CN109996867A - 制备体细胞的方法、体细胞和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于提供了：在不进行人工基因导入的情况下从体细胞制备褐色脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞或心肌细胞的方法；褐色脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞或心肌细胞；或者包含能够用于上述制备方法的化学物质的组合的组合物。作为本发明，可以举出制备褐色脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞或心肌细胞的方法，该方法包括：在选自ALK5抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、GSK3抑制剂和Erk抑制剂中的抑制剂或激活剂存在或不存在的情况下培养体细胞的工序。

Description

制备体细胞的方法、体细胞和组合物
技术领域
本发明涉及制备体细胞的方法。本发明进一步涉及体细胞、以及可用于制备体细胞的方法的组合物。具体地，通过根据本发明的制备方法制备的体细胞为褐色脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞或心肌细胞。
背景技术
随着最近在细胞相关研究、特别是多能细胞相关研究中的进展，治疗性细胞在可用于移植到个体中的质量和数量方面变得可用。对于某些疾病，已经开始尝试将对治疗有效的细胞移植到患者中。
间充质细胞形成了肌肉、骨、软骨、骨髓、脂肪组织和***等生物体的各种器官，并且是用于再生医学的有希望的材料。间充质干细胞(mesenchymal stem cells：MSC)是存在于骨髓、脂肪组织、血液、胎盘和脐带等组织中的未分化细胞。由于间充质干细胞具有分化成属于间充质***的细胞的能力，因此，间充质干细胞作为制备间充质细胞的起始材料而备受关注。此外，还研究了利用间充质干细胞自身重建骨、软骨、心肌等的再生医学。
另一方面，还报道了将成纤维细胞这样的体细胞直接转化成其它细胞的方法。例如，已知通过将成纤维细胞与化学物质一起培养来获得神经细胞(非专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
非专利文献1：Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition,2015,Vol.56,No.3,pp.166-170
发明概要
本发明要解决的课题
与非专利文献1中所述的方法类似，在没有基因导入的情况下将体细胞转化成期望的细胞的方法有时是作为获得治疗性细胞的手段的有效选项。要解决的本发明的主要问题是提供在没有人工基因导入的情况下从体细胞制备褐色脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞或心肌细胞的方法；褐色脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞或心肌细胞；或者可用于上述制备方法的包含化学物质组合的组合物。
解决课题的方法
本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现，可以通过在存在或不存在某些抑制剂或激活剂的情况下培养体细胞，从而将体细胞转化成褐色脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞或心肌细胞。本发明是基于上述见解而完成的。
作为本发明，可以列举例如以下内容。
[1]一种制备褐色脂肪细胞的方法，该方法包括：在ALK5抑制剂的存在下、并且在选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂的存在下培养体细胞的工序a。
[2]根据上述[1]所述的制备褐色脂肪细胞的方法，其中，所述工序a是在ALK6抑制剂和AMPK抑制剂的存在下培养体细胞的工序。
[3]根据上述[1]或[2]所述的制备褐色脂肪细胞的方法，其中，所述工序a是在选自cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、GSK3抑制剂和Erk抑制剂中的至少一种激活剂和/或抑制剂的存在下培养体细胞的工序。
[4]根据上述[1]～[3]中任一项所述的制备褐色脂肪细胞的方法，其中，所述工序a是在以下任一项的存在下培养体细胞的工序：
(1)ALK5抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、GSK3抑制剂、和Erk抑制剂；
(2)ALK5抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、和ALK3抑制剂；
(3)ALK5抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、GSK3抑制剂、和Erk抑制剂；
(4)ALK5抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、和Erk抑制剂；
(5)ALK5抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、和GSK3抑制剂；
(6)ALK5抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂、和ALK3抑制剂。
[5]根据上述[1]～[4]中任一项所述的制备褐色脂肪细胞的方法，其中，在选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂的存在下培养体细胞是在dorsomorphin的存在下培养体细胞。
[6]根据上述[3]或[4]所述的制备褐色脂肪细胞的方法，其中，在选自ALK2抑制剂和ALK3抑制剂中的至少一种抑制剂的存在下培养体细胞是在LDN193189和/或dorsomorphin的存在下培养体细胞。
[7]根据上述[1]～[6]中任一项所述的制备褐色脂肪细胞的方法，其中，所述工序a是在p53抑制剂不存在的情况下培养体细胞的工序。
[8]根据上述[1]～[7]中任一项所述的制备褐色脂肪细胞的方法，其中，所述工序a是在与组蛋白相关的成分不存在的情况下培养体细胞的工序。
[9]根据上述[1]～[8]中任一项所述的制备褐色脂肪细胞的方法，其中，所述体细胞是成纤维细胞。
[10]一种褐色脂肪细胞，其通过上述[1]～[9]中任一项所述的制备褐色脂肪细胞的方法来制备。
[11]一种组合物，其包含ALK5抑制剂、和选自ALK6抑制剂及AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂。
[12]根据上述[11]所述的组合物，其包含ALK6抑制剂和AMPK抑制剂。
[13]根据上述[11]或[12]所述的组合物，其进一步包含选自cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、GSK3抑制剂和Erk抑制剂中的至少一种激活剂和/或抑制剂。
[14]根据上述[11]～[13]中任一项的组合物，其包含以下的任意组合：
(1)ALK5抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、GSK3抑制剂、和Erk抑制剂；
(2)ALK5抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、和ALK3抑制剂；
(3)ALK5抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、GSK3抑制剂、和Erk抑制剂；
(4)ALK5抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、和Erk抑制剂；
(5)ALK5抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、和GSK3抑制剂；
(6)ALK5抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂、和ALK3抑制剂。
[15]根据上述[11]～[14]中任一项的组合物，其中，选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂是dorsomorphin。
[16]根据上述[13]或[14]所述的组合物，其中，选自ALK2抑制剂和ALK3抑制剂中的至少一种抑制剂是LDN193189和/或dorsomorphin。
[17]根据上述[11]～[16]中任一项的组合物，其是用于从体细胞制备褐色脂肪细胞的组合物。
[18]一种制备褐色脂肪细胞的方法，该方法包括在选自以下五组中的至少一组的存在下培养体细胞的工序b：
(1)Erk抑制剂；(2)ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；(3)ALK5抑制剂；(4)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；以及(5)cAMP激活剂。
[19]根据上述[18]所述的制备褐色脂肪细胞的方法，其中，所述工序b是在选自以下五组中的至少两组的存在下培养体细胞的工序：
(1)Erk抑制剂；(2)ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；(3)ALK5抑制剂；(4)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；以及(5)cAMP激活剂。
[20]根据上述[18]或[19]所述的制备褐色脂肪细胞的方法，其中，所述工序b是在以下任一项的存在下培养体细胞的工序：
(i)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂及ALK3抑制剂、和cAMP激活剂；
(ii)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂及ALK3抑制剂、和Erk抑制剂；
(iii)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂及ALK3抑制剂、和ALK5抑制剂；
(iv)cAMP激活剂、和ALK2抑制剂及ALK3抑制剂；
(v)cAMP激活剂、和Erk抑制剂
(vi)cAMP激活剂、和ALK5抑制剂；
(vii)ALK2抑制剂及ALK3抑制剂、和ALK5抑制剂；以及
(viii)Erk抑制剂、和ALK5抑制剂。
[21]根据上述[18]或[19]所述的制备褐色脂肪细胞的方法，其中，所述工序b是在选自以下五组中的至少三组的存在下培养体细胞的工序：
(1)Erk抑制剂；(2)ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；(3)ALK5抑制剂；(4)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；以及(5)cAMP激活剂。
[22]根据上述[18]、[19]和[21]中任一项所述的制备褐色脂肪细胞的方法，其中，所述工序b是在选自以下五组中的至少四组的存在下培养体细胞的工序：
(1)Erk抑制剂；(2)ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；(3)ALK5抑制剂；(4)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；以及(5)cAMP激活剂。
[23]一种制备褐色脂肪细胞的方法，该方法包括在选自以下六组中的至少五组的存在下培养体细胞的工序b：
(1)Erk抑制剂；(2)ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；(3)ALK5抑制剂；(4)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；(5)cAMP激活剂；以及(6)GSK3抑制剂。
[24]根据上述[18]～[23]中任一项所述的制备褐色脂肪细胞的方法，其中，在ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂的存在下培养体细胞是在dorsomorphin的存在下或在dorsomorphin和LDN193189的存在下培养体细胞。
[25]根据上述[18]～[24]中任一项所述的制备褐色脂肪细胞的方法，其中，所述工序b是在p53抑制剂不存在的情况下培养体细胞的工序。
[26]根据上述[18]～[25]中任一项所述的制备褐色脂肪细胞的方法，其中，所述工序b是在与组蛋白相关的成分不存在的情况下培养体细胞的工序。
[27]根据上述[18]～[26]中任一项所述的制备褐色脂肪细胞的方法，其中，所述体细胞是成纤维细胞。
[28]一种褐色脂肪细胞，其通过上述[18]～[27]中任一项所述的制备褐色脂肪细胞的方法来制备。
[29]一种用于从体细胞制备褐色脂肪细胞的组合物，其包含选自以下五组中的至少一组：(1)Erk抑制剂；(2)ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；(3)ALK5抑制剂；(4)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；以及(5)cAMP激活剂。
[30]根据上述[29]所述的用于从体细胞制备褐色脂肪细胞的组合物，其包含选自以下五组中的至少两组：(1)Erk抑制剂；(2)ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；(3)ALK5抑制剂；(4)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；以及(5)cAMP激活剂。
[31]根据上述[29]或[30]所述的用于从体细胞制备褐色脂肪细胞的组合物，其包含以下的任一项：
(i)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂及ALK3抑制剂、和cAMP激活剂；
(ii)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂及ALK3抑制剂、和Erk抑制剂；
(iii)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂及ALK3抑制剂、和ALK5抑制剂；
(iv)cAMP激活剂、和ALK2抑制剂及ALK3抑制剂；
(v)cAMP激活剂、和Erk抑制剂
(vi)cAMP激活剂、和ALK5抑制剂；
(vii)ALK2抑制剂及ALK3抑制剂、和ALK5抑制剂；以及
(viii)Erk抑制剂、和ALK5抑制剂。
[32]根据上述[29]或[30]所述的用于从体细胞制备褐色脂肪细胞的组合物，其包含选自以下五组中的至少三组：(1)Erk抑制剂；(2)ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；(3)ALK5抑制剂；(4)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；以及(5)cAMP激活剂。
[33]根据上述[29]、[30]及[32]中任一项所述的用于制备褐色脂肪细胞的组合物，其包含选自以下五组中的至少四组：(1)Erk抑制剂；(2)ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；(3)ALK5抑制剂；(4)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；以及(5)cAMP激活剂。
[34]一种用于制备褐色脂肪细胞的组合物，其包含选自以下六组中的至少五组：(1)Erk抑制剂；(2)ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；(3)ALK5抑制剂；(4)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；(5)cAMP激活剂；以及(6)GSK3抑制剂。
[35]根据上述[29]～[34]中任一项所述的用于从体细胞制备褐色脂肪细胞的组合物，其中，ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂是dorsomorphin或dorsomorphin和LDN193189。
[36]一种制备成骨细胞的方法，该方法包括：在选自ALK5抑制剂、GSK3抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂中的至少一种抑制剂存在、cAMP激活剂存在、且Erk抑制剂不存在的情况下培养体细胞的工序c。
[37]根据上述[36]所述的制备成骨细胞的方法，其中，所述工序c是在ALK2抑制剂和ALK3抑制剂的存在下培养体细胞的工序。
[38]根据上述[36]或[37]所述的制备成骨细胞的方法，其中，所述工序c是在选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂的存在下培养体细胞的工序。
[39]根据上述[36]～[38]中任一项所述的制备成骨细胞的方法，其中，所述工序c是在以下任一项的存在下培养体细胞的工序：
(1)在ALK5抑制剂、GSK3抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂和cAMP激活剂存在、且Erk抑制剂不存在的情况下；
(2)在ALK5抑制剂、GSK3抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂和cAMP激活剂存在、且Erk抑制剂不存在的情况下。
[40]根据上述[37]或[39]所述的制备成骨细胞的方法，其中，在ALK2抑制剂和ALK3抑制剂的存在下培养体细胞是在LDN193189和/或dorsomorphin的存在下培养体细胞。
[41]根据上述[38]所述的制备成骨细胞的方法，其中，在选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂的存在下培养体细胞是在dorsomorphin的存在下培养体细胞。
[42]根据上述[36]～[41]中任一项所述的制备成骨细胞的方法，其中，所述工序c是在p53抑制剂不存在的情况下培养体细胞的工序。
[43]根据上述[36]～[42]中任一项所述的制备成骨细胞的方法，其中，所述工序c是在生长因子和/或细胞因子不存在的情况下培养体细胞的工序。
[44]根据上述[36]～[43]中任一项所述的制备成骨细胞的方法，其中，所述工序c是在与组蛋白相关的成分不存在的情况下培养体细胞的工序。
[45]根据上述[36]～[44]中任一项所述的制备成骨细胞的方法，其中，所述体细胞是成纤维细胞。
[46]一种成骨细胞，其通过上述[36]～[45]中任一项所述的制备成骨细胞的方法来制备。
[47]一种组合物，其包含选自ALK5抑制剂、GSK3抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂中的至少一种抑制剂、以及cAMP激活剂。
[48]根据上述[47]所述的组合物，其至少包含ALK2抑制剂和ALK3抑制剂。
[49]根据上述[47]或[48]所述的组合物，其进一步包含选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂。
[50]根据上述[47]或[48]所述的组合物，其包含以下的任意组合：
(1)ALK5抑制剂、GSK3抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂和cAMP激活剂；
(2)ALK5抑制剂、GSK3抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂和cAMP激活剂。
[51]根据上述[48]或[50]所述的组合物，其中，ALK2抑制剂和ALK3抑制剂是LDN193189和/或dorsomorphin。
[52]根据上述[49]所述的组合物，其中，选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂是dorsomorphin。
[53]根据上述[47]～[52]中任一项所述的组合物，其是用于从体细胞制备成骨细胞的组合物。
