CN109983165A - 对生物样品实施方案的文库制备***的操作 - Google Patents

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乔舒阿·斯塔尔
贾森·迈尔斯
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ArcherDx LLC
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Asher Texas Co Ltd
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Abstract

提供了生物分析***和用于操作该***的装置的方法。生物分析***的文库制备装置可以对生物样品实施文库制备方案，其中基于来自与生物样品和文库制备装置要使用的资源相关的编码标识符的信息确定文库制备方案。测序装置可以对由文库制备装置制备的文库实施测序过程。用于实施该过程的测序装置的配置可包括接收由文库制备装置产生的样品信息并对所述样品信息进行处理以产生测序装置的配置信息。可以分析来自测序过程的结果以基于该样品信息确定核酸序列。

Description

对生物样品实施方案的文库制备***的操作
相关申请
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求美国临时专利申请No.62/398,841、62/399,152、62/399,157、62/399,184、62/399,195、62/399,205、62/399,211和62/399,219的优先权，其中每一个均于2016年9月23日提交，并且根据35 U.S.C.§§120和365(c)要求于2017年9月15日提交的PCT国际申请No.PCT/US2017/051924的优先权，并且根据35 U.S.C.§119(e)其要求于2016年9月15日提交的美国临时专利申请No.62/395,339和于2017年9月15日提交的PCT国际申请No.PCT/US2017/051927的优先权，并且根据35 U.S.C.§119(e)其要求于2016年9月15日提交的美国临时专利申请No.62/395,347的优先权，其中每个申请的全部内容在此通过引用并入。
技术领域
本发明总体上涉及用于自动化处理分子(例如核酸)的***及相关方法。
背景技术
已经开发了许多用于处理核酸的方法。这样的方法通常包括多个酶促、纯化和制备步骤，这使得它们费力且容易出错，包括与污染相关的错误、***的使用者错误和过程偏差。作为结果，其通常难以可靠且可重现地执行这样的过程，特别是当所述过程在商业上进行时，例如在多路复用(multiplex)或高通量环境中。
核酸测序技术可以确定脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)内核苷酸的排列。核酸可包含在生物样品中，其可以通过对样品实施处理步骤来“制备”用于测序。例如，可以“制备”生物样品的核酸片段文库，以适合于将用于分析生物样品的测序的类型。
发明概述
本发明总体上涉及用于处理核酸的***及相关方法。在一些实施方案中，该***包含盒(cartridge)，所述盒包含匣(cassette)；和/或有利于自动化处理核酸(包括自动化核酸文库制备)的微流体通道。在一些实施方案中，提供了用于自动化处理核酸以产生用于下一代测序(next generation sequencing)和/或其他下游分析技术的材料的***及相关方法。
本发明的一些方面涉及操作文库制备装置的方法，所述文库制备装置配置成实施多个文库制备方案以制备用于测序的生物样品，所述多个文库制备方案中的每一个包含不同的文库制备操作组。在一些实施方案中，所述方法涉及配置文库制备装置以对生物样品实施多个文库制备方案中的文库制备方案以制备用于测序的生物样品；以及操作所述文库制备装置以对生物样品实施文库制备方案从而制备用于测序的生物样品。在一些实施方案中，配置文库制备装置的步骤包括：接收指示与所述生物样品和所述文库制备装置在实施所述文库制备方案中要使用的至少一种资源(resource)相关的编码标识符(encodedidentifier)的信息；至少部分地基于指示所述编码标识符的信息，从文库制备方案组中选择要实施的文库制备方案；以及存储指示要对生物样品实施所选择的文库制备方案的信息。
