccc cgtgtgatcc 6720
gggtctggtt tcaaaacaag cggtgcaagg acaagaagcg aagcatcatg atgaagcaac 6780
tccagcagca gcagcccaat gacaaaactg tgagtggctc tggggccggg cagggaatgc 6840
gagggggaag gagacgcagc gtgcgaggtg cgttcctggt acgcaggatc gcacggtttt 6900
caatcctgct cctgggcagg agtttggccg gggctgcccc tcatccttac ccccctaccc 6960
atgccccggg ggacaggcta cccggcgccg gccgccagct gagggcgggg aagctgggag 7020
gctccgtgcg ccgggggagc agcatccagg tcccaacctc gtgggtgggc tcatgccctt 7080
ccacctcgcc tgtacctgtg aaccggagaa acgccgtcct cccctctgag ggcaggcggc 7140
aacgaggttt ggcccgggtt ttgccaacat tcagatcgtc agttcctcac gtacacaaga 7200
agagggaggg ataatacctt ggattcctgc ctacatccag gggttccgtg ggcaggtcac 7260
cctgtgagcc cccagggcgc accgcacttc taagtaaggt cggccgctgc gccttcaggc 7320
tggcgagttc ccccaaggtg acccgcatgc ccagatcacc ctctgctcca ggtgaagccc 7380
aggcctccac agaggcatca ggcccctcgc accagtatcc actgttatct tggtcccacg 7440
gaagcaccca ctctgcaggc ctcctggtga agttaagcta gagtttcttt tcttcctttt 7500
tttcttttct ttctttttct tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttact 7560
gctttggacc tatttttaaa tgccataaaa tctgctgtca ttaaacttgg caggctggcc 7620
aagattgggc cagggcactt tctgagttgg ttagtgcata atagcacaat aggaaccaga 7680
cccaaatgct ttggggggat ggagtggggg gctggctctt ccttgaggag aacggcttgg 7740
aaaaaatctg cagctaactg aaactgctca gaaaaccacc ctgtctagag gctgaaggga 7800
agccctgctt acctcagctt tttagttctg ggaagctatg gtctgagaag gcagagggga 7860
ggaattgggc tgagctgtga aggtaagggg gaagaagaaa atcaaagtag aatttggttt 7920
aataaggtcc atgcagacct aatagtccag cccacagagg cagaaaaaca aaacaataaa 7980
acaaattgaa ttctaactaa tatccgtagg tacggcggat taactgagtc aataaagacc 8040
actatataga taagataata ccagggtata tttgcttagc ctgtgcagac aacggaggga 8100
gggaatttgc tcattaacat gttgggattg gttggggggc ctattcacag aatatccagg 8160
ggatgacagg aactcccatg gtggctgcca gtccagagag acacgacggt ggcttacagg 8220
ctaacccagt ggaagtacaa agttaccagc caccttggaa agtactgagc gacttcgcct 8280
tgcagagtga catagatcag cctgcttttc agcaactggt aagtgtcagc tcccagatgg 8340
aagaggctga attcccaaca ggagactctg gtttaactgt cacacattga aagattcagt 8400
ggggagggtg ccttcttggg ctcagggttg gggagaaacc aaggaggtgg gtaatgaaga 8460
gaagggagac aaatgcaggg aaaacgaacc tcttggcatc tttttttttt taatgagact 8520
gcataatttg accatatagg ttgaattttc tatcaatcag gccttctttg aaggattaat 8580
ttcaaggtac ctaactctag gtagcatgtg ccagaagatg tacagtgttg gagaatcata 8640
catcttagaa ttttagagtt gtcaaggact tcaggaaatc gtcttggcat ttcaatcagc 8700
aattagtaag tttatccttc ctgagcatct agagaatggg atatatagga cccaaatcaa 8760
ggcgattgta gtatataatc aatgctataa tacacaatca gtgttgttat caataaacag 8820
caggcatgtg tctgggtaca attttcaaat atattaataa agattattca aatagatgaa 8880
tactttttgt tacagtatcc cttgctggga atgtcttaat ctaaaatgta ggaccgttta 8940
aatgttttca agtgtatgag ttcaaatgtc atagagacac acagtgtgta ccatgtatag 9000
caaaagggac atgagctcta ccaatcagaa gtaaagtgtt taatctgtga aaaccttaac 9060
atgttttcca catccagaga ggagaaaatt aattcacttt ttgcctacaa aaggcttaag 9120
gggtcaagat aaataagaac aataaatata tgtcctttgt aatatgctat atttatatag 9180
atgatttttt tttcttaaag agtaatcagc cttatagaat cttgttttat aaaatgtaaa 9240
gatctatcct gaaaccttgt tccctttttt ggaaatgaag ctttagttga ggttagcttt 9300
ttaccctcat atttacctgg agggcatttg ctttctcaat gtcaacagtt aggtaattgg 9360
ccagaggcaa gtggttaaaa gggcttggcc ccaggcttgt gtttgcaaat gctaagtggg 9420
tgcagaggct agaagtccct taatctcata ttggaaaaat ttactgtaga aagaaatgta 9480
ggctctagaa ctaggaaaaa aaaattattc taagctcatt aatctgttga gttatttgag 9540
cgaatcctga atcacaggag gaaggtaagg ggaggcttca gggcagccaa atgtttgcac 9600
tttctgaaac tttagtgtca gatgagagca gtggaaggga agctgaggca ggagtgggca 9660
tagttagaga aggtttacaa cagcagtaca atgcgtttag ggttaaaaga aggagtcaga 9720
tatttaagaa ggagtcagat attagggtta aaagaaggag tcagaatggg atgatgtcat 9780
aatatatggg tctcattttg gaaggaagag cctgatttaa agagagagag agagaaaggc 9840
caagaggcag caggaccaac aaggaagaat gcccaagctg tgagcctgct gaggagttaa 9900
tctttgttct gtggagcctc ctctcaatct cctgtcaaag gatctgagcc tgttacggat 9960
tttccaactg aagaagagag tctttgatgc ctagagactg agagctcacc tactcccagg 10020
gcaacatgta gccagcagga taattttatt tcgagcatgc atagtagagt tgtgatgcca 10080
ttttacagtg ggaaacacat ttgttcttaa ataatttaat gcaacataat gttgggaatt 10140
cagtttcagt taaaacagag atcttttgga agatgggaaa gtgagaggat ttcttcccaa 10200
gtttttctcc tctaggcttt ctctaagcct gttaaaattc agttatctat gtgaatatct 10260
ttacatatct atctacacaa acatttctac atatacaata tgatgagttt ataatctttt 10320
tatgaatact attccagtgt cctttattta tttctcaacc ttctatgcag gtcaattttt 10380
cagaaggagg accgggctct aattccactg gcagtgaagt agcatcaatg tcctctcaac 10440
ttccagatac acctaacagc atggtagcca gtcctattga ggcatgagga acattcattc 10500
tgtatttttt ttccctgttg gagaaagtgg gaaattataa tgtcgaactc tgaaacaaaa 10560
gtatttaacg acccagtcaa tgaaaactga atcaagaaat gaatgctcca tgaaatgcac 10620
gaagtctgtt ttaatgacaa ggtgatatgg tagcaacact gtgaagacaa tcatgggatt 10680
ttactagaat taaacaacaa acaaaacgca aaacccagta tatgctattc aatgatctta 10740
gaagtactga aaaaaaaaga cgtttttaaa acgtagagga tttatattca aggatctcaa 10800
agaaagcatt ttcatttcac tgcacatcta gagaaaaaca aaaatagaaa attttctagt 10860
ccatcctaat ctgaatggtg ctgtttctat attggtcatt gccttgccaa acaggagctc 10920
cagcaaaagc gcaggaagag agactggcct ccttggctga aagagtcctt tcaggaaggt 10980
ggagctgcat tggtttgata tgtttaaagt tgactttaac aaggggttaa ttgaaatcct 11040
gggtctcttg gcctgtcctg tagctggttt attttttact ttgccccctc cccacttttt 11100
ttgagatcca tcctttatca agaagtctga agcgactata aaggtttttg aattcagatt 11160
taaaaaccaa cttataaagc attgcaacaa ggttacctct attttgccac aagcgtctcg 11220
ggattgtgtt tgacttgtgt ctgtccaaga acttttcccc caaagatgtg tatagttatt 11280
ggttaaaatg actgttttct ctctctatgg aaataaaaag gaaaaaaaaa aaggaaactt 11340
tttttgtttg ctcttgcatt gcaaaaatta taaagtaatt tattatttat tgtcggaaga 11400
cttgccactt ttcatgtcat ttgacatttt ttgtttgctg aagtgaaaaa aaaagataaa 11460
ggttgtacgg tggtctttga attatatgtc taattctatg tgttttgtct ttttcttaaa 11520
tattatgtga aatcaaagcg ccatatgtag aattatatct tcaggactat ttcactaata 11580
aacatttggc atagataaat aaataaa 11607
<210> 2
<211> 2729
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (549)..(1598)
<400> 2
gaaggaagag gaagaggagg agagggaggc cagagccaga acagcccggc agcccgagct 60
tcgggggaga acggcctgag ccccgagcaa gttgcctcgg gagccctaat cctctcccgc 120
tggctcgccg agcggtcagt ggcgctcagc ggcggcgagg ctgaaatatg ataatcagaa 180
cagctgcgcc gcgcgccctg cagccaatgg gcgcggcgct cgcctgacgt ccccgcgcgc 240
tgcgtcagac caatggcgat ggagctgagt tggagcagag aagtttgagt aagagataag 300
gaagagaggt gcccgagccg cgccgagtct gccgccgccg cagcgcctcc gctccgccaa 360
ctccgccggc ttaaattgga ctcctagatc cgcgagggcg cggcgcagcc gagcagcggc 420
tctttcagca ttggcaaccc caggggccaa tatttcccac ttagccacag ctccagcatc 480
ctctctgtgg gctgttcacc aactgtacaa ccaccatttc actgtggaca ttactccctc 540
ttacagat atg gga gac atg gga gat cca cca aaa aaa aaa cgt ctg att 590
Met Gly Asp Met Gly Asp Pro Pro Lys Lys Lys Arg Leu Ile
1 5 10
tcc cta tgt gtt ggt tgc ggc aat cag att cac gat cag tat att ctg 638
Ser Leu Cys Val Gly Cys Gly Asn Gln Ile His Asp Gln Tyr Ile Leu
15 20 25 30
agg gtt tct ccg gat ttg gaa tgg cat gcg gca tgt ttg aaa tgt gcg 686
Arg Val Ser Pro Asp Leu Glu Trp His Ala Ala Cys Leu Lys Cys Ala
35 40 45
gag tgt aat cag tat ttg gac gag agc tgt aca tgc ttt gtt agg gat 734
Glu Cys Asn Gln Tyr Leu Asp Glu Ser Cys Thr Cys Phe Val Arg Asp
50 55 60
ggg aaa acc tac tgt aaa aga gat tat atc agg ttg tac ggg atc aaa 782
Gly Lys Thr Tyr Cys Lys Arg Asp Tyr Ile Arg Leu Tyr Gly Ile Lys
65 70 75
tgc gcc aag tgc agc atc ggc ttc agc aag aac gac ttc gtg atg cgt 830
Cys Ala Lys Cys Ser Ile Gly Phe Ser Lys Asn Asp Phe Val Met Arg
80 85 90
gcc cgc tcc aag gtg tat cac atc gag tgt ttc cgc tgt gtg gcc tgc 878
Ala Arg Ser Lys Val Tyr His Ile Glu Cys Phe Arg Cys Val Ala Cys
95 100 105 110
agc cgc cag ctc atc cct ggg gac gaa ttt gcg ctt cgg gag gac ggt 926
Ser Arg Gln Leu Ile Pro Gly Asp Glu Phe Ala Leu Arg Glu Asp Gly
115 120 125
ctc ttc tgc cga gca gac cac gat gtg gtg gag agg gcc agt cta ggc 974
Leu Phe Cys Arg Ala Asp His Asp Val Val Glu Arg Ala Ser Leu Gly
130 135 140
gct ggc gac ccg ctc agt ccc ctg cat cca gcg cgg cca ctg caa atg 1022
Ala Gly Asp Pro Leu Ser Pro Leu His Pro Ala Arg Pro Leu Gln Met
145 150 155
gca gcg gag ccc atc tcc gcc agg cag cca gcc ctg cgg ccc cac gtc 1070
Ala Ala Glu Pro Ile Ser Ala Arg Gln Pro Ala Leu Arg Pro His Val
160 165 170
cac aag cag ccg gag aag acc acc cgc gtg cgg act gtg ctg aac gag 1118
His Lys Gln Pro Glu Lys Thr Thr Arg Val Arg Thr Val Leu Asn Glu
175 180 185 190
aag cag ctg cac acc ttg cgg acc tgc tac gcc gca aac ccg cgg cca 1166
Lys Gln Leu His Thr Leu Arg Thr Cys Tyr Ala Ala Asn Pro Arg Pro
195 200 205
gat gcg ctc atg aag gag caa ctg gta gag atg acg ggc ctc agt ccc 1214
Asp Ala Leu Met Lys Glu Gln Leu Val Glu Met Thr Gly Leu Ser Pro
210 215 220
cgt gtg atc cgg gtc tgg ttt caa aac aag cgg tgc aag gac aag aag 1262
