CN109996860A - 用于核酸制备的*** - Google Patents

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nucleic acid
cartridge bay
reaction vessel
primer
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乔舒阿·斯塔尔
贾森·迈尔斯
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Asher Texas Co Ltd
ArcherDx LLC
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Asher Texas Co Ltd
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Abstract

本文中提供了用于自动化处理核酸的装置及相关方法。在一些方面中，本申请涉及包含至少两个盒舱的装置，所述盒舱具有至少一个在所述至少两个盒舱之间共享的共享资源。

Description

用于核酸制备的***
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求每一项均于2016年9月23日提交的美国临时专利申请No.62/398,841、62/399,152、62/399,157、62/399,184、62/399,195、62/399,205、62/399,211和62/399,219的优先权，并根据35U.S.C.§§120和365(c)要求于2017年9月15日提交的PCT国际申请No.PCT/US2017/051924的优先权，并根据35U.S.C.§119(e)要求于2016年9月15日提交的美国临时专利申请No.62/395,339的优先权，并要求于2017年9月15日提交的PCT国际申请No.PCT/US2017/051927的优先权，并根据35U.S.C.§119(e)要求于2016年9月15日提交的美国临时专利申请No.62/395,347的优先权，所述申请各自的全部内容在此通过引用并入。
技术领域
本发明一般地涉及用于自动化处理分子(例如，核酸)的***及相关方法。
背景技术
已经开发了许多用于处理核酸的方法。这样的方法通常包括多个酶促、纯化和制备步骤，使得它们费力且容易发生误差，包括与污染相关的误差、***性用户误差和过程偏差。结果，通常难以可靠且可再现地执行这样的过程，特别是当这些过程在商业上进行，例如在多路复用(multiplex)或高通量情况中时。
发明概述
本发明一般地涉及用于处理核酸的***(例如，装置)。在一些实施方案中，该***包含两个或更多个盒舱(cartridge bay)和至少一个在两个或更多个盒舱之间共享的共享资源(shared resource)(例如，光学模块(optics module))。在一些实施方案中，该装置被配置成如果共享资源(例如，光学模块)正由一个或更多个盒舱使用则阻止访问一个或更多个盒舱。在一些实施方案中，该装置被配置成如果共享资源(例如，光学模块)未由一个或更多个盒舱使用则允许访问一个或更多个盒舱。
在一些方面中，本发明涉及用于处理核酸的***及相关方法。在一些实施方案中，该***包含盒(cartridge)，其包含有利于自动化处理核酸(包括自动核酸文库制备)的匣(cassette)和/或微流体通道(microfluidic channel)。在一些实施方案中，提供了用于自动化处理核酸以产生用于下一代测序(next generation sequencing)和/或其他下游分析技术之材料的***及相关方法。
在一些方面中，本公开内容涉及用于进行反应的装置。在一些实施方案中，该装置包含至少两个用于处理核酸的盒舱(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个盒舱)。在一些实施方案中，每个盒舱可被配置成容纳(house)盒舱组件(cartridgebay assembly)。在一些实施方案中，盒舱组件包含多个用于接纳(receive)反应容器(reaction vessel)的接纳器(receptacle)。在一些实施方案中，该装置包含至少两个用户访问门(user access door)(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个用户访问门)。在一些实施方案中，每个用户访问门提供对一个盒舱的访问。在一些实施方案中，访问一个盒舱可用于将包含反应容器的盒转移到一个盒舱中和从一个盒舱中转移出。在一些实施方案中，该装置包含至少一个在至少两个盒舱之间共享的共享资源。在一些实施方案中，至少一个共享资源被配置成监测反应容器内的活动。
在一些实施方案中，本文中提供的装置包含至少两个盒舱。在一些实施方案中，盒舱被配置成包含盒舱组件。在一些实施方案中，盒舱组件包含多个用于接纳反应容器的接纳器。在一些实施方案中，盒舱组件包含热覆盖物组件(thermal cover assembly)。在一些实施方案中，热覆盖物组件包含热传递表面(thermal transfer surface)。在一些实施方案中，热传递表面被配置成有利于热覆盖物组件与反应容器之间的热交换。
在一些实施方案中，本文中提供的装置包含至少两个盒舱和在至少两个盒舱之间共享的至少一个共享资源。在一些实施方案中，至少一个共享资源被配置成处理反应容器内的反应。在一些实施方案中，至少一个共享资源包含至少一个光学模块。在一些实施方案中，至少一个光学模块被配置成收集从反应容器发射的电磁信号(例如，发光或荧光)。在一些实施方案中，所收集的电磁信号包含荧光信号。在一些实施方案中，至少一个光学模块被配置成将电磁信号发射到反应容器中。在一些实施方案中，所发射的电磁信号包含激发能(excitation energy)。在一些实施方案中，至少一个光学模块被配置成将电磁信号发射到反应容器中并从反应容器收集电磁信号。
在一些实施方案中，本文中提供的装置包含至少一个在多个盒舱(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个盒舱)之间共享的共享资源。在一些实施方案中，至少一个共享资源包含至少一个光学模块，该光学模块被配置成由至少一个自动***(automated positioner)移动。在一些实施方案中，至少一个光学模块和至少一个自动***由电子模块驱动。在一些实施方案中，至少一个共享资源包含至少一个条码扫描器(barcode scanner)。在一些实施方案中，至少一个条码扫描器被配置成由至少一个自动***移动。在一些实施方案中，至少一个条码扫描器和至少一个自动***由电子模块驱动。在一些实施方案中，至少一个光学模块和至少一个条码扫描器被配置成由同一自动***移动。在一些实施方案中，至少一个共享资源和至少一个自动***由同一电子模块驱动。在一些实施方案中，至少一个自动***在盒舱组件上方的指定空间内(例如，在热覆盖物组件上方)运行。
在一些方面中，本公开内容涉及用于执行反应的装置，其包含至少两个盒舱。在一些实施方案中，每个盒舱被配置成容纳接纳一个或更多个盒(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个盒)的盒舱组件。在一些实施方案中，该装置包含至少两个用户访问门(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个用户访问门)，每个用户访问门被配置成提供对一个盒舱的访问。在一些实施方案中，访问一个盒舱可用于将盒转移到一个盒舱中和从一个盒舱中转移出。在一些实施方案中，该装置包含至少一个共享资源，该共享资源在至少两个盒舱之间共享。在一些实施方案中，至少一个共享资源被配置成监测反应。在一些实施方案中，该装置包含控制部件(control feature)，在至少一个共享资源正被任意盒舱使用时，该控制部件阻止用户访问至少两个盒舱。
在一些实施方案中，本文中提供的装置包含两个或更多个盒舱，每个盒舱包含盒舱组件。在一些实施方案中，盒舱组件包含基部组件(base assembly)。在一些实施方案中，基部组件包含多个用于接纳反应容器的接纳器。在一些实施方案中，一个或更多个盒包含反应容器。在一些实施方案中，盒舱组件包含热覆盖物组件。在一些实施方案中，热覆盖物组件包含热传递表面，该热传递表面被配置成有利于热覆盖物组件与反应容器之间的热交换。
在一些方面中，本公开内容提供了用于自动化处理核酸的装置。在一些实施方案中，如本文中所述，该装置包含至少两个用于处理核酸的盒舱(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个盒舱)。在一些实施方案中，每个盒舱可被配置成容纳盒舱组件。在一些实施方案中，盒舱组件包含基部组件和热覆盖物组件。在一些实施方案中，基部组件包含多个用于接纳反应容器的接纳器。在一些实施方案中，基部组件包含多个热电装置。在一些实施方案中，基部组件包含多个用于接纳反应容器的接纳器和多个热电装置。在一些实施方案中，每个接纳器包含与至少一个热电装置热连通的热护套(thermaljacket)。在一些实施方案中，热护套包含第一热传递表面。在一些实施方案中，第一热传递表面被配置成围绕反应容器的至少一部分以有利于反应容器与护套之间的热交换。在一些实施方案中，热覆盖物组件包含第二热传递表面。在一些实施方案中，第二热传递表面被配置成有利于覆盖物组件与反应容器之间的热交换。在一些实施方案中，该装置包含至少两个用户访问门(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个用户访问门)。在一些实施方案中，每个用户访问门提供对一个盒舱的访问。在一些实施方案中，访问一个盒舱可用于将包含反应容器的盒转移到一个盒舱中和从一个盒舱中转移出。在一些实施方案中，该装置包含至少一个光学模块。在一些实施方案中，在所述至少两个盒舱之间共享至少一个光学模块。在一些实施方案中，至少一个光学模块被配置成从盒舱组件中的反应容器收集电磁信号。在一些实施方案中，至少一个光学模块被配置成监测核酸的处理。
在一些实施方案中，本文中提供的装置包含两个或更多个盒舱，所述盒舱包含两个或更多个盒舱组件。在一些实施方案中，所述两个或更多个盒舱组件包含基部组件和热覆盖物组件。在一些实施方案中，热覆盖物组件包含第二热传递表面。在一些实施方案中，第二热传递表面包含定位于反应容器上方的多个孔。在一些实施方案中，所述多个孔为至少一个光学模块提供光路(light path)以监测核酸的处理。在一些实施方案中，至少一个光学模块通过收集电磁信号监测核酸的处理。在一些实施方案中，所收集的电磁信号包含荧光信号。在一些实施方案中，至少一个光学模块被配置成将电磁信号发射到反应容器中。在一些实施方案中，所发射的电磁信号包含激发能。在一些实施方案中，至少一个光学模块被配置成将电磁信号发射到反应容器中并从反应容器收集电磁信号。
在一些实施方案中，本文中提供的装置包含至少一个光学模块以监测核酸的处理。在一些实施方案中，至少一个光学模块被配置成由至少一个自动***(例如，1个、2个、3个、4个、5个或更多个自动***)移动。在一些实施方案中，至少一个自动***是XY***(例如，XY载台组件(stage assembly))。在一些实施方案中，至少一个自动***在至少两个盒舱组件上方的指定空间内(例如，在至少两个盒舱的热覆盖物组件上方)运行。在一些实施方案中，该装置包含在至少两个盒舱之间共享的至少一个条码扫描器(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个条码扫描器)。在一些实施方案中，至少一个条码扫描器被配置成由至少一个自动***移动。在一些实施方案中，至少一个光学模块和至少一个条码扫描器被配置成由同一自动***移动。
当结合附图考虑时，根据本发明的多种非限制性实施方案的以下详细描述，本发明的其他优点和新颖特征变得明显。在本说明书和通过引用并入的文件包含冲突和/或不一致的公开内容的情况下，以本说明书为准。
附图简述
将参照附图通过举例描述本发明的一些非限制性实施方案，所述附图是示意性的并且不旨在按比例绘制。在附图中，所示的每个相同或几乎相同的组件通常由单个数字示出。为了清楚起见，并非每个组件都标记在每个图中，在示出不是使本领域的普通技术人员理解本发明所必需的情况下，也没有显示本发明的每个实施方案的每个组件。在图中：
图1是核酸文库制备工作流程的示意图。
图2A是使用微流体盒用于自动核酸文库制备的***的图。
图2B是示出使用微流体盒用于自动核酸文库制备的***的内部组件的图。
图3是微流体盒舱组件的透视图；
图4A是微流体盒载体(carrier)组件的顶视图；
图4B是微流体盒的透视图；
图5是微流体盒的分解图；
图6是来自后透视图的图，其示出了使用微流体盒用于自动核酸文库制备的***的内部组件。
图7是来自顶视图的图，其示出了使用微流体盒用于自动核酸文库制备的***的内部组件；
图8A是示出使用微流体盒用于自动核酸文库制备的***的非限制性框架组件内的示例性XY***的图；以及
图8B是包含非限制性光学模块的示例性XY***的透视图。
发明详述
一般地提供了用于处理核酸的包含具有模块化组件(匣)和/或微流体通道的盒的***。在一些实施方案中，提供了用于自动化处理核酸以产生用于下一代测序和/或其他下游分析技术之材料的***及相关方法。在一些实施方案中，本文中描述的***包含盒，所述盒包含框架(frame)、可***到该框架中的一个或更多个匣，以及用于输送流体的通道***。在某些实施方案中，所述一个或更多个匣包含一个或更多个被配置成容纳和/或接纳流体(例如，所储存的试剂、样品)的储存器或容器。在一些情况下，所储存的试剂可包含一种或更多种冻干球(lyosphere)。本文中描述的***和方法可用于进行化学和/或生物反应，包括用于核酸处理的反应，包括聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)。在一些实施方案中，本文中提供的***和方法可用于处理核酸，如图1所示。例如，在一些实施方案中，在本文中更详细地描述的图1中示出的核酸制备方法可以以多路复用方式进行，其中多种不同的(例如，多至8种不同的)样品以自动化方式并行处理。这样的***和方法可在实验室、临床(例如，医院)或研究环境中实施。