[54]一种制备软骨细胞的方法，该方法包括：在选自cAMP激活剂、ALK5抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂和GSK3抑制剂中的至少一种抑制剂存在、Erk抑制剂不存在、且选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂不存在的情况下培养体细胞的工序d。
[55]根据上述[54]所述的制备软骨细胞的方法，其中，所述工序d是至少在ALK2抑制剂和ALK3抑制剂的存在下培养体细胞的工序。
[56]根据上述[54]或[55]所述的制备软骨细胞的方法，其中，所述工序d是在cAMP激活剂、ALK5抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂和GSK3抑制剂存在、Erk抑制剂不存在、且ALK6抑制剂和AMPK抑制剂不存在的情况下培养体细胞的工序。
[57]根据上述[55]或[56]所述的制备软骨细胞的方法，其中，在ALK2抑制剂和ALK3抑制剂的存在下培养体细胞是在LDN193189的存在下培养体细胞。
[58]根据上述[54]～[57]中任一项所述的制备软骨细胞的方法，其中，所述工序d是在p53抑制剂不存在的情况下培养体细胞的工序。
[59]根据上述[54]～[58]中任一项所述的制备软骨细胞的方法，其中，所述工序d是在与组蛋白相关的成分不存在的情况下培养体细胞的工序。
[60]根据上述[54]～[59]中任一项所述的制备软骨细胞的方法，其中，所述体细胞是成纤维细胞。
[61]一种软骨细胞，其通过上述[54]～[60]中任一项所述的制备软骨细胞的方法来制备。
[62]一种用于从体细胞制备软骨细胞的组合物，其包含选自cAMP激活剂、ALK5抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂和GSK3抑制剂中的至少一种抑制剂。
[63]根据上述[62]所述的组合物，其至少包含ALK2抑制剂和ALK3抑制剂。
[64]一种组合物，其包含cAMP激活剂、ALK5抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂和GSK3抑制剂。
[65]根据上述[63]或[64]所述的组合物，其中，ALK2抑制剂和ALK3抑制剂是LDN193189。
[66]根据上述[64]或[65]所述的组合物，其是用于从体细胞制备软骨细胞的组合物。
[67]一种制备神经细胞的方法，该方法包括：在选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂的存在下培养体细胞的工序e。
[68]根据上述[67]所述的制备神经细胞的方法，其中，所述工序e是在ALK6抑制剂和AMPK抑制剂的存在下培养体细胞的工序。
[69]根据上述[67]或[68]所述的制备神经细胞的方法，其中，所述工序e是在选自cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂、GSK3抑制剂和Erk抑制剂中的至少一种激活剂和/或抑制剂的存在下培养体细胞的工序。
[70]根据上述[67]～[69]中任一项所述的制备神经细胞的方法，其中，所述工序e是在以下任一项的存在下培养体细胞的工序：
(1)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂、GSK3抑制剂和Erk抑制剂；
(2)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂、GSK3抑制剂和Erk抑制剂；
(3)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂和Erk抑制剂；
(4)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂和GSK3抑制剂。
[71]根据上述[67]～[70]中任一项所述的制备神经细胞的方法，其中，在选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂的存在下培养体细胞是在dorsomorphin的存在下培养体细胞。
[72]根据上述[69]所述的制备神经细胞的方法，其中，在选自ALK2抑制剂和ALK3抑制剂中的至少一种抑制剂的存在下培养体细胞是在LDN193189和/或dorsomorphin的存在下培养体细胞。
[73]根据上述[67]～[72]中任一项所述的制备神经细胞的方法，其中，所述工序e是在p53抑制剂不存在的情况下培养体细胞的工序。
[74]根据上述[67]～[73]中任一项所述的制备神经细胞的方法，其中，所述工序e是在生长因子和/或细胞因子不存在的情况下培养体细胞的工序。
[75]根据上述[67]～[74]中任一项所述的制备神经细胞的方法，其中，所述工序e是在与组蛋白相关的成分不存在的情况下培养体细胞的工序。
[76]根据上述[67]～[75]中任一项所述的制备神经细胞的方法，其中，所述体细胞是成纤维细胞。
[77]一种神经细胞，其通过上述[67]～[76]中任一项所述的制备神经细胞的方法来制备。
[78]一种用于从体细胞制备神经细胞的组合物，其包含选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂。
[79]一种用于从体细胞制备神经细胞的组合物，其包含ALK6抑制剂和AMPK抑制剂。
[80]一种组合物，其包含选自ALK6抑制剂及AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂、和选自cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂、GSK3抑制剂及Erk抑制剂中的至少一种激活剂和/或抑制剂。
[81]根据上述[80]所述的组合物，其包含以下任意组合：
(1)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂、GSK3抑制剂、和Erk抑制剂；
(2)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂、GSK3抑制剂、和Erk抑制剂；
(3)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂、和Erk抑制剂；
(4)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂、和GSK3抑制剂。
[82]根据上述[81]所述的组合物，其中，ALK6抑制剂和AMPK抑制剂是dorsomorphin。
[83]根据上述[81]所述的组合物，其中，ALK2抑制剂和ALK3抑制剂是LDN193189和/或dorsomorphin。
[84]根据上述[80]～[83]中任一项所述的组合物，其是用于从体细胞制备神经细胞的组合物。
[85]一种制备心肌细胞的方法，该方法包括：在选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂的存在下、且在cAMP激活剂、ALK5抑制剂和Erk抑制剂的存在下培养体细胞的工序f。
[86]根据上述[85]所述的制备心肌细胞的方法，其中，所述工序f是在ALK6抑制剂和AMPK抑制剂的存在下、且在cAMP激活剂、ALK5抑制剂和Erk抑制剂的存在下培养体细胞的工序。
[87]根据上述[85]或[86]所述的制备心肌细胞的方法，其中，所述工序f是在选自ALK2抑制剂和ALK3抑制剂中的至少一种抑制剂的存在下培养体细胞的工序。
[88]根据上述[85]～[87]中任一项所述的制备心肌细胞的方法，其中，所述工序f是在GSK3抑制剂的存在下培养体细胞的工序。
[89]根据上述[85]～[88]中任一项所述的制备心肌细胞的方法，其中，所述工序f是在以下任一项的存在下培养体细胞的工序：
(1)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂、GSK3抑制剂、和Erk抑制剂；
(2)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂、和Erk抑制剂。
[90]根据上述[85]～[89]中任一项所述的制备心肌细胞的方法，其中，在选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂的存在下培养体细胞是在dorsomorphin的存在下培养体细胞。
[91]根据上述[85]～[90]中任一项所述的制备心肌细胞的方法，其中，所述工序f是在ALK4抑制剂不存在的情况下培养体细胞的工序。
[92]根据上述[85]～[91]中任一项所述的制备心肌细胞的方法，其中，所述工序f是在p53抑制剂不存在的情况下培养体细胞的工序。
[93]根据上述[85]～[92]中任一项所述的制备心肌细胞的方法，其中，所述工序f是在与组蛋白相关的成分不存在的情况下培养体细胞的工序。
[94]根据上述[85]～[93]中任一项所述的制备心肌细胞的方法，其中，所述体细胞是成纤维细胞。
[95]一种心肌细胞，其通过上述[85]～[94]中任一项所述的制备心肌细胞的方法来制备。
[96]一种组合物，其包含选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂、以及cAMP激活剂、ALK5抑制剂及Erk抑制剂。
[97]根据上述[96]所述的组合物，其包含ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK5抑制剂和Erk抑制剂。
[98]根据上述[96]或[97]所述的组合物，其进一步包含选自ALK2抑制剂和ALK3抑制剂中的至少一种抑制剂。
[99]根据上述[96]～[98]中任一项所述的组合物，其进一步包含GSK3抑制剂。
[100]根据上述[96]～[98]中任一项所述的组合物，其包含以下任意组合：
(1)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂、GSK3抑制剂、和Erk抑制剂；
(2)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂、和Erk抑制剂。
[101]根据上述[97]～[100]中任一项所述的组合物，其中，ALK6抑制剂和AMPK抑制剂是dorsomorphin。
[102]根据上述[96]～[101]中任一项所述的组合物，其是用于从体细胞制备心肌细胞的组合物。
发明的效果
根据本发明的制备方法或本发明的组合物，可以在不进行基因导入的情况下从体细胞制备褐色脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞或心肌细胞。根据本发明获得的褐色脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞或心肌细胞在再生医学等方面是有用的。
附图说明
图1示出了将培养开始21天后的细胞进行固定、然后进行了免疫染色的结果。
图2示出了用各化合物的组合处理了3周后的细胞状态。
图3示出了用各化合物的组合进行了处理时Fabp 4(脂肪细胞特异性基因)的定量的结果。
图4示出了免疫染色38岁龄受试者的成纤维细胞中UCP1蛋白(绿色)和细胞核(蓝色)的结果。由于图4是单色的，因此没有显示出绿色和蓝色，但是在图4的原始照片中显示出绿色和蓝色。
图5示出了免疫染色38岁龄受试者的成纤维细胞中UCP1蛋白(绿色)和细胞核(蓝色)的结果。由于图5是单色的，因此没有显示出绿色和蓝色，但是在图5的原始照片中显示出绿色和蓝色。
图6示出了免疫染色38岁龄受试者的成纤维细胞中UCP1蛋白(绿色)和细胞核(蓝色)的结果。由于图6是单色的，因此没有显示出绿色和蓝色，但是在图6的原始照片中显示出绿色和蓝色。
图7示出了免疫染色38岁龄受试者的成纤维细胞中UCP1蛋白(绿色)和细胞核(蓝色)的结果。由于图7是单色的，因此没有显示出绿色和蓝色，但是在图7的原始照片图像中显示出绿色和蓝色。
图8示出了免疫染色38岁龄受试者的成纤维细胞中UCP1蛋白(绿色)和细胞核(蓝色)的结果。由于图8是单色的，因此没有显示出绿色和蓝色，但是在图8的原始照片中显示出绿色和蓝色。
图9示出了免疫染色来自于3名年龄为38岁(A)、49岁(B)和0岁(C)的受试者的成纤维细胞中UCP1蛋白(绿色)和线粒体(红色)的结果。由于图9是单色的，因此没有显示出绿色和红色，但是在图9的原始照片中显示出绿色和红色。
图10示出了通过在化合物混合物(5CORo-GM)中培养来自于3名年龄为38岁(A)、49岁(B)和0岁(C)的受试者的成纤维细胞3周，然后在仅Ro中培养1周使其成熟的细胞的状态。
图11示出了对对照细胞(未用化合物处理)和来自于3名年龄为0、38和49岁的受试者的成纤维细胞的褐色脂肪细胞中的Ucp1基因、Ckmt1基因、Cited1基因、Colla2基因、Fabp4基因、AdipoQ基因及Pparγ基因的表达进行定量而得到的结果。数据以平均值±SD表示(n＝3)。Student t检验：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图12示出了在用异丙肾上腺素(0.1μM、1μM或10μM)或毛喉素(0.1μM、1μM或10μM)进行了处理后对褐色脂肪细胞中的Ucp1、Ckmt1和Cited1的mRNA进行定量的结果。未处理的褐色脂肪细胞的表达量被标准化为1的第一泳道表示对照细胞(未添加化合物)的表达量。数据以平均值±SD表示(n＝3)。Student t检验：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图13示出了使用Flux分析仪测定来自于对照细胞(未添加化合物)和成纤维细胞(A：38岁龄、B：49岁龄、和C：0岁龄)的褐色脂肪细胞(对于各细胞，n＝3)的耗氧速率的结果。在图中所示的时刻，添加了寡霉素(O)、FCCP(F)和抗霉素A/鱼藤酮(A/R)。数据以平均值±SD表示(n＝3～5)。
图14示出了对培养开始21天后的细胞进行染色的结果。
图15示出了对培养开始21天后的细胞进行染色的结果。
图16示出了在将培养开始14天后的细胞固定后进行免疫染色的结果。
图17示出了在将培养开始21天后的细胞固定后进行免疫染色的结果。
具体实施方式
在下文中，对本发明的实施方式进行详细说明。
1.体细胞
生物细胞可以分类为体细胞和生殖细胞。在本发明的方法中，可以使用任意的体细胞作为起始材料。体细胞没有特别限制，可以是从生物体采集的原代细胞、或已建立的细胞。在本发明中，可以使用处于各种分化阶段的体细胞，例如，处于终末分化阶段的体细胞、在通向终末分化的途径上的体细胞、或已经初始化获得了多能性的体细胞。作为可用于本发明的体细胞，没有特别限制，可以列举任意体细胞，例如造血细胞(各种淋巴细胞、巨噬细胞、树突细胞、骨髓细胞等)、来自于器官的细胞(肝细胞、脾细胞、胰腺细胞、肾细胞、肺细胞等)、肌肉组织细胞(骨骼肌细胞、平滑肌细胞、成肌细胞、心肌细胞等)、成纤维细胞、神经细胞、成骨细胞、软骨细胞、内皮细胞、***、脂肪细胞(白色脂肪细胞等)、胚胎干细胞(ES细胞)等。这些细胞的前体细胞、癌细胞也可以应用于本发明的方法。作为体细胞，可以优选使用成纤维细胞。
作为上述的体细胞的来源，可以示例出人、非人哺乳动物和除哺乳动物以外的动物(鸟类、爬行动物类、两栖动物类、鱼类等)，但并不限定于此。作为体细胞的来源，优选为人和除人以外的哺乳动物，特别优选为人。在以对人施用为目的而通过本发明的方法制备褐色脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞或心肌细胞的情况下，可以优选使用从具有与受体的组织相容性抗原的类型相同或相似的供体采集的体细胞。也可以将从受体自身采集的体细胞供于褐色脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞或心肌细胞的制备。
2.ALK5抑制剂
ALK5是被称为TGFβR1(转化生长因子β受体1)的TGFβ受体亚家族成员。ALK5是在与TGFβ结合时与II型TGFβ受体形成异二聚体复合物的丝氨酸/苏氨酸激酶，将TGFβ信号从细胞表面传递至细胞质。
“在ALK5抑制剂的存在下”是指在能够抑制ALK5的培养条件下，其方式没有特别限制，可以利用能够抑制ALK5的任意方式。在本发明中，可以使用直接作用于ALK5并抑制其功能的物质(例如，抗ALK5抗体、其它药剂)、抑制ALK5自身产生的药剂等。另外，还可以通过在其上游抑制与ALK5相关的信号传导来抑制ALK5。
作为ALK5抑制剂，可以使用以下的化合物，但在本发明中没有特别限制。可以优选使用SB431542。
CultureSure(注册商标)A83-01(和光纯药工业株式会社制造)(CAS No.:909910-43-6)
[化学式1]
ALK5抑制剂(和光纯药工业株式会社制造)或Repsox(Abcam公司制造)(CAS No.:446859-33-2)
[化学式2]
D4476(和光纯药工业株式会社制造)(CAS No.:301836-43-1)
[化学式3]
LY364947(和光纯药工业株式会社制造)(CAS No.:396129-53-6)
[化学式4]
SB431542(和光纯药工业株式会社制造)(CAS No.:301836-41-9)
[化学式5]
SB525334(和光纯药工业株式会社制造)(CAS No.:356559-20-1)
[化学式6]
SD208(和光纯药工业株式会社制造)(CAS No.:627536-09-8)
[化学式7]
ALK5抑制剂的浓度可以适当确定，没有特别限制，例如，可以在0.2μmol/L～20μmol/L、优选在0.5μmol/L～10μmol/L的范围使用。
3.ALK6抑制剂
ALK6也被称为BMPR1B，是骨形态发生蛋白(BMP)受体成员的跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶成员，与作为激活素受体的ACVR1和ACVR2非常类似。ALK6主要参与软骨中的骨生成和胚胎发生。
“在ALK6抑制剂的存在下”是指在能够抑制ALK6的培养条件下，其方式没有特别限制，可以利用能够抑制ALK6的任意方式。在本发明中，可以使用直接作用于ALK6并抑制其功能的物质(例如，抗ALK6抗体、其它药剂)、抑制ALK6自身产生的药剂等。另外，还可以通过在其上游抑制与ALK6相关的信号传导来抑制ALK6。
作为ALK6抑制剂，可以使用以下的化合物，但在本发明中没有特别限制。可以优选使用dorsomorphin。
Dorsomorphin(Dorsomorphin:和光纯药工业株式会社制造)(CAS No.:866405-64-3)
[化学式8]
K02288(CAS No.:1431985-92-0)
[化学式9]
ALK6抑制剂的浓度可以适当确定，没有特别限制，例如，可以在0.1μmol/L～10μmol/L、优选在0.2μmol/L～5μmol/L的范围使用。
4.AMPK抑制剂
AMPK(AMP激活的蛋白激酶)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，起到细胞内能量传感器的作用。能量在ATP被分解成AMP和磷酸的过程中产生，AMPK是由该AMP激活的蛋白激酶。另外，已知AMPK影响与细胞增殖控制相关的若干蛋白质的活性。
“在AMPK抑制剂的存在下”是指在能够抑制AMPK的培养条件下，其方式没有特别限制，可以利用能够抑制AMPK的任意方式。在本发明中，可以使用直接作用于AMPK并抑制其功能的物质(例如，抗AMPK抗体、其它药剂)、抑制AMPK自身产生的药剂等。另外，还可以通过在其上游抑制与AMPK相关的信号传导来抑制AMPK。
作为AMPK抑制剂，可以使用以下的化合物，但在本发明中没有特别限制。可以优选使用dorsomorphin。
Dorsomorphin(Dorsomorphin:和光纯药工业株式会社制造)(AMPK抑制剂，也称为化合物C)(CAS No.:866405-64-3)
靛玉红-3’-肟(和光纯药工业株式会社制造)(CAS No.:160807-49-8)
[化学式10]
Dorsomorphin二盐酸盐(Dorsomorphin dihydrochloride)(CAS No.:1219168-18-9)
盐酸阿霉素(Doxorubicin hydrochloride)(CAS No.:25316-40-9)
STO-609(CAS No.:52029-86-4)
AMPK抑制剂的浓度可以适当确定，没有特别限制，例如，可以在0.1μmol/L～10μmol/L、优选在0.2μmol/L～5μmol/L的范围使用。