Arg Val Ile Arg Val Trp Phe Gln Asn Lys Arg Cys Lys Asp Lys Lys
225 230 235
cga agc atc atg atg aag caa ctc cag cag cag cag ccc aat gac aaa 1310
Arg Ser Ile Met Met Lys Gln Leu Gln Gln Gln Gln Pro Asn Asp Lys
240 245 250
act aat atc cag ggg atg aca gga act ccc atg gtg gct gcc agt cca 1358
Thr Asn Ile Gln Gly Met Thr Gly Thr Pro Met Val Ala Ala Ser Pro
255 260 265 270
gag aga cac gac ggt ggc tta cag gct aac cca gtg gaa gta caa agt 1406
Glu Arg His Asp Gly Gly Leu Gln Ala Asn Pro Val Glu Val Gln Ser
275 280 285
tac cag cca cct tgg aaa gta ctg agc gac ttc gcc ttg cag agt gac 1454
Tyr Gln Pro Pro Trp Lys Val Leu Ser Asp Phe Ala Leu Gln Ser Asp
290 295 300
ata gat cag cct gct ttt cag caa ctg gtc aat ttt tca gaa gga gga 1502
Ile Asp Gln Pro Ala Phe Gln Gln Leu Val Asn Phe Ser Glu Gly Gly
305 310 315
ccg ggc tct aat tcc act ggc agt gaa gta gca tca atg tcc tct caa 1550
Pro Gly Ser Asn Ser Thr Gly Ser Glu Val Ala Ser Met Ser Ser Gln
320 325 330
ctt cca gat aca cct aac agc atg gta gcc agt cct att gag gca tga 1598
Leu Pro Asp Thr Pro Asn Ser Met Val Ala Ser Pro Ile Glu Ala
335 340 345
ggaacattca ttctgtattt tttttccctg ttggagaaag tgggaaatta taatgtcgaa 1658
ctctgaaaca aaagtattta acgacccagt caatgaaaac tgaatcaaga aatgaatgct 1718
ccatgaaatg cacgaagtct gttttaatga caaggtgata tggtagcaac actgtgaaga 1778
caatcatggg attttactag aattaaacaa caaacaaaac gcaaaaccca gtatatgcta 1838
ttcaatgatc ttagaagtac tgaaaaaaaa agacgttttt aaaacgtaga ggatttatat 1898
tcaaggatct caaagaaagc attttcattt cactgcacat ctagagaaaa acaaaaatag 1958
aaaattttct agtccatcct aatctgaatg gtgctgtttc tatattggtc attgccttgc 2018
caaacaggag ctccagcaaa agcgcaggaa gagagactgg cctccttggc tgaaagagtc 2078
ctttcaggaa ggtggagctg cattggtttg atatgtttaa agttgacttt aacaaggggt 2138
taattgaaat cctgggtctc ttggcctgtc ctgtagctgg tttatttttt actttgcccc 2198
ctccccactt tttttgagat ccatccttta tcaagaagtc tgaagcgact ataaaggttt 2258
ttgaattcag atttaaaaac caacttataa agcattgcaa caaggttacc tctattttgc 2318
cacaagcgtc tcgggattgt gtttgacttg tgtctgtcca agaacttttc ccccaaagat 2378
gtgtatagtt attggttaaa atgactgttt tctctctcta tggaaataaa aaggaaaaaa 2438
aaaaaggaaa ctttttttgt ttgctcttgc attgcaaaaa ttataaagta atttattatt 2498
tattgtcgga agacttgcca cttttcatgt catttgacat tttttgtttg ctgaagtgaa 2558
aaaaaaagat aaaggttgta cggtggtctt tgaattatat gtctaattct atgtgttttg 2618
tctttttctt aaatattatg tgaaatcaaa gcgccatatg tagaattata tcttcaggac 2678
tatttcacta ataaacattt ggcatagata aataaataaa aaaaaaaaaa a 2729
<210> 3
<211> 349
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Met Gly Asp Met Gly Asp Pro Pro Lys Lys Lys Arg Leu Ile Ser Leu
1 5 10 15
Cys Val Gly Cys Gly Asn Gln Ile His Asp Gln Tyr Ile Leu Arg Val
20 25 30
Ser Pro Asp Leu Glu Trp His Ala Ala Cys Leu Lys Cys Ala Glu Cys
35 40 45
Asn Gln Tyr Leu Asp Glu Ser Cys Thr Cys Phe Val Arg Asp Gly Lys
50 55 60
Thr Tyr Cys Lys Arg Asp Tyr Ile Arg Leu Tyr Gly Ile Lys Cys Ala
65 70 75 80
Lys Cys Ser Ile Gly Phe Ser Lys Asn Asp Phe Val Met Arg Ala Arg
85 90 95
Ser Lys Val Tyr His Ile Glu Cys Phe Arg Cys Val Ala Cys Ser Arg
100 105 110
Gln Leu Ile Pro Gly Asp Glu Phe Ala Leu Arg Glu Asp Gly Leu Phe
115 120 125
Cys Arg Ala Asp His Asp Val Val Glu Arg Ala Ser Leu Gly Ala Gly
130 135 140
Asp Pro Leu Ser Pro Leu His Pro Ala Arg Pro Leu Gln Met Ala Ala
145 150 155 160
Glu Pro Ile Ser Ala Arg Gln Pro Ala Leu Arg Pro His Val His Lys
165 170 175
Gln Pro Glu Lys Thr Thr Arg Val Arg Thr Val Leu Asn Glu Lys Gln
180 185 190
Leu His Thr Leu Arg Thr Cys Tyr Ala Ala Asn Pro Arg Pro Asp Ala
195 200 205
Leu Met Lys Glu Gln Leu Val Glu Met Thr Gly Leu Ser Pro Arg Val
210 215 220
Ile Arg Val Trp Phe Gln Asn Lys Arg Cys Lys Asp Lys Lys Arg Ser
225 230 235 240
Ile Met Met Lys Gln Leu Gln Gln Gln Gln Pro Asn Asp Lys Thr Asn
245 250 255
Ile Gln Gly Met Thr Gly Thr Pro Met Val Ala Ala Ser Pro Glu Arg
260 265 270
His Asp Gly Gly Leu Gln Ala Asn Pro Val Glu Val Gln Ser Tyr Gln
275 280 285
Pro Pro Trp Lys Val Leu Ser Asp Phe Ala Leu Gln Ser Asp Ile Asp
290 295 300
Gln Pro Ala Phe Gln Gln Leu Val Asn Phe Ser Glu Gly Gly Pro Gly
305 310 315 320
Ser Asn Ser Thr Gly Ser Glu Val Ala Ser Met Ser Ser Gln Leu Pro
325 330 335
Asp Thr Pro Asn Ser Met Val Ala Ser Pro Ile Glu Ala
340 345
<210> 4
<211> 11465
<212> DNA
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 4
caatggcgat ggagctgagt tggagctgag aagtttgagt aagagataag gaagagaggt 60
gccccgagcc gtgcgagtcc gccgctgctg ctgcgcctcc gctctgccaa ctccgccggc 120
ttaaatcgga ctcccagatc tgcgagggcg cggcgcagcc gggcagctgt ttcccccagt 180
tttggcaacc ccgggggcca ctatttgcca cctagccaca gcaccagcat cctctctgtg 240
ggctattcac caattgtcca accaccattt cactgtggac attactccct cttacagata 300
tgggagacat gggcgatcca ccaaaaagta agaagcggtt taaccttgtg gggcttggtg 360
tgctgttgtg gtgtgggggg gtctctctca ggcaccgatg acagggctct ttggatttgt 420
agtcactgcc tggagagaca gaagagaagg tggtcctttt gttgttgttg ttgctgctgc 480
tgttgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 540
tttcttcttg tcacgcttgc agcttgcatg tttggtgtga attccgatct ttgagaaact 600
gatcatacct tgtgtttgaa tgctctgtgc cctcccaaac tctagccgcc tgcccggtgc 660
ttagcggtga tttcctcctc cggattccgg agctcttgga gaagttatta tgtagcaaag 720
gtctgcctgc acaaaccaca ccggcagata tgaattagca ttagacttgc aaaagagagc 780
gagtgacaac tgtattgatg tctactcttc taacaatatc cattcccgcg tgctattgaa 840
gaacgtgctt cacggaaaat atagacatcc cagcgttgct ttaacgcttc tagtcaaaac 900
cttttctttg acatgactta tccataatct tgcctaatga ttatagcaaa gagggaggag 960
ggagaaaaca caaaatgagc gggtttgatt gcgtgctaag cttacaatgt agactattca 1020
aatctgcgtt ttacatatat tccacctccc tttttaaaaa agcgagtcaa ggttttgatg 1080
gcacactcca attaccatcc caaagtgcaa tactctttaa gggaagaaca agaaaaaaaa 1140
aaaaagggaa agaaaaaaat tcttccagaa tacaccctat aagagaacga cactaaaagt 1200
gtgtttatct ctgtaggaag taaacggtta gtcaatcatg catttatttt catttcagaa 1260
aaacgtctga tttccctgtg tgttggttgc ggcaatcaaa ttcacgacca gtatattctg 1320
agggtttctc cggatttgga gtggcatgca gcatgtttga aatgtgcgga gtgtaatcag 1380
tatttggacg aaagctgtac gtgctttgtt agggatggga aaacctactg taaaagagat 1440
tatatcaggt atgccatttt tacagggtta ttttctgaga tttcttggct ctccttgttt 1500
attatttgat gtgcctttgt tttgttttgt tgtttttaga gggagggaga acgtttactt 1560
tagagtgccc agtgtacaag aaatgttttt aaaattaaac tgttgttcat ttcatatctt 1620
tggggggtgg ggtgtcgctg tgtttcataa atttttgttg ataaggtttg ttaatgactc 1680
tttgaatttt tcatacaaaa gattatttcc ctctttaaac ttccctaagg acaacaacaa 1740
aattaaggca aataagttta gggtttcaaa ctttaaaaat tctattttca ctgtatagtt 1800
tatcatctta tttatttttc tcctgtttta tcaatgactt acattatttt gggggctcca 1860
aataaacaga caaaagtttc accaaaggat ttttgaagaa caagtacaaa cattgctccc 1920
tttacttttg gggtgactct tcctttgata aaaaatttta aaaccaaaat aaaatattcc 1980
ttaacgcccc ccccccaaaa aaaaccaccg gaaatttaat ctttttaaat attaaccctt 2040
tggtgatatc taactgcctt ttctttctta tcttatctgg gctgatgaat tagacagagc 2100
agatcaaatt gcccatcatc tgtctgcgaa caattggtat atttaggtaa ttgaacagct 2160
tcctttctca cattaaaatc tagtaactga taaaatgagg gaatcagctg acggacaaga 2220
ccaaaaccag ggaggaggat ctgagctggc ttttgttgca cttttttttt tttcctaatt 2280
tcaagtttct ctgacctacc agtttatatc agaaacttga ctttctacct tagaaagcct 2340
ggtagaattt ctaaaggaaa atgtgtttgt tctaatacaa agcaagatac tgttcccctt 2400
cactgttagg ctggcgatgg cagaaatgta gccgatttta gatttcagag gtggccattg 2460
gcaagtgatc ggcttttcct aagccataaa gcgctttgga gcttcagaac tttcattaaa 2520
gtttagttaa gatttaaaat acagccccac cagtttttct cctgctggaa taatgcccct 2580
ccctcggttt tgttttgttt tgctttaaaa aaaacataga ttggaggata tattcatgat 2640
agctaaaatt aaacaatata ctagggaggg tttgcttgtt tgtttgtttg gtttggtttt 2700
aatgacaagg agaatgggag gaagtgggat acaggaaagg ggagggattt cgtcaatggt 2760
ttgggaaccc ggcaaagtaa gtcttccttc tataaaatgg atgatcttgc attggagagg 2820
cagaaggtag gaaaaaaaat ttcaagtctg tcttccaacc tctgagaaat aatccctttt 2880
catcttttac ttggctggtg tgggctctcg ggacactgga gagggagaag ggagaaccta 2940
ctttgaaact ccaaaagcat ctttacgcct ctgaagatac tgtttccctc ccttgtatac 3000
agacttgctt cattccggat ctgtcaattt gcagatggag tcactcagtt acttttcctt 3060
ttctcttctc ttctcttccg cctgggagca tgtttgtaag tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 3120
tgtgtgtgtg tgtgtgtgta acacccatgc acaacccttt tggaggatct atagttgtaa 3180
aagcagggta gagtgaccat ttttatttta aggtctctca ttggggaagc aacatgccac 3240
ctcctttgtg tggatcttgt cctatctttt ttcactctct atgtagaaat tactgatagc 3300
tattgaggga tatccaggca atgaagcagt ggatggacta taaggactat aaggactgag 3360
cggtggtaag gaaaggctga caggggagga agcttttagc agtgcgggtt ggttttgttg 3420
tttttttgtc catttgtctt gctagccttg tcccccaggc aaactgaagt agaggtacat 3480
gctttaggaa ccgaggaaag actggttgga ggaacagaag ctgggcatta aaataaaaga 3540
ggaagaatgg agaaagaact ttccattaac aagagccccg tggaaaatct ttagttggat 3600
aaatactgga aggccttcac tggagaggac ctggaaactc tctagtgctt catcttgtta 3660
ttgcgttctg ggattttgtg tgttcagatg gagtggggtg accctcagtc cccttcccca 3720