在一些实施方案中，本文中提供的***可用于下一代测序(next generationsequencing，NGS)样品制备(例如，文库样品制备)。在一些实施方案中，本文中提供的***可用于样品质量控制。图2A和2B示出了用作实验室台式仪器的示例***200，其利用多个一次性匣(disposable cassette)、引物匣(primer cassette)和体相流体匣(bulk fluidcassette)。在一些实施方案中，该***适用于标准实验室工作台。
在一些实施方案中，***可具有触摸屏界面(例如，如图2A的示例性***中所示，该***包含触摸屏界面202)。在一些实施方案中，界面用“估计的完成时间”、“当前处理步骤”或其他指示符(indicator)显示一个或更多个盒舱中每一个的状态。在一些实施方案中，可为一个或更多个盒中的每一个创建日志文件或报告。在一些实施方案中，日志文件或报告可保存在仪器上。在一些实施方案中，可从仪器发送文本文件或输出，例如，针对所处理的盒的日期范围或针对具有特定序列号的盒。
在一些实施方案中，本文中提供的***可包含一个或更多个盒舱(例如，两个，如图2B的示例性***中所示，该***包含两个盒舱210)，其能够接纳一个或更多个核酸制备盒。在一些实施方案中，盒舱上方的空间被保留用于XY***224，以将光学模块226(和/或条码扫描器，例如，2-D条码扫描器)移动至每个盒舱的盖228(例如，加热的盖)上方。在一些实施方案中，***包含驱动光学模块226和XY***224的电子模块222。在一些实施方案中，XY***224将定位光学模块226以使其可激发容器中的材料(例如，荧光团)并收集所发出的荧光。在一些实施方案中，这将通过放置在每个容器上方的盖(例如，加热的盖)中的孔来实现。在一些实施方案中，条码扫描器将确认已将适当的盒和引物匣******中。在一些实施方案中，光学模块226将在处理样品期间(例如，在核酸扩增期间)根据需要收集来自每个盒舱中的每个盒的光信号，以检测所扩增核酸的水平。在一些实施方案中，本文中描述的***包含有助于***内组件的温度调节的元件，例如一个或更多个风扇或风扇组件(例如，图2B中所示的风扇组件220)。
在一些实施方案中，一个或更多个盒舱可以以任意组合处理核酸制备盒。在一些实施方案中，每个盒舱由例如操作者或机器人组件(robotic assembly)装载。图3示出了微流体盒舱组件300的示例性图。在一些实施方案中，当舱处于打开位置时，通过将盒放入载体板(carrier plate)370中以形成载体板组件(carrier plate assembly)304，将盒装载到舱(bay)中。在一些实施方案中，载体板本身是可从盒舱移除的独立组件。该盒舱将盒保持在相对于仪器的已知位置。在一些实施方案中，盖328(例如，加热的盖)包含一个或更多个孔330以有利于处理和/或监测在一个或更多个容器中发生的反应。在一些实施方案中，在将新盒装载到仪器上之前，可将引物匣安装到盒上。在一些实施方案中，引物匣将与盒分开包装。在一些实施方案中，可将引物匣置于盒中。在一些实施方案中，将鉴定引物匣和盒二者，使得将它们放置在仪器上允许仪器读取它们(例如，使用条码扫描器)并启动与匣相关的方案。
在一些实施方案中，在将载体安装到仪器中之前，可将体相试剂加载到载体中。在一些实施方案中，可通过仪器或远程样品加载站上的接口向用户或机器人组件通知要加载哪些试剂以及在何处加载它们。在一些实施方案中，在将具有引物匣的盒装载到仪器中之后，用户会作出选择某些反应条件(例如，多个PCR循环)和/或要在盒上运行的样品量的选择。在一些实施方案中，每个盒可具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个样品的容量。
在一些实施方案中，本文中提供的***可被配置成处理RNA。然而，在一些实施方案中，***可被配置成处理DNA。在一些实施方案中，可在***内串联或并行处理不同的核酸。在一些实施方案中，盒可以以自动化方式用于进行基因融合测定，例如，以检测ALK、RET或ROS1中的遗传改变。此类测定在本文中以及在2013年11月14日公开的美国专利申请公开号US 2013/0303461、2013年7月20日公开的美国专利申请公开号和US 2015/02011050中公开，其各自的内容通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，本文中提供的***可以以自动化方式处理来自Integrated DNA Technologies的Xgen方案或其他类似的核酸处理方案。
在一些实施方案中，盒和匣将具有用于执行特定方案所需的所有试剂。在一些实施方案中，一旦载体被装载到盒舱中，就关闭对该舱的访问门，并且任选地盖(例如，加热的盖)可自动降低。在一些实施方案中，盖(例如，加热的盖)的下降促使盒向下到加热器护套阵列上(或将盒向下放置在其上)，该加热器护套阵列符合盒中的一组一个或更多个温度受控容器中的每一个。在一些实施方案中，这将已知位置的盒垂直地放置在抽屉组件(drawerassembly)中。在一些实施方案中，盖的下降促使盒向下到一定位置，在该位置，盒中存在的旋转阀能够与控制盒中的阀的旋转位置的相应驱动器接合。在一些实施方案中，提供自动组件以确保旋转阀与其驱动器正确地接合。
在本文中提供的方法的一些实施方案中，存在于盒中(例如，在匣的容器内)的核酸样品将与冻干球混合。在一些实施方案中，冻干球将含有将附接于样品的荧光团。在一些实施方案中，在冻干球中还将存在“参考物质”，其将含有已知量的分子(例如，合成DNA)。在一些实施方案中，附接于“参考材料”的将是另一荧光团，其将在与样品荧光团不同波长下发射光。在一些实施方案中，所使用的荧光团可通过嵌入染料(例如，SYBR Green)或报道子/猝灭剂化学(例如，TaqMan等)附接于样品或“参考材料”。在一些实施方案中，在定量PCR(qPCR)循环期间，将监测两种荧光团的荧光，并随后将其用于通过比较CT方法确定样品中核酸(例如，DNA、cDNA)的量。
有利地，本文中描述的某些***可包含模块化组件(例如，匣)，其可允许定制待执行的特定反应和/或步骤。在一些实施方案中，用于进行特定类型反应的某些匣包含在盒中。例如，包含容器的匣可存在于盒中，所述容器包含用于进行PCR反应的多个步骤的不同的试剂以及冻干球。框架或盒还可包含空区域，供用户***一个或更多个包含用于在盒中进行的特定反应(或反应组)的特定流体和/或试剂的匣。例如，用户可将包含特定缓冲液、试剂、醇和/或引物的一个或更多个匣***到框架或盒中。或者，用户可将包含不同组的流体和/或试剂的不同组的匣***到框架或匣的空区域中，以进行不同的反应和/或实验。在将匣***到框架或盒中之后，它们可与通道***形成流体连接，用于输送流体以进行反应/分析。
在一些实施方案中，可通过将不同的匣***到盒中来同时或依次执行多个分析。例如，本文中描述的***和方法可有利地提供分析两个或更多个样品的能力，而无需打开***或更换盒。例如，在一些情况下，可并行进行一个或更多个样品的一个或更多个反应(例如，并行进行两个或更多个PCR反应)。这样的模块性和灵活性可允许分析多个样品，其各自可需要在单个流体***内进行一个或数个反应步骤。因此，可使用本文中描述的***和方法进行多个复杂的反应和分析。
与某些现有的流体***和方法不同，本文中所述的***和方法可以是可重复使用的(例如，可重复使用的载体板)或一次性的(例如，包含匣和多种流体组件的可消耗组件)。在一些情况下，与用于执行类似反应和实验的某些现有流体***相比，本文中描述的***可占据相对小的占位面积(footprint)。
在一些实施方案中，匣和/或盒包含与一个或更多个样品进行特定反应或分析(或一组反应或分析)所需的储存流体和/或试剂。匣的实例包含但不限于试剂匣、引物匣、缓冲液匣、废物匣、样品匣和输出匣。可使用其他合适的模块或匣。此类匣可以以在使用所存储的试剂之前防止或消除那些试剂的污染或损失的方式配置。其他优点在下面更详细地描述。
在一个实施例中，如图4A和4B中举例说明性地所示，盒400包含框架410和匣420、422、424、426、428、430、432和440。在一些实施方案中，这些匣中各自可与通道***(例如，定位在匣下方，未示出)流体地连通。在一些实施方案中，匣428(例如，试剂匣)、430(例如，试剂匣)和432(例如，试剂匣)中的至少一个可由用户***到框架410中，使得匣与通道***流体地连通。例如，在一些实施方案中，匣428、430和432中之一是含有反应缓冲液(例如，Tris缓冲液)的试剂匣。在某些实施方案中，匣428、430和/或432可包含用于反应或一组反应的一种或更多种试剂和/或反应容器。在一些实施方案中，模块440包含多个样品孔和/或输出孔(例如，被配置成接纳一个或更多个样品的样品孔)。在一些情况下，匣420、422、424和426可包含一种或更多种所储存的试剂或反应物(例如，冻干球)。例如，匣420、422、424和426各自可包含用于进行单独反应的不同组的所储存试剂或反应物。例如，匣420可包含用于进行第一PCR反应的第一组试剂，且匣422可包含用于进行第二PCR反应的第二组试剂。第一和第二反应可同时(例如，并行)或依次进行。
在一些实施方案中，如图4A中举例说明性地所示，载体板组件480包含载体板470和包含模块450、452、454、456、458和460的附加匣(additional cassette)。在一个示例性实施方案中，匣450、452、454、456、458和460可各自包含一种或更多种所储存的试剂和/或可被配置和布置成接纳一种或更多种流体(例如，模块458可以是被配置成收集反应废液的废物模块)。在一些实施方案中，匣450、452、454、456、458和460中的一个或更多个可以是可再填充的。
图5是根据一组实施方案的示例性盒500的分解图。盒500包含引物盒510和引物盒515，其可***到框架520中的一个或更多个开口中。盒500还包含流体层组件(fluidicslayer assembly)540，其包含与框架520相邻且不整合的通道***。在一些实施方案中，匣532组(例如，包含一个或更多个引物匣、缓冲液匣、试剂匣和/或废物匣，每个任选地包含一个或更多个容器)、反应匣534组(其包含反应容器)、输入/输出匣533(其包含样品输入容器536和输出容器538)可***到框架520中的一个或更多个开口中。在一些实施方案中，匣500包含阀板550。在一些实施方案中，阀板550连接(例如，卡扣(snap))到框架520中并将框架520中的流体层组件540和匣532、533和534保持就位。在某些实施方案中，如本文中所述，匣500包含阀560和多个密封件565。在一些情况下，框架520和/或一个或更多个模块可被覆盖物570、572和/或574覆盖。
图6中示出的是包含两个盒舱610的示例***600的后透视图。在一些实施方案中，如本文中所述的***或装置可包含两个或更多个盒舱(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多个盒舱)。本文中描述的***或装置包含一个或更多个在盒舱之间共享的共享资源。这样的共享资源(例如，光学模块)可由电子模块622驱动。电子模块可驱动***或装置内的附加元件(例如，XY***)的运行。该***或装置可包含用于启动运行和终止运行的电源开关601。在一些实施方案中，***可包含风扇组件(fan assembly)620，以辅助***内组件的温度调节。在一些实施方案中，本文中提供的装置或***包含一个或更多个风扇组件(例如，1个、2个、3个、4个或5个或更多个风扇组件)。在一些实施方案中，每个风扇组件可包含一个或更多个风扇(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多个风扇)。
如本文中所述，***或装置包含一个或更多个共享资源，其可用于监测和/或处理不同盒舱中的反应。图7中示出的是包含两个盒舱的示例***700的顶部透视图。光学模块726被显示为示例性共享资源。在该非限制性实例中，光学模块能够通过使用自动***(例如，XY***、XY载台组件)来处理和/或监测跨两个盒舱的反应。光学模块726被描述为由XY***定位，该XY***使用第一轨道723移动光学模块跨第一轴(例如，X轴)，且使用第二轨道725移动光学模块跨第二轴(例如，Y轴)。在该示例性***中，光学模块显示为在盒舱组件的加热的盖728上方的空间中运行。一旦通过XY***在特定反应容器上方对准，加热的盖中的一个或更多个孔730为光学模块提供光路以处理和/或监测容器中发生的反应。
在一些实施方案中，光学模块(例如，光学装置)被配置成允许在适当尺寸的反应容器中准确且精确地测量光谱信号。在一些实施方案中，光学模块被定位以便使得能够将激发光递送到被测量的容器中，而不将激发光明显地引入到相邻容器中。在一些实施方案中，光学模块提供足够的数值孔径以有利于捕获足够的从容器中的反应发射的所得光，以允许测量与反应中评估的活性成比例的可感知信号。
在一些实施方案中，光学模块包含一个或更多个滤光器(filter)。例如，来自例如弧光灯(arc lamp)的光源的激发波长的光可通过干涉滤光器或其他装置传递以将光的激发波长分离至透镜以用于照射容器内容物。透镜捕获由容器中的反应发出的一部分光。同样地，由光学模块检测的发射光可通过干涉滤光器传递，该干涉滤光器仅将反应中的发射光的待测量波长传递至光敏检测器(例如，光电二极管、光电倍增管或电荷-耦合装置)的面。在一些实施方案中，光学模块能够发射和/或检测一种或更多种波长的光。例如，光学模块能够从容器中的多种荧光团测量多个发射波长，例如共振能量转移探针的供体和受体发射强度，或从报告不同生物分子活性的同一样品中的不同荧光团测量。