5.cAMP激活剂
cAMP(环磷酸腺苷)是以第二信使的形式参与各种胞内信号传导的物质。在细胞中，cAMP通过利用腺苷酸环化酶(adenylate cyclase)将腺苷三磷酸(ATP)环化而生成。
“在cAMP激活剂的存在下”是指在能够激活cAMP的培养条件下，其方式没有特别限制，例如，可以利用能够使细胞内cAMP浓度增加的任意方式。作为使细胞内cAMP浓度增加的方式，例如，除了可以使用能够直接作用于作为与cAMP生成相关的酶的腺苷酸环化酶而将其激活的物质、能够促进腺苷酸环化酶表达的物质以外，还可以使用抑制作为将cAMP分解的酶的磷酸二酯酶的物质等。也可以使用二丁酰cAMP(dibutyryl cAMP)，其是cAMP的结构类似物、且在细胞中具有与cAMP相同的作用。
作为可用于本发明的cAMP激活剂(腺苷酸环化酶激活剂)，可以列举毛喉素(CASNo.:66575-29-9)和毛喉素衍生物(例如，日本特开2002-348243号公报)等。可以优选使用毛喉素。
毛喉素(CAS No.:66428-89-5)
[化学式11]
异丙肾上腺素(CAS No.:7683-59-2)
NKH477(CAS No.:138605-00-2)
PACAP1-27(CAS No.:127317-03-7)
PACAP1-38(CAS No.:137061-48-4)
cAMP激活剂的浓度可以适当确定，没有特别限制，例如，可以在0.5μmol/L～50μmol/L、优选在1μmol/L～30μmol/L的范围使用。
6.ALK2抑制剂和ALK3抑制剂
ALK2是ALK家族成员的受体丝氨酸/苏氨酸激酶，位于与SMAD蛋白、特别是SMAD1/5/8相关的信号传导途径的上游。通过激活ALK2-Smad1途径，由内皮糖蛋白(endoglin)降低***癌细胞的运动性。ALK2基因是与进行性骨化性纤维增殖症(FOP)相关的主要基因，所述进行性骨化性纤维增殖症是以肌肉组织中的进行性异位骨发生为特征的罕见常染色体显性先天性疾病。
ALK3是跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员。ALK3基因在PTEN(染色体10上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物)(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome10)突变阴性考登病(Cowden’s disease)中作为次要易感性基因发挥作用。ALK3转运在FOP的病变形成中起到重要作用，而且也参与人T细胞分化。
“在ALK2抑制剂和ALK3抑制剂的存在下”是指在能够抑制ALK2和ALK3的培养条件下，其方式没有特别限制，可以利用能够抑制ALK2和ALK3的任意方式。在本发明中，可以使用直接作用于ALK2或ALK3并抑制其功能的物质(例如，抗ALK2抗体、抗ALK3抗体、其它药剂)、抑制ALK2自身或ALK3自身产生的药剂等。另外，还可以通过在其上游抑制与ALK2和ALK3相关的信号传导来抑制ALK2和ALK3。
作为ALK2抑制剂和ALK3抑制剂，可以使用以下的化合物，但在本发明中没有特别限制。可以优选使用抑制ALK2和ALK3两者的LDN193189。
DMH1(ALK2抑制剂)(CAS No.:1206711-16-1)
[化学式12]
K02288(ALK2抑制剂和ALK3抑制剂)(CAS No.:1431985-92-0)
[化学式13]
LDN212854(ALK2抑制剂和ALK3抑制剂)(CAS No.:1432597-26-6)
[化学式14]
LDN193189(ALK2抑制剂和ALK3抑制剂)(CAS No.:1062368-24-4)
[化学式15]
LDN193189HCl(ALK2抑制剂和ALK3抑制剂)(CAS No.:1062368-62-0)[化学式16]
ML347(ALK2抑制剂和ALK3抑制剂)(CAS No.:1062368-49-3)
[化学式17]
LDN214117(CAS No.:1627503-67-6)
ALK2抑制剂和ALK3抑制剂的浓度可以适当确定，没有特别限制，例如，可以在0.1μmol/L～10μmol/L、优选在0.2μmol/L～5μmol/L的范围使用。
7.GSK3抑制剂
发现了糖原合成酶激酶(glycogen synthase kinase:GSK)3是将糖原合成酶磷酸化并使其失活的蛋白激酶。在哺乳动物中，GSK3分为2种同种型，即51kDa的α(GSK3α)和47kDa的β(GSK3β)。GSK3具有将各种蛋白质磷酸化的活性，不仅与糖原代谢相关，而且还与细胞***、细胞增殖等生理现象相关。
“在GSK3抑制剂的存在下”是指在能够抑制GSK3的培养条件下，其方式没有特别限制，可以利用抑制GSK3活性的物质，例如，可以利用抗GSK3抗体、GSK抑制剂这样的抑制GSK3信号的方式。另外，由于GSK3在自身的特定位点被磷酸化时会失活，因此促进磷酸化的方式也可以用于抑制GSK3信号。
作为可用于本发明的GSK3抑制剂，可以使用以下的化合物。可以优选使用CHIR99021。
CHIR99021(CAS No.:252917-06-9)
[化学式18]
BIO((2’Z,3’E)-6-溴靛玉红-3’-肟)(CAS No.:667463-62-9)
[化学式19]
肯帕罗酮(Kenpaullone)(CAS No.:142273-20-9)
[化学式20]
A1070722(CAS No.:1384424-80-9)
[化学式21]
SB216763(CAS No.:280744-09-4)
CHIR98014(CAS No.:556813-39-9)
TWS119(CAS No.:601514-19-6)
Tideglusib(CAS No.:865854-05-3)
SB415286(CAS No.:264218-23-7)
Bikinin(CAS No.:188011-69-0)
IM-12(CAS No.:1129669-05-1)
1-氮杂肯帕罗酮(1-Azakenpaullone)(CAS No.:676596-65-9)LY2090314(CASNo.:603288-22-8)
AZD1080(CAS No.:612487-72-6)
AZD2858(CAS No.:486424-20-8)
AR-A014418(CAS No.:487021-52-3)
TDZD-8(CAS No.:327036-89-5)
靛玉红(CAS No.:479-41-4)
GSK3抑制剂的浓度可以适当确定，没有特别限制，例如，可以在0.1μmol/L～10μmol/L、优选在0.2μmol/L～5μmol/L的范围使用。
8.Erk抑制剂
已知，Erk是由EGF(表皮生长因子)、血清刺激或氧化应激等激活的MAPK亚家族，而且Erk可以根据其相关信号传导途径的差异而分类为ERK1/2、ERK5、ERK7、ERK8。通过配体与表皮生长因子受体(EGFR)等酪氨酸激酶受体结合，发生信号传导，因此，存在于Erk激活环(activation loop)中的TEY基序被磷酸化并被激活。
“在Erk抑制剂的存在下”是指在能够抑制Erk的培养条件下，其方式没有特别限制，可以利用抑制Erk活性的物质，例如，可以利用抗Erk抗体、Erk抑制剂这样的Erk信号抑制方式。另外，抑制例如Erk激酶、Erk激酶激酶等与Erk的激活相关的酶也可以用于抑制Erk。
作为Erk抑制剂，可以使用以下的化合物，但在本发明中没有特别限制。可以优选使用PD0325901。
PD0325901(CAS No.:391210-10-9)
[化学式22]
奥罗莫星(Olomoucine)(CAS No.:101622-51-9)
[化学式23]
Aminopurvalanol A(CAS No.:220792-57-4)
[化学式24]
AS703026(CAS No.:1236699-92-5)
AZD8330(CAS No.:869357-68-6)
BIX02188(CAS No.:334949-59-6)
BIXO2189(CAS No.:1265916-41-3)
CI-1040(CAS No.:212631-79-3)
Cobimetirlib(CAS No.:934660-93-2)
GDC-0623(CAS No.:1168091-68-6)
MEk162(CAS No.:606143-89-9)
PD318088(CAS No.:391210-00-7)
PD98059(CAS No.:167869-21-8)
Refametinib(CAS No.:923032-37-5)
RO4987655(CAS No.:874101-00-5)
SCH772984(CAS No.:942183-80-4)
司美替尼(Selumetinib)(CAS No.:606143-52-6)
SL327(CAS No.:305350-87-2)
曲美替尼(Trametinib)(CAS No.:871700-17-3)
ARRY-142886(CAS No.:606143-52-6)
XL518(CAS No.:934660-93-2)
RDEA119(CAS No.:923032-38-6)
Erk抑制剂的浓度可以适当确定，没有特别限制，例如，可以在0.1μmol/L～10μmol/L、优选在0.2μmol/L～5μmol/L的范围使用。
9.优选的培养条件
尽管培养条件在本发明中没有特别限制，但优选在工序a～f中在p53抑制剂不存在的情况下培养体细胞。“在p53抑制剂不存在的情况下”是指实质上不存在p53抑制剂，不仅包括p53抑制剂完全不存在的情况，还包括p53抑制剂以痕量存在的情况。p53蛋白是被称为肿瘤抑制基因的p53基因的产物，与细胞周期调控、细胞凋亡调节相关。p53的功能通过与DNA的特异性结合和基因表达控制来发挥作用。作为p53抑制剂，可以示例出例如：pifithrin-α(CAS No.:63208-82-2)、pifithrin-β(CAS No.:511296-88-1)、pifithrin-μ(CAS No.:64984-31-2)、NSC66811(CAS No.:6964-62-1)、Nultin-3(CAS No.:548472-68-0)等，但在本发明中，可以在上述的p53抑制剂不存在的情况下培养体细胞。
优选在工序a～f中在与组蛋白相关的组分不存在的情况下培养体细胞，但在本发明中没有特别限制。在与组蛋白相关的组分不存在的情况下是指实质上不存在与组蛋白相关的组分，不仅包括与组蛋白相关的组分完全不存在的情况，还包括与组蛋白相关的组分以痕量存在的情况。作为与组蛋白相关的组分，可以举出例如组蛋白去乙酰化酶抑制剂等。在不使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂的情况下，可能诱导引起意外分化的多能细胞的风险进一步降低，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂被认为可促进利用核重编程因子进行的重编程。
10.体细胞的培养
本发明中的体细胞的培养只要在选择与待使用的体细胞种类相应的培养基、温度、其它条件、并在上述各种抑制剂(及根据需要添加的激活剂)的存在下实施即可。培养基可以从公知的培养基或市售的培养基中选择。例如，可以在通常的培养基MEM(最低基础培养基)、DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基)、DMEM/F12或这些培养基的改良培养基中添加适当成分(血清、蛋白质、氨基酸、糖类、维生素类、脂肪酸类、抗生素等)来使用。
作为培养条件，可以选择通常的细胞培养条件。可以示例出37℃、5％CO2的条件等。在培养中，优选以适当的间隔更换培养基(优选每1～7天一次，更优选每3～4天一次)。在以成纤维细胞作为材料实施本发明的方法时，褐色脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞或心肌细胞在37℃、5％CO2的条件下于5～8天至3周中出现。通过选择易于培养的体细胞作为待使用的体细胞，可以将预先增加了数量的体细胞转变为褐色脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞或心肌细胞。因此，也可以容易地进行扩大了规模的褐色脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞或心肌细胞的制备。
在体细胞的培养中，可以使用平板、培养皿、细胞培养瓶和细胞培养袋等细胞培养容器。需要说明的是，作为细胞培养袋，优选具有透气性的袋。在需要大量细胞的情况下，可以使用大型培养罐。培养可以在开放***或封闭***中实施，在以将得到的褐色脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞或心肌细胞对人施用等作为目的时，优选在封闭***中进行培养。
在本发明的方法中，通过在含有上述各种抑制剂的培养基中对体细胞进行培养，可以通过一步培养由体细胞制备褐色脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞或心肌细胞。
A.与褐色脂肪细胞相关的发明
[1]制备褐色脂肪细胞的方法
本发明涉及制备褐色脂肪细胞的方法，该方法包括：在ALK5抑制剂的存在下、并且在选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂的存在下培养体细胞的工序a。
优选工序a是在ALK6抑制剂和AMPK抑制剂的存在下培养体细胞的工序。
优选工序a是在选自cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、GSK3抑制剂和Erk抑制剂中的至少一种激活剂和/或抑制剂的存在下培养体细胞的工序。
特别优选工序a是在以下任一项的存在下培养体细胞的工序。
(1)ALK5抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、GSK3抑制剂、和Erk抑制剂；
(2)ALK5抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、和ALK3抑制剂；
(3)ALK5抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、GSK3抑制剂、和Erk抑制剂；
(4)ALK5抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、和Erk抑制剂；
(5)ALK5抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、和GSK3抑制剂；
(6)ALK5抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂、和ALK3抑制剂。
本发明进一步涉及制备褐色脂肪细胞的方法，该方法包括在选自以下五组中至少一组的存在下培养体细胞的工序b：(1)Erk抑制剂；(2)ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；(3)ALK5抑制剂；(4)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；以及(5)cAMP激活剂。
优选工序b是在选自以下五组中至少两组的存在下培养体细胞的工序：(1)Erk抑制剂；(2)ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；(3)ALK5抑制剂；(4)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；以及(5)cAMP激活剂。
优选工序b是在以下任一项的存在下培养体细胞的工序。
(i)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂及ALK3抑制剂、和cAMP激活剂；
(ii)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂及ALK3抑制剂、和Erk抑制剂；
(iii)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂及ALK3抑制剂、和ALK5抑制剂；
(iv)cAMP激活剂、和ALK2抑制剂及ALK3抑制剂；
(v)cAMP激活剂、和Erk抑制剂
(vi)cAMP激活剂、和ALK5抑制剂；
(vii)ALK2抑制剂及ALK3抑制剂、和ALK5抑制剂；以及
(viii)Erk抑制剂、和ALK5抑制剂。
优选工序b是在选自以下五组中至少三组(更优选为至少四组)的存在下培养体细胞的工序：(1)Erk抑制剂；(2)ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；(3)ALK5抑制剂；(4)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；以及(5)cAMP激活剂。
本发明进一步涉及制备褐色脂肪细胞的方法，该方法包括在选自以下六组中至少五组的存在下培养体细胞的工序b：(1)Erk抑制剂；(2)ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；(3)ALK5抑制剂；(4)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；(5)cAMP激活剂；以及(6)GSK3抑制剂。
<具有2种以上抑制作用的抑制剂>
作为上述的各种抑制剂，可以使用具有2种以上抑制作用的抑制剂。
例如，作为ALK2抑制剂和ALK3抑制剂，可以使用抑制ALK2和ALK3两者的LDN193189，或者也可以使用抑制ALK2、ALK3、ALK6和AMPK的dorsomorphin。即，可以通过在LDN193189和/或dorsomorphin的存在下培养体细胞来实现在选自ALK2抑制剂和ALK3抑制剂中的至少一种抑制剂的存在下培养体细胞。
另外，作为ALK6抑制剂和AMPK抑制剂，可以使用抑制ALK6和AMPK两者的dorsomorphin。即，可以通过在dorsomorphin的存在下培养体细胞来实现在选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂的存在下培养体细胞。
此外，作为ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂，可以使用抑制ALK6、AMPK、ALK2和ALK3的dorsomorphin。即，可以通过在dorsomorphin的存在下培养体细胞来实现在ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂的存在下培养体细胞。
<体细胞的培养>
在本发明中，由体细胞制备褐色脂肪细胞。作为对分化诱导成脂肪细胞有效的物质，已知有***、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、罗格列酮、糖皮质激素、磷酸二酯酶抑制剂、三碘甲腺原氨酸(也称为T3)等。作为对分化诱导成褐色脂肪细胞有效的物质，例如，可以使用市售的作为分化诱导剂的物质。在本发明中，优选在上述物质的存在下培养体细胞。
优选可以使用选自***、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和罗格列酮中的1种以上，优选使用2种以上，更优选使用3种以上，进一步优选使用4种。
在使用***时，***的浓度没有特别限制，优选在0.2μmol/L～20μmol/L、优选在0.5μmol/L～10μmol/L的范围使用。
在使用胰岛素时，胰岛素的浓度没有特别限制，优选在1μg/mL～100μg/mL、优选在2μg/mL～50μg/mL的范围使用。
在使用3-异丁基-1-甲基黄嘌呤时，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的浓度没有特别限制，优选在0.05μmol/L～50μmol/L、优选在0.1μmol/L～10μmol/L的范围使用。
在使用罗格列酮时，罗格列酮的浓度没有特别限制，优选在0.1μmol/L～10μmol/L、优选在0.2μmol/L～5μmol/L的范围使用。
<褐色脂肪细胞>
可通过上述的本发明的褐色脂肪细胞的制备方法获得含有褐色脂肪细胞的细胞群。通过本发明的制备褐色脂肪细胞的方法制备的褐色脂肪细胞也包含于本发明的范围内。通过本发明的方法制备的褐色脂肪细胞可以是终末分化后的细胞或注定分化成褐色脂肪细胞的前体细胞。此外，通过本发明的方法制备的褐色脂肪细胞也可以是被称为褐色脂肪样细胞的米色细胞(beige cell)或明亮细胞(bright cell)。