cctttgttgt tgatggtgat gatggtggtg gtggtggtgg tgtgcttttt cagaaatact 3780
tttagtagca gaaattgagg gatagagaat ggaaagcata gggctactgg ccactaatgt 3840
cccctgaatc cctccctgca agtatttgca agaataatcc tgagactggt accagaggct 3900
ggttcgaggt ttagaatcca tcaataaatt ttccttggtt tgggctgagt gcctgaacta 3960
agaggtacaa acttagacag acacagaggt tcaccataaa ggttcccctt gttaaagggg 4020
aggttaagga agaaggaggg agaggaagag aagggggagg agggaggaag ggggtggggt 4080
tgtttctata ttctgcccaa ctttgctatt gctatttttt tttccaggca ggtcaggttt 4140
atggcccggg tctctggcca tcttgggaca gaacctgcct gaaatcaccc atttttgtgt 4200
gtgtgtgtgt gcttttcttc ccatgccggg gccggttcat tcaggttgta cgggatcaaa 4260
tgcgccaagt gcagcatagg cttcagcaag aacgacttcg tgatgcgtgc ccgctctaag 4320
gtgtaccaca tcgagtgttt ccgctgtgta gcctgcagcc gacagctcat cccgggagac 4380
gaattcgccc tgcgggagga tgggcttttc tgccgtgcag accacgatgt ggtggagaga 4440
gccagcctgg gagctggaga ccctctcagt cccttgcatc cagcgcggcc tctgcaaatg 4500
gcaggtactc ctccacccag aggctgagaa aaggcaggcg gggctaaatc ataacctttc 4560
tttcctgcaa cctaggggtc acacagtggt gcagaaagtg gcctgcagta aaccacacgt 4620
gctctttgcc tttctagcaa atttccatac actcgtcgtc tgccttgacg gcacaaccac 4680
acatctaaat gtctgtctat atacaagtac acagcatacc ccgcttgtgc acacatgtat 4740
acacaagccc aaactgtact gtcagcttta ctttggcctc taacccatag cttactgaaa 4800
atgggcttca gctctctgcc aggttttctc ctagctgccg cctaattaaa ggggtggagc 4860
cctaggtctc gaggagtttc ctccctagcc ctgcgaagga agcttaagca gccccaaggc 4920
atttagcttc ccacctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct 4980
ctctctctct ccctctccct ctccctctcc ctctccctct ccctctctct ctctctctct 5040
ctctctctcc cccccccttg ggatttactt tccaatccaa aagcttttta aaatttattt 5100
ttatgccttt gtcaaaaaac aaaacaaaca aacaaacaaa aacccccatg tccctaaaag 5160
atacagtgtc agtaactgca ggcactgcac aggactgtaa cttaaaactg tcaacagcct 5220
aatctgcagt aattgccttt taaaaaggag cctgcctctt taagccattc attctacgtg 5280
atttggtgag aatttcatct ccaagcctgt agctgtagct ctaaattgac cccataggtg 5340
tttggcctga ccccaggggg gcgtggaagg tgtgggattt gtaccgtgga gatcagagga 5400
ccagttgccc ataaaggaaa gtggaaacac aaaggttggc taaaaccaag accggcagac 5460
agcagaacat tgtttcctcc ctgccttcca gtcagaagca ggtctccatc cctccatccc 5520
cgttagtata aagccatcag ctcctactaa ataccagagg tgagaaaatg acagcttttc 5580
cccaaccccc aactcacctc ttctagctgc tctgcaattc ttccctgagt gatgtctaac 5640
tagcagacaa gggataaagc caagggtgag aaacggcaga agaggcagaa atcttgggag 5700
ggaagggaag gaccgtctcc actcctcagt catctcaagc tcagacagtt caacagagtt 5760
tcagttttct tttgcttggg gtcagcgggt ctctggaaca tcccacattg ttgatttagt 5820
actaagaaag acaggcggac cattcgggta gttggaatcc agcatttctt tagcttctaa 5880
atatgattgt cccctagaac tgaagttcaa ggctttctgg cataattatc tgacttttgg 5940
tcgcagactt cccagccctg tcgtgtctct agctgtcact ggggtgttct gcgttttatt 6000
ttcaggtacc ctctatgact ttaatccaga agggaaaggc aagcctggag gtgggggtgt 6060
aatctgtgac cttcttctgg ttatgaggga aggggggagg gagagatttt actgttgaaa 6120
aaaaaatgtc tctggtgcgg gtggagacag acttctttcg gctaattgtg tagtgaatgg 6180
ggagtaggaa caggggttgc atctcttatc tcccccatta ctctctgcat tgtcttctat 6240
tgactaagga gcgagagatc ttcttcctcc tcatccctac cctctgctgt ttctgcgagg 6300
tgtgctgagc cagggctaga tagggaatgg agtgggctga tggtggcggg agtggccttg 6360
catgctcacc gagtcccttt gccccgtagc cgaacccatc tcggctaggc agccagctct 6420
gcggccgcac gtccacaagc agccggagaa gaccacccga gtgcggactg tgctcaacga 6480
gaagcagctg cacaccttgc ggacctgcta tgccgccaac cctcggccag atgcgctcat 6540
gaaggagcaa ctagtggaga tgacgggcct cagtcccaga gtcatccgag tgtggtttca 6600
aaacaagcgg tgcaaggaca agaaacgcag catcatgatg aagcagctcc agcagcagca 6660
acccaacgac aaaactgtga gtagccccga agctaagcaa ggaagggatg ctaggagacc 6720
ttggaagacc gggctagcgg ggcatccctg tgatctgatg gattggtact ctgtggagca 6780
ccagcaggag cccaaaccaa ggtggacctc tcacttcacc taaacccagg tgtatagtgt 6840
ctactctcta caagaaggcc gagatttggc tggttagaaa ctgcagacgt ctgagtggtg 6900
cccatcctcc cccatccatt gctgattcca aaaggggtca tggtcttcat caccatgggc 6960
accctggaac ctaaaggacc tagtggctcc ctccctccca gggcagatgg tgcgaggtct 7020
tgaactcagg ttctgcaagc attggcacca ttagagttgc tcccgttgtg aagggcaaca 7080
tcttgagtgc tgatctagaa catgattcaa tatactttcc atctatccag cattctggtc 7140
tcaccccaac tcttggcaag acttgccact gtttttgcat ttgggagatc ccttcaaggt 7200
gcccatgcag acactcccct cttccaagct tccttccagc ctttggtatc attatgttag 7260
gcaacaacac actccccttc cacccccctc ccccacctct tgcttaagtt aaggtaaagg 7320
ttttttgttt ttttttttta aactacttca gccctatttt taaatgccat tttttaaaaa 7380
aaatccattg tcattaaact tggcaggcag accgagactg ggtaagggta ctttctaagt 7440
tagagcataa tagcacagaa gtagccagac ccagaaacct tggggctagg gtggggtaag 7500
tatgattctg gaaggaagag tgcttagggg cagggggatg ggttcagcta actcaaactg 7560
cctagaaaac cagtatcaga aggctgaagg gagacagacc ctggctggac ctcagttttc 7620
tagttctggg agactgtggc ctcttaacgc aggtgggagg ggttggggta gggcataagc 7680
tgtgaaggtg aagcaaaagg tgatagatgc agcagaattg ttttaataag atctcagcca 7740
gtctcataat ccactgcaca gaagtagaaa aacaaaactg aactcaaact catatccata 7800
ggtacagcag attaactgag tcaatacagg gccactgtgt agataagata aatacttggg 7860
tatatttact tagcacatgc agaccaggaa gggagggagt ttgctcatta acatgttggg 7920
atgggggggg gcgttattca cagaatatcc aggggatgac aggaactccc atggtggctg 7980
ctagtccgga gagacatgat ggtggtttac aggctaaccc agtagaggtg caaagttacc 8040
agccgccctg gaaagtactg agtgacttcg ccttgcaaag cgacatagat cagcctgctt 8100
ttcagcaact ggtaagtgtc tggctcccaa atgggaaaag actggatccc taacaaaaaa 8160
aggagactcg ttttaactgt taggcattga aaggtcccct ggggtgaggg agggtaccgg 8220
gattagagag aaagcaggat gtggtggtga agaggaggga ggcagatgga aggaaaggag 8280
atctcttgtg aatctttgtt taaaactgag atgccacaat ttaactatgt agcctaagtg 8340
tgtagtgtga tcttcctaca aaggaggcat atcttatggg ttgagcttct cagtgcctaa 8400
gtagttctgt gtacagaggt acagacagtg gcaatgtcac atattttagg ctgttctaaa 8460
ttacaaggac ttcagagacc accgtggcat ttggatcagc aatcagtaag ttctttgctt 8520
tacctgtgtc ttgtgactga ttcaagtaaa aatgactggg atgcacgccc agtgtgatac 8580
ccagttagaa tgcagttgtg cataagcagc agggagctgt ctgaacacaa ttctcttcta 8640
tgtcaaccac gaggatagtt atttaaatag tttggttgat atttattatt gttatgtttc 8700
tttcaaagca cagattgatc taaagcagag gattttaaaa atatttttaa acaaatgagt 8760
tcagatatga cacaattaca ttcagtgtgg catgtatgcc aaaaggaaca tgagcattgt 8820
cagaggcaat gcatatttaa cttgtgaaaa cctgtcttag cactaaaggg tctaacacat 8880
tcatccatag cagagaatta attcatttta cctataaaag gttaagataa agaaaaattt 8940
aaagatagat cggtgtggtg catatgctta aggttttttt tcttcttcct taaaggatga 9000
tcagccccat agatactgtt ttattaaaca cgaagctgag tcctaaaaaa cacccctttc 9060
tttagaagca cagttaatgc atcaattgag aataggtttc cccccattct atcctgtgcc 9120
ctaagcatat ttgctttctc ttgtcaacag ttataagggt gattggccag aggcaagtgc 9180
ttaaaagggc ttggtaccat gctctctctc tctctctctc tctctctctt tctctctctc 9240
tcctccccac ccccgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 9300
gtgtgtgtat gtgtatgtgt aaatgggcca atctagtgag caggcaaatt tgagaagtcc 9360
cctgacctcg caaggagaag gtttaataga tagtagataa gggattctgg agccaaagag 9420
aaagtttttc cttaaataaa acaaattgtc cctaggaagc attctgtagg taaactttga 9480
ataatagaaa aggaggtgag agggggcttg gttcctcctg aaacttgagt gtcaggtgag 9540
aacggtgaag tggaacccga ggaaggggta ggagggtatg gttatgggtg ggggtgacag 9600
tttacgtcac actgaattta taatgagatg atgaatgtgt aggtctcctt gtggaaaggg 9660
gaggaggggt caggcaatga gagcacactg tgaatccact aaagagttaa gcattgttcc 9720
tcaggagcct gccttgaatt tctggcctag agaactttcc tactccccgg gctagtaggc 9780
agctggataa ttttatttca agccttagag ggagagttat gatgccactt tacagtggga 9840
aacacatttg ctcttaaata atttaatagg acacaatgtt gggaattcag cttgggttaa 9900
aagagagctc tttaggaaga tggagaaatg gagagcattt ctttgcaagt gcttctcctg 9960
ggcttccttt aaagcctgtt taaattctat gacaggcata ggtatctttg ttggtatacc 10020
agttctactt acaggaactt ataggcgtag actcaatgta atacttttgt atagctcggg 10080
acactactga agcccctttt gctgacttct caaccttcca tacaggtcaa tttttcagaa 10140
ggaggaccag gctctaattc tactggcagt gaagtagcat cgatgtcctc gcagctccca 10200
gatacaccca acagcatggt agccagtcct attgaggcat gaggaacatt cattcagatg 10260
ttttgttttg ttttgttttg tttttttccc ctgttggaga aagtgggaaa tgacgttgaa 10320
ctccgaaata aaaagtattt aacgacccag tcaatggaaa ctgaatcaag aaatgaacgc 10380
tccaggaagc gcatgaagtc tgttctaatg acaaagtgat atggtagcaa cactgtgaag 10440
acaatcatgg gattttacta gaataaaaac aaacaaacaa acaaaaccct aagcccaaca 10500
tatgctattc aatgacctta ggagtactta aaaaagaaaa agaaaaaaaa aagagagaga 10560
gaccgttttt aaaacgtaga ggatttatat tcaaggatct caaaaaatgc gcgttttcat 10620
ttcactgcac atctagagga agagcagaaa cagagaattt cctagtccat cctattctga 10680
atggtgctgt ttctatattg gtcactgcct tgccaaacag gagctccggc acagagcgga 10740
agaaaccagc ctcagtgact tgaaagtgtc ctttcaggaa ggcggagctg cgttggtttg 10800
caatgttttt agttgacttt gacaaggggt tacgtgaaat tctgggtctc ttaagcatgc 10860
cctgtagctg gtttctcttt tacgtttgcc tctcctccca tccttttctt tccttttctt 10920
tatttctctt tacaattttt ttgagatcca tcctctatca agaagtctga agcgacttta 10980
aaggttttta aatttgtatt taaaaaccaa cttataaagc attgcaacaa ggttacctct 11040