在一些实施方案中，光学模块可适于检测和测量很多种物理信号，所述物理信号提供了期望测量的反应容器内容物的生物化学或生物物理状态的指示。在一些实施方案中，光学模块可以是光谱读取器，例如荧光读取器，其能够访问多容器组件(例如，盒、匣)的每个容器，照射其内容物，并测量多个波段中由容器内容物发出的光强度。在一些实施方案中，使用本领域中已知的方法将荧光信号的变化确定为在两种不同发射波长下的荧光比值。除了可能的不同光谱模态(包含吸光度、荧光、共振能量转移、时间分辨荧光或共振能量转移、偏振荧光、或其他单光谱或多光谱发光或荧光模态)，光学模块可很容易地适应以使用新荧光团，例如被开发与红外波长光(例如，量子点)一起使用的那些。
在一些实施方案中，本文中提供的装置可被配置成根据共享资源(例如，光学模块)的使用来允许或拒绝对一个或更多个盒舱的访问。在一些实施方案中，该装置被配置成当盒舱正使用共享资源(例如，光学模块)时阻止访问盒舱。在一些实施方案中，该装置被配置成当共享资源(例如，光学模块)未正被盒舱使用时阻止访问盒舱。在一些实施方案中，该装置被配置成如果光学模块正在被一个或更多个盒舱使用则阻止访问一个或更多个盒舱。在一些实施方案中，当光学模块在装置内运行时，阻止访问一个或更多个盒舱可有利地使光的引入(例如，来自相邻舱或来自外部环境的光)最小化或消除。例如，从相对于装置本身而言外部的光源向装置中引入光可干扰光学模块对反应的监测。在一些实施方案中，该装置被配置成如果共享资源(例如，光学模块)未被一个或更多个盒舱使用则允许访问一个或更多个盒舱。
在一些实施方案中，为了移动能够访问多容器组件(例如，盒、匣)的一个或更多个容器的光学装置，可通过机器人载台组件(例如，自动XY***)定位光学模块，该组件可安装在容器上方或其他合适的布置中。在利用可在单光子检测模式下运行的光电检测器的一些实施方案中，可仅需要光学模块在容器上方停留非常短暂的时间来获得光谱读数。例如，一些光谱读数器能够处理通过并行运行大量小型化测定或反应而产生的通量和灵敏度要求。
图8A示出了示例***800的前透视图，其示出了非限制性框架组件内的自动***(例如，XY***)。在该实例中，使用自动双轴***将光学模块826定位在***内。***使用第一轨道823以将光学模块沿第一轴(例如，X轴)定位在特定点处。在附接点821处附接至第一轨道的第二轨道825将光学模块沿第二轴(例如，Y轴)定位在特定点处。在该实例中，沿第一轴定位将确定哪个盒舱正在使用光学模块，并且沿两个轴定位将确定给定盒舱中的哪个容器正被光学模块监测和/或处理。图8B中示出了包含示例性光学模块826的非限制性XY***824的隔离视图。在该实例中，示例性光学模块826被显示为包含条码读取器827。如所描述的，XY***824使用第一轨道823和第二轨道825定位在***内，其中第一和第二轨道附接在附接点821处。
扩增(AMP)方法
本文中描述了确定与已知靶核苷酸序列邻接的核苷酸序列的方法。该方法可使用本文中公开的***以自动化方式实现。传统的测序方法随机地(例如，“鸟枪”测序)或在用于设计引物的两个已知序列之间产生序列信息。相比之下，在一些实施方案中，本文中所述的某些方法允许以高水平的特异性和灵敏度确定已知序列的单个区域的上游或下游的核苷酸序列(例如，测序)。
在一些实施方案中，本文中提供的***可配置成例如以自动化方式实施使用下一代测序技术在确定核苷酸序列之前富集特定核苷酸序列的方法。在一些实施方案中，本文中提供的方法可涉及富集包含脱氧核糖核酸(DNA)的样品。在一些实施方案中，本文中提供的方法包括：(a)将包含已知靶核苷酸序列的靶核酸与通用寡核苷酸尾部衔接子(tail-adapter)连接；(b)用第一衔接子引物和第一靶特异性引物扩增靶核酸的一部分和通用寡核苷酸尾部衔接子的扩增链；(c)用第二衔接子引物和第二靶特异性引物扩增从步骤(b)得到的扩增子的一部分；以及(d)将DNA溶液转移给用户。在一些实施方案中，所述方法的一个或更多个步骤可在本文中提供的盒的不同容器内进行。在一些实施方案中，盒中的微流体通道和阀有利于反应材料/流体从盒中的一个容器转移到另一个容器，以允许反应以自动化方式进行。在一些实施方案中，随后可使用下一代测序技术用第一和第二测序引物对DNA溶液进行测序。
在一些实施方案中，使用本文中提供的***处理的样品包含基因组DNA。在一些实施方案中，包含基因组DNA的样品包含在步骤(a)之前的片段化步骤。在一些实施方案中，每个连接和扩增步骤可任选地包含随后的纯化步骤(例如，步骤(a)与步骤(b)之间的样品纯化，步骤(b)与步骤(c)之间的样品纯化，和/或在步骤(c)之后的样品纯化)。例如，富集包含基因组DNA的样品的方法可包括：(a)基因组DNA片段化；(b)将包含已知靶核苷酸序列的靶核酸与通用寡核苷酸尾部衔接子连接；(c)连接后样品纯化；(d)用第一衔接子引物和第一靶特异性引物扩增靶核酸的一部分和通用寡核苷酸尾部衔接子的扩增链；(e)扩增后样品纯化；(f)用第二衔接子引物和第二靶特异性引物扩增从步骤(d)得到的扩增子的一部分；(g)扩增后样品纯化；以及(h)将纯化的DNA溶液转移给用户。在一些实施方案中，所述方法的步骤可在本文中提供的盒的不同容器内进行。在一些实施方案中，盒中的微流体通道和阀以自动化方式有利于反应材料/流体从盒中的一个容器转移到另一个容器。随后可使用下一代测序技术用第一和第二测序引物对纯化的样品进行测序。
在一些实施方案中，本文中提供的***和方法可用于处理核酸，如图1中的示例性工作流程所示。提供核酸样品120。在一些实施方案中，样品包含RNA。在一些实施方案中，样品包含DNA(例如，双链互补DNA(cDNA)和/或双链基因组DNA(gDNA)102)。在一些实施方案中，使核酸样品经历包含核酸末端修复(end repair)和/或dA加尾(dA tailing)的步骤102。在一些实施方案中，使核酸样品经历包含衔接子连接(adapter ligation)的步骤104。在一些实施方案中，通用寡核苷酸衔接子122与核酸样品中的一种或更多种核酸连接。在一些实施方案中，连接步骤包含平末端连接。在一些实施方案中，连接步骤包含黏性末端连接。在一些实施方案中，连接步骤包含突出端连接。在一些实施方案中，连接步骤包含TA连接。在一些实施方案中，进行dA加尾步骤102以在核酸样品中产生与通用寡核苷酸衔接子中的突出端互补的突出端(例如，TA连接)。在一些实施方案中，将通用寡核苷酸衔接子与核酸样品中的一个或更多个核酸的两端连接，以产生侧翼为通用寡核苷酸衔接子的核酸124。在一些实施方案中，使用衔接子引物130和第一靶特异性引物132进行初始轮的扩增。在一些实施方案中，使用衔接子引物和第二靶特异性引物134对扩增的样品进行第二轮的扩增。在一些实施方案中，第二靶特异性引物相对于第一靶特异性引物是嵌套的。在一些实施方案中，第二靶特异性引物包含位于杂交序列5’的另外序列(例如，共同序列)，其可包含条码(barcode)、索引(index)、衔接子序列或测序引物位点。在一些实施方案中，第二靶特异性引物还与另外的引物接触，所述引物与第二靶特异性引物的共同序列杂交，如134所示。在一些实施方案中，第二轮的扩增产生适用于核酸测序(例如，下一代测序方法)的核酸126。
在一些实施方案中，本文中提供的***和方法可用于处理核酸，如以下中所述：于2017年9月15日提交的PCT国际申请No.PCT/US2017/051924，并且其根据35U.S.C.§119(e)要求于2016年9月15日提交的美国临时专利申请No.62/395,339的优先权；以及2017年9月15日提交的PCT国际申请No.PCT/US2017/051927，并且其根据35U.S.C.§119(e)要求于2016年9月15日提交的美国临时专利申请No.62/395,347的优先权，其中与核酸文库制备相关的每一项的全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，使用本文中提供的***处理的样品包含核糖核酸(RNA)。在一些实施方案中，本文中提供的***可用于通过以下方法处理RNA：(a)在杂交条件下使包含已知靶核苷酸序列的靶核酸分子与随机引物群接触；(b)进行模板依赖性延伸反应，该反应由杂交的随机引物引发，并使用杂交位点下游的靶核酸分子的部分作为模板；(c)在杂交条件下使步骤(b)的产物与初始靶特异性引物接触；(d)进行模板依赖性延伸反应，该反应由杂交的初始靶特异性引物引发并使用靶核酸分子作为模板；(e)对核酸进行末端修复、磷酸化和腺苷酸化；(f)将包含已知靶核苷酸序列的靶核酸与通用寡核苷酸尾部衔接子连接；(g)用第一衔接子引物和第一靶特异性引物扩增靶核酸的一部分和通用寡核苷酸尾部衔接子的扩增链；(h)用第二衔接子引物和第二靶特异性引物扩增从步骤(g)得到的扩增子的一部分；以及(i)将cDNA溶液转移给用户。在一些实施方案中，所述方法的一个或更多个步骤可在本文中提供的盒的不同容器内进行。在一些实施方案中，随后可使用下一代测序技术用第一和第二测序引物对cDNA溶液进行测序。
在一些实施方案中，每个连接和扩增步骤可任选地包含随后的样品纯化步骤(例如，步骤(f)与步骤(g)之间的样品纯化步骤，步骤(g)与步骤(h)之间的样品纯化步骤，和/或步骤(h)之后的样品纯化)。例如，富集包含RNA之样品的方法可包含：(a)在杂交条件下使包含已知靶核苷酸序列的靶核酸分子与随机引物群接触；(b)进行模板依赖性延伸反应，该反应由杂交的随机引物引发，并使用杂交位点下游的靶核酸分子的部分作为模板；(c)在杂交条件下使步骤(b)的产物与初始靶特异性引物接触；(d)进行模板依赖性延伸反应，该反应由杂交的初始靶特异性引物引发并使用靶核酸分子作为模板；(e)对核酸进行末端修复、磷酸化和腺苷酸化；(f)将包含已知靶核苷酸序列的靶核酸与通用寡核苷酸尾部衔接子连接；(g)连接后样品纯化；(h)用第一衔接子引物和第一靶特异性引物扩增靶核酸的一部分和通用寡核苷酸尾部衔接子的扩增链；(i)扩增后样品纯化；(j)用第二衔接子引物和第二靶特异性引物扩增从步骤(h)得到的扩增子的一部分；(k)扩增后样品纯化；以及(l)将纯化的cDNA溶液转移给用户。在一些实施方案中，所述方法的一个或更多个步骤可在本文中提供的盒的不同容器内进行。随后可使用下一代测序技术用第一和第二测序引物对纯化的样品进行测序。
在一些实施方案中，本文中提供的***可被配置成例如以自动化方式实施富集核苷酸序列的方法，所述核苷酸序列包含未知核苷酸序列的邻近区域下游的已知靶核苷酸序列(例如，包含含有未知序列的5’区和含有已知序列的3’区的核苷酸序列)。在一些实施方案中，该方法包括：(a)在杂交条件下使包含已知靶核苷酸序列的靶核酸分子与初始靶特异性引物接触；(b)进行模板依赖性延伸反应，该反应由杂交的初始靶特异性引物引发并使用靶核酸分子作为模板；(c)在杂交条件下使步骤(b)的产物与加尾的随机引物群接触；(d)进行模板依赖性延伸反应，该反应由杂交的加尾的随机引物引发，并使用杂交位点下游的靶核酸分子的部分作为模板；(e)用第一尾部引物和第一靶特异性引物扩增靶核酸分子的一部分和加尾的随机引物序列；(f)用第二尾部引物和第二靶特异性引物扩增从步骤(e)得到的扩增子的一部分；以及(g)将cDNA溶液转移给用户。随后可使用下一代测序技术用第一和第二测序引物对cDNA溶液进行测序。在一些实施方案中，加尾的随机引物群包含单链寡核苷酸分子，其具有与第一测序引物相同的5’核酸序列和包含约6至约12个随机核苷酸的3’核酸序列。在一些实施方案中，第一靶特异性引物包含可在退火温度下与靶核酸的已知靶核苷酸序列特异性退火的核酸序列。在一些实施方案中，第二靶特异性引物包含3’部分，其包含可与从步骤(e)得到的扩增子所包含的已知靶核苷酸序列的一部分特异性退火的核酸序列；以及包含与第二测序引物相同的核酸序列的5’部分，并且第二靶特异性引物相对于第一靶特异性引物是嵌套的。在一些实施方案中，第一尾部引物包含与加尾的随机引物相同的核酸序列。在一些实施方案中，第二尾部引物包含与第一测序引物的一部分相同的核酸序列，并且相对于第一尾部引物是嵌套的。在一些实施方案中，该方法的一个或更多个步骤可在本文中提供的盒的不同容器内进行。
在一些实施方案中，本文中提供的***可被配置成例如以自动化方式实施富集核苷酸序列的方法，所述核苷酸序列包含未知核苷酸序列的邻近区域上游的已知靶核苷酸序列(例如，包含含有已知序列的5’区和含有未知序列的3’区的核苷酸序列)。在一些实施方案中，该方法包括：(a)在杂交条件下使包含已知靶核苷酸序列的靶核酸分子与加尾的随机引物群接触；(b)进行模板依赖性延伸反应，该反应由杂交加尾的随机引物引发，并使用杂交位点下游的靶核酸分子部分作为模板；(c)在杂交条件下使步骤(b)的产物与初始靶特异性引物接触；(d)进行模板依赖性延伸反应，该反应由杂交的初始靶特异性引物引发并使用靶核酸分子作为模板；(e)用第一尾部引物和第一靶特异性引物扩增靶核酸分子的一部分和加尾的随机引物序列；(f)用第二尾部引物和第二靶特异性引物扩增从步骤(e)得到的扩增子的一部分；以及(g)将cDNA溶液转移给用户。随后可使用下一代测序技术用第一和第二测序引物对cDNA溶液进行测序。在一些实施方案中，加尾的随机引物群包含单链寡核苷酸分子，其具有与第一测序引物相同的5’核酸序列和包含约6至约12个随机核苷酸的3’核酸序列。在一些实施方案中，第一靶特异性引物包含可在退火温度下与靶核酸的已知靶核苷酸序列特异性退火的核酸序列。在一些实施方案中，第二靶特异性引物包含3’部分，其包含可与从步骤(c)得到的扩增子所包含的已知靶核苷酸序列的一部分特异性退火的核酸序列；以及包含与第二测序引物相同的核酸序列的5’部分，并且第二靶特异性引物相对于第一靶特异性引物是嵌套的。在一些实施方案中，第一尾部引物包含与加尾的随机引物相同的核酸序列。在一些实施方案中，第二尾部引物包含与第一测序引物的一部分相同的核酸序列，并且相对于第一尾部引物是嵌套的。在一些实施方案中，所述方法的一个或更多个步骤可在本文中提供的盒的不同容器内进行。在一些实施方案中，该方法还包含在初始靶特异性引物延伸之后使样品与RNA酶接触的步骤。在一些实施方案中，加尾的随机引物可形成发夹环结构。在一些实施方案中，初始靶特异性引物和第一靶特异性引物是相同的。在一些实施方案中，加尾的随机引物还包含条码部分，其包含位于与第一测序引物相同的5’核酸序列与包含6至12个随机核苷酸的3’核酸序列之间的6至12个随机核苷酸。