可以利用例如细胞的形态变化、褐色脂肪细胞的特征性质、特异性标志物来对通过本发明的方法制备的褐色脂肪细胞进行检测、确认和分离。
脂肪细胞在细胞内积累脂肪。因此，可以通过使用了油红O的细胞内脂肪染色来检测脂肪细胞。
作为褐色脂肪细胞的特异性标志物，可以列举：UCP1、EVOL3(延伸因子极长链脂肪酸样蛋白3,Elongation of very long chain fatty acid protein 3)、PGC1A(PPARγ共激活因子1-α,PPAR gamma coactivator 1-alpha)、PRDM16(PRD1-BF1-RIZ1结构域同源蛋白16,PRD1-BF1-RIZ1homologous domain containing 16)、CIDEA(细胞死亡诱导DFFA样效应蛋白A,Cell Death-Inducing DFFA-Like Effector A)；等，但并不限定于此。UCP1是一种解偶联蛋白(uncoupling protein)。
在特异性标志物的检测中，可以利用检疫方法(利用抗体进行的检测)，在与蛋白质分子相关时，也可以通过其mRNA量的定量来检测。识别褐色脂肪细胞的特异性标志物的抗体对于分离和纯化通过本发明的方法得到的褐色脂肪细胞是有用的。
通过本发明的方法制备的褐色脂肪细胞可以用于例如外科治疗后的组织修复等。使用通过本发明的方法制备的褐色脂肪细胞，可以制造用于组织修复等的药物组合物。另外，预期对生物体移植、施用褐色脂肪细胞对于生物体的代谢改善、防止肥胖等具有效果。
在将褐色脂肪细胞制成药物组合物的情况下，可以按照通常方法将褐色脂肪细胞与药学上可接受的载体进行混合等而制成适合于对个体施用的形式的制剂。作为载体，可以举出例如添加生理盐水、葡萄糖、其它佐剂(例如，D-山梨糖醇、D-甘露醇、氯化钠等)而变得等张的注射用蒸馏水。此外，可以配合缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液)、镇痛剂(例如，苯扎氯铵、盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(例如，人血清白蛋白、聚乙二醇等)、防腐剂、抗氧化剂等。
此外，褐色脂肪细胞可以与对于褐色脂肪细胞的功能发挥、生物粘附性改善有效的其它细胞、成分组合而制成组合物。
另外，通过本发明的方法制备的褐色脂肪细胞也可以用于与褐色脂肪细胞发生作用的药物候选化合物的筛选、药物候选化合物的安全性评价。根据本发明可以在一次操作中获得大量的褐色脂肪细胞，因此能够获得具有重现性的研究结果，而不受细胞批次差异的影响。
[2]组合物
本发明进一步涉及组合物，其包含ALK5抑制剂、和选自ALK6抑制剂及AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂。
优选本发明的组合物包含ALK6抑制剂和AMPK抑制剂。
优选本发明的组合物进一步包含选自AMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、GSK3抑制剂和Erk抑制剂中的至少一种激活剂和/或抑制剂。
作为本发明的组合物的具体例子，可以列举包含以下的任意组合的组合物。
(1)ALK5抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、GSK3抑制剂、和Erk抑制剂；
(2)ALK5抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、和ALK3抑制剂；
(3)ALK5抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、GSK3抑制剂、和Erk抑制剂；
(4)ALK5抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、和Erk抑制剂；
(5)ALK5抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、和GSK3抑制剂；
(6)ALK5抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂、和ALK3抑制剂。
上述激活剂和抑制剂的具体实例和优选实例如本说明书中的记载所述。
本发明进一步涉及用于从体细胞制备褐色脂肪细胞的组合物，其包含选自以下组中的至少一组(优选至少两组、至少三组、或至少四组)：(1)Erk抑制剂；(2)ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；(3)ALK5抑制剂；(4)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；以及(5)cAMP激活剂。
作为本发明的上述组合物的具体例子，可以列举包含以下任一项的组合物。
(i)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂及ALK3抑制剂、和cAMP激活剂；
(ii)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂及ALK3抑制剂、和Erk抑制剂；
(iii)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂及ALK3抑制剂、和ALK5抑制剂；
(iv)cAMP激活剂、和ALK2抑制剂及ALK3抑制剂；
(v)cAMP激活剂、和Erk抑制剂
(vi)cAMP激活剂、和ALK5抑制剂；
(vii)ALK2抑制剂及ALK3抑制剂、和ALK5抑制剂；以及
(viii)Erk抑制剂、和ALK5抑制剂。
本发明进一步涉及用于制备褐色脂肪细胞的组合物，其包含选自以下组中的至少五组：(1)Erk抑制剂；(2)ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；(3)ALK5抑制剂；(4)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；(5)cAMP激活剂；以及(6)GSK3抑制剂。
本发明的组合物可以用作用于从体细胞制备褐色脂肪细胞的组合物。另外，本发明的组合物也可以用作用于从体细胞制备褐色脂肪细胞的培养基。
作为从体细胞制备褐色脂肪细胞所使用的培养基，可以示例出在基础培养基中含有ALK5抑制剂、和选自ALK6抑制剂及AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂作为活性成分的培养基，所述基础培养基是将对于细胞培养所必需的成分混合而制造的。只要以对制备褐色脂肪细胞有效的浓度含有上述的有效成分即可，有效成分的浓度可由本领域技术人员适当确定。基础培养基可以从公知的培养基或市售的培养基中选择。例如，可以使用通常的培养基MEM(最低基础培养基)、DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基)和DMEM/F12、或这些培养基的改良培养基作为基础培养基。
另外，可以在培养基中添加本说明书中上述记载的公知的培养基成分，例如：血清、蛋白质(白蛋白、转铁蛋白、生长因子等)、氨基酸、糖类、维生素类、脂肪酸类、抗生素等。
另外，可以在培养基中添加本说明书中上述记载的***、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、罗格列酮、糖皮质激素和磷酸二酯酶抑制剂等对诱导分化成脂肪细胞有效的物质。
此外，在本发明中，也可以通过对生物体施用ALK5抑制剂、和选自ALK6抑制剂及AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂，从而在生物体内从体细胞制备褐色脂肪细胞。即，根据本发明，可以提供一种在生物体内从体细胞制备褐色脂肪细胞的方法，该方法包括对生物体施用ALK5抑制剂、和选自ALK6抑制剂及AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂。待施用于生物体的抑制剂的优选组合如本说明书中所述。另外，作为生物体，可以示例出人、除人以外的哺乳动物和除哺乳动物以外的动物(鸟类、爬行动物类、两栖动物类、鱼类等)，特别优选为人。通过对生物体内的特定部位施用ALK5抑制剂、和选自ALK6抑制剂及AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂，可以在上述特定部位处从体细胞制备褐色脂肪细胞。
B.与成骨细胞相关的发明
[1]制备成骨细胞的方法
本发明涉及制备成骨细胞的方法，该方法包括：在选自ALK5抑制剂、GSK3抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂中的至少一种抑制剂存在、cAMP激活剂存在、且Erk抑制剂不存在的情况下培养体细胞的工序c。
优选工序c是在ALK2抑制剂和ALK3抑制剂的存在下培养体细胞的工序。
优选工序c是在选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂的存在下培养体细胞的工序。
特别优选工序c是在以下任一项的存在下培养体细胞的工序。
(1)在ALK5抑制剂、GSK3抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂和cAMP激活剂存在、且Erk抑制剂不存在的情况下；
(2)在ALK5抑制剂、GSK3抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂和cAMP激活剂存在、且Erk抑制剂不存在的情况下。
<Erk抑制剂>
在本发明中，在Erk抑制剂不存在的情况下培养体细胞。在Erk抑制剂不存在的情况下是指实质上不存在Erk抑制剂，不仅包括Erk抑制剂完全不存在的情况，还包括Erk抑制剂以痕量存在的情况。即，在抑制Erk活性的物质不存在、例如在抗Erk抗体、Erk抑制剂这样的Erk信号抑制方式不存在的情况下培养体细胞。另外，例如在抑制Erk激酶、Erk激酶激酶等与Erk活化相关的酶的方式不存在的情况下培养体细胞。
<具有2种以上抑制作用的抑制剂>
作为上述各种抑制剂，可以使用具有2种以上抑制作用的抑制剂。
例如，作为ALK2抑制剂和ALK3抑制剂，可以使用抑制ALK2和ALK3两者的LDN193189，或者也可以使用抑制ALK2、ALK3、ALK6和AMPK的dorsomorphin。即，可以通过在LDN193189和/或dorsomorphin的存在下培养体细胞来实现在ALK2抑制剂和ALK3抑制剂的存在下培养体细胞。
另外，作为ALK6抑制剂和AMPK抑制剂，可以使用抑制ALK6和AMPK两者的dorsomorphin。即，可以通过在dorsomorphin的存在下培养体细胞来实现在选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂的存在下培养体细胞。
<其它优选条件>
虽然在本发明中没有特别限制，但优选在工序c中在生长因子和/或细胞因子不存在的情况下培养体细胞。在生长因子和/或细胞因子不存在的情况下是指生长因子和/或细胞因子实质上不存在的情况，不仅包括生长因子和/或细胞因子完全不存在的情况，还包括生长因子和/或细胞因子以痕量存在的情况。作为在生长因子和/或细胞因子不存在的情况下培养体细胞的优点，可以举出能够廉价地制备成骨细胞。
生长因子是在生物体内促进特定细胞的增殖、分化的内源蛋白质的总称。细胞因子是由免疫细胞分泌的蛋白质，起到未限定靶细胞的信息传递的作用。作为细胞因子，参与免疫、炎症的细胞因子很多，也有参与细胞增殖、分化、细胞死亡或伤口愈合的细胞因子。需要说明的是，生长因子包括在细胞因子中，并不是相互排斥的概念。
作为生长因子，可以列举：表皮生长因子(Epidermal Growth Factor:EGF)、***(Insulin-like Growth Factor:IGF)、转化生长因子(Transforming GrowthFactor:TGF)、神经生长因子(Nerve Growth Factor:NGF)、血管内皮生长因子(VesicularEndothelial Growth Factor:VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic FibroblastGrowth Factor:bFGF)、肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor:HGF)等。
作为细胞因子，可以列举：白介素(Interleukin:IL)、干扰素(Interferon:IFN)、瘦蛋白(leptin)等。
<体细胞的培养>
在本发明中，从体细胞制备成骨细胞。作为对分化诱导为成骨细胞有效的物质，已知有***、氢化可的松、抗坏血酸、β-甘油磷酸等。作为对分化诱导为成骨细胞有效的物质，例如，可以使用市售的作为分化诱导剂的物质。在本发明中，优选在上述物质的存在下培养体细胞。
<成骨细胞>
可以通过上述的本发明的成骨细胞的制备方法获得含有成骨细胞的细胞群。通过本发明的制备成骨细胞的方法制备的成骨细胞也在本发明的范围内。对于通过本发明的方法制备的成骨细胞而言，除了终末分化后的细胞以外，还可以是注定分化为成骨细胞的前体细胞。
可以利用例如细胞的形态变化、成骨细胞的特征性质、特异性标志物来对通过本发明的方法制备的成骨细胞进行检测、确认和分离。
作为成骨细胞的特异性标志物，已知有骨特异性碱性磷酸酶和骨钙素，可以用其作为指标来检测成骨细胞。另外，由于成骨细胞具有在细胞外部沉积钙的性质，因此还可以通过利用von Kossa染色或茜素红染色对细胞外的钙进行染色来检测成骨细胞。
在特异性标志物的检测中，可以利用检疫方法(利用抗体进行的检测)，在与蛋白质分子相关时，也可以通过其mRNA量的定量来检测。识别成骨细胞的特异性标志物的抗体对于分离和纯化通过本发明的方法获得的成骨细胞是有用的。
通过本发明的方法制备的成骨细胞可以用于例如在生物体中补充数量减少或功能降低的细胞的再生医学。在治疗中可以单独使用按照本发明的方法制备的成骨细胞、或者使用与其它细胞、基质(生物高分子化合物等)组合而形成的组织。使用按照本发明的方法制备的成骨细胞可以制造用于组织修复等的药物组合物。
在将成骨细胞制成药物组合物的情况下，可以按照通常方法将成骨细胞与药学上可接受的载体进行混合等而制成适合于对个体施用的形式的制剂。作为载体，可以举出例如添加生理盐水、葡萄糖、其它佐剂(例如，D-山梨糖醇、D-甘露醇、氯化钠等)而变得等张的注射用蒸馏水。此外，可以配合缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液)、镇痛剂(例如，苯扎氯铵、盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(例如，人血清白蛋白、聚乙二醇等)、防腐剂、抗氧化剂等。
此外，成骨细胞可以与对于成骨细胞的功能发挥、生物粘附性改善有效的其它细胞、成分组合而制成组合物。
此外，按照本发明的方法制备的成骨细胞可以用于与成骨细胞发生作用的药物候选化合物的筛选、药物候选化合物的安全性评价。由于本发明可以在一次操作中得到大量的成骨细胞，因此能够获得具有重现性的研究结果，而不受细胞批次差异的影响。
[2]组合物
本发明进一步涉及一种组合物，其包含选自ALK5抑制剂、GSK3抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂中的至少一种抑制剂、以及cAMP激活剂。
优选本发明的组合物至少包含ALK2抑制剂和ALK3抑制剂。
优选本发明的组合物还含有选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂。
作为本发明的组合物的具体例子，可以列举包含以下任意组合的组合物。
(1)ALK5抑制剂、GSK3抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、和cAMP激活剂；
(2)ALK5抑制剂、GSK3抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、和cAMP激活剂。
上述激活剂和抑制剂的具体实例和优选实例如本说明书中的记载所述。
本发明的组合物可以用作用于从体细胞制备成骨细胞的组合物。另外，本发明的组合物也可以用作用于从体细胞制备成骨细胞的培养基。
作为从体细胞制备成骨细胞所使用的培养基，可以示例出在基础培养基中含有选自ALK5抑制剂、GSK3抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂中的至少一种抑制剂、以及cAMP激活剂作为有效成分的培养基，所述基础培养基是将对于细胞培养所必需的成分混合而制造的。只要以对制备成骨细胞有效的浓度包含上述的有效成分即可，有效成分的浓度可由本领域技术人员适当确定。基础培养基可以从公知的培养基或市售的培养基中选择。例如，可以使用通常的培养基MEM(最低基础培养基)、DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基)、DMEM/F12、或这些培养基的改良培养基作为基础培养基。
另外，可以在培养基中添加本说明书中上述记载的公知的培养基成分，例如：血清、蛋白质(白蛋白、转铁蛋白、生长因子等)、氨基酸、糖类、维生素类、脂肪酸类、抗生素等。
此外，可以在培养基中添加本说明书中上述记载的***、氢化可的松、抗坏血酸、β-甘油磷酸等对诱导分化为成骨细胞有效的物质。
作为本发明的方法和组合物，可以是除了使用在具有L-谷氨酸、酚红和丙酮酸钠的D-MEM(高葡萄糖)(和光纯药工业株式会社制造)中添加市售的成骨细胞分化诱导剂(成骨细胞诱导剂试剂；Takara Bio公司制造)而成的培养基(每100mL培养基中添加有1mL的抗坏血酸、200μL的氢化可的松、2mL的β-甘油磷酸的培养基)的情况以外的情况，所述D-MEM含有SB-431524(终浓度2μmol/L)、LDN-193189(终浓度1μmol/L)、CHIR99021(终浓度1μmol/L)、pifithrin-α(终浓度5μmol/L)和毛喉素(终浓度7.5μmol/L)。
作为本发明的方法和组合物，可以是除了使用在D-MEM中添加成骨细胞分化诱导剂而成的培养基的情况以外的情况，所述D-MEM含有SB-431524、LDN-193189、CHIR99021、pifithrin-α和毛喉素。
作为本发明的方法和组合物，可以是除了使用在含有SB-431524、LDN-193189、HIR99021、pifithrin-α和毛喉素的培养基中添加成骨细胞分化诱导剂而成的培养基的情况以外的情况。
此外，在本发明中，也可以通过对生物体施用选自ALK5抑制剂、GSK3抑制剂、ALK2的抑制剂和ALK3抑制剂中的至少一种抑制剂、以及cAMP激活剂，从而在生物体内从体细胞制备成骨细胞。即，根据本发明，可以提供一种在生物体内从体细胞制备成骨细胞的方法，该方法包括对生物体施用选自ALK5抑制剂、GSK3抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂中的至少一种抑制剂、以及cAMP激活剂。待施用于生物体的抑制剂的优选组合如本说明书中所述。另外，作为生物体，可以示例出人、除人以外的哺乳动物和除哺乳动物以外的动物(鸟类、爬行动物类、两栖动物类、鱼类等)，特别优选为人。通过对生物体内的特定部位施用选自ALK5抑制剂、GSK3抑制剂、ALK2的抑制剂和ALK3抑制剂中的至少一种抑制剂、以及cAMP激活剂，可以在上述特定部位处从体细胞制备成骨细胞。
C.与软骨细胞相关的发明
[1]制备软骨细胞的方法
本发明涉及制备软骨细胞的方法，该方法包括：在选自cAMP激活剂、ALK5抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂和GSK3抑制剂中的至少一种抑制剂的存在、Erk抑制剂不存在、且选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂不存在的情况下培养体细胞的工序d。
优选工序d是至少在ALK2抑制剂和ALK3抑制剂的存在下培养体细胞的工序。
优选工序d是在cAMP激活剂、ALK5抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂和GSK3抑制剂存在、Erk抑制剂不存在、且ALK6抑制剂和AMPK抑制剂不存在的情况下培养体细胞的工序。
<ALK6抑制剂和AMPK抑制剂>