在某些实施方案中，选择文库制备方案包括基于编码标识符自动选择文库制备方案。在某些实施方案中，选择文库制备方案还包括在选择中在不需人为干预的情况下选择所述文库制备方案。
在某些实施方案中，与生物样品和至少一种资源相关的编码标识符是电子可读标识符。在某些实施方案中，与生物样品相关的编码标识符是条码。在某些实施方案中，接收指示编码标识符的信息包括扫描条码。在某些实施方案中，文库制备装置包含条码扫描仪；并且接收指示编码标识符的信息包括用文库制备装置的条码扫描仪扫描条码。在某些实施方案中，与生物样品相关的编码标识符是近场通信(Near Field Communication，NFC)标签。在某些实施方案中，接收指示编码标识符的信息包括询问(interrogating)NFC标签。
在某些实施方案中，文库制备装置包含NFC询问器；并且接收指示编码标识符的信息包括用文库制备装置的NFC询问器询问所述NFC标签。
在某些实施方案中，接收指示与生物样品和至少一种资源相关的编码标识符的信息包括接收与生物样品相关的信息。
在某些实施方案中，接收指示与生物样品和至少一种资源相关的编码标识符的信息包括接收标识生物样品和标识配置成在实施文库制备方案期间容纳所述生物样品的盒的信息；并且选择文库制备方案包括至少部分地基于指示盒的信息来选择方案。
在某些实施方案中，所述盒为配置成与所述多个文库制备方案中的一个或更多个文库制备方案一起使用的类型，所述盒布置成至少部分地通过包含预先设置在所述盒内的材料来实施，所述材料用于实施所述一个或更多个文库制备方案；所述标识盒的信息包括标识盒的类型的信息；并且选择文库制备方案包括至少部分地基于所述标识盒的类型的信息来选择方案。
在某些实施方案中，接收指示与生物样品和至少一种资源相关的编码标识符的信息包括：接收标识要在待实施的文库制备方案中使用的至少一种材料的信息；并且选择文库制备方案包括基于标识要在文库制备方案中使用的至少一种材料的信息选择文库制备方案。
在某些实施方案中，接收指示与生物样品和至少一种资源相关的编码标识符的信息包括接收与配置成在实施文库制备方案期间容纳所述生物样品的盒相关的编码标识符；配置文库制备装置还包括从至少一个数据存储区并基于编码标识符检索标识所述生物样品和标识所述文库制备方案要使用的至少一种资源的信息；并且选择文库制备方案包括基于标识生物样品和至少一种资源的检索信息选择文库制备方案。
在一些实施方案中，配置文库制备装置还包括：确定操作所述文库制备装置以实施文库制备方案的文库制备操作的时间表；并且操作所述文库制备装置包括操作所述文库制备装置以根据所述时间表实施文库制备操作。
在某些实施方案中，确定时间表包括：评价用于利用文库制备装置实施文库制备方案的文库制备操作的多个时间表选项的估计完成时间；以及基于评价结果选择多个时间表选项中的一个。
在一些实施方案中，确定所述时间表还包括评价第一存储信息，其关于实施所述文库制备方案的所述文库制备操作的至少第一部分的估计持续时间；以及对于文库制备选项的至少第二部分评价第二存储信息，其关于在完成操作之后开始后续操作之前的持续时间的容差(tolerance)。
在某些实施方案中，文库制备装置包含多个样品孔，在所述样品孔中对所述生物样品实施文库制备方案；并且确定在多个样品孔中的第一样品孔中实施文库制备方案的时间表还包括评价用于在文库制备装置的第二样品孔中对第二生物样品实施第二文库制备方案的第二时间表。
在一些实施方案中，操作文库制备装置以对生物样品实施文库制备方案包括操作文库制备装置以实施文库制备操作，所述文库制备操作包括操作文库制备装置以将生物样品的至少一部分暴露在一定温度下一段时间。
在某些实施方案中，操作文库制备装置以对生物样品实施文库制备方案包括操作所述文库制备装置以实施文库制备操作，所述文库制备操作包括操作所述文库制备装置以将一定体积的材料从所述文库制备装置内的第一位置运输(transport)至第二位置。
在一些实施方案中，所述方法还包括提供文库制备方案是否完成的指示，并且当文库制备方案指示为完成时解锁文库制备装置的开口。