通用寡核苷酸尾部衔接子
本文中使用的术语“通用寡核苷酸尾部衔接子”是指由两条链(阻断链和扩增链)构成并包含第一可连接双链末端和第二未配对末端的核酸分子。通用寡核苷酸尾部衔接子的阻断链包含5’双链体部分。扩增链包含未配对的5’部分、3’双链体部分、3’T突出端、以及与第一和第二测序引物相同的核酸序列。阻断链和扩增链的双链体部分基本上互补，并形成包含3’T突出端的第一可连接双链体末端，并且双链体部分具有足够的长度以在连接温度下保持双链体形式。
在一些实施方案中，包含与第一和第二测序引物相同的核酸序列的扩增链的部分可至少部分地包含在扩增链的5’未配对部分中。
在一些实施方案中，通用寡核苷酸尾部衔接子可包含双链体部分和未配对部分，其中未配对部分仅包含扩增链的5’部分，即阻断链的整体是双链体部分。
在一些实施方案中，通用寡核苷酸尾部衔接子可具有“Y”形，即未配对部分可包含未配对的阻断链和扩增链二者的部分。阻断链的未配对部分可以比扩增链的未配对部分更短、更长或与其长度相等。在一些实施方案中，阻断链的未配对部分可以比扩增链的未配对部分更短。Y形通用寡核苷酸尾部衔接子具有以下优点：在PCR方案期间，阻断链的未配对部分不会经历3’延伸。
在一些实施方案中，通用寡核苷酸尾部衔接子的阻断链还可包含3’未配对部分，其基本上不与扩增链的5’未配对部分互补；并且其中阻断链的3’未配对部分基本上不与任何引物互补或基本上不与任何引物相同。在一些实施方案中，通用寡核苷酸尾部衔接子的阻断链还可包含3’未配对部分，其在退火温度下不与扩增链的5’未配对部分特异性退火；并且其中阻断链的3’未配对部分在退火温度下不会与任何引物或其互补物特异性退火。
第一扩增步骤
本文中使用的术语“第一靶特异性引物”是指包含核酸序列的单链寡核苷酸，所述核酸序列可在合适的退火条件下与具有靶核酸特征链的核酸模板特异性退火。
在一些实施方案中，引物(例如，靶特异性引物)可包含5’标签序列部分。在一些实施方案中，反应中存在的多种引物(例如，所有第一靶特异性引物)可包含相同的5’标签序列部分。在一些实施方案中，在多路复用PCR反应中，不同的引物种类可以以脱靶方式彼此相互作用，导致引物延伸并随后通过DNA聚合酶扩增。在这样的一些实施方案中，这些引物二聚体倾向于短，并且它们的高效扩增可超过反应并占优势，导致所期望靶序列的扩增差。因此，在一些实施方案中，在引物中(例如，在靶特异性引物上)包含5’标签序列可导致形成在两端含有相同互补尾部的引物二聚体。在一些实施方案中，在随后的扩增循环中，此类引物二聚体将变性为单链DNA引物二聚体，每个在其两端包含由5’标签引入的互补序列。在一些实施方案中，代替与这些单链DNA引物二聚体退火的引物，可发生分子内发夹(一种锅柄样结构(panhandle like structure))形成，这是由于同一引物二聚体分子上的互补标签的最近可接近性而不是在不同分子上与新引物的分子相互作用。因此，在一些实施方案中，这些引物二聚体可被低效地扩增，使得引物不会被二聚体指数消耗用于扩增；相反，标记的引物可保持高且足够的浓度，用于靶序列的所期望的特异性扩增。在一些实施方案中，引物二聚体的积累在多路复用扩增的情况下可以是不期望的，因为它们竞争并消耗反应中的其他试剂。
在一些实施方案中，5’标签序列可以是富含GC的序列。在一些实施方案中，5’标签序列可包含至少50％GC含量、至少55％GC含量、至少60％GC含量、至少65％GC含量、至少70％GC含量、至少75％GC含量、至少80％GC含量或更高的GC含量。在一些实施方案中，标签序列可包含至少60％GC含量。在一些实施方案中，标签序列可包含至少65％GC含量。
本文中使用的术语“第一衔接子引物”是指包含与第一测序引物的5’部分相同的核酸序列的核酸分子。因为第一尾部衔接子引物因此与扩增链的至少一部分序列相同(与互补相反)，它将不能与通用寡核苷酸尾部衔接子本身的任何部分特异性退火。
在第一扩增步骤的第一PCR扩增循环中，第一靶特异性引物可与包含已知靶核苷酸序列的任何核酸的模板链特异性退火。取决于设计第一靶特异性引物的取向，将已知靶核苷酸序列上游或下游的序列合成为与模板链互补的链。如果在PCR的延伸阶段期间，模板链的5’末端终止于连接的通用寡核苷酸尾部衔接子，则新合成的产物链的3’末端将包含与第一尾部衔接子引物互补的序列。在随后的PCR扩增循环中，第一靶特异性引物和第一尾部衔接子引物都能够与靶核酸序列的适当链特异性退火，并且已知的核苷酸靶序列与通用寡核苷酸尾部衔接子之间的序列可被扩增(即，复制)。
第二扩增步骤
本文中使用的术语“第二靶特异性引物”是指单链寡核苷酸，其包含含有可与由前述扩增步骤产生的扩增子所包含的已知靶核苷酸序列的一部分特异性退火的核酸序列的3’部分；以及含有与第二测序引物相同的核酸序列的5’部分。第二靶特异性引物可通过另外的引物(例如，具有3’测序衔接子/索引序列的引物)进一步接触，所述引物与第二靶特异性引物的共同序列杂交。在一些实施方案中，另外的引物可包含位于杂交序列5’的另外的序列，其可包含条码、索引、衔接子序列或测序引物位点。在一些实施方案中，另外的引物是通用测序衔接子/索引引物。第二靶特异性引物相对于第一靶特异性引物是嵌套的。在一些实施方案中，第二靶特异性引物相对于第一靶特异性引物嵌套至少3个核苷酸，例如3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、或者15个或更多个核苷酸。
在一些实施方案中，反应中存在的所有第二靶特异性引物包含相同的5’部分。在一些实施方案中，第二靶特异性引物的5’部分可用于抑制引物二聚体，如针对上文中所述的第一靶特异性引物的5’标签所述。
在一些实施方案中，第一和第二靶特异性引物与靶核酸的相同链基本上互补。在一些实施方案中，与已知的靶序列特异性退火的第一和第二靶特异性引物的部分可包含已知靶核苷酸序列的总共至少20个独特碱基，例如20个或更多个独特碱基、25个或更多个独特碱基、30个或更多个独特碱基、35个或更多个独特碱基、40个或更多个独特碱基、或者50个或更多个独特碱基。在一些实施方案中，与已知的靶序列特异性退火的第一和第二靶特异性引物的部分可包含已知的靶核苷酸序列的总共至少30个独特碱基。
本文中使用的术语“第二衔接子引物”是指包含与第一测序引物的一部分相同的核酸序列的核酸分子，并且相对于第一衔接子引物是嵌套的。因为第二尾部衔接子引物因此与扩增链的至少一部分序列相同(与互补相反)，其将不能与通用寡核苷酸尾部衔接子本身的任何部分特异性退火。在一些实施方案中，第二衔接子引物与第一测序引物相同。
第二衔接子引物应相对于第一衔接子引物是嵌套的，即第一衔接子引物包含与扩增链相同的核酸序列，其不包含在第二衔接子引物中并且比与第二衔接子引物所包含的扩增链相同的任何序列更接近扩增引物的5’末端。在一些实施方案中，第二衔接子引物嵌套至少3个核苷酸，例如3个核苷酸、4个核苷酸、5个核苷酸、6个核苷酸、7个核苷酸、8个核苷酸、9个核苷酸、10个核苷酸或更多。
在一些实施方案中，第一衔接子引物可包含与通用寡核苷酸尾部衔接子的扩增链的约20个最5’端碱基相同的核酸序列，并且第二衔接子引物可包含与通用寡核苷酸尾部衔接子的扩增链的约30个碱基相同的核酸序列，其具有5’碱基，其是位于扩增链的5’端的3’的至少3个核苷酸。
在一些实施方案中，可使用嵌套的引物组。在一些实施方案中，使用嵌套的衔接子引物消除了产生可扩增的最终扩增子的可能性(例如，在桥式PCR或乳液PCR期间)但不能使用某些技术高效测序。在一些实施方案中，可使用半嵌套引物组。
样品纯化步骤
在一些实施方案中，可在方法的任何适当步骤之前和/或之后从酶、引物或缓冲液组分中分离靶核酸和/或其扩增产物。可使用任何合适的分离核酸的方法。在一些实施方案中，分离可包含固相可逆固定化(Solid Phase Reversible Immobilization，SPRI)净化。用于SPRI净化的方法是本领域中公知的，例如Agencourt AMPure XP-PCR Purification(目录号A63880，Beckman Coulter；Brea，CA)。在一些实施方案中，酶可通过热处理失活。
在一些实施方案中，可使用适当的方法(例如，纯化、消化等)从核酸制备物中除去未杂交的引物。在一些实施方案中，核酸酶(例如，核酸外切酶I)用于从制备物中除去引物。在一些实施方案中，此类核酸酶在引物消化后被热失活。一旦核酸酶失活，可将另一组引物与其他合适的组分(例如，酶、缓冲液)一起添加以进行进一步的扩增反应。
测序
在一些方面中，本文中描述的技术涉及富集核酸样品用于寡核苷酸测序的方法。在一些实施方案中，可通过下一代测序方法进行测序。本文中使用的“下一代测序”是指寡核苷酸测序技术，其在高于通过常规测序方法(例如，Sanger测序)可能的速率的速率下能够对寡核苷酸进行测序，因为并行进行和读出数千至数百万个测序反应。下一代测序方法/平台的一些非限制性实例包括大规模平行标识测序(Massively parallel SignatureSequencing)(Lynx Therapeutics)；454焦磷酸测序(454Life Sciences/RocheDiagnostics)；固相可逆染料-终止子测序(Solexa/Illumina)；SOLiD技术(AppliedBiosystems)；离子半导体测序(ION Torrent)；DNA纳米球测序(Complete Genomics)；以及可从Pacific Biosciences、Intelligen Bio-systems和Oxford Nanopore Technologies获得的技术。在一些实施方案中，测序引物可包含与所选择的下一代测序方法相容的部分。下一代测序技术以及相关测序引物的限制和设计参数是本领域中公知的(参见，例如，Shendure等，“Next-generation DNA sequencing，”Nature，2008，第26卷，第10期，1135-1145；Mardis，“The impact of next-generation sequencing technology ongenetics”，Trends in Genetics，2007，第24卷，第3期，第133至141页；Su等，“Next-generation sequencing and its applications in molecular diagnostics”，ExpertRev Mol Diagn，2011，11(3)：333-43；Zhang等，“The impact of next-generationsequencing on genomics”，J Genet Genomics，2011，38(3)：95-109；(Nyren，P等，AnalBiochem 208：17175(1993)；Bentley，D.R.Curr Opin Genet Dev 16：545-52(2006)；Strausberg，R.L.等，Drug Disc Today 13：569-77(2008)；美国专利No.7,282,337；美国专利No.7,279,563；美国专利No.7,226,720；美国专利No.7,220,549；美国专利No.7,169,560；美国专利No.6,818,395；美国专利No.6,911,345；美国公开号2006/0252077；2007/0070349；以及20070070349；其通过引用整体并入本文)。
在一些实施方案中，测序步骤依赖于使用第一和第二测序引物。在一些实施方案中，选择第一和第二测序引物以与本文中所述的下一代测序方法相容。
将测序读取与基因组和/或cDNA序列的已知序列数据库比对的方法是本领域中公知的，并且该过程的软件可商购获得。在一些实施方案中，没有完整地定位于野生型序列数据库的读取(较少的测序引物和/或衔接子核苷酸序列)可以是基因组重排或大的得失位突(indel mutation)变。在一些实施方案中，包含定位于基因组中多个位置的序列的读取(较少的测序引物和/或衔接子核苷酸序列)可以是基因组重排。
AMP引物
在一些实施方案中，设计四种类型的引物(例如，第一和第二靶特异性引物以及第一和第二衔接子引物)，使得它们将在约61至72℃(例如，约61至69℃、约63至69℃、约63至67℃、约64至66℃)的退火温度下与其互补序列特异性退火。在一些实施方案中，设计四种类型的引物使得它们在低于72℃的退火温度下与其互补序列特异性退火。在一些实施方案中，设计四种类型的引物使得它们在低于70℃的退火温度下与其互补序列特异性退火。在一些实施方案中，设计四种类型的引物使得它们在低于68℃的退火温度下与其互补序列特异性退火。在一些实施方案中，设计四种类型的引物使得它们在约65℃的退火温度下与其互补序列特异性退火。在一些实施方案中，本文中提供的***被配置成改变容器温度(例如，通过在不同温度范围之间循环)以有利于引物退火。
在一些实施方案中，与已知靶核苷酸序列特异性退火的靶特异性引物的部分将在约61至72℃的温度下特异性退火，例如，约61至69℃、约63至69℃、约63至67℃、约64至66℃。在一些实施方案中，与已知的靶核苷酸序列特异性退火的靶特异性引物的部分将在PCR缓冲液中在约65℃的温度下特异性退火。
在一些实施方案中，本文中所述的引物和/或衔接子不能包含经修饰碱基(例如，引物和/或衔接子不能包含阻断3’胺)。
核酸延伸、扩增和PCR