attttgccac aagcgtctcg ggattgtgtt tgactcctgt ctgtccaaga acttttcccc 11100
caaagatgtg tatagttatt ggttaaaatg actgttttcg ctctttctgg aaataaagag 11160
gaaaaaggaa actttttttg tttgctcttg cattgcaaaa attataaaag taatttatta 11220
tttattgtca ggagacttgc cacttttcat gtcatttgac tttttttttg tttgctgaag 11280
taaaaagaag ataaaggttg taccgtggtc tttgaattat atgtctaagt ttatgtgttt 11340
tgtctttttt ttttctttaa atattatgtg aaatcaaagc gccatatgta gaattatatc 11400
ttcaggacta tttcactaat aaacgtttgg catagataat taaataaacg caatgattca 11460
gggtc 11465
<210> 5
<211> 2526
<212> DNA
<213> 小鼠
<220>
<221> CDS
<222> (267)..(1316)
<400> 5
tttgagtaag agataaggaa gagaggtgcc ccgagccgtg cgagtccgcc gctgctgctg 60
cgcctccgct ctgccaactc cgccggctta aatcggactc ccagatctgc gagggcgcgg 120
cgcagccggg cagctgtttc ccccagtttt ggcaaccccg ggggccacta tttgccacct 180
agccacagca ccagcatcct ctctgtgggc tattcaccaa ttgtccaacc accatttcac 240
tgtggacatt actccctctt acagat atg gga gac atg ggc gat cca cca aaa 293
Met Gly Asp Met Gly Asp Pro Pro Lys
1 5
aaa aaa cgt ctg att tcc ctg tgt gtt ggt tgc ggc aat caa att cac 341
Lys Lys Arg Leu Ile Ser Leu Cys Val Gly Cys Gly Asn Gln Ile His
10 15 20 25
gac cag tat att ctg agg gtt tct ccg gat ttg gag tgg cat gca gca 389
Asp Gln Tyr Ile Leu Arg Val Ser Pro Asp Leu Glu Trp His Ala Ala
30 35 40
tgt ttg aaa tgt gcg gag tgt aat cag tat ttg gac gaa agc tgt acg 437
Cys Leu Lys Cys Ala Glu Cys Asn Gln Tyr Leu Asp Glu Ser Cys Thr
45 50 55
tgc ttt gtt agg gat ggg aaa acc tac tgt aaa aga gat tat atc agg 485
Cys Phe Val Arg Asp Gly Lys Thr Tyr Cys Lys Arg Asp Tyr Ile Arg
60 65 70
ttg tac ggg atc aaa tgc gcc aag tgc agc ata ggc ttc agc aag aac 533
Leu Tyr Gly Ile Lys Cys Ala Lys Cys Ser Ile Gly Phe Ser Lys Asn
75 80 85
gac ttc gtg atg cgt gcc cgc tct aag gtg tac cac atc gag tgt ttc 581
Asp Phe Val Met Arg Ala Arg Ser Lys Val Tyr His Ile Glu Cys Phe
90 95 100 105
cgc tgt gta gcc tgc agc cga cag ctc atc ccg gga gac gaa ttc gcc 629
Arg Cys Val Ala Cys Ser Arg Gln Leu Ile Pro Gly Asp Glu Phe Ala
110 115 120
ctg cgg gag gat ggg ctt ttc tgc cgt gca gac cac gat gtg gtg gag 677
Leu Arg Glu Asp Gly Leu Phe Cys Arg Ala Asp His Asp Val Val Glu
125 130 135
aga gcc agc ctg gga gct gga gac cct ctc agt ccc ttg cat cca gcg 725
Arg Ala Ser Leu Gly Ala Gly Asp Pro Leu Ser Pro Leu His Pro Ala
140 145 150
cgg cct ctg caa atg gca gcc gaa ccc atc tcg gct agg cag cca gct 773
Arg Pro Leu Gln Met Ala Ala Glu Pro Ile Ser Ala Arg Gln Pro Ala
155 160 165
ctg cgg ccg cac gtc cac aag cag ccg gag aag acc acc cga gtg cgg 821
Leu Arg Pro His Val His Lys Gln Pro Glu Lys Thr Thr Arg Val Arg
170 175 180 185
act gtg ctc aac gag aag cag ctg cac acc ttg cgg acc tgc tat gcc 869
Thr Val Leu Asn Glu Lys Gln Leu His Thr Leu Arg Thr Cys Tyr Ala
190 195 200
gcc aac cct cgg cca gat gcg ctc atg aag gag caa cta gtg gag atg 917
Ala Asn Pro Arg Pro Asp Ala Leu Met Lys Glu Gln Leu Val Glu Met
205 210 215
acg ggc ctc agt ccc aga gtc atc cga gtg tgg ttt caa aac aag cgg 965
Thr Gly Leu Ser Pro Arg Val Ile Arg Val Trp Phe Gln Asn Lys Arg
220 225 230
tgc aag gac aag aaa cgc agc atc atg atg aag cag ctc cag cag cag 1013
Cys Lys Asp Lys Lys Arg Ser Ile Met Met Lys Gln Leu Gln Gln Gln
235 240 245
caa ccc aac gac aaa act aat atc cag ggg atg aca gga act ccc atg 1061
Gln Pro Asn Asp Lys Thr Asn Ile Gln Gly Met Thr Gly Thr Pro Met
250 255 260 265
gtg gct gct agt ccg gag aga cat gat ggt ggt tta cag gct aac cca 1109
Val Ala Ala Ser Pro Glu Arg His Asp Gly Gly Leu Gln Ala Asn Pro
270 275 280
gta gag gtg caa agt tac cag ccg ccc tgg aaa gta ctg agt gac ttc 1157
Val Glu Val Gln Ser Tyr Gln Pro Pro Trp Lys Val Leu Ser Asp Phe
285 290 295
gcc ttg caa agc gac ata gat cag cct gct ttt cag caa ctg gtc aat 1205
Ala Leu Gln Ser Asp Ile Asp Gln Pro Ala Phe Gln Gln Leu Val Asn
300 305 310
ttt tca gaa gga gga cca ggc tct aat tct act ggc agt gaa gta gca 1253
Phe Ser Glu Gly Gly Pro Gly Ser Asn Ser Thr Gly Ser Glu Val Ala
315 320 325
tcg atg tcc tcg cag ctc cca gat aca ccc aac agc atg gta gcc agt 1301
Ser Met Ser Ser Gln Leu Pro Asp Thr Pro Asn Ser Met Val Ala Ser
330 335 340 345
cct att gag gca tga ggaacattca ttcagatgtt ttgttttgtt ttgttttgtt 1356
Pro Ile Glu Ala
tttttcccct gttggagaaa gtgggaaatg acgttgaact ccgaaataaa aagtatttaa 1416
cgacccagtc aatggaaact gaatcaagaa atgaacgctc caggaagcgc atgaagtctg 1476
ttctaatgac aaagtgatat ggtagcaaca ctgtgaagac aatcatggga ttttactaga 1536
ataaaaacaa acaaacaaac aaaaccctaa gcccaacata tgctattcaa tgaccttagg 1596
agtacttaaa aaagaaaaag aaaaaaaaaa gagagagaga ccgtttttaa aacgtagagg 1656
atttatattc aaggatctca aaaaatgcgc gttttcattt cactgcacat ctagaggaag 1716
agcagaaaca gagaatttcc tagtccatcc tattctgaat ggtgctgttt ctatattggt 1776
cactgccttg ccaaacagga gctccggcac agagcggaag aaaccagcct cagtgacttg 1836
aaagtgtcct ttcaggaagg cggagctgcg ttggtttgca atgtttttag ttgactttga 1896
caaggggtta cgtgaaattc tgggtctctt aagcatgccc tgtagctggt ttctctttta 1956
cgtttgcctc tcctcccatc cttttctttc cttttcttta tttctcttta caattttttt 2016
gagatccatc ctctatcaag aagtctgaag cgactttaaa ggtttttaaa tttgtattta 2076
aaaaccaact tataaagcat tgcaacaagg ttacctctat tttgccacaa gcgtctcggg 2136
attgtgtttg actcctgtct gtccaagaac ttttccccca aagatgtgta tagttattgg 2196
ttaaaatgac tgttttcgct ctttctggaa ataaagagga aaaaggaaac tttttttgtt 2256
tgctcttgca ttgcaaaaat tataaaagta atttattatt tattgtcagg agacttgcca 2316
cttttcatgt catttgactt tttttttgtt tgctgaagta aaaagaagat aaaggttgta 2376
ccgtggtctt tgaattatat gtctaagttt atgtgttttg tctttttttt ttctttaaat 2436
attatgtgaa atcaaagcgc catatgtaga attatatctt caggactatt tcactaataa 2496
acgtttggca tagataatta aataaacgca 2526
<210> 6
<211> 349
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 6
Met Gly Asp Met Gly Asp Pro Pro Lys Lys Lys Arg Leu Ile Ser Leu
1 5 10 15
Cys Val Gly Cys Gly Asn Gln Ile His Asp Gln Tyr Ile Leu Arg Val
20 25 30
Ser Pro Asp Leu Glu Trp His Ala Ala Cys Leu Lys Cys Ala Glu Cys
35 40 45
Asn Gln Tyr Leu Asp Glu Ser Cys Thr Cys Phe Val Arg Asp Gly Lys
50 55 60
Thr Tyr Cys Lys Arg Asp Tyr Ile Arg Leu Tyr Gly Ile Lys Cys Ala
65 70 75 80
Lys Cys Ser Ile Gly Phe Ser Lys Asn Asp Phe Val Met Arg Ala Arg
85 90 95
Ser Lys Val Tyr His Ile Glu Cys Phe Arg Cys Val Ala Cys Ser Arg
100 105 110
Gln Leu Ile Pro Gly Asp Glu Phe Ala Leu Arg Glu Asp Gly Leu Phe
115 120 125
Cys Arg Ala Asp His Asp Val Val Glu Arg Ala Ser Leu Gly Ala Gly
130 135 140
Asp Pro Leu Ser Pro Leu His Pro Ala Arg Pro Leu Gln Met Ala Ala
145 150 155 160
Glu Pro Ile Ser Ala Arg Gln Pro Ala Leu Arg Pro His Val His Lys
165 170 175
Gln Pro Glu Lys Thr Thr Arg Val Arg Thr Val Leu Asn Glu Lys Gln
180 185 190
Leu His Thr Leu Arg Thr Cys Tyr Ala Ala Asn Pro Arg Pro Asp Ala
195 200 205
Leu Met Lys Glu Gln Leu Val Glu Met Thr Gly Leu Ser Pro Arg Val
210 215 220
Ile Arg Val Trp Phe Gln Asn Lys Arg Cys Lys Asp Lys Lys Arg Ser
225 230 235 240
Ile Met Met Lys Gln Leu Gln Gln Gln Gln Pro Asn Asp Lys Thr Asn
245 250 255
Ile Gln Gly Met Thr Gly Thr Pro Met Val Ala Ala Ser Pro Glu Arg
260 265 270
His Asp Gly Gly Leu Gln Ala Asn Pro Val Glu Val Gln Ser Tyr Gln
275 280 285
Pro Pro Trp Lys Val Leu Ser Asp Phe Ala Leu Gln Ser Asp Ile Asp
290 295 300
Gln Pro Ala Phe Gln Gln Leu Val Asn Phe Ser Glu Gly Gly Pro Gly
305 310 315 320
Ser Asn Ser Thr Gly Ser Glu Val Ala Ser Met Ser Ser Gln Leu Pro
325 330 335
Asp Thr Pro Asn Ser Met Val Ala Ser Pro Ile Glu Ala
340 345
<210> 7
<211> 5753
<212> DNA
<213> 智人
<400> 7
gctagtgcgt gttgacgtca tgctgcgtgc gggccggtgc ggaatcgctc cttcaactcc 60
gcggggcagt aggagttagt tagcaaagag ccgaggccgg gcgcgcgacc ctcgtccttc 120
tgcccctggc cgcacacttt gcgcacatct ctttttctgc atggtggata ttatttttca 180
ttatcctttt ctgggtgcta tgggtgatca ttccaagagt aagtatttct gtgtgtgtgt 240
ggggtggggt gtgtgtgtat gcttaatatg caaaatttct aatgcagaaa aatgtttagt 300
ggattctaca agtggcttct atttgtcaga atagtttagg agaggaaaaa cgaatgcatg 360
tctcctgcag gactgcttat ctttgggaat cctgttgttt tattttataa gtaaacacta 420
tttctcaagc cggctaggat gacttcgggc tgcgaaatct gcttctgttt tgcgcaaagg 480
caattaggtt tgatttaggg atgtgggttt tttttttttt ggttgttgtt tgtttgcctt 540
tcggtttttc aaagctagga agctttcttt cgcttgctct gggatattta aactaagaaa 600
tgtctgagag gatgagcggg gactgccgaa agacgatgtg tctgtgttgg gataggaggc 660
agccgctgtg agtgggagtg tgtgagcgga aatgccagga cagcaccgtt aggtgttgat 720
atccaggcgt ccgcagtgcc tgtgtattta ctctcttctt agtttcgtgt ttgcgtttag 780
tttcaagaca cgtcgacaaa acgactgtca ttaatgaatg taataacgaa atatttgggg 840
tgggggacag aagaaacctt cagcaatcca caagatactg gtttttcgtt tccaatgccc 900
tggaccttta gagagctcat catctttcct tatggtcgca agtcttgaaa gaaagagcaa 960
gagagcgagc gggttgggtt ggggctggag tagccgaggc cggcctgggt ccgggcagtc 1020
aggcctgacg cggccccgcg cccttccccg gcagagaagc ccgggacggc catgtgcgtg 1080
ggctgcggga gtcagatcca cgaccagttt atcctgcggg tgtcgcccga cctcgagtgg 1140
cacgcggcct gcctcaagtg tgccgagtgc agccagtacc tggacgagac gtgcacgtgc 1200