在本发明中，在选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂不存在的情况下培养体细胞。
在选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂不存在的情况下是指选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂实质上不存在，不仅包括选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂完全不存在的情况，还包括选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂以痕量存在的情况。
在本发明的一个实例中，可以在上述的ALK6抑制剂或AMPK抑制剂不存在的情况下培养体细胞。
<Erk抑制剂>
在本发明中，在Erk抑制剂不存在的情况下培养体细胞。在Erk抑制剂不存在的情况下是指Erk抑制剂实质上不存在，不仅包括Erk抑制剂完全不存在的情况，还包括Erk抑制剂以痕量存在的情况。即，在抑制Erk活性的物质不存在、例如在抗Erk抗体、Erk抑制剂等Erk信号抑制方式不存在的情况下培养体细胞。另外，例如在抑制Erk激酶、Erk激酶激酶等与Erk活化相关的酶的方式不存在的情况下培养体细胞。
<具有2种以上抑制作用的抑制剂>
作为上述各种抑制剂，可以使用具有2种以上抑制作用的抑制剂。
例如，作为ALK2抑制剂和ALK3抑制剂，可以使用抑制ALK2和ALK3两者的LDN193189。
<体细胞的培养>
在本发明中，从体细胞制备软骨细胞。作为对分化诱导成软骨细胞有效的物质，已知有胰岛素、抗坏血酸、抗坏血酸-2-磷酸、氢化可的松、TGF-β(转化生长因子-β)、***等。作为对分化诱导成软骨细胞有效的物质，例如，可以使用市售的作为分化诱导剂的物质。在本发明中，优选在上述物质的存在下培养体细胞。
<软骨细胞>
可以通过上述的本发明的软骨细胞的制备方法得到含有软骨细胞的细胞群。通过本发明的制备软骨细胞的方法制备的软骨细胞也在本发明的范围内。对于通过本发明的方法制备的软骨细胞而言，除了终末分化的细胞以外，还可以是注定分化为软骨细胞的前体细胞。
可以利用例如细胞的形态变化、软骨细胞的特征性质、特异性标志物来对通过本发明的方法制备的软骨细胞进行检测、确认和分离。
由于软骨细胞含有硫酸皮肤素、硫酸软骨素这样的酸性粘多糖，因此，可以通过用酸性粘多糖的染色中所使用的阿辛蓝(Alcian Blue)进行染色，从而检测软骨细胞。另外，可以通过作为软骨组织的染色方法而公知的番红O(Safranin O)染色来检测软骨细胞。此外，在软骨细胞中高度表达的II型胶原和聚集蛋白聚糖也是对于软骨细胞的确认有用的特异性标志物。
在特异性标志物的检测中，可以利用检疫方法(利用抗体进行的检测)，在与蛋白质分子相关时，也可以通过其mRNA量的定量来检测。识别软骨细胞的特异性标志物的抗体对于分离和纯化通过本发明的方法获得的软骨细胞也是有用的。
通过本发明的方法制备的软骨细胞可以用于例如在生物体内补充数量减少或功能降低的细胞的再生医学。在治疗中可以单独使用按照本发明的方法制备的软骨细胞、或者使用与其它细胞、基质(生物高分子化合物等)组合而形成的组织。例如，可以将使软骨细胞与支架物质(胞外基质成分等)组合而形成的组织移植到患者中。使用按照本发明的方法制备的软骨细胞可以制造用于组织修复等的药物组合物。例如，为了治疗外伤、衰老相关的关节损伤、治疗关节疾病或使其症状缓解，可以对患者施用软骨细胞。
在将软骨细胞制成药物组合物的情况下，可以按照通常方法将软骨细胞与药学上可接受的载体进行混合等而制成适合于对个体施用的形式的制剂。作为载体，可以举出例如添加生理盐水、葡萄糖、其它佐剂(例如，D-山梨糖醇、D-甘露醇、氯化钠等)而变得等张的注射用蒸馏水。此外，可以配合缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液)、镇痛剂(例如，苯扎氯铵、盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(例如，人血清白蛋白、聚乙二醇等)、防腐剂、抗氧化剂等。
此外，软骨细胞可以与对于软骨细胞的功能发挥、生物粘附性改善有效的其它细胞、成分组合而制成组合物。
此外，按照本发明的方法制备的软骨细胞可以用于与软骨细胞发生作用的药物候选化合物的筛选、药物候选化合物的安全性评价。由于本发明可以在一次操作中提供大量的软骨细胞，因此能够获得具有重现性的研究结果，而不受细胞批次差异的影响。
[2]组合物
本发明进一步涉及用于从体细胞制备软骨细胞的组合物，其包含选自cAMP激活剂、ALK5抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂和GSK3抑制剂中的至少一种抑制剂。优选本发明的组合物至少包含ALK2抑制剂和ALK3抑制剂。
本发明进一步涉及组合物，其包含cAMP激活剂、ALK5抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂和GSK3抑制剂，优选上述组合物为用于从体细胞制备软骨细胞的组合物。
上述激活剂和抑制剂的具体实例和优选实例如本说明书中的记载所述。
本发明的组合物可以用作用于从体细胞制备软骨细胞的组合物。另外，本发明的组合物还可以用作用于从体细胞制备软骨细胞的培养基。
作为从体细胞制备软骨细胞所使用的培养基，可以示例出在基础培养基中含有选自cAMP激活剂、ALK5抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂和GSK3抑制剂中的至少一种抑制剂作为有效成分而成的培养基，所述基础培养基是将对于细胞培养所必需的成分混合而制造的。只要以对制备软骨细胞有效的浓度包含上述的有效成分即可，有效成分的浓度可由本领域技术人员适当确定。基础培养基可以从公知的培养基或市售的培养基中选择。例如，可以使用通常的培养基MEM(最低基础培养基)、DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基)和DMEM/F12、或这些培养基的改良培养基作为基础培养基。
另外，可以在培养基中添加本说明书中上述记载的公知的培养基成分，例如：血清、蛋白质(白蛋白、转铁蛋白、生长因子等)、氨基酸、糖类、维生素类、脂肪酸类、抗生素等。
此外，可以在培养基中添加本说明书中上述记载的胰岛素、抗坏血酸、抗坏血酸-2-磷酸、氢化可的松、TGF-β(转化生长因子-β)、***等对诱导分化成软骨细胞有效的物质。
作为本发明的方法和组合物，可以是除了使用D-MEM、高葡萄糖、丙酮酸盐(ThermoFisher Scientific公司制造)的情况以外的情况，所述D-MEM含有SB-431524(终浓度2μmol/L)、LDN-193189(终浓度1μmol/L)、CHIR99021(终浓度1μmol/L)、pifthrin-α(终浓度5μmol/L)、毛喉素(终浓度7.5μmol/L)、胰岛素-转铁蛋白-硒(终浓度1％)、抗坏血酸-2-磷酸(终浓度50μg/ml)、***(终浓度100nmol/L)、TGF-β3(终浓度10ng/ml)、L-脯氨酸(终浓度40μg/ml)、抗生素-抗真菌剂(Thermo Fisher Scientific公司制造,终浓度1×)。
作为本发明的方法和组合物，可以是除了使用含有SB-431524、LDN-193189、CHIR99021、pifthrin-α、毛喉素、胰岛素-转铁蛋白-硒、抗坏血酸-2-磷酸、***、TGF-β3、L-脯氨酸、抗生素-抗真菌剂(Thermo Fisher Scientific公司制造)的D-MEM的情况以外的情况。
作为本发明的方法和组合物，可以是除了使用含有SB-431524、LDN-193189、CHIR99021、pifthrin-α、毛喉素、胰岛素-转铁蛋白-硒、抗坏血酸-2-磷酸、***、TGF-β3、L-脯氨酸、抗生素-抗真菌剂(Thermo Fisher Scientific公司制造)的培养基的情况以外的情况。
此外，在本发明中，也可以通过对生物体施用选自cAMP激活剂、ALK5抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂和GSK3抑制剂中的至少一种抑制剂，从而在生物体内从体细胞制备软骨细胞。即，根据本发明，可以提供一种在生物体内从体细胞制备软骨细胞的方法，该方法包括对生物体施用选自cAMP激活剂、ALK5抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂和GSK3抑制剂中的至少一种。待施用于生物体的抑制剂的优选组合如本说明书中所述。另外，作为生物体，可以示例出人、除人以外的哺乳动物和除哺乳动物以外的动物(鸟类、爬行动物类、两栖动物类、鱼类等)，特别优选为人。通过对生物体内的特定部位施用选自cAMP激活剂、ALK5抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂和GSK3抑制剂中的至少一种抑制剂，可以在上述特定部位处从体细胞制备软骨细胞。
D.与神经细胞相关的发明
[1]制备神经细胞的方法
本发明涉及制备神经细胞的方法，该方法包括：在选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂的存在下培养体细胞的工序e。
优选工序e是在ALK6抑制剂和AMPK抑制剂的存在下培养体细胞的工序。
优选工序e是在选自cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂、GSK3抑制剂和Erk抑制剂中的至少一种激活剂和/或抑制剂的存在下培养体细胞的工序。
特别优选工序e是在以下任一项的存在下培养体细胞的工序。
(1)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂、GSK3抑制剂、和Erk抑制剂；
(2)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂、GSK3抑制剂、和Erk抑制剂；
(3)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂、和Erk抑制剂；
(4)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂、和GSK3抑制剂。
<具有2种以上抑制作用的抑制剂>
作为上述的各种抑制剂，可以使用具有2种以上抑制作用的抑制剂。
例如，作为ALK2抑制剂和ALK3抑制剂，可以使用抑制ALK2和ALK3两者的LDN193189，或者也可以使用抑制ALK2、ALK3、ALK6和AMPK的dorsomorphin。即，可以通过在LDN193189和/或dorsomorphin的存在下培养体细胞来实现在选自ALK2抑制剂和ALK3抑制剂中至少一种抑制剂的存在下培养体细胞。
另外，作为ALK6抑制剂和AMPK抑制剂，可以使用抑制ALK6和AMPK两者的dorsomorphin。即，可以通过在dorsomorphin的存在下培养体细胞来实现在选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制的存在下培养体细胞。
<其它优选条件>
虽然在本发明中没有特别限制，但优选在工序e中在生长因子和/或细胞因子不存在的情况下培养体细胞。在生长因子和/或细胞因子不存在的情况下是指生长因子和/或细胞因子实质上不存在的情况，不仅包括生长因子和/或细胞因子完全不存在的情况，还包括生长因子和/或细胞因子以痕量存在的情况。作为在生长因子和/或细胞因子不存在的情况下培养体细胞的优点，可以举出能够廉价地制备神经细胞。
生长因子是在生物体内促进特定细胞的增殖、分化的内源蛋白质的总称。细胞因子是由免疫细胞分泌的蛋白质，起到未限定靶细胞的信息传递的作用。作为细胞因子，参与免疫、炎症的细胞因子很多，也有参与细胞增殖、分化、细胞死亡或伤口愈合的细胞因子。需要说明的是，生长因子包括在细胞因子中，并不是相互排斥的概念。
作为生长因子，可以列举：表皮生长因子(Epidermal Growth Factor:EGF)、***(Insulin-like Growth Factor:IGF)、转化生长因子(Transforming GrowthFactor:TGF)、神经生长因子(Nerve Growth Factor:NGF)、血管内皮生长因子(VesicularEndothelial Growth Factor:VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic FibroblastGrowth Factor:bFGF)、肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor:HGF)等。
作为细胞因子，可以列举：白介素(Interleukin:IL)、干扰素(Interferon:IFN)、瘦蛋白(leptin)等。
<体细胞的培养>
在本发明中，从体细胞制备神经细胞。作为对分化诱导为神经细胞有效的物质，已知有脑源性神经营养因子(BDNF:Brain-Derived Neurotrophic Factor)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF:Glial cell-Derived Neurotrophic Factor)、cAMP、抗坏血酸、抗坏血酸-2-磷酸等。作为对分化诱导为神经细胞有效的物质，例如，可以使用市售的作为分化诱导剂的物质。在本发明中，可以在上述物质的存在下培养体细胞。
<神经细胞>
可以通过上述的本发明的神经细胞的制备方法获得含有神经细胞的细胞群。通过本发明的制备神经细胞的方法制备的神经细胞也在本发明的范围内。作为通过本发明的方法制备的神经细胞，可以示例出神经细胞(神经元)、神经胶质细胞(星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞)、施万细胞等，但并不限定于此。除了上述的终末分化后的细胞以外，还可以是注定分化成神经细胞的前体细胞。
按照本发明的方法制备的神经细胞可以通过例如细胞的形态变化来确认。由于神经细胞根据细胞种类而采取特征性的形态，因此，通过对培养前后的细胞形态进行比较，可以确认神经细胞的存在。另外，可以对例如酶、受体或小分子化合物等神经细胞的特征性分子进行检测来确认神经细胞。作为神经细胞的特征性分子，可以列举β3-微管蛋白、突触蛋白I、囊泡谷氨酸转运蛋白(vesicular glutamate transporter:vGULT)、微管相关蛋白(microtubule-associated protein:MAP)2、γ-氨基丁酸(GABA)、酪氨酸羟化酶等，但并不限定于此。
在特异性标志物的检测中，可以利用检疫方法(利用抗体进行的检测)，在与蛋白质分子相关时，也可以通过其mRNA量的定量来检测。识别神经细胞的特征性分子的抗体对于分离和纯化通过本发明的方法获得的神经细胞也是有用的。
通过本发明的方法制备的神经细胞对于例如神经***疾病的治疗是有用的。作为神经***疾病，可以列举脊髓损伤、脑血管疾病(脑梗塞等)、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、肌萎缩侧索硬化症等，但并不限定于此。使用通过本发明的方法制备的神经细胞，可以制造用于神经***疾病的治疗的药物组合物。
在将神经细胞制成药物组合物的情况下，可以按照通常方法将成骨细胞与药学上可接受的载体进行混合等而制成适合于对个体施用的形式的制剂。作为载体，可以举出例如添加生理盐水、葡萄糖、其它佐剂(例如，D-山梨糖醇、D-甘露醇、氯化钠等)而变得等张的注射用蒸馏水。此外，可以配合缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液)、镇痛剂(例如，苯扎氯铵、盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(例如，人血清白蛋白、聚乙二醇等)、防腐剂、抗氧化剂等。
此外，神经细胞可以与对于神经细胞的功能发挥、生物粘附性改善有效的其它细胞、成分组合而制成组合物。
此外，按照本发明的方法制备的神经细胞也可以用于与神经细胞发生作用的药物候选化合物的筛选、药物候选化合物的安全性评价。由于本发明可以在一次操作中得到大量的神经细胞，因此能够获得具有重现性的研究结果，而不受细胞批次差异的影响。
[2]组合物
本发明进一步涉及用于从体细胞制备神经细胞的组合物，其包含选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂。上述组合物可以包含ALK6抑制剂和AMPK抑制剂。
本发明进一步涉及组合物，其包含选自ALK6抑制剂及AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂、和选自cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂、GSK3抑制剂及Erk抑制剂中的至少一种激活剂和/或抑制剂。
作为本发明的组合物的具体实例，可以列举包含以下任意组合的组合物。
(1)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂、GSK3抑制剂、和Erk抑制剂；
(2)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂、GSK3抑制剂、和Erk抑制剂；
(3)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂、和Erk抑制剂；
(4)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂、和GSK3抑制剂。
上述激活剂和抑制剂的具体实例和优选实例如本说明书中的记载所述。
本发明的组合物可以用作用于从体细胞制备神经细胞的组合物。另外，本发明的组合物也可以用作用于从体细胞制备神经细胞的培养基。
作为从体细胞制备神经细胞所使用的培养基，可以示例出在基础培养基中含有选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂作为有效成分而成的培养基，所述基础培养基是将对于细胞培养所必需的成分混合而制造的。只要以对制备神经细胞有效的浓度包含上述的有效成分即可，有效成分的浓度可由本领域技术人员适当确定。基础培养基可以从公知的培养基或市售的培养基中选择。例如，可以使用通常的培养基MEM(最低基础培养基)、DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基)、DMEM/F12、或这些培养基的改良培养基作为基础培养基。
另外，可以在培养基中添加本说明书中上述记载的公知的培养基成分，例如：血清、蛋白质(白蛋白、转铁蛋白、生长因子等)、氨基酸、糖类、维生素类、脂肪酸类、抗生素等。
此外，可以在培养基中添加本说明书中上述记载的脑源性神经营养因子(BDNF:Brain-Derived Neurotrophic Factor)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF:Glial cell-Derived Neurotrophic Factor)、cAMP、抗坏血酸、抗坏血酸-2-磷酸等对诱导分化为神经细胞有效的物质。
此外，在本发明中，也可以通过对生物体施用选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂，从而在生物体内从体细胞制备神经细胞。即，根据本发明，可以提供一种在生物体内从体细胞制备神经细胞的方法，该方法包括对生物体施用选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂。待施用于生物体的抑制剂的优选组合如本说明书中所述。另外，作为生物体，可以示例出人、除人以外的哺乳动物和除哺乳动物以外的动物(鸟类、爬行动物类、两栖动物类、鱼类等)，特别优选为人。通过对生物体内的特定部位施用选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂，可以在上述特定部位处从体细胞制备神经细胞。
E.与心肌细胞相关的发明
[1]制备心肌细胞的方法
本发明涉及制备心肌细胞的方法，该方法包括：在选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂的存在下、且选自cAMP激活剂、ALK5抑制剂和Erk抑制剂中的至少一种抑制剂的存在下培养体细胞的工序f。