在一些实施方案中，本文中描述的方法包含延伸方案或步骤。在此类实施方案中，延伸可从一个或更多个杂交的加尾的随机引物使用所述引物与之杂交的核酸分子作为模板进行。本文中描述了延伸步骤。在一些实施方案中，一个或更多个加尾的随机引物可与样品中的基本上所有核酸杂交，其中许多核酸可不包含已知靶核苷酸序列。因此，在一些实施方案中，由于与不包含已知靶核苷酸序列的模板杂交，可发生随机引物的延伸。
在一些实施方案中，本文中描述的方法可涉及聚合酶链式反应(PCR)扩增方案，其涉及一个或更多个扩增循环。本文中描述的方法的扩增步骤可各自包含PCR扩增方案，即一组聚合酶链式反应(PCR)扩增循环。在一些实施方案中，本文中提供的***被配置成改变容器温度(例如，通过在不同温度范围之间循环)以有利于不同的PCR步骤，例如解链、退火、延伸等。
在一些实施方案中，本文中提供的***被配置成以自动化方式实施扩增方案。本文中使用的术语“扩增方案”是指特异性扩增(提高其丰度)目的核酸的过程。在一些实施方案中，当先前聚合酶延伸的产物充当连续轮次延伸的模板时，发生指数扩增。在一些实施方案中，根据本文中公开的方法的PCR扩增方案可包含至少一个，并且在一些情况下至少5个或更多个迭代循环。在一些实施方案中，每个迭代循环包含以下步骤：1)链分离(例如，热变性)；2)寡核苷酸引物与模板分子退火；以及3)退火引物的核酸聚合酶延伸。应当理解，可使用这些步骤中的每一个中涉及的任何合适的条件和时间。在一些实施方案中，所选择的条件和时间可取决于长度、序列含量、解链温度、二级结构特征或与反应中使用的核酸模板和/或引物相关的其他因素。在一些实施方案中，根据本文中所述方法的扩增方案在热循环仪中进行，该热循环仪中的许多是可商购的。
在一些实施方案中，核酸延伸反应涉及使用核酸聚合酶。本文中使用的短语“核酸聚合酶”是指催化核苷三磷酸的模板依赖性聚合以形成与模板核酸序列互补的引物延伸产物的酶。核酸聚合酶在退火的引物的3’端开始合成，并在朝向模板的5’端的方向上进行。许多核酸聚合酶是本领域中已知的并且是可商购的。一组核酸聚合酶是热稳定的，即它们在经受足以使互补核酸的退火链变性的温度(例如94℃，或有时更高)之后保持功能。用于扩增的方案的一个非限制性实例涉及在以下条件下使用聚合酶(例如，Phoenix Taq，VeraSeq)：98℃持续30秒，随后是14至22个循环，每个循环包含在98℃下解链10秒，随后在68℃下退火30秒，接着在72℃下延伸3分钟，然后在4℃下保持反应。然而，也可使用其他适当的反应条件。在一些实施方案中，可调节退火/延伸温度以引起盐浓度的差异(例如，高3℃以得到更高的盐浓度)。在一些实施方案中，减慢升温速率(例如，1℃/s、0.5℃/s、0.28℃/s、0.1℃/s或更慢)，例如，从98℃至65℃，改善了高度多路复用样品的引物性能和覆盖均匀性。在一些实施方案中，本文中提供的***被配置成改变容器温度(例如，通过在不同温度范围之间循环，具有受控的升温或降温速率)以有利于扩增。
在一些实施方案中，核酸聚合酶在酶进行模板依赖性延伸的条件下使用。在一些实施方案中，核酸聚合酶是DNA聚合酶I、Taq聚合酶、Phoenix Taq聚合酶、Phusion聚合酶、T4聚合酶、T7聚合酶、Klenow片段、Klenow exo-、phi29聚合酶、AMV逆转录酶、M-MuLV逆转录酶、HIV-1逆转录酶、VeraSeq ULtra聚合酶、VeraSeq HF 2.0聚合酶、EnzScript、或其他合适的聚合酶。在一些实施方案中，核酸聚合酶不是逆转录酶。在一些实施方案中，核酸聚合酶作用于DNA模板。在一些实施方案中，核酸聚合酶作用于RNA模板。在一些实施方案中，延伸反应涉及对RNA进行逆转录以产生互补DNA分子(RNA依赖性DNA聚合酶活性)。在一些实施方案中，逆转录酶是小鼠莫洛尼鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus，M-MLV)聚合酶、AMV逆转录酶、RSV逆转录酶、HIV-1逆转录酶、HIV-2逆转录酶、或其他合适的逆转录酶。
在一些实施方案中，核酸扩增反应涉及包含链分离步骤的循环，其通常包含加热反应混合物。本文中使用的术语“链分离”或“对链进行分离”意指处理核酸样品，使得互补的双链分子分离成可用于与寡核苷酸引物退火的两条单链。在一些实施方案中，根据本文中所述方法的链分离通过将核酸样品加热至高于其解链温度(Tm)来实现。在一些实施方案中，对于在适合于核酸聚合酶的反应制备物中的含有核酸分子的样品，加热至94℃足以实现链分离。在一些实施方案中，合适的反应制剂含有一种或更多种盐(例如，1至100mM KCl，0.1至10mM MgCl2)、至少一种缓冲剂(例如，1至20mM Tris-HCl)和载体(例如，0.01至0.5％BSA)。合适缓冲液的非限制性实例包含50mM KCl，10mM Tris-HCl(在25℃下pH 8.8)，0.5至3mM MgCl2和0.1％BSA。
在一些实施方案中，核酸扩增涉及将引物与具有靶核酸特征链的核酸模板退火。在一些实施方案中，靶核酸链可用作模板核酸。
本文中使用的术语“退火”是指在两个核酸之间形成一个或更多个互补碱基对。在一些实施方案中，退火涉及杂交在一起的两条互补或基本上互补的核酸链。在一些实施方案中，在延伸反应的情况下，退火涉及引物与模板的杂交，从而形成模板依赖性聚合酶的引物延伸底物。在一些实施方案中，退火(例如，在引物与核酸模板之间)的条件可基于引物的长度和序列而变化。在一些实施方案中，退火的条件基于引物的Tm(例如，所计算的Tm)。在一些实施方案中，延伸方案的退火步骤涉及在链分离步骤后将温度降低至基于引物的Tm(例如，所计算的Tm)的温度，持续足以允许这种退火的时间。在一些实施方案中，可使用许多算法中的任意一种来确定Tm(例如，OLIGOTM(Molecular Biology Insights Inc.Colorado)引物设计软件和VENTRO NTITM(Invitrogen，Inc.California)引物设计软件和可在互联网上获自的程序，包括Primer3、Oligo Calculator和NetPrimer(Premier Biosoft；Palo Alto，CA；并且可免费获自万维网(例如，在premierbiosoft.com/netprimer/netprlaunch/Help/xnetprlaunch.html))。在一些实施方案中，引物的Tm可使用下式计算，该公式由NetPrimer软件使用并且在Frieir等的PNAS 198683：9373-9377中更详细地描述，该文献通过引用整体并入本文。
Tm＝ΔH/(AS+R*ln(C/4))+16.6log([K+]/(1+0.7[K+]))-273.15
其中：ΔH是螺旋形成的焓；ΔS是螺旋形成的熵；R是摩尔气体常数(1.987cal/℃*mol)；C是核酸浓度；[K+]是盐浓度。对于大多数扩增方案，退火温度选择为比预测的Tm低约5℃，尽管可使用接近和高于Tm(例如，比预测的Tm低1℃至5℃或比预测的Tm高1℃至5℃)，同样可使用例如比预测的Tm低超过5℃的温度(例如，低6℃、低8℃、低10℃或更低)。在一些实施方案中，退火温度越接近Tm，退火越具有特异性。在一些实施方案中，在延伸反应期间(例如，在PCR扩增方案的情况下)用于引物退火的时间至少部分地基于反应的体积来确定(例如，其中较大体积涉及较长时间)。在一些实施方案中，在延伸反应期间(例如，在PCR扩增方案的情况下)用于引物退火的时间至少部分地基于引物和模板浓度来确定(例如，其中较高的引物与模板的相对浓度涉及比较低相对浓度更短的时间)。在一些实施方案中，取决于体积和相对引物/模板浓度，延伸反应中(例如，在扩增方案的情况下)的引物退火步骤可以是1秒至5分钟、10秒至2分钟，或30秒至2分钟。本文中使用的“基本上退火”是指当在PCR扩增方案的上下文中使用时，在两个核酸之间形成互补碱基对的程度足以产生可检出水平的特异性扩增产物。
本文中使用的术语“聚合酶延伸”是指通过核酸聚合酶将至少一个互补核苷酸模板依赖性地添加至与核酸模板退火的引物的3’端。在一些实施方案中，聚合酶延伸添加多于一个核苷酸，例如，直至并包含对应于模板全长的核苷酸。在一些实施方案中，聚合酶延伸的条件至少部分基于所用聚合酶的特性。在一些实施方案中，用于聚合酶延伸的温度基于酶的已知活性性质。在一些实施方案中，其中退火温度低于酶的最佳温度，使用较低的延伸温度可以是可接受的。在一些实施方案中，在低于其最佳延伸温度的情况下，酶可保持至少部分活性。在一些实施方案中，聚合酶延伸(例如，用热稳定聚合酶(例如Taq聚合酶及其变体)进行)在65℃至75℃或68℃至72℃下进行。在一些实施方案中，本文中提供的方法涉及引物的聚合酶延伸，所述引物在PCR扩增方案的每个循环时与核酸模板退火。在一些实施方案中，使用具有相对强的链置换活性的聚合酶进行聚合酶延伸。在一些实施方案中，出于检测融合(例如，5’融合)的目的，具有强链置换的聚合酶可用于制备核酸。
在一些实施方案中，引物延伸在允许退火的寡核苷酸引物延伸的条件下进行。本文中使用的术语“允许退火的寡核苷酸延伸以使得产生延伸产物的条件”是指一组条件(例如，温度、盐和辅因子浓度、pH和酶浓度)，在该条件下核酸聚合酶催化引物延伸。在一些实施方案中，这样的条件至少部分地基于所用的核酸聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶可在合适的反应制备物中进行引物延伸反应。在一些实施方案中，合适的反应制备物包含一种或更多种盐(例如，1至100mM KCl，0.1至10mM MgCl2)、至少一种缓冲剂(例如，1至20mMTris-HCl)、载体(例如，0.01至0.5％BSA)、以及一种或更多种NTP(例如，dATP、dTTP、dCTP和dGTP各自10至200μM)。一组非限制性条件是在72℃下50mM KCl，10mM Tris-HCl(在25℃下，pH 8.8)，0.5至3mM MgCl2，200μM每种dNTP和0.1％BSA，在该温度下聚合酶(例如，Taq聚合酶)催化引物延伸。在一些实施方案中，起始和延伸的条件可包括在合适的缓冲液中存在一种、两种、三种或四种不同的脱氧核苷三磷酸(例如，选自dATP、dTTP、dCTP和dGTP)和聚合诱导剂，例如DNA聚合酶或逆转录酶。在一些实施方案中，“缓冲液”可包含溶剂(例如，水性溶剂)加合适的辅因子和影响pH、离子强度等的试剂。
在一些实施方案中，本文中提供的***被配置成以自动化方式实施多个核酸扩增循环。在一些实施方案中，核酸扩增涉及多至5轮、多至10轮、多至20轮、多至30轮、多至40轮或更多轮(循环)的扩增。在一些实施方案中，核酸扩增可包含一组长度为5个循环至20个循环的PCR扩增方案的循环。在一些实施方案中，扩增步骤可包含一组长度为10个循环至20个循环的PCR扩增方案的循环。在一些实施方案中，每个扩增步骤可包含一组长度为12个循环至16个循环的PCR扩增方案的循环。在一些实施方案中，退火温度可低于70℃。在一些实施方案中，退火温度可低于72℃。在一些实施方案中，退火温度可以是约65℃。在一些实施方案中，退火温度可以是约61至约72℃。
在多种实施方案中，本文中所述的方法和组合物涉及用本文中所述的一种或更多种类型的引物进行PCR扩增方案。本文中使用的“引物”是指这样的寡核苷酸，其能够与核酸模板特异性退火并提供充当模板依赖性聚合酶之底物的3’端，以产生与模板互补的延伸产物。在一些实施方案中，引物是单链的，使得引物及其互补物可退火以形成两条链。根据本文中所述的方法和组合物的引物可包含杂交序列(例如，与核酸模板退火的序列)，其为长度小于或等于300个核苷酸，例如，长度为小于或等于300个、或250个、或200个、或150个、或100个、或90个、或80个、或70个、或60个、或50个、或40个、或30个或更少、或20个或更少、或15个或更少，但至少6个核苷酸。在一些实施方案中，引物的杂交序列可以是长度为6至50个核苷酸、长度为6至35个核苷酸、长度为6至20个核苷酸、长度为10至25个核苷酸。
任何合适的方法可用于合成寡核苷酸和引物。在一些实施方案中，商业来源提供了适合于提供用于本文中所述方法和组合物之引物的寡核苷酸合成服务(例如，INVITROGENTM定制DNA寡核苷酸(Life Technologies，Grand Island，NY)或来自IntegratedDNA Technologies(Coralville，IA)的定制DNA寡核苷酸)。
DNA剪切/片段化
本文中使用的核酸(例如，在测序之前)可被剪切，例如机械或酶促剪切，以产生具有任何期望尺寸的片段。机械剪切过程的一些非限制性实例包括超声处理、雾化和可从Covaris(Woburn，MA)获得的AFATM剪切技术。在一些实施方案中，可通过超声处理机械剪切核酸。在一些实施方案中，此处提供的***可具有一个或更多个例如在安装在盒内的匣内的容器，在所述容器中核酸被例如机械或酶促地剪切。
在一些实施方案中，靶核酸未经剪切或消化。在一些实施方案中，制备步骤的核酸产物(例如，延伸产物、扩增产物)未经剪切或酶促消化。
在一些实施方案中，当靶核酸是RNA时，可对样品进行逆转录酶方案以产生DNA模板，并可随后剪切DNA模板。在一些实施方案中，可在进行逆转录酶方案之前剪切靶RNA。在一些实施方案中，包含靶RNA的样品可用于本文中所述的方法，所述方法使用从新鲜或降解的试样中提取的总核酸；无需去除基因组DNA以进行cDNA测序；无需耗尽核糖体RNA以进行cDNA测序；在任何步骤中都无需机械或酶促剪切；通过使用随机六聚体对RNA进行双链cDNA合成。
靶核酸
本文中使用的术语“靶核酸”是指目的核酸分子(例如，待分析的核酸)。在一些实施方案中，靶核酸包含靶核苷酸序列(例如，已知或预先确定的核苷酸序列)和待确定的相邻核苷酸序列(其可被称为未知序列)二者。靶核酸可具有任何合适的长度。在一些实施方案中，靶核酸是双链的。在一些实施方案中，靶核酸是DNA。在一些实施方案中，靶核酸是基因组或染色体DNA(gDNA)。在一些实施方案中，靶核酸可以是互补DNA(cDNA)。在一些实施方案中，靶核酸是单链的。在一些实施方案中，靶核酸可以是RNA(例如，mRNA、rRNA、tRNA、长非编码RNA、微RNA)。