ttcgtgagag acgggaagac ctactgcaag cgggactatg tcaggtgagg ccggcgggaa 1260
cgcgggctgg gccaccgcgc gcaggggccg gggccgggac tggggatggc ggcctgcccg 1320
cgcgccccgg ccctgcccag ggagaaggcc atccgcatcc cgcacgggtg ccgcagcgct 1380
cccccgggcc cgggaatgcc cgcaggcggg tcaccgcagt ctcctggtgg ccacaaagtg 1440
tcctgggcgc gcgccggagc cgtagcagcc agggagatga gggcggccgc aggcccagcg 1500
ctgacaccgc cgcaccttgg gcccgcaggc tgttcggcat caagtgcgcc aagtgccagg 1560
tgggcttcag cagcagcgac ctggtgatga gggcgcggga cagcgtgtac cacatcgagt 1620
gcttccgctg ctccgtgtgc agccgccagc tgctgcctgg ggacgagttc tcgctgcggg 1680
agcacgagct gctctgccgc gccgaccacg gcctcctgct cgagcgcgcc gcggccggca 1740
gcccgcgcag ccccggcccg cttcccggcg cccgcggcct gcatctgccc ggtaagcgcg 1800
ccggggcctg tgccggggtg agcggggtgt atgtgcgtgc gtgtgtgtag gggtacgctt 1860
gtgtccctaa cgagaagttg tcagttgtgt gtggttccgt ctgccgggat agtgtttttc 1920
tgtatcagtg cggaactgtg tgctgggaac aaggctgtgt gtattctcgt gtgctcggga 1980
gaaactgcgt gtgtatgagt gtgtgagcac ggagaattgt gcagaatcgt gttctccatg 2040
accaggaaca tgcagggcac agtgctagga gcagaagagt ggatgacaac agggaatctt 2100
aagtggtgtc cgtcttgggg cttgtattag gaatttcttg gaggaatatg tgttattgtc 2160
agagggtaag gtttgcccag gggtatgtgt gtaagtaaca cagctccaaa ctgggagctg 2220
ggcaggagct tggtcagcca ggagccaaga acccaacaaa gaggggtttt tgccatcttg 2280
ttttgaggcc cagtttgatg aacaatttag ccaggttctt ctgggggagg gggagtatca 2340
atgcatagtg gactgtcact ggaatattct gggtcctaat cagcagctgc ccagagatgg 2400
ggtctgagtg tataatgggc aggtacggct gaacagaaac agaggtgcct ccaccccagg 2460
caaggcagtt tcccccaggt agccataggc ctgcagcaca gatccgtaga ccaggctggg 2520
cctctgggtg ctgtgtggcc ttgccccgct cctcccctct ctggatcttc acttcctccc 2580
tatagaaaga ggaaactggg ctggatgggc tatttgtaaa tatttgtcca gacctagaaa 2640
ttcgtagagg ggaacataaa ccgaaatggt gcagtacaga tccacggtat atatgggtcg 2700
ggatcaaatg gagatgtgaa atgggagcaa gcgggtattc agtgcacccc catctgggat 2760
ctcggagagg ctcccctttg tttgtttcgg gcttcagggt gcaggctctg gaatcagtca 2820
ctgtttcccc gggatggaga gaacctgggg ccaagcgagg agagtgccag cggctgctca 2880
gcaccttggt cggtgggagg ccactgggct ggggaacctg gagccttgag gaaggagaca 2940
ggggccgaag cccaagggcg ggcaggaagg aactgttgca agccctggag gcccgtccat 3000
aaccgtggat gagtcttcta cacatgtggc ctggccctgt ccaaatgggc tctgaaggag 3060
gggaagggcc ctcgtaggcc cccggcatat tcgcacctcc cacccagtcc cctgggcagc 3120
gcctcgccct gggtccacgt cggtcccttt ccctctccag agtcctgggc aagcctcttt 3180
cctcttcctc tgaaactccg acttcttccg gagggcttcg ctcgttccga gggtcctgcg 3240
actggaggag gcacatccct gagcagccac tccctccccg cagcggcctg tcgccgagct 3300
cccgcgccct gcttgagctc gggagagatc gctgcggggc agtccggccc gggagcgaga 3360
gaaagaacga aaatgcacag ctctctccga gtaaggcgaa cagatggaga ggaagacgaa 3420
caattaaacg aaacaaacag aataaaacag aaacgaaatc gggccccggg gggctgggcc 3480
acccggaggt tgggctcggg gcgggtgggt ggcggcccct cgctaacctc tggcctcacc 3540
ctgtcctggc agacgctggg tcgggccggc agcccgcgtt gcgcccgcac gtgcacaagc 3600
agacggagaa gacgacccgc gtgcggactg tgctgaacga gaagcagctg cacactctgc 3660
ggacctgcta cgccgccaac ccgcggcccg acgctctcat gaaggagcag ctggtggaga 3720
tgaccggcct gagcccgcgg gtcatccgcg tctggttcca gaacaagcgc tgcaaggaca 3780
agaagaaatc cattctcatg aagcagctgc agcagcagca gcacagcgac aagacggtga 3840
gcagccgctg ggccggaggc tcgagtcggg tgggggctgc gcttccgccg cggtatctgc 3900
gtgccctttt ctgggcgagc cctgggagat ccagggagaa ctgggcgctc cagatggtgt 3960
atgtctgtac cttcacagca aggcttccct tggatttgag gcttcctatt ttgtctggga 4020
tcggggtttc tccttgtccc agtggcagcc ccgcgttgcg ggttccgggc gctgcgcgga 4080
gcccaaggct gcatggcagt gtgcagcgcc cgccagtcgg gctggtgggt tgtgcactcc 4140
gtcggcagct gcagaaaggt gggagtgcag gtcttgcctt tcctcaccgg gcggttggct 4200
tccagcaccg aggctgacct atcgtggcaa gtttgcggcc cccgcagatc cccagtggag 4260
aaagagggct cttccgatgc gatcgagtgt gcgcctcccc gcaaagcaat gcagacccta 4320
aatcactcaa ggcctggagc tccagtctca aaggtggcag aaaaggccag acctaactcg 4380
agcacctact gccttctgct tgccccgcag agccttcagg gactgactgg gacgcccctg 4440
gtggcgggca gtcccatccg ccatgagaac gccgtgcagg gcagcgcagt ggaggtgcag 4500
acgtaccagc cgccgtggaa ggcgctcagc gagtttgccc tccagagcga cctggaccaa 4560
cccgccttcc aacagctggt gaggccctgc cctacccgcc ccgacctcgg gactctgcgg 4620
gttggggatt tagccactta gcctggcaga gaggggaggg ggtggccttg ggctgagggg 4680
ctgggtacag ccctaggcgg tgggggaggg ggaacagtgg cgggctctga aacctcacct 4740
cggcccatta cgcgccctaa accaggtctc cctggattaa agtgctcaca agagaggtcg 4800
caggattaac caacccgctc ccccgcccta atccccccct cgtgcgcctg gggacctggc 4860
ctccttctcc gcagggcttg ctctcagctg gcggccggtc cccaagggac actttccgac 4920
tcggagcacg cggccctgga gcaccagctc gcgtgcctct tcacctgcct cttcccggtg 4980
tttccgccgc cccaggtctc cttctccgag tccggctccc taggcaactc ctccggcagc 5040
gacgtgacct ccctgtcctc gcagctcccg gacaccccca acagtatggt gccgagtccc 5100
gtggagacgt gagggggacc cctccctgcc agcccgcgga cctcgcatgc tccctgcatg 5160
agactcaccc atgctcaggc cattccagtt ccgaaagctc tctcgccttc gtaattattc 5220
tattgttatt tatgagagag taccgagaga cacggtctgg acagcccaag gcgccaggat 5280
gcaacctgct ttcaccagac tgcagacccc tgctccgagg actcttagtt tttcaaaacc 5340
agaatctggg acttaccagg gttagctctg ccctctcctc tcctctctac gtggccgccg 5400
ctctgtctct ccacgcccca cctgtgtccc catctcggcc ggcccggagc tcgcccacgc 5460
ggacccccgc cctgccccag ctcagcgctc cctggcggct tcgcccgggc tcctagcggg 5520
gaaaaggaag gggataactc agaggaacag acactcaaac tcccaaagcg catgattgct 5580
gggaaacagt agaaaccaga cttgccttga aagtgtttaa gttattcgac ggaggacaga 5640
gtatgtgagc ctttgccgaa caaacaaacg taagttattg ttatttattg tgagaacagc 5700
cagttcatag tgggacttgt attttgatct taataaaaaa taataacccg ggg 5753
<210> 8
<211> 1918
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (161)..(1240)
<400> 8
gctagtgcgt gttgacgtca tgctgcgtgc gggccggtgc ggaatcgctc cttcaactcc 60
gcggggcagt aggagttagt tagcaaagag ccgaggccgg gcgcgcgacc ctcgtccttc 120
tgcccctggc cgcacacttt gcgcacatct ctttttctgc atg gtg gat att att 175
Met Val Asp Ile Ile
1 5
ttt cat tat cct ttt ctg ggt gct atg ggt gat cat tcc aag aag aag 223
Phe His Tyr Pro Phe Leu Gly Ala Met Gly Asp His Ser Lys Lys Lys
10 15 20
ccc ggg acg gcc atg tgc gtg ggc tgc ggg agt cag atc cac gac cag 271
Pro Gly Thr Ala Met Cys Val Gly Cys Gly Ser Gln Ile His Asp Gln
25 30 35
ttt atc ctg cgg gtg tcg ccc gac ctc gag tgg cac gcg gcc tgc ctc 319
Phe Ile Leu Arg Val Ser Pro Asp Leu Glu Trp His Ala Ala Cys Leu
40 45 50
aag tgt gcc gag tgc agc cag tac ctg gac gag acg tgc acg tgc ttc 367
Lys Cys Ala Glu Cys Ser Gln Tyr Leu Asp Glu Thr Cys Thr Cys Phe
55 60 65
gtg aga gac ggg aag acc tac tgc aag cgg gac tat gtc agg ctg ttc 415
Val Arg Asp Gly Lys Thr Tyr Cys Lys Arg Asp Tyr Val Arg Leu Phe
70 75 80 85
ggc atc aag tgc gcc aag tgc cag gtg ggc ttc agc agc agc gac ctg 463
Gly Ile Lys Cys Ala Lys Cys Gln Val Gly Phe Ser Ser Ser Asp Leu
90 95 100
gtg atg agg gcg cgg gac agc gtg tac cac atc gag tgc ttc cgc tgc 511
Val Met Arg Ala Arg Asp Ser Val Tyr His Ile Glu Cys Phe Arg Cys
105 110 115
tcc gtg tgc agc cgc cag ctg ctg cct ggg gac gag ttc tcg ctg cgg 559
Ser Val Cys Ser Arg Gln Leu Leu Pro Gly Asp Glu Phe Ser Leu Arg
120 125 130
gag cac gag ctg ctc tgc cgc gcc gac cac ggc ctc ctg ctc gag cgc 607
Glu His Glu Leu Leu Cys Arg Ala Asp His Gly Leu Leu Leu Glu Arg
135 140 145
gcc gcg gcc ggc agc ccg cgc agc ccc ggc ccg ctt ccc ggc gcc cgc 655
Ala Ala Ala Gly Ser Pro Arg Ser Pro Gly Pro Leu Pro Gly Ala Arg
150 155 160 165
ggc ctg cat ctg ccc gac gct ggg tcg ggc cgg cag ccc gcg ttg cgc 703
Gly Leu His Leu Pro Asp Ala Gly Ser Gly Arg Gln Pro Ala Leu Arg
170 175 180
ccg cac gtg cac aag cag acg gag aag acg acc cgc gtg cgg act gtg 751
Pro His Val His Lys Gln Thr Glu Lys Thr Thr Arg Val Arg Thr Val
185 190 195
ctg aac gag aag cag ctg cac act ctg cgg acc tgc tac gcc gcc aac 799
Leu Asn Glu Lys Gln Leu His Thr Leu Arg Thr Cys Tyr Ala Ala Asn
200 205 210
ccg cgg ccc gac gct ctc atg aag gag cag ctg gtg gag atg acc ggc 847
Pro Arg Pro Asp Ala Leu Met Lys Glu Gln Leu Val Glu Met Thr Gly
215 220 225
ctg agc ccg cgg gtc atc cgc gtc tgg ttc cag aac aag cgc tgc aag 895
Leu Ser Pro Arg Val Ile Arg Val Trp Phe Gln Asn Lys Arg Cys Lys
230 235 240 245
gac aag aag aaa tcc att ctc atg aag cag ctg cag cag cag cag cac 943
Asp Lys Lys Lys Ser Ile Leu Met Lys Gln Leu Gln Gln Gln Gln His
250 255 260
agc gac aag acg agc ctt cag gga ctg act ggg acg ccc ctg gtg gcg 991
Ser Asp Lys Thr Ser Leu Gln Gly Leu Thr Gly Thr Pro Leu Val Ala
265 270 275
ggc agt ccc atc cgc cat gag aac gcc gtg cag ggc agc gca gtg gag 1039
Gly Ser Pro Ile Arg His Glu Asn Ala Val Gln Gly Ser Ala Val Glu
280 285 290
gtg cag acg tac cag ccg ccg tgg aag gcg ctc agc gag ttt gcc ctc 1087
Val Gln Thr Tyr Gln Pro Pro Trp Lys Ala Leu Ser Glu Phe Ala Leu
295 300 305
cag agc gac ctg gac caa ccc gcc ttc caa cag ctg gtc tcc ttc tcc 1135
Gln Ser Asp Leu Asp Gln Pro Ala Phe Gln Gln Leu Val Ser Phe Ser
310 315 320 325