优选工序f是在ALK6抑制剂和AMPK抑制剂的存在下、且在cAMP激活剂、ALK5抑制剂和Erk抑制剂的存在下培养体细胞的工序。
优选工序f是在选自ALK2抑制剂和ALK3抑制剂中的至少一种抑制剂的存在下培养体细胞的工序。
优选工序f是在GSK3抑制剂的存在下培养体细胞的工序。
特别优选工序f是在以下任一项的存在下培养体细胞的工序。
(1)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂、GSK3抑制剂、和Erk抑制剂；
(2)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂、和Erk抑制剂。
<具有2种以上抑制作用的抑制剂>
作为上述各种抑制剂，可以使用具有2种以上抑制作用的抑制剂。
例如，作为ALK2抑制剂和ALK3抑制剂，可以使用抑制ALK2和ALK3两者的LDN193189，或者也可以使用抑制ALK2、ALK3、ALK6和AMPK的dorsomorphin。即，可以通过在LDN193189和/或dorsomorphin的存在下培养体细胞来实现在选自ALK2抑制剂和ALK3抑制剂的至少一种抑制剂的存在下培养体细胞。
另外，作为ALK6抑制剂和AMPK抑制剂，可以使用抑制ALK6和AMPK两者的dorsomorphin。即，可以通过在dorsomorphin的存在下培养体细胞来实现在选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂的存在下培养体细胞。
<其它优选条件>
虽然在本发明中没有特别限制，但优选在工序f中在ALK4抑制剂不存在的情况下培养体细胞。在ALK4抑制剂不存在的情况下是指ALK4抑制剂实质上不存在的情况，不仅包括ALK4抑制剂完全不存在的情况，还包括ALK4抑制剂以痕量存在的情况。ALK4是受体丝氨酸/苏氨酸激酶的亚家族成员，通过激活蛋白介导信号传导。在脊椎动物的发育阶段中，ALK4在Cripto的存在下介导Nodal信号传导。
在本说明书中作为ALK5抑制剂之一而示例出的SB431542(和光纯药工业株式会社制造)也具有ALK4抑制作用，但在本发明中，作为ALK5抑制剂，优选使用不具有ALK4抑制作用的化合物。
<体细胞的培养>
在本发明中，从体细胞制备心肌细胞。作为对分化诱导成心肌细胞有效的物质，已知有5-氮胞苷、TGF-β(转化生长因子-β)、血管紧张素-II、BMP-2(骨形态发生蛋白2)、二甲基亚砜(DMSO)等。作为对分化诱导成心肌细胞有效的物质，例如，可以使用市售的作为分化诱导剂的物质。在本发明中，优选在上述物质的存在下培养体细胞。
<心肌细胞>
可以通过上述的本发明的心肌细胞的制备方法获得含有心肌细胞的细胞群。通过本发明的制备心肌细胞的方法制备的心肌细胞也在本发明的范围内。对于通过本发明的方法制备的心肌细胞而言，除了终末分化后的细胞以外，还可以是注定分化成心肌细胞的前体细胞。
可以利用例如例如细胞的形态变化、心肌细胞的特征性质、特异性标志物来对通过本发明的方法制备的心肌细胞进行检测、确认和分离。
心肌细胞具有自主搏动这样的其它细胞所不具有的特征，可以通过在显微镜下的观察而与其它细胞相区别。另外，作为心肌细胞的特异性标志物，可以列举心肌肌钙蛋白C(cTnT)、α肌球蛋白重链、α肌动蛋白等，但并不限定于此。
在特异性标志物的检测中，可以利用检疫方法(利用抗体进行的检测)，在与蛋白质分子相关时，也可以通过其mRNA量的定量来检测。识别心肌细胞的特异性标志物的抗体对于分离和纯化通过本发明的方法获得的心肌细胞也是有用的。
通过本发明的方法制备的心肌细胞可以用于例如组织修复等。使用通过本发明的方法制备的心肌细胞，可以制备用于组织修复等的药物组合物。作为心力衰竭或心肌梗塞等心脏疾病的治疗手段，进行了心肌细胞的制备方法和心肌细胞的移植方法的开发。例如，通过将心肌细胞和内皮细胞等层叠而形成的心肌片层显示出优异的治疗效果和生物粘附性，因此期待可用于治疗严重的心力衰竭。
在将心肌细胞制成药物组合物的情况下，可以按照通常方法将心肌细胞与药学上可接受的载体进行混合等而制成适合于对个体施用的形式的制剂。作为载体，可以举出例如添加生理盐水、葡萄糖、其它佐剂(例如，D-山梨糖醇、D-甘露醇、氯化钠等)而变得等张的注射用蒸馏水。此外，可以配合缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液)、镇痛剂(例如，苯扎氯铵、盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(例如，人血清白蛋白、聚乙二醇等)、防腐剂、抗氧化剂等。
此外，心肌细胞可以与对于心肌细胞的功能发挥、生物粘附性改善有效的其它细胞、成分组合而制成组合物。
此外，按照本发明的方法制备的心肌细胞可以用于与心肌细胞发生作用的药物候选化合物的筛选、药物候选化合物的安全性评价。心肌细胞是用于评价药物候选化合物的心脏毒性的重要工具。由于根据本发明可以在一次操作中获得大量的心肌细胞，因此能够得到具有重现性的研究结果，而不受细胞批次差异的影响。
[2]组合物
本发明进一步涉及组合物，其包含选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂、以及cAMP激活剂、ALK5抑制剂及Erk抑制剂。
优选本发明的组合物包含ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK5抑制剂和Erk抑制剂。
优选本发明的组合物进一步包含选自ALK2抑制剂和ALK3抑制剂中的至少一种抑制剂。
优选本发明的组合物进一步包含GSK3抑制剂。
作为本发明的组合物的具体实例，可以列举包含以下任意组合的组合物。
(1)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂、GSK3抑制剂、和Erk抑制剂；
(2)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂、和Erk抑制剂。
上述激活剂和抑制剂的具体实例和优选实例如本说明书中的记载所述。
本发明的组合物可以用作用于从体细胞制备心肌细胞的组合物。另外，本发明的组合物还可以用作用于从体细胞制备心肌细胞的培养基。
作为从体细胞制备心肌细胞所使用的培养基，可以示例出在基础培养基中含有自由ALK6抑制剂及AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂、以及cAMP激活剂、ALK5抑制剂及Erk抑制剂作为有效成分而成的培养基，所述基础培养基是将对于细胞培养所必需的成分混合而制造的。只要以对制备心肌细胞有效的浓度包含上述的有效成分即可，有效成分的浓度可由本领域技术人员适当确定。基础培养基可以从公知的培养基或市售的培养基中选择。例如，可以使用通常的培养基MEM(最低基础培养基)、DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基)和DMEM/F12、或这些培养基的改良培养基作为基础培养基。
另外，可以在培养基中添加本说明书中上述记载的公知的培养基成分，例如：血清、蛋白质(白蛋白、转铁蛋白、生长因子等)、氨基酸、糖类、维生素类、脂肪酸类、抗生素等。
此外，可以在培养基中添加本说明书中上述记载的对诱导分化成心肌细胞有效的物质。
此外，在本发明中，也可以通过对生物体施用选自ALK6抑制剂及AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂、以及cAMP激活剂、ALK5抑制剂及Erk抑制剂，从而在生物体内从体细胞制备心肌细胞。即，根据本发明，可以提供一种在生物体内从体细胞制备心肌细胞的方法，该方法包括对生物体施用选自ALK6抑制剂及AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂、以及cAMP激活剂、ALK5抑制剂及Erk抑制剂。待施用于生物体的抑制剂的优选组合如本说明书中所述。另外，作为生物体，可以示例出人、除人以外的哺乳动物和除哺乳动物以外的动物(鸟类、爬行动物类、两栖动物类、鱼类等)，特别优选为人。通过对生物体内的特定部位施用选自ALK6抑制剂及AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂、以及cAMP激活剂、ALK5抑制剂及Erk抑制剂，可以在特定部位处从体细胞制备心肌细胞。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行具体说明，但是本发明并不限于实施例的范围。
实施例A：褐色脂肪细胞制备1
<从人成纤维细胞诱导褐色脂肪细胞>
(1)人成纤维细胞
作为材料的人成纤维细胞购自DS Pharma Biomedical公司。其是来自于38岁的人的皮肤的成纤维细胞。
(2)从人成纤维细胞直接诱导成褐色脂肪细胞
将人成纤维细胞以每皿8×104个接种于35mm的培养皿，在添加有10％胎牛血清(Fetal bovine serum；FBS)、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM高葡萄糖培养基(和光纯药工业株式会社制造)中在37℃、5％CO2的条件下培养了2天。需要说明的是，DMEM表示Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)。
将上述的人成纤维细胞的培养皿中的培养基更换为具有L-谷氨酰胺酚红、丙酮酸钠的DMEM(高葡萄糖)(和光纯药工业株式会社制造)，所述DMEM含有胰岛素(终浓度10μg/ml)、***(终浓度2.5μmol/L)、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(终浓度0.5mmol/L)、罗格列酮(终浓度1μmol/L)、及按照表1添加的小分子化合物。随后，每3天将培养基更换为具有相同组成的培养基，并且在37℃、5％CO2的条件下进行培养。表1中记载的化合物的详细情况如本说明书中所述。
[表1]
表1(表中数值的单位是μmol/L)
(3)褐色脂肪细胞的评价
按照上述(2)进行了培养，其结果是，在培养开始6天后出现了脂肪细胞样的细胞。在培养开始21天后，用2％多聚甲醛对细胞进行了固定，然后进行免疫染色。染色中使用了抗UCP1抗体(ab10983，Abcam公司制造；稀释400倍使用)。将结果示于图1。在图中，上部为免疫染色的结果，蓝色表示用DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)进行的核染色的结果，绿色表示UCP-1的染色结果。需要说明的是，由于图1是单色的，因此未显示出蓝色和绿色，但在图1的原始照片中显示出绿色和蓝色。下部示出了相同的视野内的相差显微镜图像。
如图1所示可知，通过添加多种小分子化合物进行培养，出现了作为褐色脂肪细胞的标志物的UCP-1阳性细胞。另外可知，在向褐色脂肪细胞的分化中，在作为TGF抑制剂的SB431542和BMP抑制剂中，优选具有ALK6抑制能力及AMPK抑制能力的dorsomorphin。
实施例B：褐色脂肪细胞制备2
将化合物的缩写示于以下。
G：CHIR99021
M：PD0325901
S：SB431542
L：LDN193189
F：毛喉素
D：dorsomorphin
Ro：罗格列酮
需要说明的是，5C是指G、M、S、L及F这5种的组合。5CD是指5C加上D。5CDRo是指5C加上D和Ro。5CDRo-G是指从5CDRo中排除G。这些缩写也适用于其它注释。
<方法>
(细胞培养)
人皮肤成纤维细胞购自DS Pharma Biomedical公司。将细胞信息记载于下表。
[表2]
将约1.5×105个细胞接种于包含高葡萄糖DMEM培养基(11995-065,Gibco,MA,USA)的35mm培养皿，所述高葡萄糖DMEM培养基添加有10％胎牛血清(FBS)(HyClone,Utah,USA)和青霉素/链霉素(Gibco)。
(从人成纤维细胞直接转变为褐色脂肪细胞)
在各人成纤维细胞达到80～90％汇合后，更换培养基，开始直接转化成褐色脂肪细胞。使用的脂肪细胞培养基是在高葡萄糖DMEM培养基(043-30085,和光纯药工业株式会社)中添加包含抗坏血酸、生物素、泛酸，三碘甲腺原氨酸、辛酸、胰岛素、***、IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)、FBS及青霉素/链霉素的添加剂试剂(MK425,Takara Bio公司)而制备的。小分子化合物全部购自和光纯药工业株式会社，按照以下的最终浓度添加至脂肪细胞培养基。CHIR99021(1μM)、PD0325901(1μM)、SB431542(2μM)、LDN193189(1μM)、毛喉素(7.5μM)、pifithrin-α(5μM)、dorsomorphin(1μM)和罗格列酮(1μM)。在包含各示出的化合物的脂肪细胞培养基中将人成纤维细胞培养了3周。每3天更换培养基。将细胞在仅包含罗格列酮(1μM)的脂肪细胞培养基中进一步培养1周，使化学诱导的褐色脂肪样细胞成熟。
(免疫染色)
按照现有的报道(Dai P,et al.J Clin Biochem Nutr.2015；56(3):166-70)进行免疫细胞化学。首先，用2％多聚甲醛(NACALAI TESQUE公司)固定细胞。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗3次，然后在含有0.1％Triton X-100的PBS中将细胞温育10分钟。接着，在室温下用含有3％脱脂乳的PBS封闭细胞1小时。用封闭溶液以1/500稀释UCP-1抗体(ab10983,Abcam,Cambridge,UK)。将细胞与抗体在4℃下温育过夜。用PBS清洗3次，然后在室温下将细胞与Alexa Fluor 488驴抗兔IgG(A-21206,Thermo Fisher Scientific)温育2小时。用DAPI溶液(同仁化学研究所)对细胞核进行了染色。使用荧光显微镜(Axio Vert.A1,CarlZeiss,Oberkochen,Germany)获得全部图像。使用MitoTracker(注册商标)Red CMXRos(Thermo Fisher Scientific)对线粒体进行了染色。
(RNA分离及QRT-PCR)
为了对基因表达进行定量，使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)从用各化合物进行了处理的成纤维细胞中提取总RNA。作为对照，使用脂肪细胞培养基对成纤维细胞进行了平行培养。在用0.1μM、1μM及10μM的异丙肾上腺素或毛喉素处理了3小时或6小时后，从用化合物诱导的褐色脂肪细胞和对照细胞中提取总RNA。利用ReverTraAce(注册商标)PCR RTMaster Mix with gDNA Remover(东洋纺)进行逆转录后，使用Power SYBR Green PCRMaster Mix(Thermo Fisher Scientific)进行了实时PCR分析。反应在以下的条件下进行，每1个水平实施了3次反应。在95℃下反应10分钟后，进行95℃下15秒钟、60℃下60秒钟的40个循环。结果全部以Tbp mRNA的量进行了标准化。QRT-PCR中使用的引物示于下表。
[表3]
(耗氧速率的测定)
为了测定线粒体的耗氧速率(oxygen consumption rate:OCR)，在96孔板上利用化合物的组合(5CDRo-GM；即SB431542、LDN193189、毛喉素、dorsomorphin、罗格列酮)对0岁、38岁和49岁的3种不同的成纤维细胞进行了3周的直接转化。作为对照，在脂肪细胞培养基中对成纤维细胞进行了平行培养。为了使其成熟，将这些细胞进一步在仅含有罗格列酮的脂肪细胞培养基中培养了1周。在37℃的非CO2培养箱内温育1小时，然后使用XF96Extracellular Flux Analyzer(Seahorse Bioscience Inc.,Billerica,MA)按照操作说明书对包含用化合物诱导的褐色脂肪细胞的各孔的耗氧速率进行了分析。在分析中，通过注射装置将寡霉素、FCCP(碳酰氰4-(三氟甲氧基)苯腙)及抗霉素A/鱼藤酮添加至各孔，使得最终浓度分别为2μM、0.25μM和0.5μM。
<结果>
(用于从人成纤维细胞直接转化成脂肪细胞的化合物的鉴定)
如图2所示，利用5CDRo的组合促进了直接转化。在从5CDRo(CHIR99021、PD0325901、SB431542、LDN193189、毛喉素、dorsomorphin、罗格列酮)的组合中排除了CHIR99021和PD0325901时，转化效率和脂滴的形成得到了改善(图2)。
在用化合物的组合处理后的细胞中对脂肪细胞特异性基因的表达进行了定量。与对照相比，在用化合物的组合处理后的细胞中，Fabp4的表达增加(图3)。
(在用化合物诱导的脂肪细胞样细胞中Ucp1表达和线粒体生成的增加)
用各化合物的组合将细胞温育了3周，然后从脂肪细胞培养基中除去除罗格列酮以外的化合物，进行了1周的温育。由此，显著地促进了脂肪细胞样细胞的成熟，脂滴的量增加。
5CDRo-G(PD0325901、SB431542、LDN193189、毛喉素、dorsomorphin、罗格列酮)有效地产生了褐色脂肪细胞(图4和下表)。
将从5CDRo-G中排除了除CHIR99021以外的一种化合物的结果示于图5。当排除PD0325901或LDN193189时，脂肪细胞样细胞的制备效率最大化。“毛喉素、dorsomorphin和SB431542”、“毛喉素、LDN193189和SB431542”、“dorsomorphin、LDN193189和SB431542”、及“dorsomorphin、PD032590和SB431542”等包含3种化合物的组合显示出向脂肪细胞样细胞的有效转化(图6)。在2种以下的化合物的情况下，也显示出进行直接转化(图7和图8)。
根据图4～图8所示的结果对化合物的各种组合的转化成脂肪细胞样细胞的效率进行了评价，将评价结果示于下表。需要说明的是，图4～图8是用相差显微镜观察免疫染色结果而得到的结果，根据细胞的状态对效率进行了综合判断。符号“+”的数量越多，转变效率越高。例如，符号“++++”表示基本上全部转化为褐色脂肪细胞。符号“-”表示未转化为褐色脂肪细胞。
[表4]
[表5]
组合 效率
3种化合物
FDLRo ++
FDMRo ++
FDSRo +++
FLMRo +
FLSRo +++
FMSRo ++
DLMRo ++
DLSRo +++
DMSRo +++
LMSRo ++
2种化合物
DFRo +
DLRo +
DMRo ++
DSRo ++
FLRo ++
FMRo ++
FSRo +++
LSRo +++
MSRo ++
1种化合物
GRo -
MRo +
LRo +
SRo ++
DRo +
FRo +
仅Ro -
为了确认用5CDRo-GM(SB431542、LDN193189、毛喉素、dorsomorphin、罗格列酮)直接转化的有用性，对来自于成人和新生儿(38岁、49岁和0岁)的3种成纤维细胞进行了试验。在利用罗格列酮进行的最后一周的成熟后，成纤维细胞全部生成了脂肪细胞样细胞(图9的A～C)。
还进行免疫细胞化学分析，对蛋白质表达和UCP1的细胞定位进行了分析。其结果表明，脂肪细胞样细胞的大部分为UCP-1阳性，显示出具有褐色脂肪细胞的特征。此外，UCP-1的染色与线粒体信号的增加充分重叠。通过油红染色确认了脂肪细胞样细胞具有大量脂滴(图10)。
(在用化合物诱导后的褐色脂肪细胞中诱导人褐色脂肪细胞特异性基因的表达)
为了表征用化合物诱导后的褐色脂肪细胞的基因表达，通过QRT-PCR定量了对人褐色脂肪组织特异性的多种标志物基因。将0岁(新生儿)、38岁和49岁的3名受试者的人源成纤维细胞与5CDRo-GM一起培养3周，然后用罗格列酮成熟1周。
与未添加化合物的对象相比，在全部成纤维细胞中诱导了Ucpl mRNA(图11A)。在全部成纤维细胞中诱导了Ckmt1(线粒体肌酸激酶)和Cited1(人褐色脂肪细胞标志物)的表达(图11A)。Col1a2(成纤维细胞的标志物之一)减少了约40％～80％，因此表明细胞的命运已从成纤维细胞变为褐色脂肪细胞(图11B)。对于用化合物诱导后的褐色脂肪细胞而言，作为脂肪生成/分化标志物的Fabp4、AdipoQ和Pparγ的表达在全部成纤维细胞中增加(图11C)。需要说明的是，图11中的5CD是指5CDRo，5CD-MG与5CDRo-MG含义相同。
(用化合物诱导后的褐色脂肪细胞中用于产热的功能性β肾上腺素受体信号)