在一些实施方案中，靶核酸可由基因组DNA构成。在一些实施方案中，靶核酸可由核糖核酸(RNA)(例如mRNA)构成。在一些实施方案中，靶核酸可由cDNA构成。许多适用于本文中所述方法的测序方法提供了具有数十至数百个核苷酸碱基的最佳读取长度的测序运行(例如，Ion Torrent技术可产生200至400bp的读取长度)。由例如基因组DNA或mRNA构成的靶核酸可由基本上长于该最佳读取长度的核酸分子构成。为了使由第二扩增步骤产生的扩增的核酸部分具有合适的长度用于特定测序技术，已知的靶核苷酸序列与通用寡核苷酸尾部衔接子可与之连接的靶核酸末端之间的距离应该尽可能接近所选技术的最佳读取长度。例如，如果给定测序技术的最佳读取长度是200bp，则根据本文中所述方法扩增的核酸分子应具有约400bp或更短的平均长度。由例如基因组DNA或mRNA构成的靶核酸可被剪切，例如机械或酶促地剪切，以产生具有任何期望尺寸的片段。机械剪切过程的一些非限制性实例包括超声处理、雾化和可从Covaris(Woburn，MA)获得的AFATM剪切技术。在一些实施方案中，可通过超声处理机械剪切由基因组DNA构成的靶核酸。
在一些实施方案中，当靶核酸由RNA构成时，可对样品进行逆转录酶方案以产生DNA模板，并且可随后剪切DNA模板。在一些实施方案中，可在进行逆转录酶方案之前剪切靶RNA。在一些实施方案中，包含靶RNA的样品可用于本文中所述的方法，所述方法使用从新鲜或降解的试样中提取的总核酸；无需去除基因组DNA以进行cDNA测序；无需耗尽核糖体RNA以进行cDNA测序；在任何步骤中都无需机械或酶促剪切；通过使用随机六聚体对RNA进行双链cDNA合成；以及通过使核酸进行末端修复、磷酸化和腺苷酸化。
在一些实施方案中，已知的靶核苷酸序列可由基因重排构成。本文中描述的方法适用于确定基因重排的存在和/或身份，因为基因重排的仅一半必须先前已知(即，将被基因特异性引物靶向的基因重排的一半)。在一些实施方案中，基因重排可包含癌基因(oncogene)。在一些实施方案中，基因重排可包含融合癌基因。
本文中使用的术语“已知靶核苷酸序列”是指靶核酸的一部分，该部分的序列(例如，核酸的核苷酸碱基的身份和顺序)是已知的。例如，在一些实施方案中，已知的靶核苷酸序列是核酸的核苷酸序列，其是已知的或在探询(interrogation)核酸的相邻未知序列之前已经确定的。已知的靶核苷酸序列可具有任何合适的长度。
在一些实施方案中，靶核苷酸序列(例如，已知的靶核苷酸序列)长度为10个或更多个核苷酸、30个或更多个核苷酸、40个或更多个核苷酸、50个或更多个核苷酸、100个或更多个核苷酸、200个或更多个核苷酸、300个或更多个核苷酸、400个或更多个核苷酸、500个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，靶核苷酸序列(例如，已知靶核苷酸序列)长度为10至100个核苷酸、10至500个核苷酸、10至1000个核苷酸、100至500个核苷酸、100至1000个核苷酸、500至1000个核苷酸、500至5000个核苷酸。
在一些实施方案中，本文中提供了用于确定核酸的邻接(或相邻)部分的序列的方法。本文中使用的术语“与……邻接的核苷酸序列”是指紧邻另一核苷酸序列(例如，已知的核苷酸序列)的上游或下游的核酸分子(例如，靶核酸)的核苷酸序列。在一些实施方案中，与已知的靶核苷酸序列邻接的核苷酸序列可具有任何合适的长度。在一些实施方案中，与已知的靶核苷酸序列邻接的核苷酸序列包含1kb或更短的核苷酸序列，例如1kb或更短的核苷酸序列、750bp或更短的核苷酸序列、500bp或更短的核苷酸序列、400bp或更短的核苷酸序列、300bp或更短的核苷酸序列、200bp或更短的核苷酸序列、100bp或更短的核苷酸序列。在一些实施方案中，其中样品包含含有已知的靶核苷酸序列的不同靶核酸(例如，其中已知的靶核苷酸序列在其基因组中或在分开的、不同的染色体上多次出现的细胞)，存在包含“与已知的靶核苷酸序列邻接的核苷酸序列”的多个序列。本文中使用的术语“确定核苷酸序列”是指确定核酸的核苷酸碱基的身份和相对位置。
在一些实施方案中，已知的靶核酸可含有由基因重排产生的融合序列。在一些实施方案中，本文中描述的方法适合于确定基因重排的存在和/或身份。在一些实施方案中，基因重排的一部分的身份是先前已知的(例如，将由基因特异性引物靶向的基因重排的部分)，并且其他部分的序列可使用本文中公开的方法确定。在一些实施方案中，基因重排可涉及癌基因。在一些实施方案中，基因重排可包含融合癌基因。
样品
在一些实施方案中，核酸存在于或获得自合适的样品中(例如，食物样品、环境样品、生物样品(例如，血液样品等))。在一些实施方案中，靶核酸是获得自对象的生物样品。在一些实施方案中，样品可以是获得自对象的诊断样品。在一些实施方案中，样品还可包含蛋白质、细胞、流体、生物流体、防腐剂和/或其他物质。作为非限制性实例，样品可以是颊部拭子(cheek swab)、血液、血清、血浆、痰、脑脊液、尿、泪、肺泡分离物、胸膜液、心包液、囊液、肿瘤组织、组织、活检物、唾液、吸出物、或其组合。在一些实施方案中，可通过切除或活检获得样品。
在一些实施方案中，样品可获得自需要治疗与遗传改变相关之疾病(例如，癌症或遗传性疾病)的对象。在一些实施方案中，已知的靶序列存在于疾病相关基因中。
在一些实施方案中，样品获得自需要治疗癌症的对象。在一些实施方案中，样品包含肿瘤细胞群，例如至少一种肿瘤细胞。在一些实施方案中，样品包含肿瘤活检物，包括但不限于未经处理的活检物组织或经处理的活检物组织(例如，***固定的和/或石蜡包埋的活检物组织)。
在一些实施方案中，样品是新鲜收集的。在一些实施方案中，在用于本文中所述的方法和组合物之前储存样品。在一些实施方案中，样品是未经处理的样品。本文中使用的“未经处理的样品”是指除了在溶液中稀释和/或悬浮之外没有任何先前样品预处理的生物样品。在一些实施方案中，样品获得自对象并在用于本文中所述的方法和组合物之前进行保存或加工。作为非限制性实例，样品可包埋在石蜡中、冷藏或冷冻。根据本文中所述的方法和组合物，在确定核酸的存在之前，可将冷冻的样品解冻。在一些实施方案中，样品可以是经加工或处理的样品。用于处理或加工样品的示例性方法包含但不限于离心、过滤、超声处理、均化(homogenization)、加热、冷冻和解冻、与防腐剂(例如，抗凝剂或核酸酶抑制剂)接触、及其任意组合。在一些实施方案中，可用化学和/或生物试剂处理样品。可使用化学和/或生物试剂以在加工和/或储存期间保护样品或由样品包含的核酸和/或维持样品或由样品包含的核酸的稳定性。作为补充或替代，可使用化学和/或生物试剂以从样品的其他组分中释放核酸。作为非限制性实例，在用于本文中所述的方法和组合物之前，可用抗凝剂处理血液样品。用于核酸分析的样品的加工、保存或处理的合适的方法和过程可用于本文中公开的方法中。在一些实施方案中，样品可以是澄清化的流体样品。在一些实施方案中，可通过低速离心(例如，3,000xg或更低)使样品澄清并收集包含澄清化流体样品的上清液。
在一些实施方案中，可在用于本文中所述的方法和组合物之前分离、富集或纯化样品中存在的核酸。可使用从样品中分离、富集或纯化核酸的合适方法。例如，用于从多种样品类型中分离基因组DNA的试剂盒是可商购的(例如，目录号51104、51304、56504和56404；Qiagen；Germantown，MD)。在一些实施方案中，本文中描述的方法涉及富集靶核酸的方法，例如，在靶核酸测序之前。在一些实施方案中，在测序之前不知道待富集的靶核酸的一端的序列。在一些实施方案中，本文中描述的方法涉及在使用下一代测序技术确定核苷酸序列之前富集特定核苷酸序列的方法。在一些实施方案中，富集特定核苷酸序列的方法不包括杂交富集。
靶基因(ALK、ROS1、RET)和治疗应用
在本文中所述方法的一些实施方案中，确定与已知的寡核苷酸靶序列邻接的序列可提供与疾病治疗相关的信息。因此，在一些实施方案中，本文中公开的方法可用于帮助治疗疾病。在一些实施方案中，样品可来自需要治疗与遗传改变相关之疾病的对象。在一些实施方案中，已知的靶序列是疾病相关基因(例如，癌基因)的序列。在一些实施方案中，与已知的寡核苷酸靶序列邻接的序列和/或该已知的寡核苷酸靶序列可包含与疾病相关的突变或遗传异常，例如SNP、***、缺失和/或基因重排。在一些实施方案中，样品中存在的与已知的靶序列邻接的序列和/或已知的靶序列包含基因重排产物的序列。在一些实施方案中，基因重排可以是癌基因，例如融合癌基因。
某些癌症治疗对于包含某些癌基因的肿瘤特别有效，例如，靶向给定融合癌基因的作用或表达的治疗剂可对包含该融合癌基因的肿瘤有效，但对缺乏该融合癌基因的肿瘤无效。本文中描述的方法可有助于确定揭示癌基因状态(例如，突变、SNP和/或重排)的特定序列。在一些实施方案中，本文中描述的方法还可允许在侧翼区域的序列已知时确定特定序列，例如，本文中描述的方法可确定涉及已知基因(例如，癌基因)之基因重排的存在和身份，其中在进行本文中描述的方法之前，精确位置和/或重排配偶体是未知的。
在一些实施方案中，对象需要治疗肺癌。在一些实施方案中，例如，当从需要治疗肺癌的对象获得样品时，已知的靶序列可包含来自选自ALK、ROS1和RET的基因的序列。因此，在一些实施方案中，基因重排导致涉及ALK、ROS1或RET的融合。涉及ALK、ROS1或RET的基因排列的非限制性实例描述于例如Soda等，Nature 2007 448561-6：Rikova等，Cell 2007131：1190-1203；Kohno等，Nature Medicine 2012 18：375-7；Takouchi等，NatureMedicine 2012 18：378-81；其通过引用整体并入本文。然而，应该理解的是，基因重排的精确位置和参与重排的第二基因的身份可以不是事先已知的。因此，在本文中所述的方法中，可检测这种重排的存在和身份，而不必须知道重排的位置或参与基因重排的第二基因的身份。
在一些实施方案中，已知的靶序列可包含来自选自以下的基因的序列：ALK、ROS1和RET。
在一些实施方案中，从对象的肿瘤获得的样品中的ALK的基因重排的存在可表明肿瘤易于用选自以下的治疗进行治疗：ALK抑制剂；克唑替尼(crizotinib)(PF-02341066)；AP26113；LDK378；3-39；AF802；IPI-504；ASP3026；AP-26113；X-396；GSK-1838705A；CH5424802；ALK激酶活性的二氨基和氨基嘧啶抑制剂，例如NVP-TAE684和PF-02341066(参见，例如，Galkin等，Proc Natl Acad Sci USA，2007，104：270-275；Zou等，Cancer Res，2007，67：4408-4417；Hallberg和Palmer F1000Med Reports2011 3：21；Sakamoto等，Cancer Cell 2011 19：679-690；以及WO 04/079326中公开的分子)。所有前述参考文献都通过引用整体并入本文。ALK抑制剂可包含降低ALK或其一部分之表达和/或激酶活性的任何药剂，包括例如降低ALK或其一部分之表达和/或活性的寡核苷酸、小分子和/或肽。本文中使用的“间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase)”或“ALK”是指通常以野生型形式参与神经元调节的跨膜tyROS1ine激酶。ALK基因和mRNA的核苷酸序列对于许多物种是已知的，这些物种包括人(例如，如根据NCBI基因ID：238所注释)。
在一些实施方案中，获得自对象的肿瘤的样品中的ROS1的基因重排的存在可表明肿瘤易于用选自下组的治疗进行治疗：ROS1抑制剂和如上所述的ALK抑制剂(例如，克唑替尼)。ROS1抑制剂可包括降低ROS1或其一部分之表达和/或激酶活性的任何药剂，包括例如降低ROS1或其一部分之表达和/或活性的寡核苷酸、小分子和/或肽。本文中使用的“c-ros癌基因1”或“ROS1”(在本领域中也称为ros-1)是指sevenless亚家族的跨膜酪氨酸激酶，其与PTPN6相互作用。ROS1基因和mRNA的核苷酸序列对于许多物种是已知的，这些物种包括人(例如，如根据NCBI基因ID：6098所注释)。
在一些实施方案中，获得自对象的肿瘤的样品中的RET的基因重排的存在可表明肿瘤易于用选自以下的治疗进行治疗：RET抑制剂；DP-2490、DP-3636、SU5416；BAY 43-9006、BAY 73-4506(瑞戈非尼(regorafenib))、ZD6474、NVP-AST487、索拉非尼、RPI-1、XL184、凡德他尼、舒尼替尼、伊马替尼、帕唑帕尼、阿西替尼、莫特塞尼、吉非替尼和醉茄素A(withaferin A)(参见例如Samadi等，Surgery 2010 148：1228-36；Cuccuru等，JNCI200413：1006-1014；Akeno-Stuart等，Cancer Research 2007 67：6956；Grazma等，J ClinOncol 2010 28：15s 5559；Mologni等，J Mol Endocrinol 2006 37：199-212；Calmomagno等，Journal NCI 200698：326-334；Mologni，Curr Med Chem 2011 18：162-175；以及WO06/034833；美国专利公开2011/0201598和美国专利8,067,434中公开的化合物)。所有前述参考文献都通过引用整体并入本文。RET抑制剂可包含降低RET或其一部分之表达和/或激酶活性的任何药剂，包括例如降低RET或其一部分之表达和/或活性的寡核苷酸、小分子和/或肽。本文中使用的“在转染期间重排”或“RET”是指钙黏蛋白超家族的受体酪氨酸激酶，其参与神经嵴发育并识别神经胶质细胞系来源的神经营养因子家族信号传导分子。RET基因和mRNA的核苷酸序列对于许多物种是已知的，这些物种包括人(例如，如根据NCBI基因ID：5979所注释)。