gag tcc ggc tcc cta ggc aac tcc tcc ggc agc gac gtg acc tcc ctg 1183
Glu Ser Gly Ser Leu Gly Asn Ser Ser Gly Ser Asp Val Thr Ser Leu
330 335 340
tcc tcg cag ctc ccg gac acc ccc aac agt atg gtg ccg agt ccc gtg 1231
Ser Ser Gln Leu Pro Asp Thr Pro Asn Ser Met Val Pro Ser Pro Val
345 350 355
gag acg tga gggggacccc tccctgccag cccgcggacc tcgcatgctc 1280
Glu Thr
cctgcatgag actcacccat gctcaggcca ttccagttcc gaaagctctc tcgccttcgt 1340
aattattcta ttgttattta tgagagagta ccgagagaca cggtctggac agcccaaggc 1400
gccaggatgc aacctgcttt caccagactg cagacccctg ctccgaggac tcttagtttt 1460
tcaaaaccag aatctgggac ttaccagggt tagctctgcc ctctcctctc ctctctacgt 1520
ggccgccgct ctgtctctcc acgccccacc tgtgtcccca tctcggccgg cccggagctc 1580
gcccacgcgg acccccgccc tgccccagct cagcgctccc tggcggcttc gcccgggctc 1640
ctagcgggga aaaggaaggg gataactcag aggaacagac actcaaactc ccaaagcgca 1700
tgattgctgg gaaacagtag aaaccagact tgccttgaaa gtgtttaagt tattcgacgg 1760
aggacagagt atgtgagcct ttgccgaaca aacaaacgta agttattgtt atttattgtg 1820
agaacagcca gttcatagtg ggacttgtat tttgatctta ataaaaaata ataacccggg 1880
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1918
<210> 9
<211> 359
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Met Val Asp Ile Ile Phe His Tyr Pro Phe Leu Gly Ala Met Gly Asp
1 5 10 15
His Ser Lys Lys Lys Pro Gly Thr Ala Met Cys Val Gly Cys Gly Ser
20 25 30
Gln Ile His Asp Gln Phe Ile Leu Arg Val Ser Pro Asp Leu Glu Trp
35 40 45
His Ala Ala Cys Leu Lys Cys Ala Glu Cys Ser Gln Tyr Leu Asp Glu
50 55 60
Thr Cys Thr Cys Phe Val Arg Asp Gly Lys Thr Tyr Cys Lys Arg Asp
65 70 75 80
Tyr Val Arg Leu Phe Gly Ile Lys Cys Ala Lys Cys Gln Val Gly Phe
85 90 95
Ser Ser Ser Asp Leu Val Met Arg Ala Arg Asp Ser Val Tyr His Ile
100 105 110
Glu Cys Phe Arg Cys Ser Val Cys Ser Arg Gln Leu Leu Pro Gly Asp
115 120 125
Glu Phe Ser Leu Arg Glu His Glu Leu Leu Cys Arg Ala Asp His Gly
130 135 140
Leu Leu Leu Glu Arg Ala Ala Ala Gly Ser Pro Arg Ser Pro Gly Pro
145 150 155 160
Leu Pro Gly Ala Arg Gly Leu His Leu Pro Asp Ala Gly Ser Gly Arg
165 170 175
Gln Pro Ala Leu Arg Pro His Val His Lys Gln Thr Glu Lys Thr Thr
180 185 190
Arg Val Arg Thr Val Leu Asn Glu Lys Gln Leu His Thr Leu Arg Thr
195 200 205
Cys Tyr Ala Ala Asn Pro Arg Pro Asp Ala Leu Met Lys Glu Gln Leu
210 215 220
Val Glu Met Thr Gly Leu Ser Pro Arg Val Ile Arg Val Trp Phe Gln
225 230 235 240
Asn Lys Arg Cys Lys Asp Lys Lys Lys Ser Ile Leu Met Lys Gln Leu
245 250 255
Gln Gln Gln Gln His Ser Asp Lys Thr Ser Leu Gln Gly Leu Thr Gly
260 265 270
Thr Pro Leu Val Ala Gly Ser Pro Ile Arg His Glu Asn Ala Val Gln
275 280 285
Gly Ser Ala Val Glu Val Gln Thr Tyr Gln Pro Pro Trp Lys Ala Leu
290 295 300
Ser Glu Phe Ala Leu Gln Ser Asp Leu Asp Gln Pro Ala Phe Gln Gln
305 310 315 320
Leu Val Ser Phe Ser Glu Ser Gly Ser Leu Gly Asn Ser Ser Gly Ser
325 330 335
Asp Val Thr Ser Leu Ser Ser Gln Leu Pro Asp Thr Pro Asn Ser Met
340 345 350
Val Pro Ser Pro Val Glu Thr
355
<210> 10
<211> 1057
<212> DNA
<213> 智人
<400> 10
tgattggaca gcagcgaggt cccaccgggc gcctccgcgg cttaaaaccg aagcgggggc 60
gagggggagg tagagcccgc cccctgcgcg tcgcggctgg gagggagagg aggtgggaga 120
gaaggaagag gcggaggagg cagcgggcgc cgaggctctg ggacccgcag gcaagccaga 180
ccgacgcgca gagccgggag cctcatcgca gcggcagcgg cagcggcggg ctcgggccgg 240
cctcgggggc tgctcaccca catgagcatc cgcccacccg gcgagccccc gagcccaggc 300
ggcgcggcca tggccgagct caagtcgctg tcgggggacg cgtacctggc actaagccac 360
ggctacgcgg cggcggctgc gggtctcgcc tacggggcgg cgcgagaacc cgaagcggcc 420
cgcggctacg gcactccggg cccgggcggc gacctccccg cggcgcctgc acctcgcgcc 480
ccagctcagg cggcggagag cagcggcgaa cagagcgggg acgaggacga cgccttcgag 540
cagcggcggc ggcggcgcgg gccagggagc gcggcggacg ggcggcggcg gccgcgagag 600
cagcggtctc tgcggctcag catcaacgcg cgcgagcggc ggcgcatgca cgacctaaac 660
gacgcgctgg acgggctgcg agccgtcatc ccctacgcgc acagcccgtc ggtgcgcaag 720
ctctccaaga tcgccacgct gctgctcgcc aagaactata tcctcatgca ggcgcaggcc 780
ctggacgaga tgcggcgcct ggtggccttc ctcaaccagg gccagggcct ggccgcgccc 840
gtaaacgccg cgcccttgac gcccttcggc caggccactg tgtgcccctt ctccgcaggc 900
gccgccctgg ggccctgccc tgacaagtgc gccgccttct ccgggacgcc ctccgcgctt 960
tgcaaacact gtcacgagaa gccgtgaccg cgcgggcccc cggccctccc gcacgcgtcc 1020
tccgatcgcc cctgtgactg tctctctgcc cggacag 1057
<210> 11
<211> 1057
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (262)..(987)
<400> 11
tgattggaca gcagcgaggt cccaccgggc gcctccgcgg cttaaaaccg aagcgggggc 60
gagggggagg tagagcccgc cccctgcgcg tcgcggctgg gagggagagg aggtgggaga 120
gaaggaagag gcggaggagg cagcgggcgc cgaggctctg ggacccgcag gcaagccaga 180
ccgacgcgca gagccgggag cctcatcgca gcggcagcgg cagcggcggg ctcgggccgg 240
cctcgggggc tgctcaccca c atg agc atc cgc cca ccc ggc gag ccc ccg 291
Met Ser Ile Arg Pro Pro Gly Glu Pro Pro
1 5 10
agc cca ggc ggc gcg gcc atg gcc gag ctc aag tcg ctg tcg ggg gac 339
Ser Pro Gly Gly Ala Ala Met Ala Glu Leu Lys Ser Leu Ser Gly Asp
15 20 25
gcg tac ctg gca cta agc cac ggc tac gcg gcg gcg gct gcg ggt ctc 387
Ala Tyr Leu Ala Leu Ser His Gly Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Gly Leu
30 35 40
gcc tac ggg gcg gcg cga gaa ccc gaa gcg gcc cgc ggc tac ggc act 435
Ala Tyr Gly Ala Ala Arg Glu Pro Glu Ala Ala Arg Gly Tyr Gly Thr
45 50 55
ccg ggc ccg ggc ggc gac ctc ccc gcg gcg cct gca cct cgc gcc cca 483
Pro Gly Pro Gly Gly Asp Leu Pro Ala Ala Pro Ala Pro Arg Ala Pro
60 65 70
gct cag gcg gcg gag agc agc ggc gaa cag agc ggg gac gag gac gac 531
Ala Gln Ala Ala Glu Ser Ser Gly Glu Gln Ser Gly Asp Glu Asp Asp
75 80 85 90
gcc ttc gag cag cgg cgg cgg cgg cgc ggg cca ggg agc gcg gcg gac 579
Ala Phe Glu Gln Arg Arg Arg Arg Arg Gly Pro Gly Ser Ala Ala Asp
95 100 105
ggg cgg cgg cgg ccg cga gag cag cgg tct ctg cgg ctc agc atc aac 627
Gly Arg Arg Arg Pro Arg Glu Gln Arg Ser Leu Arg Leu Ser Ile Asn
110 115 120
gcg cgc gag cgg cgg cgc atg cac gac cta aac gac gcg ctg gac ggg 675
Ala Arg Glu Arg Arg Arg Met His Asp Leu Asn Asp Ala Leu Asp Gly
125 130 135
ctg cga gcc gtc atc ccc tac gcg cac agc ccg tcg gtg cgc aag ctc 723
Leu Arg Ala Val Ile Pro Tyr Ala His Ser Pro Ser Val Arg Lys Leu
140 145 150
tcc aag atc gcc acg ctg ctg ctc gcc aag aac tat atc ctc atg cag 771
Ser Lys Ile Ala Thr Leu Leu Leu Ala Lys Asn Tyr Ile Leu Met Gln
155 160 165 170
gcg cag gcc ctg gac gag atg cgg cgc ctg gtg gcc ttc ctc aac cag 819
Ala Gln Ala Leu Asp Glu Met Arg Arg Leu Val Ala Phe Leu Asn Gln
175 180 185
ggc cag ggc ctg gcc gcg ccc gta aac gcc gcg ccc ttg acg ccc ttc 867
Gly Gln Gly Leu Ala Ala Pro Val Asn Ala Ala Pro Leu Thr Pro Phe
190 195 200
ggc cag gcc act gtg tgc ccc ttc tcc gca ggc gcc gcc ctg ggg ccc 915
Gly Gln Ala Thr Val Cys Pro Phe Ser Ala Gly Ala Ala Leu Gly Pro
205 210 215
tgc cct gac aag tgc gcc gcc ttc tcc ggg acg ccc tcc gcg ctt tgc 963
Cys Pro Asp Lys Cys Ala Ala Phe Ser Gly Thr Pro Ser Ala Leu Cys
220 225 230
aaa cac tgt cac gag aag ccg tga ccgcgcgggc ccccggccct cccgcacgcg 1017
Lys His Cys His Glu Lys Pro
235 240
tcctccgatc gcccctgtga ctgtctctct gcccggacag 1057
<210> 12
<211> 241
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
Met Ser Ile Arg Pro Pro Gly Glu Pro Pro Ser Pro Gly Gly Ala Ala
1 5 10 15
Met Ala Glu Leu Lys Ser Leu Ser Gly Asp Ala Tyr Leu Ala Leu Ser
20 25 30
His Gly Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Gly Leu Ala Tyr Gly Ala Ala Arg
35 40 45
Glu Pro Glu Ala Ala Arg Gly Tyr Gly Thr Pro Gly Pro Gly Gly Asp
50 55 60
Leu Pro Ala Ala Pro Ala Pro Arg Ala Pro Ala Gln Ala Ala Glu Ser
65 70 75 80
Ser Gly Glu Gln Ser Gly Asp Glu Asp Asp Ala Phe Glu Gln Arg Arg
85 90 95
Arg Arg Arg Gly Pro Gly Ser Ala Ala Asp Gly Arg Arg Arg Pro Arg
100 105 110
Glu Gln Arg Ser Leu Arg Leu Ser Ile Asn Ala Arg Glu Arg Arg Arg
115 120 125
Met His Asp Leu Asn Asp Ala Leu Asp Gly Leu Arg Ala Val Ile Pro
130 135 140
Tyr Ala His Ser Pro Ser Val Arg Lys Leu Ser Lys Ile Ala Thr Leu
145 150 155 160
Leu Leu Ala Lys Asn Tyr Ile Leu Met Gln Ala Gln Ala Leu Asp Glu
165 170 175
Met Arg Arg Leu Val Ala Phe Leu Asn Gln Gly Gln Gly Leu Ala Ala
180 185 190
Pro Val Asn Ala Ala Pro Leu Thr Pro Phe Gly Gln Ala Thr Val Cys
195 200 205
Pro Phe Ser Ala Gly Ala Ala Leu Gly Pro Cys Pro Asp Lys Cys Ala
210 215 220
Ala Phe Ser Gly Thr Pro Ser Ala Leu Cys Lys His Cys His Glu Lys
225 230 235 240
Pro
<210> 13
<211> 2520
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 13
agagcggccc cggccggcca cgcgccttgg tgagaaggcg caggaagggt ggccggccgg 60
agaggccacg cgcaggcccg gggactgaca gacagctgga caggtggacg cgcccgcagg 120
gcaagaagcc atactgccgt agcgggctcc agaggtcatg gccgagctca agtcgctgtc 180
gggggactcg tacctggcgc tgagccacag ctacacggcg accggccacg cctacgctgc 240
agcgcgcgga ccggagacca cacgcggctt cggtgcatcg ggtccgggtg gcgacctccc 300
ggcggctccc gcttctcgtg tccccgccgc gacggtggag agcagcggcg agcagagcgg 360
cgacgaggac gaagccttcg agaggcggcg gcggcggcga gggtccgggg ttgcggttga 420