在某些实施方案中，文库制备装置包含多个盒舱(cartridge bay)，每个盒舱配置成容纳盒，在所述盒中对生物样品实施文库制备方案。在某些实施方案中，所述方法还包括配置文库制备装置以在位于多个盒舱的第一盒舱中的第一盒中实施文库制备方案。在某些实施方案中，所述方法还包括在实施第一盒中的文库制备方案的至少一部分期间防止对多个盒舱的第二盒舱的访问。
本发明的另一些方面涉及配置待对生物样品进行的测序过程以确定所述生物样品中包含的至少一种核酸序列的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：接收由对所述生物样品实施文库制备方案的文库制备装置产生的样品信息，以制备用于测序的生物样品，所述样品信息标识包含至少一种核酸的生物样品；处理由文库制备装置产生的样品信息，以产生将对生物样品进行测序过程的测序装置的配置信息，所述配置信息标识出被测序装置用于调节所述测序过程的进行的至少一个参数；以及将测序装置的配置信息存储在至少一个数据存储区中。
在某些实施方案中，接收样品信息包括标识确定生物样品的信息。在一些实施方案中，接收样品信息包括接收标识组织类型的信息。在某些实施方案中，接收样品信息包括接收标识与生物样品相关的患者的信息。在一些实施方案中，接收样品信息包括接收标识对生物样品实施的文库制备方案的信息。
在某些实施方案中，接收样品信息包括接收关于文库制备方案的实施结果的信息。在一些实施方案中，接收样品信息包括接收关于对生物样品进行qPCR过程的结果的信息。在一些实施方案中，关于qPCR结果的信息包括关于qPCR过程的结果强度的信息。在某些实施方案中，关于qPCR结果的信息包括至少一种核酸序列和与所述至少一种核酸序列相关的至少一种质量评分。
在一些实施方案中，处理样品信息以产生配置信息包括产生测序装置的样品表(sample sheet)。在某些实施方案中，处理样品信息以产生配置信息还包括：确定要使用的测序装置；以及以所述测序装置接收输入信息的格式产生所述样品表。在一些实施方案中，样品表包含标识生物样品的信息。在某些实施方案中，样品表包含标识文库制备方案的信息。
在一些实施方案中，所述方法还包括：向所述测序装置提供所述样品表。在一些实施方案中，向所述测序装置提供所述样品表包括经由网络与所述测序装置通信。
在某些实施方案中，所述方法还包括：向分用(demultiplexing)装置提供所述样品表，以对所述测序过程的结果实施分用过程。在某些实施方案中，所述分用装置与所述测序装置是同一装置。在一些实施方案中，所述方法还包括：接收关于分用过程的结果的信息并存储分用过程的结果。
在一些实施方案中，接收样品信息包括从文库制备装置接收样品信息。在一些实施方案中，所述方法由文库制备装置实施，并且接收样品信息包括从文库制备装置的数据存储区接收样品信息。
在另一些方面，本发明涉及分析对生物样品进行的测序过程的结果以确定包含在所述生物样品中的核酸序列的方法。在一些实施方案中，所述方法包括接收由对所述样品实施文库制备方案的文库制备装置产生的样品信息，以制备用于测序的生物样品，所述样品信息标识出所述生物样品和对所述生物样品实施的文库制备方案；接收对所述生物样品进行的所述测序过程的结果，所述结果标识在所述测序过程期间在所述生物样品中检测到的至少一种核酸序列；至少部分地基于由所述文库制备装置产生的所述样品信息来配置对所述测序过程的所述结果进行的分析过程；用经配置分析过程分析所述测序过程的结果；以及存储所述经配置分析过程的结果。
在一些实施方案中，接收样品信息包括从文库制备装置接收样品信息。在某些实施方案中，接收测序过程的结果包括从由样品信息所标识的数据存储区的位置接收结果。在一些实施方案中，接收测序过程的结果包括在通过监测数据存储区的位置确定测序过程完成时自动接收测序过程的结果。
当结合附图考虑本发明的多种非限制性实施方案的以下详细描述时，本发明的其他优点和新颖特征将变得明显。在本说明书与通过引用并入的文件包含冲突和/或不一致的公开内容的情况下，应以本说明书为准。
附图简述
将参考附图通过实例描述本发明的非限制性实施方案，附图是示意性的并且不旨在按比例绘制。在附图中，所示的每个相同或几乎相同的组件通常由单个数字表示。为了清楚起见，并非每个组件都标记在每个图中，在解释说明对于使本领域普通技术人员理解本发明来说不是必需的情况下，也没有示出本发明的每个实施方案的每个组件。在图中：
图1是核酸文库制备工作流的示意图；