本文中描述的方法的应用的另一些非限制性实例包括检测血液恶性标志物及其组(例如，包括检测淋巴瘤和白血病中的基因组重排的那些)、检测肉瘤相关的基因组重排及其组；以及检测IGH/TCR基因重排及其组用于淋巴瘤测试。
在一些实施方案中，本文中描述的方法涉及用针对癌症的治疗来治疗患有或诊断为患有例如癌症的对象。患有癌症的对象可由医生使用当前诊断癌症的方法来识别。例如，表征这些病症并有助于诊断的肺癌症状和/或并发症是本领域中公知的，其包括但不限于呼吸微弱、锁骨上***肿大、肺部异常声音、当胸部被敲击时有浊音，以及胸痛。可有助于诊断例如肺癌的测试包括但不限于X射线、针对高水平的某些物质(例如，钙)的血液测试、CT扫描和肿瘤活检。肺癌的家族史或暴露于肺癌风险因素(例如，吸烟或暴露于烟雾和/或空气污染)也可有助于确定对象是否可能患有肺癌或有助于进行肺癌的诊断。
癌症可包括但不限于上皮癌，包含腺癌、淋巴瘤、母细胞瘤、黑素瘤、肉瘤、白血病、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、胶质母细胞瘤、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、包括胶质母细胞瘤和髓母细胞瘤在内的脑癌；乳腺癌、***、绒毛膜癌；结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌、子宫内膜癌；食管癌、胃癌；多种类型的头颈部癌症、包括鲍恩病(Bowen’s disease)和佩吉特病(Paget’s disease)在内的上皮内肿瘤；包括急性淋巴细胞白血病和急性髓细胞性白血病在内的血液肿瘤(hematologicalneoplasm)；卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、毛细胞白血病；慢性髓细胞性白血病、AIDS相关白血病和成人T细胞白血病淋巴瘤；肾癌，例如肾细胞癌、T细胞急性淋巴细胞白血病/淋巴瘤、包括霍奇金病和淋巴细胞淋巴瘤在内的淋巴瘤；肝癌，例如肝上皮癌(hepaticcarcinoma)和肝细胞瘤(hepatoma)、梅克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma)、黑素瘤、多发性骨髓瘤；神经母细胞瘤；包括鳞状细胞癌在内的口腔癌；包括由上皮细胞引起的那些在内的卵巢癌、包括平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和骨肉瘤在内的肉瘤；胰腺癌；包括黑素瘤、***、生殖细胞和间充质细胞在内的皮肤癌；***癌症，直肠癌；外阴癌，包括腺癌在内的肾癌；睾丸癌，其包括胚组织瘤(germinal tumor)，例如***瘤、非***瘤(畸胎瘤、绒毛膜癌)、间质瘤和生殖细胞肿瘤；包括甲状腺腺癌和髓样癌在内的甲状腺癌；食管癌、唾液腺癌和肾母细胞瘤(Wilm’s tumor)。在一些实施方案中，癌症可以是肺癌。
多路复用方法
本文中描述的方法可以以多路复用形式使用。在本文中所述方法的一些实施方案中，多路复用应用可包括确定与一种或更多种已知的靶核苷酸序列邻接的核苷酸序列。本文中使用的“多路复用扩增”是指涉及在一个或更多个反应容器中同时扩增多于一种靶核酸的过程。在一些实施方案中，方法涉及随后使用一组或更多组引物确定多路复用扩增产物的序列。多路复用可指在单个反应中检测约2至1,000个不同的靶序列。本文中使用的多路复用是指在单个反应中检测2至1,000个不同的靶序列之间的任何范围，例如，5至500个、25至1,000个或10至100个不同的靶序列等。术语“多路复用”应用于PCR意味着在同一PCR反应中存在对至少两种不同靶序列具有特异性的引物。
在一些实施方案中，可用多种引物(例如，多个第一和第二靶特异性引物)扩增样品中的靶核酸或样品的分离部分。在一些实施方案中，多种引物(例如，多种第一和第二靶特异性引物)可存在于单一反应混合物中，例如，可在同一反应混合物中产生多种扩增产物。在一些实施方案中，多个引物(例如，多组第一和第二靶特异性引物)可与由单独的基因构成的已知的靶序列特异性退火。在一些实施方案中，至少两组引物(例如，至少两组第一和第二靶特异性引物)可与已知的靶序列的不同部分特异性退火。在一些实施方案中，至少两组引物(例如，至少两组第一和第二靶特异性引物)可与由单个基因构成的已知靶序列的不同部分特异性退火。在一些实施方案中，至少两组引物(例如，至少两组第一和第二靶特异性引物)可与包含已知靶序列的基因的不同外显子特异性退火。在一些实施方案中，多个引物(例如，第一靶特异性引物)可包含相同的5’标签序列部分。
在本文中所述方法的一些实施方案中，多路复用应用可包括在一个测序反应或测序运行中的多个样品中确定与一个或更多个已知靶核苷酸序列邻接的核苷酸序列。在一些实施方案中，多个样品可具有不同的来源，例如来自不同组织和/或不同对象。在此类实施方案中，引物(例如，加尾的随机引物)还可包含条码部分。在一些实施方案中，可将具有独特条码部分的引物(例如，加尾的随机引物)添加至每个样品中并与其中的核酸连接；随后可合并样品。在此类实施方案中，扩增产物的每个所得测序读取将包含条码，其识别含有扩增产物所来源的模板核酸的样品。
分子条码
在一些实施方案中，引物和/或衔接子可含有另外的序列，例如标识符(identifier)序列(例如，条码、索引)、测序引物杂交序列(例如，Rd1)和衔接子序列。在一些实施方案中，衔接子序列是与下一代测序***一起使用的序列。在一些实施方案中，衔接子序列是基于Illumina的测序技术的P5和P7序列。在一些实施方案中，衔接子序列是与IonTorrent测序技术兼容的P1和A。
在一些实施方案中，本文中使用的“分子条码”、“分子条码标签”和“索引”可互换使用，并且通常是指可用作标识符的核酸的核苷酸序列，所述标识符例如源标识符、位置标识符、日期或时间标识符(例如，采样或处理的日期或时间)，或核酸的其他标识符。在一些实施方案中，此类分子条码或索引序列可用于鉴定核酸群中存在的核酸的不同方面。在一些实施方案中，分子条码或索引序列可提供靶核酸的源或位置标识符。例如，分子条码或索引序列可用于鉴定从中获得核酸的患者。在一些实施方案中，分子条码或索引序列使得能够在单个反应上(例如，在单个流动单元中进行)对多个不同样品进行测序。在一些实施方案中，出于检测个体测序反应的目的，索引序列可用于使序列成像仪定向。在一些实施方案中，分子条码或索引序列可以是长度为2至25个核苷酸，长度为2至15个核苷酸，长度为2至10个核苷酸，长度为2至6个核苷酸。在一些实施方案中，条码或索引包含至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或至少25个核苷酸。
在一些实施方案中，当根据本文中描述的方法使用加尾的随机引物群时，在扩增之后可存在多种可区分的扩增产物。在一些实施方案中，因为加尾的随机引物在样品的所有核酸分子中的多个位置杂交，一组靶特异性引物可使由多于1个杂交事件产生的延伸产物杂交(和扩增)，例如，一个加尾的随机引物可在与靶特异性引物杂交位点相隔第一距离(例如，100个核苷酸)处杂交，并且另一个加尾的随机引物可在与靶特异性引物杂交位点相隔第二距离(例如，200个核苷酸)处杂交，从而产生了两种扩增产物(例如，包含约100bp的第一扩增产物和包含约200bp的第二扩增产物)。在一些实施方案中，可使用下一代测序技术对这些多重扩增产物每种进行测序。在一些实施方案中，这些多重扩增产物的测序是有利的，因为其提供了多个重叠序列读取，其可彼此比较以检测在扩增或测序过程期间引入的序列错误。在一些实施方案中，可比对单独的扩增产物，并且当它们在特定碱基处存在的序列不同时，可存在PCR和/或测序的伪象(artifact)或错误。
计算机和控制设备
本文中提供的***包含若干组件，包括传感器、环境控制***(例如，加热器、风扇)、机器人(例如，XY***)等，其可在计算机、处理器、微控制器或其他控制器的方向上一起操作。组件可包括例如XY***、液体处理装置、微流体泵、线性致动器、阀驱动器、门操作***、光学组件、条码扫描器、成像或检测***、触摸屏界面等。
在一些情况下，例如控制***和/或其中提供的或与其接合的组件之运作的操作可使用硬件、软件或其组合来实施。当在软件中实施时，软件代码可在任何合适的处理器或处理器集合上执行，无论是在单个组件中提供还是在多个组件之间分布。这样的处理器可作为集成电路实施，其中集成电路组件中具有一个或更多个处理器。可使用任何合适形式的电路来实施处理器。
计算机可体现为多种形式中的任一种，例如机架式计算机(rack-mountedcomputer)、台式计算机(desktop computer)、膝上计算机(laptop computer)或平板计算机(tablet computer)。另外，计算机可嵌入通常不被视为计算机但具有合适处理能力的装置中，包括个人数字助理(Personal Digital Assistant，PDA)、智能电话或任何其他合适的便携式、移动或固定电子装置，包括***本身。
在某些情况下，计算机可具有一个或更多个输入和输出装置。这些装置尤其可用于呈现用户界面。可用于提供用户界面的输出装置的实例包括用于输出的可视呈现的打印机或显示屏和用于输出的可听呈现的扬声器或其他声音生成设备。可用于用户界面的输入装置的实例包括键盘和指示装置，例如鼠标、触摸板和数字化平板电脑。在另一些实例中，计算机可通过语音识别或以其他可听形式、通过可见手势、通过触觉输入(例如，包括振动、触觉和/或其他力)、或其任意组合来接收输入信息。
一个或更多个计算机可通过一个或更多个网络以任何合适的形式互连，包括作为局域网或广域网，例如企业网络或因特网。这样的网络可基于任何合适的技术，并且可根据任何合适的协议进行操作，并且可包括无线网络、有线网络或光纤网络。
本文中概述的多种方法或过程可被编码为可在采用多种操作***或平台中的任一个的一个或更多个处理器上执行的软件。这样的软件可使用许多合适的编程语言和/或编程或脚本工具中的任一种来编写，并且可被编译为在框架或虚拟机上执行的可执行机器语言代码或中间代码。
用于控制本文中提供的方法或过程的一种或更多种算法可体现为用一个或更多个程序编码的可读存储介质(或多个可读介质)(例如，计算机存储器、一个或更多个软盘、压缩盘(compact disc，CD)、光盘、数字视频盘(digital video disk，DVD)、磁带、闪存、现场可编程门阵列(Field Progammable Gate Array)或其他半导体装置中的电路配置，或其他有形存储介质)，当在一个或更多个计算机或其他处理器上执行时，其执行实施本文中描述的多种方法或过程的方法。
在一些实施方案中，计算机可读存储介质可将信息保留足够的时间以提供非过渡形式的计算机可执行指令。这样的计算机可读存储介质可以是可移动的，使得存储在其上的程序可加载到一个或更多个不同的计算机或其他处理器上，以实施本文中描述的方法或过程的多个方面。本文中使用的术语“计算机可读存储介质”仅涵盖可被视为产品(例如，制品)或机器的计算机可读介质。作为替代或补充，本文中描述的方法或过程可体现为除计算机可读存储介质之外的计算机可读介质，例如传播信号。
术语“程序”或“软件”在本文中以一般含义使用，以指可用于对计算机或其他处理器进行编程以实施本文中所述的方法或过程的多个方面的任何类型的代码或可执行指令集。另外，应当理解，根据本实施方案的一个方面，在执行时执行本文中描述的方法或过程的一个或更多个程序不需要驻留在单个计算机或处理器上，而是可以以模块化方式在许多不同的计算机或处理器中分布以实施多种程序或操作。
可执行指令可以是许多形式，例如程序模块，由一个或更多个计算机或其他装置执行。通常来说，程序模块包含执行特定任务或实施特定抽象数据类型的例程、程序、对象、组件、数据结构等。通常来说，程序模块的功能可如所期望地在多个实施方案中组合或分布。
而且，数据结构可以以任何合适的形式存储在计算机可读介质中。数据存储的非限制性实例包括结构化、非结构化、本地化、分布式、短期和/或长期存储。可用于传送数据的协议的非限制性实例包括专有和/或行业标准协议(例如，HTTP、HTML、XML、JSON、SQL、web服务、文本、电子表格等、或其任意组合)。为了简化说明，可将数据结构显示成具有通过数据结构中的位置相关的字段。这样的关系同样可通过对具有传达各字段之间关系的、计算机可读介质中的位置的字段分配存储来实现。然而，可使用任何合适的机制来建立数据结构的字段中的信息之间的关系，包括通过使用指针(pointer)、标签或建立数据要素之间关系的其他机构。
在一些实施方案中，与***的操作相关的信息(例如，温度、成像或光学信息、荧光信号、组件位置(例如，加热的盖的位置、旋转阀位置)、液体处理状态、条码状态、舱访问门位置或其任意组合)可从与***相关联(例如，位于***内)的一个或更多个传感器或读取器获得，并且可存储在计算机可读介质中以提供关于过程(例如，自动化文库制备过程)期间的条件的信息。在一些实施方案中，可读介质包含数据库。在一些实施方案中，所述数据库包含来自单个***(例如，来自一个或更多个舱)的数据。在一些实施方案中，所述数据库包含来自多个***的数据。在一些实施方案中，以使其防篡改(tamperproof)的方式存储数据。在一些实施方案中，存储由***生成的所有数据。在一些实施方案中，存储数据的子集。
实施例
以下实施例旨在举例说明本文中所述的某些实施方案，包括本发明的某些方面，但不是举例说明本发明的全部范围。
实施例1：用于核酸制备的***
图6中示出了示例性***600。在该非限制性实施方案中，***包含两个盒舱610。可使用电源开关601启动或终止该特定实施方案的操作。在操作期间，电子模块622可负责控制(例如，驱动)***内的一个或更多个元件或组件。同样在操作期间，提供***的一种或更多种形式的温度调节可以是可用的。例如，该示例性***包含风扇组件620。