cgcacggcgg cggccccggg agcagcgctc gctgaggctc agcatcaacg cgcgcgaacg 480
gcgacgcatg catgacctga acgacgcgct ggacggactg cgcgcagtca tcccctacgc 540
gcacagcccg tcggtgcgca agctctccaa gatagccaca cttctgctgg ccaaaaacta 600
catcctcatg caggcgcagg ccctggagga gatgcggcgc ttggtagcat acctcaacca 660
aggccagggc ctcgcggcgc cggtggccgc cgcgcctcta acgccctttg gccaggcagc 720
gatttacccg ttctcggcgg gcaccgcgct cgggccctgc ccagacaagt gtgccacctt 780
ctcaggatcg ccctcggcgc tttgcaaaca ctgcggcgag aagccctgag ggctccgatc 840
ccctctgcag ccgcctttct atttagactg ttccctgtcc tcgctggcgg gactctatga 900
gaaagcccag tactccgctt acagaactgt tgggtgcaga atgagaagtc cgtctgagaa 960
agccagagag ttggcgctgg actctagacc ctgccgcatc cactgaacta tctcagctaa 1020
aaggctacgg gagtgagcag ttagtgaatg gtcccacatc tgacaggtga ctgcccaagg 1080
ctcaggagcg caggcacaga gcatcgcgct tgaccacatc ctagcgttgg atggggaacc 1140
cagccccttc taagccaact tgcagggcct tgcttgcttc aactagacct gttcctcagg 1200
acgggtgcgg cccctcacct cgggcctctg ttggctccaa gactccagac ccggcctaaa 1260
agcaaaatta cgccgaggtc ctttggagag gtcgtggagg cagacgcagg aagatcccag 1320
gaggtgagct ttacaacgtt ttccaagtct gagcttgttc tgttaacatt cttgcctgcc 1380
cagaggctca ggaaattcaa gccagcctca aaagtctgtg gaaacatctc taaataagcc 1440
tggagcgcca ccgccggcct cctgtgggct gagctgggtt tcacttcttt ctacttgtcc 1500
caaggggact ggtggagccc tcacaacctg ctcagggcta cttgaccctg gagggtcagc 1560
cgaagagtct agtctagctc caggaccaac caagtcccct ctgcgccagt tcgggaactt 1620
ctggaggaag ccgggctacc ggtgagtacc cggtgaggtg ttggactgaa tgggaactgg 1680
tcgctcccca aatcggacca cagcccagaa tcctgccact gtacctagtc tgagccttag 1740
cccgcgcgtc tcagatgttg cctggttttc ctctgtggcc atcagcagct tccgcctcca 1800
tttacccagt tttcttggct ttcattgatg caaagcaaat cgggagaggg ccactgctca 1860
gcaaagcgcc tgtctatagc gcttaacttg aattaacgca ttggaaaagg cccttttgta 1920
tttgcaaaat gacgtgtgtg attaagtctt attcataaag acgtatgctt aatactggtt 1980
tctgctaatt tctatttttt atttcttaag tgtctttccc ctcccctaaa ataatctatt 2040
ttgcacattt caaaacagac tgtttttcaa gttcgcttaa gatgaacagg gaaaactgga 2100
aactcaagtg ttgttagctc tggggtcatt acccactatt atttttcaaa gtcttttatt 2160
tatatttaga cgaggggtag tgtgcagaat aaagtactta aaacttattt ttttaaaaat 2220
atgattaaaa tttaatatca aattaagtgt acatctatga tttgattcat aatttcaatt 2280
gtcagacagt gatactggtt tggaatcctt ctacggcccc aagaaatgct gagattttac 2340
aatggatcca tactccatta agagatgtgt gagttcatac gaaaaatgtg taggagtgtt 2400
gggtggagac acaggggtga tcccaacctg caggaggcag agacaggggc atggggattc 2460
tgagaccagc ctgagcaaca cagggaggct ctcttaggac aagaaaacaa ttaactttga 2520
<210> 14
<211> 2520
<212> DNA
<213> 小鼠
<220>
<221> CDS
<222> (158)..(829)
<400> 14
agagcggccc cggccggcca cgcgccttgg tgagaaggcg caggaagggt ggccggccgg 60
agaggccacg cgcaggcccg gggactgaca gacagctgga caggtggacg cgcccgcagg 120
gcaagaagcc atactgccgt agcgggctcc agaggtc atg gcc gag ctc aag tcg 175
Met Ala Glu Leu Lys Ser
1 5
ctg tcg ggg gac tcg tac ctg gcg ctg agc cac agc tac acg gcg acc 223
Leu Ser Gly Asp Ser Tyr Leu Ala Leu Ser His Ser Tyr Thr Ala Thr
10 15 20
ggc cac gcc tac gct gca gcg cgc gga ccg gag acc aca cgc ggc ttc 271
Gly His Ala Tyr Ala Ala Ala Arg Gly Pro Glu Thr Thr Arg Gly Phe
25 30 35
ggt gca tcg ggt ccg ggt ggc gac ctc ccg gcg gct ccc gct tct cgt 319
Gly Ala Ser Gly Pro Gly Gly Asp Leu Pro Ala Ala Pro Ala Ser Arg
40 45 50
gtc ccc gcc gcg acg gtg gag agc agc ggc gag cag agc ggc gac gag 367
Val Pro Ala Ala Thr Val Glu Ser Ser Gly Glu Gln Ser Gly Asp Glu
55 60 65 70
gac gaa gcc ttc gag agg cgg cgg cgg cgg cga ggg tcc ggg gtt gcg 415
Asp Glu Ala Phe Glu Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Ser Gly Val Ala
75 80 85
gtt gac gca cgg cgg cgg ccc cgg gag cag cgc tcg ctg agg ctc agc 463
Val Asp Ala Arg Arg Arg Pro Arg Glu Gln Arg Ser Leu Arg Leu Ser
90 95 100
atc aac gcg cgc gaa cgg cga cgc atg cat gac ctg aac gac gcg ctg 511
Ile Asn Ala Arg Glu Arg Arg Arg Met His Asp Leu Asn Asp Ala Leu
105 110 115
gac gga ctg cgc gca gtc atc ccc tac gcg cac agc ccg tcg gtg cgc 559
Asp Gly Leu Arg Ala Val Ile Pro Tyr Ala His Ser Pro Ser Val Arg
120 125 130
aag ctc tcc aag ata gcc aca ctt ctg ctg gcc aaa aac tac atc ctc 607
Lys Leu Ser Lys Ile Ala Thr Leu Leu Leu Ala Lys Asn Tyr Ile Leu
135 140 145 150
atg cag gcg cag gcc ctg gag gag atg cgg cgc ttg gta gca tac ctc 655
Met Gln Ala Gln Ala Leu Glu Glu Met Arg Arg Leu Val Ala Tyr Leu
155 160 165
aac caa ggc cag ggc ctc gcg gcg ccg gtg gcc gcc gcg cct cta acg 703
Asn Gln Gly Gln Gly Leu Ala Ala Pro Val Ala Ala Ala Pro Leu Thr
170 175 180
ccc ttt ggc cag gca gcg att tac ccg ttc tcg gcg ggc acc gcg ctc 751
Pro Phe Gly Gln Ala Ala Ile Tyr Pro Phe Ser Ala Gly Thr Ala Leu
185 190 195
ggg ccc tgc cca gac aag tgt gcc acc ttc tca gga tcg ccc tcg gcg 799
Gly Pro Cys Pro Asp Lys Cys Ala Thr Phe Ser Gly Ser Pro Ser Ala
200 205 210
ctt tgc aaa cac tgc ggc gag aag ccc tga gggctccgat cccctctgca 849
Leu Cys Lys His Cys Gly Glu Lys Pro
215 220
gccgcctttc tatttagact gttccctgtc ctcgctggcg ggactctatg agaaagccca 909
gtactccgct tacagaactg ttgggtgcag aatgagaagt ccgtctgaga aagccagaga 969
gttggcgctg gactctagac cctgccgcat ccactgaact atctcagcta aaaggctacg 1029
ggagtgagca gttagtgaat ggtcccacat ctgacaggtg actgcccaag gctcaggagc 1089
gcaggcacag agcatcgcgc ttgaccacat cctagcgttg gatggggaac ccagcccctt 1149
ctaagccaac ttgcagggcc ttgcttgctt caactagacc tgttcctcag gacgggtgcg 1209
gcccctcacc tcgggcctct gttggctcca agactccaga cccggcctaa aagcaaaatt 1269
acgccgaggt cctttggaga ggtcgtggag gcagacgcag gaagatccca ggaggtgagc 1329
tttacaacgt tttccaagtc tgagcttgtt ctgttaacat tcttgcctgc ccagaggctc 1389
aggaaattca agccagcctc aaaagtctgt ggaaacatct ctaaataagc ctggagcgcc 1449
accgccggcc tcctgtgggc tgagctgggt ttcacttctt tctacttgtc ccaaggggac 1509
tggtggagcc ctcacaacct gctcagggct acttgaccct ggagggtcag ccgaagagtc 1569
tagtctagct ccaggaccaa ccaagtcccc tctgcgccag ttcgggaact tctggaggaa 1629
gccgggctac cggtgagtac ccggtgaggt gttggactga atgggaactg gtcgctcccc 1689
aaatcggacc acagcccaga atcctgccac tgtacctagt ctgagcctta gcccgcgcgt 1749
ctcagatgtt gcctggtttt cctctgtggc catcagcagc ttccgcctcc atttacccag 1809
ttttcttggc tttcattgat gcaaagcaaa tcgggagagg gccactgctc agcaaagcgc 1869
ctgtctatag cgcttaactt gaattaacgc attggaaaag gcccttttgt atttgcaaaa 1929
tgacgtgtgt gattaagtct tattcataaa gacgtatgct taatactggt ttctgctaat 1989
ttctattttt tatttcttaa gtgtctttcc cctcccctaa aataatctat tttgcacatt 2049
tcaaaacaga ctgtttttca agttcgctta agatgaacag ggaaaactgg aaactcaagt 2109
gttgttagct ctggggtcat tacccactat tatttttcaa agtcttttat ttatatttag 2169
acgaggggta gtgtgcagaa taaagtactt aaaacttatt tttttaaaaa tatgattaaa 2229
atttaatatc aaattaagtg tacatctatg atttgattca taatttcaat tgtcagacag 2289
tgatactggt ttggaatcct tctacggccc caagaaatgc tgagatttta caatggatcc 2349
atactccatt aagagatgtg tgagttcata cgaaaaatgt gtaggagtgt tgggtggaga 2409
cacaggggtg atcccaacct gcaggaggca gagacagggg catggggatt ctgagaccag 2469
cctgagcaac acagggaggc tctcttagga caagaaaaca attaactttg a 2520
<210> 15
<211> 223
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 15
Met Ala Glu Leu Lys Ser Leu Ser Gly Asp Ser Tyr Leu Ala Leu Ser
1 5 10 15
His Ser Tyr Thr Ala Thr Gly His Ala Tyr Ala Ala Ala Arg Gly Pro
20 25 30
Glu Thr Thr Arg Gly Phe Gly Ala Ser Gly Pro Gly Gly Asp Leu Pro
35 40 45
Ala Ala Pro Ala Ser Arg Val Pro Ala Ala Thr Val Glu Ser Ser Gly
50 55 60
Glu Gln Ser Gly Asp Glu Asp Glu Ala Phe Glu Arg Arg Arg Arg Arg
65 70 75 80
Arg Gly Ser Gly Val Ala Val Asp Ala Arg Arg Arg Pro Arg Glu Gln
85 90 95
Arg Ser Leu Arg Leu Ser Ile Asn Ala Arg Glu Arg Arg Arg Met His
100 105 110
Asp Leu Asn Asp Ala Leu Asp Gly Leu Arg Ala Val Ile Pro Tyr Ala
115 120 125
His Ser Pro Ser Val Arg Lys Leu Ser Lys Ile Ala Thr Leu Leu Leu
130 135 140
Ala Lys Asn Tyr Ile Leu Met Gln Ala Gln Ala Leu Glu Glu Met Arg
145 150 155 160
Arg Leu Val Ala Tyr Leu Asn Gln Gly Gln Gly Leu Ala Ala Pro Val
165 170 175
Ala Ala Ala Pro Leu Thr Pro Phe Gly Gln Ala Ala Ile Tyr Pro Phe
180 185 190
Ser Ala Gly Thr Ala Leu Gly Pro Cys Pro Asp Lys Cys Ala Thr Phe
195 200 205
Ser Gly Ser Pro Ser Ala Leu Cys Lys His Cys Gly Glu Lys Pro
210 215 220
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Bhlhb4的gRNA（gRNA for Bhlhb4）
<400> 16
ccgagctcaa gtcgctgtcg 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Bhlhb4的gRNA
<400> 17
cgcgccttgg tgagaaggcg 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠ISL1的gRNA（gRNA for mouse ISL1）
<400> 18
tcttcaatag cacgcgggaa 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠ISL1的gRNA
<400> 19
tcctaagcca taaagcgctt 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人ISL1的gRNA（gRNA for Human ISL1）
<400> 20
ccaactccgc cggcttaaat 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人ISL1的gRNA
<400> 21
gggaggttaa tacttcggag 20

Claims (31)

1.一种移植用细胞群，其包含双极细胞调控基因进行了改造的视网膜系细胞。
2.如权利要求1所述的移植用细胞群，其为细胞悬浮液或细胞聚集体的形态。
3.如权利要求1或2所述的移植用细胞群，其中，所述双极细胞调控基因为编码转录调控因子的基因。