基于Ucpl的产热在褐色脂肪细胞中通过交感神经***和β肾上腺素受体信号传导途径来调节。为了对用化合物诱导后的褐色脂肪细胞中的产热能力进行评价，在用3种不同浓度的异丙肾上腺素(β肾上腺素受体激动剂)进行了3小时或6小时处理后，对Ucp1mRNA进行了定量(图12A)。通过3小时处理，Ucp1mRNA略微增加，与未处理的细胞相比，通过6小时处理，明显增加至约4～5倍。为了确认Ucp1的诱导是通过细胞cAMP浓度的增大而进行的诱导，用3种不同浓度的毛喉素对细胞进行了3小时或6小时处理(图12B)。与未处理的细胞相比，处理6小时的细胞的Ucp1表达比处理3小时的细胞的Ucp1表达更强。与此相对，作为其它人褐色脂肪细胞特异性基因的Ckmt1和Cited1的表达没有观察到明显变化。上述结果表明，表达的增加对Ucp1等产热基因是特异性的(图12C和D)。另外，上述结果表明，产热基因的诱导可以响应β肾上腺素受体信号传导途径。
(用化合物诱导后的褐色脂肪细胞中的耗氧速率(OCR)的增加)
为了证明用化合物诱导后的褐色脂肪细胞中线粒体的增加与耗氧速率的增加相关，利用Flux分析仪对来自于不同的人成纤维细胞的褐色脂肪细胞进行了分析。通常通过在测定中添加扰动试剂来改变OCR值，与对照相比，来自于38岁的成纤维细胞的褐色脂肪细胞显示出更高的OCR(图13A)。来自于其它成纤维细胞的褐色脂肪细胞也显示出OCR的增加(图13B和C)。上述结果表明，在用化合物诱导后的褐色脂肪细胞中，线粒体中的氧化代谢加快，变得活化。
实施例C：成骨细胞的制备
<从人成纤维细胞诱导成骨细胞>
(1)人成纤维细胞
作为材料的人成纤维细胞购自DS Pharma Biomedical公司。其是来自于38岁的人的皮肤的成纤维细胞。
(2)从人成纤维细胞直接诱导为成骨细胞
将人成纤维细胞以每皿5×104个接种于35mm的培养皿，在添加有10％胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养基(Gibco公司制造)中在37℃、5％CO2的条件下培养至汇合。需要说明的是，DMEM表示Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco’sModified Eagle Medium)。
将上述的人成纤维细胞的培养皿中的培养基更换为具有L-谷氨酰胺和苯酚红的RPMI1640(和光纯药工业株式会社制造)，所述RPMI1640含有成骨细胞诱导剂(Osteoblast-Inducer Reagent；Takara Bio公司制造)及按照表1添加的小分子化合物。随后，每3天将培养基更换为具有相同组成的培养基，并且在37℃、5％CO2的条件下进行培养。表6中记载的化合物的详细情况如本说明书中所述。
[表6]
表6(表中的数值的单位是μmol/L)
(3)成骨细胞的评价
按照上述(2)进行了培养，其结果是，在培养开始7天后出现了成骨细胞样的细胞。在培养开始21天后，按照通常方法对细胞进行von Kossa染色，评价了是否有钙沉积。将结果示于图14。在图中，上部示出了von Kossa染色的结果，下部示出了相同的视野内的相差显微镜图像。
如图14所示可知，在实施例1和实施例2中出现了能够通过von Kossa染色识别钙沉积的细胞。另外可知，对于成骨细胞的分化而言，在作为cAMP激活剂的毛喉素、作为TGF抑制剂的SB431542、BMP抑制剂中，具有ALK2/3抑制能力、且不具有ALK6抑制能力和AMPK抑制能力的LDN193189和作为GSK-3β抑制剂的CHIR99021是很重要的，并且优选不添加作为Erk抑制剂的PD325901。
实施例D：软骨细胞的制备
<从人成纤维细胞诱导软骨细胞>
(1)人成纤维细胞
作为材料的人成纤维细胞购自DS Pharma Biomedical公司。其是来自于38岁的人的皮肤的成纤维细胞。
(2)从人成纤维细胞直接诱导为软骨细胞
将人成纤维细胞以每皿5×104个接种于35mm的培养皿，在添加有10％胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养基(Gibco公司制造)中在37℃、5％CO2的条件下培养至汇合。需要说明的是，DMEM表示Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco’sModified Eagle Medium)。
将上述的人成纤维细胞的培养皿中的培养基更换为含有胰岛素-转铁蛋白-硒(Thermo Fisher Scientific公司制造，终浓度1％)、抗坏血酸-2-磷酸(和光纯药工业株式会社制造，终浓度50μg/ml)、***(和光纯药工业株式会社制造，终浓度0.1μM)、TGF-β3(PeproTech公司制造，终浓度10ng/ml)、L-脯氨酸(NACALAI TESQUE公司制造，终浓度40μg/ml)、抗生素-抗真菌剂(Thermo Fisher Scientific公司制造，终浓度1×)、以及按照表1添加的小分子化合物的DMEM(Thermo Fisher Scientific公司制造)。随后，每3天将培养基更换为具有相同组成的培养基，并且在37℃、5％CO2的条件下进行培养。表7中记载的化合物的详细情况如本说明书中所述。
[表7]
表7(表中的数值的单位是μmol/L)
(3)软骨细胞的评价
按照实施例(2)进行了培养，其结果是，在培养开始7天后出现了软骨细胞样的细胞。在培养开始21天后，按照通常方法对细胞进行阿辛蓝(Alcian Blue)染色，评价了是否存在作为软骨基质的酸性多糖。将结果示于图15。在图中，上部示出了阿辛蓝染色的结果，下部示出了相同的视野内的相差显微镜图像。
如图15所示可知，在实施例1中出现了能够通过阿辛蓝染色识别酸性多糖产生的细胞。另外可知，对于分化成软骨细胞而言，在作为cAMP激活剂的毛喉素、作为TGF抑制剂的SB431542、BMP抑制剂中，添加具有ALK2/3抑制能力的LDN193189、作为GSK-3β抑制剂的CHIR99021是很重要的，而且在BMP抑制剂中，优选不包含具有ALK6抑制能力和AMPK抑制能力的dorsomorphin、作为Erk抑制剂的PD325901。
实施例E：神经细胞的制备
<从人成纤维细胞诱导神经细胞>
(1)人成纤维细胞
作为材料的人成纤维细胞购自DS Pharma Biomedical公司。其是来自于38岁的人的皮肤的成纤维细胞。
(2)从人成纤维细胞直接诱导成神经细胞
将人成纤维细胞以每皿8×104个接种于35mm的培养皿，在添加有10％胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM高葡萄糖培养基(和光纯药工业株式会社制造)中在37℃、5％CO2的条件下培养了2天。需要说明的是，DMEM表示Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)。
将上述的人成纤维细胞的培养皿中的培养基更换为含有0.5％N-2补充剂(ThermoFisher Scientific公司制造)、1％B-27补充剂(Thermo Fisher Scientific公司制造)、50％DMEM/F12、50％Neurobasal培养基(Thermo Fisher Scientific公司制造)、以及按照表1添加的小分子化合物的培养基。随后，每3天将培养基更换为具有相同组成的培养基，并且在37℃、5％CO2的条件下进行培养。表8中记载的化合物的详细情况如本说明书中所述。
[表8]
表8(表中的数值的单位是μmol/L)
(3)神经细胞的评价
按照上述(2)进行了培养，其结果是，在培养开始5天后，识别出神经样突起结构。在培养开始14天后，用2％多聚甲醛固定细胞，然后进行了免疫染色。在染色中，使用了抗βIII-微管蛋白抗体(MMS-435P，Covance公司制造；稀释1000倍使用)。将结果示于图16。在图中，上部示出了免疫染色的结果，蓝色表示用DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)进行的核染色的结果，绿色表示β3-微管蛋白(βIII-tubulin)的染色结果。下部示出了相同的视野内的相差显微镜图像。
如图16所示可知，在实施例1～5中出现了βIII-微管蛋白阳性细胞。此外，对于分化成神经细胞而言，在BMP抑制剂中，具有ALK6抑制能力和AMPK抑制能力的dorsomorphin是很重要的。
实施例F：心肌细胞的制备
<从人成纤维细胞诱导心肌细胞>
(1)人成纤维细胞
作为材料的人成纤维细胞购自DS Pharma Biomedical公司。其是来自于38岁的人的皮肤的成纤维细胞。
(2)从人成纤维细胞直接诱导成心肌细胞
将人成纤维细胞以每皿8×104个接种于35mm的培养皿，在添加有10％胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM高葡萄糖培养基(Gibco公司制造)中在37℃、5％CO2的条件下培养了2天。需要说明的是，DMEM表示Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)。
将上述的人成纤维细胞的培养皿中的培养基更换为具有L-谷氨酰胺、酚红、丙酮酸钠的DMEM(高葡萄糖)(和光纯药工业株式会社制造)，所述DMEM(高葡萄糖)含有10％胎牛血清、1％N-2补充剂(Thermo Fisher Scientific公司制造)、2％B-27补充剂(ThermoFisher Scientific公司制造)、1×MEM非必需氨基酸(Thermo Fisher Scientific公司制造)、0.1mM 2-巯基乙醇、50μg/ml青霉素、100μg/ml链霉素、以及按照表1添加的小分子化合物。随后，每3天将培养基更换为具有相同组成的培养基，并且在37℃、5％CO2的条件下进行培养。表9中记载的化合物的详细情况如本说明书中所述。
[表9]
表9(表中的数值的单位是μmol/L)
(3)心肌细胞的评价
按照上述(2)进行了培养，其结果是，在培养开始8天后，识别出收缩或搏动的单体细胞、小细胞团。在培养开始21天以后，观察到大量收缩或搏动的心肌细胞样的团块。在培养开始21天后，用2％多聚甲醛固定细胞，然后进行了免疫染色。在染色中，使用了抗cTnT抗体(ab10214，Abcam公司制造；稀释200倍使用)。将结果示于图17。在图中，上部示出了免疫染色的结果，蓝色表示用DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)进行的核染色的结果，绿色表示cTnT的染色结果。下部示出了相同的视野内的相差显微镜图像。
如图17所示可知，在实施例1～4中出现了cTnT阳性细胞。此外，对于分化成心肌细胞而言，在作为cAMP激活剂的毛喉素、作为TGF抑制剂的Repsox、BMP抑制剂中，具有ALK6抑制能力和AMPK抑制能力的dorsomorphin、作为Erk抑制剂的PD0325901是很重要的。
序列表
<110> 京都府公立大学法人
<120> 制备体细胞的方法、体细胞和组合物
<130>丂P17051WO
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成DNA
<400> 1
actacggggt tatcacctgt gag 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成DNA
<400> 2
gtgcaggagt aggccacatt ac 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成DNA
<400> 3
tctacgacac ggtccaggag 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成DNA
<400> 4
gaatactgcc actcctccag tc 22
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成DNA
<400> 5
agcaggaatg gctcgagac 19
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成DNA
<400> 6
atcctcctca ttcacccaga tc 22
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成DNA
<400> 7
tggcacctca cctgcgaag 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成DNA
<400> 8
gcagaatggc cactgctttg 20
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成DNA
<400> 9
tcgcacatgc cgtgacttg 19
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成DNA
<400> 10
gatagcatcc atagtgcatc cttg 24
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成DNA
<400> 11
gccaggaatt tgacgaagtc a 21
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成DNA
<400> 12
cccatttctg cacatgtacc ag 22
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成DNA
<400> 13
ctggtgagaa gggtgagaaa g 21
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明：合成DNA
<400> 14
gtttcaccga tgtctccctt ag 22

Claims (102)

1.一种制备褐色脂肪细胞的方法，该方法包括：在ALK5抑制剂的存在下、并且在选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂的存在下培养体细胞的工序a。
2.根据权利要求1所述的制备褐色脂肪细胞的方法，其中，所述工序a是在ALK6抑制剂和AMPK抑制剂的存在下培养体细胞的工序。
3.根据权利要求1或2所述的制备褐色脂肪细胞的方法，其中，所述工序a是在选自cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、GSK3抑制剂和Erk抑制剂中的至少一种激活剂和/或抑制剂的存在下培养体细胞的工序。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的制备褐色脂肪细胞的方法，其中，所述工序a是在以下任一项的存在下培养体细胞的工序：
(1)ALK5抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、GSK3抑制剂、和Erk抑制剂；
(2)ALK5抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、和ALK3抑制剂；
(3)ALK5抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、GSK3抑制剂、和Erk抑制剂；
(4)ALK5抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、和Erk抑制剂；
(5)ALK5抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、和GSK3抑制剂；
(6)ALK5抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂、和ALK3抑制剂。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的制备褐色脂肪细胞的方法，其中，在选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂的存在下培养体细胞是在dorsomorphin的存在下培养体细胞。
6.根据权利要求3或4所述的制备褐色脂肪细胞的方法，其中，在选自ALK2抑制剂和ALK3抑制剂中的至少一种抑制剂的存在下培养体细胞是在LDN193189和/或dorsomorphin的存在下培养体细胞。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的制备褐色脂肪细胞的方法，其中，所述工序a是在p53抑制剂不存在的情况下培养体细胞的工序。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的制备褐色脂肪细胞的方法，其中，所述工序a是在与组蛋白相关的成分不存在的情况下培养体细胞的工序。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的制备褐色脂肪细胞的方法，其中，所述体细胞是成纤维细胞。
10.一种褐色脂肪细胞，其通过权利要求1～9中任一项所述的制备褐色脂肪细胞的方法来制备。
11.一种组合物，其包含ALK5抑制剂、和选自ALK6抑制剂及AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂。
12.根据权利要求11所述的组合物，其包含ALK6抑制剂和AMPK抑制剂。
13.根据权利要求11或12所述的组合物，其进一步包含选自cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、GSK3抑制剂和Erk抑制剂中的至少一种激活剂和/或抑制剂。
14.根据权利要求11～13中任一项所述的组合物，其包含以下的任意组合：
(1)ALK5抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、GSK3抑制剂、和Erk抑制剂；
(2)ALK5抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、和ALK3抑制剂；
(3)ALK5抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、GSK3抑制剂、和Erk抑制剂；
(4)ALK5抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、和Erk抑制剂；
(5)ALK5抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、和GSK3抑制剂；
(6)ALK5抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂、和ALK3抑制剂。
15.根据权利要求11～14中任一项所述的组合物，其中，选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂是dorsomorphin。
16.根据权利要求13或14所述的组合物，其中，选自ALK2抑制剂和ALK3抑制剂中的至少一种抑制剂是LDN193189和/或dorsomorphin。
17.根据权利要求11～16中任一项所述的组合物，其是用于从体细胞制备褐色脂肪细胞的组合物。
18.一种制备褐色脂肪细胞的方法，该方法包括在选自以下五组中的至少一组的存在下培养体细胞的工序b：
(1)Erk抑制剂；(2)ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；(3)ALK5抑制剂；(4)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；以及(5)cAMP激活剂。
19.根据权利要求18所述的制备褐色脂肪细胞的方法，其中，所述工序b是在选自以下五组中的至少两组的存在下培养体细胞的工序：
(1)Erk抑制剂；(2)ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；(3)ALK5抑制剂；(4)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；以及(5)cAMP激活剂。
20.根据权利要求18或19所述的制备褐色脂肪细胞的方法，其中，所述工序b是在以下任一项的存在下培养体细胞的工序：
(i)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂及ALK3抑制剂、和cAMP激活剂；
(ii)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂及ALK3抑制剂、和Erk抑制剂；