图6中的示例性***的顶视图示于图7中。示例性***700示出了非限制性自动***，其允许光学模块726监测在任一盒舱中的容器中发生的反应。自动***通过利用第一轨道723沿第一轴移动光学模块，并且通过利用第二轨道725沿第二轴移动光学模块。一旦适当地定位在反应容器上方，通过加热的盖728中的多个孔730提供从光学模块至容器的光路。
如图8A中所示，示例性***800的前透视图示出了附接至非限制性框架组件内的自动***的光学模块826。如所示出的，允许沿第一轴线移动的第一轨道823在附接点821处与允许沿第二轴线移动的第二轨道825连接。图8B中所示的隔离视图将光学模块描述为包含示例性条码扫描器827。
虽然本文中描述并举例说明了本发明的数个实施方案，但本领域普通技术人员将容易预见到用于执行本文中所述功能和/或获得结果和/或一种或更多种优势的多种其他手段和/或结构，并且每种这样的改变和/或修改都被认为在本发明的范围之内。更一般地，本领域技术人员将容易理解，本文中所描述的所有参数、尺寸、材料和构造都意在是示例性的，并且实际的参数、尺寸、材料和/或构造将取决于使用本发明教导的具体应用。本领域技术人员将认识到，或能够仅使用常规实验确定本文中所描述的本发明具体实施方案的许多等效方案。因此，应当理解的是，前面的实施方案仅通过实例的方式展示，并且除非特别描述并要求，本发明可在所附权利要求范围及其等同的范围内实施。本发明涉及本文中所描述的每个单独的特征、***、制品、材料、套件和/或方法。此外，如果该特征、***、制品、材料、套件和/或方法并非互不相同，则任何两个或更多个该特征、***、制品、材料、套件和/或方法的组合也包含在本发明的范围内。
除非明确相反指明，否则本文中在说明书和权利要求中所使用的没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。
本文中在说明书和权利要求中使用的短语“和/或”应理解为意指相关联的要素(即在一些情况下相关联存在，而在其他情况下不相关联地存在的要素)中的“任意一个或二者”。除非有明确的相反指示，否则除了被“和/或”分句特别地确定的要素之外，其他要素可任选地存在，无论其与特别确定的那些要素是否相关。因此，作为一个非限制实例，提及“A和/或B”，当与开放性语句(例如“包含/括”)结合使用时，在一个实施方案中，可指A而无B(任选地，包括除了B之外的要素)；在另一个实施方案中，指B而无A(任选地，包括除了A之外的要素)；在另一个实施方案中，指A和B二者(任选地，包括其他要素)；等。
本文中在说明书和权利要求中使用的“或”应被理解为与上文定义的“和/或”具有相同含义。例如，当分离列表中的项时，“或”或者“和/或”应被解释为包含性的，即在许多要素或要素列表中，以及任选地另外的未列出的项中，包含至少一个/种，但也包含多于一个/种的要素。仅当术语明确相反指明，例如“只有其中之一”或“恰好其中之一”，或者当在权利要求中使用“由……组成”时，将指包含许多要素或要素列表中的恰好一个/种要素。一般而言，当前面是排他性术语如“任一”、“其中之一”、“仅其中之一”或“恰好其中之一”时，本文中所使用的术语“或”应当仅被解释为排除性的替代(即，“一个或另一个，但并非二者”)。当在权利要求中使用“基本上由……组成”时，应当具有其用于专利法领域中的通常含义。
本文中在说明书和权利要求中涉及一系列的一个/种或更多个/种要素使用的短语“至少一个/种”应当被理解为意指在要素列表中，选自任何一个/种或更多个/种要素的至少一个/种要素，但未必包含该要素列表中具体列出的各个/种和每个/种要素中的至少一个/种，并且不排除该要素列表中的任何要素组合。该定义也允许除了在要素列表中被具体确定的、短语“至少一个/种”所指的要素以外，其他要素可任选的存在，无论是否与具体确定的那些要素相关。因此，作为一个非限制性实例，“A和B中的至少一个/种”(或等同地，“A或B中的至少一个/种”，或等同地，“A和/或B中的至少一个/种”)在一个实施方案中可指至少一个/种(任选地包含多于一个/种)A，而不存在B(且任选地包含除B之外的要素)；在另一个实施方案中，指至少一个/种(任选地包含多于一个/种)B，而不存在A(且任选地包含除A之外的要素)；在另一个实施方案中，指至少一个/种(任选地包含多于一个/种)A，以及至少一个/种(任选地包含多于一个/种)B(并且任选地包含其他要素)；等。
在权利要求以及在上述的说明书中，所有的连接词(例如“包含”、“包括”、“带有”、“具有”、“含有”、“涉及”、“保持”等)应理解为开放式的，即意为包括但不限于。如美国专利局的专利审查程序手册(the United States Patent Office Manual of PatentExamining Procedures)，2111.03章所述，只有连接词“由……组成”和“基本上由……组成”应分别为封闭式或半封闭式连接词。
除非另有限定或指出，否则如本文中所使用的涉及以下的术语，例如一种或更多种制品、结构、力、场、流、方向和/或轨线和/或其亚组分和/或其组合和/或以上未列出的能够用这样的术语表征的任何其他有形或无形的元素的或之间的形状、取向、对准和/或几何关系，其应被理解为不需要绝对符合这样的术语的数学定义，而应被理解为在所表征的主题可能的程度上符合这样的术语的数学定义，如这样的主题最密切相关的领域的技术人员所理解的。与形状、定向和/或几何关系相关的这些术语的实例包括但不限于描述以下的术语：形状-例如，圆形、正方形、环形的/环形、矩形的/矩形、三角形的/三角形、圆柱形的/圆柱形、椭圆的/椭圆、(n)多边形的/(n)多边形等；角定向-例如垂直、正交、平行、垂直、水平、共线等；轮廓和/或轨迹-例如，平面/平面的、共面的、半球形的、半-半球形的、线/线性、双曲线的、抛物线的、平面、弯曲的、直线的、弧形的、正弦的、切线/切线的等；方向-如北、南、东、西等；表面和/或散体材料特性(bulk material property)和/或空间/时间分辨率，和/或分布-例如，光滑、反射、透明、清晰、不透明、刚性、不可渗透、均匀、惰性、不可润湿、不溶、稳定、不变、恒定、同质等；以及相关领域技术人员显而易见的许多其他内容。作为一个实例，在本文中描述为“正方形”的制造制品不要求这样的制品具有完全平面或线性的并且以精确的90度的角度相交的面或边(实际上，这样的制品可仅作为数学抽象存在)，相反，这样的制品的形状应被解释在所记载的制造技术通常可实现或已实现的程度上为近似于数学上定义的“正方形”，如本领域技术人员所理解的或如具体描述的。作为另一个实例，在本文中描述为“对准”的两个或更多个所制造制品不要求这样的制品具有完全对准的面或边(实际上，这样的制品只可仅作为数学抽象存在)，相反，这样的制品的设置应被解释为在所记载的制造技术通常可实现或已实现的程度上为近似于数学上定义的“对准”，如本领域技术人员所理解的或如具体描述的。

Claims (48)

1.用于进行反应的装置，所述装置包含：
i)至少两个盒舱，每个盒舱被配置成容纳包含多个用于接纳反应容器之接纳器的盒舱组件；
ii)至少两个用户访问门，每个门提供对一个盒舱的访问以将包含所述反应容器的盒转移到所述一个盒舱中和从所述一个盒舱中转移出；以及
iii)至少一个共享资源，其在所述至少两个盒舱之间共享，其中所述至少一个共享资源被配置成监测所述反应容器内的活动。
2.权利要求1所述的装置，其中所述盒舱组件包含含有热传递表面的热覆盖物组件，所述热传递表面被配置成有利于所述热覆盖物组件与所述反应容器之间的热交换。
3.权利要求1至2中任一项所述的装置，其还包含至少一个共享资源，所述共享资源在所述至少两个盒舱之间共享，并且其被配置成处理所述反应容器内的反应。
4.权利要求1至3中任一项所述的装置，其中至少一个共享资源包含至少一个光学模块。
5.权利要求4所述的装置，其中至少一个光学模块被配置成收集从所述反应容器发射的电磁信号。
6.权利要求5所述的装置，其中所收集的电磁信号包含荧光信号。
7.权利要求4至6中任一项所述的装置，其中至少一个光学模块被配置成将电磁信号发射到所述反应容器中。
8.权利要求6所述的装置，其中所发射的电磁信号包含激发能。
9.权利要求4至8中任一项所述的装置，其中至少一个光学模块被配置成将电磁信号发射到所述反应容器中并从所述反应容器收集电磁信号。
10.权利要求4至9中任一项所述的装置，其中至少一个光学模块被配置成由至少一个自动***移动。
11.权利要求10所述的装置，其中至少一个光学模块和至少一个自动***由电子模块驱动。
12.权利要求1至11中任一项所述的装置，其中至少一个共享资源包含至少一个条码扫描器。
13.权利要求12所述的装置，其中所述条码扫描器被配置成由至少一个自动***移动。
14.权利要求13所述的装置，其中至少一个条码扫描器和至少一个自动***由电子模块驱动。
15.权利要求13至14中任一项所述的装置，其中至少一个光学模块和至少一个条码扫描器被配置成由同一自动***移动。
16.权利要求1至15中任一项所述的装置，其中至少一个共享资源和至少一个自动***由同一电子模块驱动。
17.权利要求10至16中任一项所述的装置，其中至少一个自动***在所述热覆盖物组件上方的指定空间内运行。
18.用于进行反应的装置，所述装置包含：
i)至少两个盒舱，每个盒舱被配置成容纳接纳一个或更多个盒的盒舱组件；
ii)至少两个用户访问门，每个门提供对一个盒舱的访问以将盒转移到所述一个盒舱中和从所述一个盒舱中转移出；
iii)至少一个共享资源，其在所述至少两个盒舱之间共享，其中所述至少一个共享资源被配置成监测所述反应；以及
iv)控制部件，其在所述至少一个共享资源正被所述至少两个盒舱中的任一个使用时阻止用户访问所述至少两个盒舱。
19.权利要求18所述的装置，其中所述盒舱组件包含含有多个用于接纳反应容器之接纳器的基部组件。
20.权利要求19所述的装置，其中一个或更多个盒包含所述反应容器。
21.权利要求18至20中任一项所述的装置，其中所述盒舱组件包含含有热传递表面的热覆盖物组件，所述热传递表面被配置成有利于所述热覆盖物组件与所述反应容器之间的热交换。
22.权利要求19至21中任一项所述的装置，其还包含至少一个共享资源，所述共享资源在所述至少两个盒舱之间共享，并且其被配置成处理所述反应容器内的反应。
23.权利要求18至22中任一项所述的装置，其中至少一个共享资源包含至少一个光学模块。
24.权利要求23所述的装置，其中至少一个光学模块被配置成收集从所述反应容器发射的电磁信号。
25.权利要求24所述的装置，其中所收集的电磁信号包含荧光信号。
26.权利要求23至25中任一项所述的装置，其中至少一个光学模块被配置成将电磁信号发射到所述反应容器中。
27.权利要求26所述的装置，其中所发射的电磁信号包含激发能。
28.权利要求23至27中任一项所述的装置，其中至少一个光学模块被配置成将电磁信号发射到所述反应容器中并从所述反应容器收集电磁信号。
29.权利要求23至28中任一项所述的装置，其中至少一个光学模块被配置成由至少一个自动***移动。
30.权利要求29所述的装置，其中至少一个光学模块和至少一个自动***由电子模块驱动。
31.权利要求18至30中任一项所述的装置，其中至少一个共享资源包含至少一个条码扫描器。
32.权利要求31所述的装置，其中所述条码扫描器被配置成由至少一个自动***移动。
33.权利要求32所述的装置，其中至少一个条码扫描器和至少一个自动***由电子模块驱动。
34.权利要求32至33中任一项所述的装置，其中至少一个光学模块和至少一个条码扫描器被配置成由同一自动***移动。
35.权利要求18至34中任一项所述的装置，其中至少一个共享资源和至少一个自动***由同一电子模块驱动。
36.权利要求29至35中任一项所述的装置，其中至少一个自动***在所述热覆盖物组件上方的指定空间内运行。
37.用于自动化处理核酸的装置，所述装置包含：
i)至少两个用于处理核酸的盒舱，其中每个盒舱被配置成容纳包含以下的盒舱组件：
基部组件，以及
热覆盖物组件，
其中所述基部组件包含多个用于接纳反应容器的接纳器和多个热电装置，其中每个接纳器包含与至少一个热电装置热连通的热护套，其中所述热护套具有第一热传递表面，其被配置成围绕反应容器的至少一部分以有利于所述反应容器与所述护套之间的热交换，并且其中所述热覆盖物组件包含第二热传递表面，其被配置成有利于所述覆盖物组件与所述反应容器之间的热交换；
ii)至少两个用户访问门，每个门提供对一个盒舱的访问以将包含所述反应容器的盒转移到所述一个盒舱中和从所述一个盒舱中转移出；以及
iii)在所述至少两个盒舱之间共享的至少一个光学模块，其中所述至少一个光学模块被配置成从所述盒舱组件中的所述反应容器收集电磁信号以监测核酸的处理。
38.权利要求37所述的装置，其中所述第二热传递表面包含定位于所述反应容器上方的多个孔。
39.权利要求38所述的装置，其中所述多个孔为至少一个光学模块提供光路以监测核酸的处理。
40.权利要求37至39中任一项所述的装置，其中所收集的电磁信号包含荧光信号。
41.权利要求37至40中任一项所述的装置，其中至少一个光学模块被配置成将电磁信号发射到所述反应容器中。
42.权利要求41所述的装置，其中所发射的电磁信号包含激发能。
43.权利要求37至42中任一项所述的装置，其中至少一个光学模块被配置成将电磁信号发射到所述反应容器中并从所述反应容器收集电磁信号。
44.权利要求37至43中任一项所述的装置，其中至少一个光学模块被配置成由至少一个自动***移动。
45.权利要求44所述的装置，其中至少一个自动***在所述至少两个盒舱的所述热覆盖物组件上方的指定空间内运行。
46.权利要求37至45中任一项所述的装置，其中所述装置包含在所述至少两个盒舱之间共享的至少一个条码扫描器。
47.权利要求46所述的装置，其中至少一个条码扫描器被配置成由至少一个自动***移动。
48.权利要求47所述的装置，其中至少一个光学模块和至少一个条码扫描器被配置成由同一自动***移动。
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