4.如权利要求3所述的移植用细胞群，其中，所述双极细胞调控基因为选自由ISL1基因和BHLHE23基因组成的组中的一个或多个基因。
5.如权利要求4所述的移植用细胞群，其中，所述ISL1基因具有下述(1)或(2)所表示的碱基序列：
(1)序列号1、4或7所表示的碱基序列；
(2)具有在序列号1、4或7所表示的碱基序列中一个或多个碱基发生缺失、添加、***或置换而得到的碱基序列、并且编码相对于序列号3、6或9所表示的氨基酸序列具有80％以上的序列一致性的蛋白质的碱基序列，该碱基序列编码符合下述(a)～(c)中至少一个条件的蛋白质：
(a)具有DNA结合能力、
(b)具有对基因的转录进行调控的功能、
(c)能够被特异性地识别由序列号3、6或9所表示的氨基酸序列构成的蛋白质的抗体所识别。
6.如权利要求4或5所述的移植用细胞群，其中，所述BHLHE23基因具有下述(1)或(2)所表示的碱基序列：
(1)序列号10或13所表示的碱基序列；
(2)具有在序列号10或13所表示的碱基序列中一个或多个碱基发生缺失、添加、***或置换而得到的碱基序列、并且编码相对于序列号12或15所表示的氨基酸序列具有80％以上的序列一致性的蛋白质的碱基序列，该碱基序列编码符合下述(a)～(c)中至少一个条件的蛋白质：
(a)具有DNA结合能力、
(b)具有对基因的转录进行调控的功能、
(c)能够被特异性地识别由序列号12或15所表示的氨基酸序列构成的蛋白质的抗体所识别。
7.如权利要求1～6中任一项所述的移植用细胞群，其中，所述双极细胞调控基因的改造包括该基因的缺失。
8.如权利要求1～7中任一项所述的移植用细胞群，其中，所述视网膜系细胞来源于多能干细胞。
9.如权利要求8所述的移植用细胞群，其中，所述多能干细胞为诱导性多能干细胞或胚胎干细胞。
10.如权利要求1～9中任一项所述的移植用细胞群，其中，所述视网膜系细胞包含选自由视网膜祖细胞、视细胞祖细胞和视细胞组成的组中的一种或多种细胞。
11.如权利要求10所述的移植用细胞群，其中，所述视网膜系细胞包含选自Chx10阳性细胞、Crx阳性细胞和恢复蛋白阳性细胞中的一种或多种细胞。
12.如权利要求10或11所述的移植用细胞群，其中，在所述移植用细胞群中，视网膜祖细胞、视细胞祖细胞和视细胞的细胞数的合计为总细胞数的10％以上。
13.如权利要求10～12中任一项所述的移植用细胞群，其中，所述视细胞、或者移植后由所述视网膜祖细胞或所述视细胞祖细胞诱导的视细胞的、移植后的功能性成活率得到改善。
14.一种培养物，其为移植用细胞群的培养物，其包含：
(1)权利要求1～13中任一项所述的移植用细胞群；和
(2)用于维持所述移植用细胞群的存活能力所需要的介质。
15.一种包含视网膜系细胞的移植用细胞群的制造方法，其包括下述工序(1)和(2)：
(1)对多能干细胞的双极细胞调控基因进行改造，在体外得到包含所述双极细胞调控基因进行了改造的所述多能干细胞的细胞群的工序；
(2)在体外将工序(1)中得到的包含所述多能干细胞的细胞群分化诱导成所述视网膜系细胞，得到包含所述视网膜系细胞的移植用细胞群的工序。
16.如权利要求15所述的制造方法，其中，包含所述视网膜系细胞的移植用细胞群为细胞悬浮液或细胞聚集体的形态。
17.如权利要求15或16所述的制造方法，其中，所述双极细胞调控基因为编码转录调控因子的基因。
18.如权利要求17所述的制造方法，其中，所述双极细胞调控基因为选自由ISL1基因和BHLHE23基因组成的组中的一个或多个基因。
19.如权利要求18所述的制造方法，其中，所述ISL1基因具有下述(1)或(2)所表示的碱基序列：
(1)序列号1、4或7所表示的碱基序列；
(2)具有在序列号1、4或7所表示的碱基序列中一个或多个碱基发生缺失、添加、***或置换而得到的碱基序列、并且编码相对于序列号3、6或9所表示的氨基酸序列具有80％以上的序列一致性的蛋白质的碱基序列，该碱基序列编码符合下述(a)～(c)中至少一个条件的蛋白质：
(a)具有DNA结合能力、
(b)具有对基因的转录进行调控的功能、
(c)能够被特异性地识别由序列号3、6或9所表示的氨基酸序列构成的蛋白质的抗体所识别。
20.如权利要求18或19所述的制造方法，其中，所述BHLHE23基因具有下述(1)或(2)所表示的碱基序列：
(1)序列号10或13所表示的碱基序列；
(2)具有在序列号10或13所表示的碱基序列中一个或多个碱基发生缺失、添加、***或置换而得到的碱基序列、并且编码相对于序列号12或15所表示的氨基酸序列具有80％以上的序列一致性的蛋白质的碱基序列，该碱基序列编码符合下述(a)～(c)中至少一个条件的蛋白质：
(a)具有DNA结合能力、
(b)具有对基因的转录进行调控的功能、
(c)能够被特异性地识别由序列号12或15所表示的氨基酸序列构成的蛋白质的抗体所识别。
21.如权利要求15～20中任一项所述的制造方法，其中，所述双极细胞调控基因的改造包括该基因的缺失。
22.如权利要求15～21中任一项所述的制造方法，其中，所述多能干细胞为诱导性多能干细胞或胚胎干细胞。
23.如权利要求15～22中任一项所述的制造方法，其中，所述视网膜系细胞包含选自由视网膜祖细胞、视细胞祖细胞和视细胞组成的组中的一种或多种细胞。
24.如权利要求23所述的制造方法，其中，所述视网膜系细胞包含选自Chx10阳性细胞、Crx阳性细胞和恢复蛋白阳性细胞中的一种或多种细胞。
25.如权利要求23或24所述的制造方法，其中，在包含所述视网膜系细胞的移植用细胞群中，视网膜祖细胞、视细胞祖细胞和视细胞的细胞数的合计为总细胞数的10％以上。
26.如权利要求23～25中任一项所述的制造方法，其中，所述视细胞、或者移植后由所述视网膜祖细胞或所述视细胞祖细胞诱导的视细胞的、移植后的功能性成活率得到改善。
27.一种基于视网膜组织的损害的疾病或视网膜组织的损伤状态的治疗方法，其包括将有效量的权利要求1～13中任一项所述的移植用细胞群移植于需要移植的对象。
28.一种用于治疗基于视网膜组织的损害的疾病或视网膜组织的损伤状态的药物组合物，其含有权利要求1～13中任一项所述的移植用细胞群作为有效成分。
29.如权利要求28所述的药物组合物，其为细胞片的形态。
30.一种基于视网膜组织的损害的疾病或视网膜组织的损伤状态的治疗药，其含有权利要求1～13中任一项所述的移植用细胞群。
31.如权利要求30所述的治疗药，其为细胞片的形态。
CN201780071865.9A 2016-11-25 2017-11-24 移植用细胞群及其制造方法 Pending CN109996873A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016229355 2016-11-25
JP2016-229355 2016-11-25
JP2017-138142 2017-07-14
JP2017138142 2017-07-14
PCT/JP2017/042238 WO2018097253A1 (ja) 2016-11-25 2017-11-24 移植用細胞集団及びその製造方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109996873A true CN109996873A (zh) 2019-07-09

Family

ID=62195093

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780071865.9A Pending CN109996873A (zh) 2016-11-25 2017-11-24 移植用细胞群及其制造方法

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20190351103A1 (zh)
EP (1) EP3546571A4 (zh)
JP (2) JP7184283B2 (zh)
KR (1) KR102599982B1 (zh)
CN (1) CN109996873A (zh)
AU (1) AU2017363689B2 (zh)
CA (1) CA3044509A1 (zh)
IL (1) IL266831B (zh)
WO (1) WO2018097253A1 (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11241460B2 (en) 2013-03-15 2022-02-08 Astellas Institute For Regenerative Medicine Photoreceptors and photoreceptor progenitors produced from pluripotent stem cells
WO2017183732A1 (ja) * 2016-04-22 2017-10-26 大日本住友製薬株式会社 網膜組織の製造法
KR102599982B1 (ko) * 2016-11-25 2023-11-09 고쿠리쓰 겐큐 가이하쓰 호징 리가가쿠 겐큐소 이식용 세포 집단 및 그의 제조 방법
GB2584664B (en) * 2019-06-10 2023-05-24 Newcells Biotech Ltd Improved retinal organoids and methods of making the same
CA3238664A1 (en) 2021-11-19 2023-05-25 Riken Production method for sheet-like retinal tissue

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110223140A1 (en) * 2009-10-06 2011-09-15 Snu R&Db Foundation Method for differentiation into retinal cells from stem cells
CN103998599A (zh) * 2011-11-25 2014-08-20 住友化学株式会社 制备视网膜组织和视网膜相关细胞的方法
WO2016063986A1 (ja) * 2014-10-24 2016-04-28 大日本住友製薬株式会社 網膜組織の製造方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
US6280718B1 (en) 1999-11-08 2001-08-28 Wisconsin Alumni Reasearch Foundation Hematopoietic differentiation of human pluripotent embryonic stem cells
CN100557023C (zh) 2001-06-08 2009-11-04 株式会社载体研究所 利用vsv-g假型化猴免疫缺陷病毒载体将基因导入灵长类胚胎干细胞
DK2496688T3 (en) 2009-11-05 2017-04-03 Riken Method of Inducing Differentiation in Cultured Stem Cells
JPWO2012173207A1 (ja) 2011-06-14 2015-02-23 独立行政法人理化学研究所 網膜細胞への分化誘導方法
JP6580989B2 (ja) 2013-08-23 2019-09-25 住友化学株式会社 網膜組織及び網膜関連細胞の製造方法
WO2015077498A1 (en) * 2013-11-20 2015-05-28 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for treating disorders of the eye
CN107109367B (zh) 2014-10-24 2021-08-10 大日本住友制药株式会社 神经组织的制备方法
KR102599982B1 (ko) * 2016-11-25 2023-11-09 고쿠리쓰 겐큐 가이하쓰 호징 리가가쿠 겐큐소 이식용 세포 집단 및 그의 제조 방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110223140A1 (en) * 2009-10-06 2011-09-15 Snu R&Db Foundation Method for differentiation into retinal cells from stem cells
CN103998599A (zh) * 2011-11-25 2014-08-20 住友化学株式会社 制备视网膜组织和视网膜相关细胞的方法
WO2016063986A1 (ja) * 2014-10-24 2016-04-28 大日本住友製薬株式会社 網膜組織の製造方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DEBRA E. BRAMBLETT ET AL.: "The transcription factor Bhlhb4 is required for rod bipolar cell maturation", 《NEURON》 *
GERVASIO MARTIN-PARTIDO ET AL.: "The role of Islet-1 in cell specification,differentiation, and maintenance of phenotypes in the vertebrate neural retina", 《NEURAL REGENERATION RESEARCH》 *
SONG ET AL.: "Atoh7 promotes the differentiation of retinal stem cells derived from Müller cells into retinal ganglion cells by inhibiting Notch signaling", 《STEM CELL RESEARCH & THERAPY》 *
YAMASAKI ET AL.: "A Genetic modification that reduces ON-bipolar cells in hESC-derived retinas enhances functional integration after transplantation", 《ISCIENCE》 *
栾文斌: "视网膜干细胞相关基因的研究进展", 《蚌埠医学院学报》 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3546571A4 (en) 2020-06-03
CA3044509A1 (en) 2018-05-31
AU2017363689A1 (en) 2019-06-13
JP2023022097A (ja) 2023-02-14
AU2017363689B2 (en) 2023-11-23
JP7448166B2 (ja) 2024-03-12
KR102599982B1 (ko) 2023-11-09
IL266831A (en) 2019-08-29
KR20190082296A (ko) 2019-07-09
IL266831B (en) 2022-02-01
JP7184283B2 (ja) 2022-12-06
JPWO2018097253A1 (ja) 2019-10-17
WO2018097253A1 (ja) 2018-05-31
EP3546571A1 (en) 2019-10-02
US20190351103A1 (en) 2019-11-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109996873A (zh) 移植用细胞群及其制造方法
US9951353B2 (en) Engineering neural stem cells using homologous recombination
Vergara et al. Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development
US11959104B2 (en) Methods of differentiating stem cell-derived ectodermal lineage precursors
US20060247195A1 (en) Method of altering cell properties by administering rna
CN105473706A (zh) 肾祖细胞
JPWO2019054514A1 (ja) 網膜組織の製造方法
KR20090109564A (ko) 간엽계 세포의 제조방법, 이빨의 제조방법 및 이빨 형성용 간엽계 세포
JP2022522897A (ja) 誘導された光受容細胞およびその産生方法
JPWO2019054515A1 (ja) 背側化シグナル伝達物質又は腹側化シグナル伝達物質による錐体視細胞又は桿体視細胞の増加方法
CN111484977B (zh) 重编程产生功能性去甲肾上腺素能神经元的方法
Connolly et al. Modelling inner ear development and disease using pluripotent stem cells–a pathway to new therapeutic strategies
JP2023543202A (ja) Ｃｙｐ４ｖ２遺伝子変異部位を標的とする核酸分子およびその使用
JP2018042503A (ja) 標的遺伝子の標識方法、ベクターシステム、細胞、及び遺伝子活性維持標的遺伝子編集キット
García-Pérez Generation of pacemaker cardiomyocytes based on hHCN4 overexpression in hiPSCs by the Sleeping Beauty transposon system
WO2023135318A1 (en) Method for expression of a transgene of interest from neural precursor cells
KR20240026435A (ko) 엑소좀을 이용한 생식세포 내 물질 전달 및 유전자 편집 시스템
Biglari et al. PRODUCTION OF MOUSE EMBRYONIC STEM CELLS EXPRESSING THE GPX1 AND NURR1 GENES BY USING LENTI VIRUS VECTORS; NEW CELLS SOURCES FOR CELL THERAPY IN PARKINSON'S
Reinhardt Cell intrinsic control of stem cell features in the retina
Žužić Forward programming of photoreceptors from induced pluripotent stem cells
Human Monitoring Stem Cell Research 280
Ludwig et al. Monitoring Stem Cell Research

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: Saitama Prefecture, Japan

Applicant after: RIKEN

Applicant after: SUMITOMO PHARMACEUTICALS CO.,LTD.

Address before: Saitama Prefecture, Japan

Applicant before: RIKEN

Applicant before: Sumitomo Pharmaceutical Co., Ltd.