(iii)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂及ALK3抑制剂、和ALK5抑制剂；
(iv)cAMP激活剂、和ALK2抑制剂及ALK3抑制剂；
(v)cAMP激活剂、和Erk抑制剂
(vi)cAMP激活剂、和ALK5抑制剂；
(vii)ALK2抑制剂及ALK3抑制剂、和ALK5抑制剂；以及
(viii)Erk抑制剂、和ALK5抑制剂。
21.根据权利要求18或19所述的制备褐色脂肪细胞的方法，其中，所述工序b是在选自以下五组中的至少三组的存在下培养体细胞的工序：
(1)Erk抑制剂；(2)ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；(3)ALK5抑制剂；(4)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；以及(5)cAMP激活剂。
22.根据权利要求18、19及21中任一项所述的制备褐色脂肪细胞的方法，其中，所述工序b是在选自以下五组中的至少四组的存在下培养体细胞的工序：
(1)Erk抑制剂；(2)ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；(3)ALK5抑制剂；(4)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；以及(5)cAMP激活剂。
23.一种制备褐色脂肪细胞的方法，该方法包括在选自以下六组中的至少五组的存在下培养体细胞的工序b：
(1)Erk抑制剂；(2)ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；(3)ALK5抑制剂；(4)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；(5)cAMP激活剂；以及(6)GSK3抑制剂。
24.根据权利要求18～23中任一项所述的制备褐色脂肪细胞的方法，其中，在ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂的存在下培养体细胞是在dorsomorphin的存在下或在dorsomorphin和LDN193189的存在下培养体细胞。
25.根据权利要求18～24中任一项所述的制备褐色脂肪细胞的方法，其中，所述工序b是在p53抑制剂不存在的情况下培养体细胞的工序。
26.根据权利要求18～25中任一项所述的制备褐色脂肪细胞的方法，其中，所述工序b是在与组蛋白相关的成分不存在的情况下培养体细胞的工序。
27.根据权利要求18～26中任一项所述的制备褐色脂肪细胞的方法，其中，所述体细胞是成纤维细胞。
28.一种褐色脂肪细胞，其通过权利要求18～27中任一项所述的制备褐色脂肪细胞的方法来制备。
29.一种用于从体细胞制备褐色脂肪细胞的组合物，其包含选自以下五组中的至少一组：(1)Erk抑制剂；(2)ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；(3)ALK5抑制剂；(4)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；以及(5)cAMP激活剂。
30.根据权利要求29所述的用于从体细胞制备褐色脂肪细胞的组合物，其包含选自以下五组中的至少两组：(1)Erk抑制剂；(2)ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；(3)ALK5抑制剂；(4)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；以及(5)cAMP激活剂。
31.根据权利要求29或30所述的用于从体细胞制备褐色脂肪细胞的组合物，其包含以下的任一项：
(i)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂及ALK3抑制剂、和cAMP激活剂；
(ii)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂及ALK3抑制剂、和Erk抑制剂；
(iii)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂及ALK3抑制剂、和ALK5抑制剂；
(iv)cAMP激活剂、和ALK2抑制剂及ALK3抑制剂；
(v)cAMP激活剂、和Erk抑制剂
(vi)cAMP激活剂、和ALK5抑制剂；
(vii)ALK2抑制剂及ALK3抑制剂、和ALK5抑制剂；以及
(viii)Erk抑制剂、和ALK5抑制剂。
32.根据权利要求29或30所述的用于从体细胞制备褐色脂肪细胞的组合物，其包含选自以下五组中的至少三组：(1)Erk抑制剂；(2)ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；(3)ALK5抑制剂；(4)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；以及(5)cAMP激活剂。
33.根据权利要求29、30及32中任一项所述的用于从体细胞制备褐色脂肪细胞的组合物，其包含选自以下五组中的至少四组：(1)Erk抑制剂；(2)ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；(3)ALK5抑制剂；(4)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；以及(5)cAMP激活剂。
34.一种用于制备褐色脂肪细胞的组合物，其包含选自以下六组中的至少五组：(1)Erk抑制剂；(2)ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；(3)ALK5抑制剂；(4)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂；(5)cAMP激活剂；以及(6)GSK3抑制剂。
35.根据权利要求29～34中任一项所述的用于从体细胞制备褐色脂肪细胞的组合物，其中，ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂是dorsomorphin或dorsomorphin和LDN193189。
36.一种制备成骨细胞的方法，该方法包括：在选自ALK5抑制剂、GSK3抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂中的至少一种抑制剂存在、cAMP激活剂存在、且Erk抑制剂不存在的情况下培养体细胞的工序c。
37.根据权利要求36所述的制备成骨细胞的方法，其中，所述工序c是在ALK2抑制剂和ALK3抑制剂的存在下培养体细胞的工序。
38.根据权利要求36或37所述的制备成骨细胞的方法，其中，所述工序c是在选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂的存在下培养体细胞的工序。
39.根据权利要求36～38中任一项所述的制备成骨细胞的方法，其中，所述工序c是在以下任一项的存在下培养体细胞的工序：
(1)在ALK5抑制剂、GSK3抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂和cAMP激活剂存在、且Erk抑制剂不存在的情况下；
(2)在ALK5抑制剂、GSK3抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂和cAMP激活剂存在、且Erk抑制剂不存在的情况下。
40.根据权利要求37或39所述的制备成骨细胞的方法，其中，在ALK2抑制剂和ALK3抑制剂的存在下培养体细胞是在LDN193189和/或dorsomorphin的存在下培养体细胞。
41.根据权利要求38所述的制备成骨细胞的方法，其中，在选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂的存在下培养体细胞是在dorsomorphin的存在下培养体细胞。
42.根据权利要求36～41中任一项所述的制备成骨细胞的方法，其中，所述工序c是在p53抑制剂不存在的情况下培养体细胞的工序。
43.根据权利要求36～42中任一项所述的制备成骨细胞的方法，其中，所述工序c是在生长因子和/或细胞因子不存在的情况下培养体细胞的工序。
44.根据权利要求36～43中任一项所述的制备成骨细胞的方法，其中，所述工序c是在与组蛋白相关的成分不存在的情况下培养体细胞的工序。
45.根据权利要求36～44中任一项所述的制备成骨细胞的方法，其中，所述体细胞是成纤维细胞。
46.一种成骨细胞，其通过权利要求36～45中任一项所述的制备成骨细胞的方法来制备。
47.一种组合物，其包含选自ALK5抑制剂、GSK3抑制剂、ALK2抑制剂和ALK3抑制剂中的至少一种抑制剂、以及cAMP激活剂。
48.根据权利要求47所述的组合物，其至少包含ALK2抑制剂和ALK3抑制剂。
49.根据权利要求47或48所述的组合物，其进一步包含选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂。
50.根据权利要求47或48所述的组合物，其包含以下的任意组合：
(1)ALK5抑制剂、GSK3抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK6抑制剂、AMPK抑制剂和cAMP激活剂；
(2)ALK5抑制剂、GSK3抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂和cAMP激活剂。
51.根据权利要求48或50所述的组合物，其中，ALK2抑制剂和ALK3抑制剂是LDN193189和/或dorsomorphin。
52.根据权利要求49所述的组合物，其中，选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂是dorsomorphin。
53.根据权利要求47～52中任一项所述的组合物，其是用于从体细胞制备成骨细胞的组合物。
54.一种制备软骨细胞的方法，该方法包括：在选自cAMP激活剂、ALK5抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂和GSK3抑制剂中的至少一种抑制剂存在、Erk抑制剂不存在、且选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂不存在的情况下培养体细胞的工序d。
55.根据权利要求54所述的制备软骨细胞的方法，其中，所述工序d是至少在ALK2抑制剂和ALK3抑制剂的存在下培养体细胞的工序。
56.根据权利要求54或55所述的制备软骨细胞的方法，其中，所述工序d是在cAMP激活剂、ALK5抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂和GSK3抑制剂存在、Erk抑制剂不存在、且ALK6抑制剂和AMPK抑制剂不存在的情况下培养体细胞的工序。
57.根据权利要求55或56所述的制备软骨细胞的方法，其中，在ALK2抑制剂和ALK3抑制剂的存在下培养体细胞是在LDN193189的存在下培养体细胞。
58.根据权利要求54～57中任一项所述的制备软骨细胞的方法，其中，所述工序d是在p53抑制剂不存在的情况下培养体细胞的工序。
59.根据权利要求54～58中任一项所述的制备软骨细胞的方法，其中，所述工序d是在与组蛋白相关的成分不存在的情况下培养体细胞的工序。
60.根据权利要求54～59中任一项所述的制备软骨细胞的方法，其中，所述体细胞是成纤维细胞。
61.一种软骨细胞，其通过权利要求54～60中任一项所述的制备软骨细胞的方法来制备。
62.一种用于从体细胞制备软骨细胞的组合物，其包含选自cAMP激活剂、ALK5抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂和GSK3抑制剂中的至少一种抑制剂。
63.根据权利要求62所述的组合物，其至少包含ALK2抑制剂和ALK3抑制剂。
64.一种组合物，其包含cAMP激活剂、ALK5抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂和GSK3抑制剂。
65.根据权利要求63或64所述的组合物，其中，ALK2抑制剂和ALK3抑制剂是LDN193189。
66.根据权利要求64或65所述的组合物，其是用于从体细胞制备软骨细胞的组合物。
67.一种制备神经细胞的方法，该方法包括：在选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂的存在下培养体细胞的工序e。
68.根据权利要求67所述的制备神经细胞的方法，其中，所述工序e是在ALK6抑制剂和AMPK抑制剂的存在下培养体细胞的工序。
69.根据权利要求67或68所述的制备神经细胞的方法，其中，所述工序e是在选自cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂、GSK3抑制剂和Erk抑制剂中的至少一种激活剂和/或抑制剂的存在下培养体细胞的工序。
70.根据权利要求67～69中任一项所述的制备神经细胞的方法，其中，所述工序e是在以下任一项的存在下培养体细胞的工序：
(1)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂、GSK3抑制剂和Erk抑制剂；
(2)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂、GSK3抑制剂和Erk抑制剂；
(3)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂和Erk抑制剂；
(4)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂和GSK3抑制剂。
71.根据权利要求67～70中任一项所述的制备神经细胞的方法，其中，在选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂的存在下培养体细胞是在dorsomorphin的存在下培养体细胞。
72.根据权利要求69所述的制备神经细胞的方法，其中，在选自ALK2抑制剂和ALK3抑制剂中的至少一种抑制剂的存在下培养体细胞是在LDN193189和/或dorsomorphin的存在下培养体细胞。
73.根据权利要求67～72中任一项所述的制备神经细胞的方法，其中，所述工序e是在p53抑制剂不存在的情况下培养体细胞的工序。
74.根据权利要求67～73中任一项所述的制备神经细胞的方法，其中，所述工序e是在生长因子和/或细胞因子不存在的情况下培养体细胞的工序。
75.根据权利要求67～74中任一项所述的制备神经细胞的方法，其中，所述工序e是在与组蛋白相关的成分不存在的情况下培养体细胞的工序。
76.根据权利要求67～75中任一项所述的制备神经细胞的方法，其中，所述体细胞是成纤维细胞。
77.一种神经细胞，其通过权利要求67～76中任一项所述的制备神经细胞的方法来制备。
78.一种用于从体细胞制备神经细胞的组合物，其包含选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂。
79.一种用于从体细胞制备神经细胞的组合物，其包含ALK6抑制剂和AMPK抑制剂。
80.一种组合物，其包含选自ALK6抑制剂及AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂、和选自cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂、GSK3抑制剂及Erk抑制剂中的至少一种激活剂和/或抑制剂。
81.根据权利要求80所述的组合物，其包含以下任意组合：
(1)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂、GSK3抑制剂、和Erk抑制剂；
(2)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂、GSK3抑制剂、和Erk抑制剂；
(3)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂、和Erk抑制剂；
(4)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂、和GSK3抑制剂。
82.根据权利要求81所述的组合物，其中，ALK6抑制剂和AMPK抑制剂是dorsomorphin。
83.根据权利要求81所述的组合物，其中，ALK2抑制剂和ALK3抑制剂是LDN193189和/或dorsomorphin。
84.根据权利要求80～83中任一项所述的组合物，其是用于从体细胞制备神经细胞的组合物。
85.一种制备心肌细胞的方法，该方法包括：在选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂的存在下、且在cAMP激活剂、ALK5抑制剂和Erk抑制剂的存在下培养体细胞的工序f。
86.根据权利要求85所述的制备心肌细胞的方法，其中，所述工序f是在ALK6抑制剂和AMPK抑制剂的存在下、且在cAMP激活剂、ALK5抑制剂和Erk抑制剂的存在下培养体细胞的工序。
87.根据权利要求85或86所述的制备心肌细胞的方法，其中，所述工序f是在选自ALK2抑制剂和ALK3抑制剂中的至少一种抑制剂的存在下培养体细胞的工序。
88.根据权利要求85～87中任一项所述的制备心肌细胞的方法，其中，所述工序f是在GSK3抑制剂的存在下培养体细胞的工序。
89.根据权利要求85～88中任一项所述的制备心肌细胞的方法，其中，所述工序f是在以下任一项的存在下培养体细胞的工序：
(1)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂、GSK3抑制剂、和Erk抑制剂；
(2)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂、和Erk抑制剂。
90.根据权利要求85～89中任一项所述的制备心肌细胞的方法，其中，在选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂的存在下培养体细胞是在dorsomorphin的存在下培养体细胞。
91.根据权利要求85～90中任一项所述的制备心肌细胞的方法，其中，所述工序f是在ALK4抑制剂不存在的情况下培养体细胞的工序。
92.根据权利要求85～91中任一项所述的制备心肌细胞的方法，其中，所述工序f是在p53抑制剂不存在的情况下培养体细胞的工序。
93.根据权利要求85～92中任一项所述的制备心肌细胞的方法，其中，所述工序f是在与组蛋白相关的成分不存在的情况下培养体细胞的工序。
94.根据权利要求85～93中任一项所述的制备心肌细胞的方法，其中，所述体细胞是成纤维细胞。
95.一种心肌细胞，其通过权利要求85～94中任一项所述的制备心肌细胞的方法来制备。
96.一种组合物，其包含选自ALK6抑制剂和AMPK抑制剂中的至少一种抑制剂、以及cAMP激活剂、ALK5抑制剂及Erk抑制剂。
97.根据权利要求96所述的组合物，其包含ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK5抑制剂和Erk抑制剂。
98.根据权利要求96或97所述的组合物，其进一步包含选自ALK2抑制剂和ALK3抑制剂中的至少一种抑制剂。
99.根据权利要求96～98中任一项所述的组合物，其进一步包含GSK3抑制剂。
100.根据权利要求96～98中任一项所述的组合物，其包含以下任意组合：
(1)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂、GSK3抑制剂、和Erk抑制剂；
(2)ALK6抑制剂、AMPK抑制剂、cAMP激活剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、ALK5抑制剂、和Erk抑制剂。
101.根据权利要求97～100中任一项所述的组合物，其中，ALK6抑制剂和AMPK抑制剂是dorsomorphin。
102.根据权利要求96～101中任一项所述的组合物，其是用于从体细胞制备心肌细胞的组合物。
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