图2A是使用微流体盒的自动化核酸文库制备的***的图；
图2B是显示使用微流体盒的自动化核酸文库制备的***的内部组件的图；
图3是微流体盒舱组合体(assembly)的透视图；
图4A是微流体盒载体组合体的俯视图；
图4B是微流体盒的透视图；
图5是微流体盒的分解图；
图6举例说明了实施生物样品的文库制备、对生物样品进行测序并对测序结果进行分析的示例性***的组件；
图7是举例说明用于操作文库制备装置以制备用于测序的生物样品，对生物样品进行测序，并对测序结果进行分析的示例性方法的流程图；
图8是举例说明用于确定对生物样品实施的文库制备方案的示例性方法的流程图；
图9是举例说明用于操作对生物样品实施的文库制备的方法的流程图；
图10是举例说明配置待对生物样品进行的测序过程以确定生物样品中包含的至少一种核酸序列的方法的流程图；
图11是举例说明分析对生物样品进行的测序过程的结果以确定生物样品中包含的核酸序列的方法的流程图；
图12是一些实施方案可以使用其进行操作的计算装置的框图；
图13是一些实施方案可以使用其进行操作的计算装置的框图；以及
图14是一些实施方案可以使用其进行操作的计算装置的框图。
发明详述
总体上提供了用于处理核酸的***，其包含具有模块化组件(匣)的盒和/或微流体通道。在一些实施方案中，提供了用于自动化处理核酸以产生用于下一代测序和/或其他下游分析技术之材料的***及相关方法。在一些实施方案中，本文中所述的***包含盒，所述盒包含框架、可***框架中的一个或更多个匣，以及用于运输流体的通道***。在某些实施方案中，所述一个或更多个匣包含配置成容纳和/或接收流体(例如，储存的试剂，样品)的一个或更多个储存器或容器。在一些情况下，储存的试剂可包括一种或更多种冻干球体。本文中所述的***和方法可用于进行化学和/或生物反应，其包括用于核酸处理的反应，包括聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)。在一些实施方案中，本文中所提供的***和方法可用于处理核酸，如图1中所示。例如，在一些实施方案中，图1中所示的核酸制备方法(在本文中对其进行更详细地描述)可以以多路复用方式进行，其中多个不同的(例如，多至8个不同的)样品以自动化方式并行地处理。这样的***和方法可以在实验室、临床环境(例如医院)或研究环境内实施。
在一些实施方案中，本文中所提供的***可用于下一代测序(NGS)样品制备(例如，文库样品制备)。在一些实施方案中，本文中所提供的***可用于样品质量控制。图2A和2B描绘了用作实验室台式仪器的示例性***200，其利用多个一次性匣、引物匣和批量流体匣。在一些实施方案中，该***适用于标准实验室工作台。
在一些实施方案中，***可具有触摸屏界面(例如，如图2A的示例性***中所示，其包含触摸屏界面202)。在一些实施方案中，界面用“估计的完成时间”、“当前处理步骤”或其他指示符显示一个或更多个盒舱中的每一个的状态。在一些实施方案中，可以为一个或更多个盒中的每一个创建日志文件或报告。在一些实施方案中，日志文件或报告可以保存在仪器上。在一些实施方案中，可以从仪器发送文本文件或输出，例如，用于处理的盒的日期范围或用于具有特定序列号的盒。
在一些实施方案中，本文中所提供的***可包含能够接收一个或更多个核酸制备盒的一个或更多个盒舱(例如，两个，如图2B的示例性***中所示，其包含两个盒舱210)。在一些实施方案中，保留盒舱上方的空间以用于XY***224，以将光学模块226(和/或条码扫描仪，例如2-D条码扫描仪)移动到每个盒舱的盖228(例如，加热盖)上方。在一些实施方案中，***包含驱动光学模块226和XY***224的电子模块222。在一些实施方案中，XY***224将定位光学模块226，使得其可激发容器中的材料(例如，荧光团)并收集射出的荧光。在一些实施方案中，这将通过放置在每个容器上的盖(例如，加热盖)中的孔来实现。在一些实施方案中，条码扫描仪将确认已将合适的盒和引物匣******中。在一些实施方案中，光学模块226将根据需要在样品处理期间收集来自每个盒舱中的每个盒的光信号，例如在核酸扩增期间以检测扩增的核酸的水平。在一些实施方案中，本文中所述的***包含有助于***内组件的温度调节的元件，例如一个或更多个风扇或风扇组合体(例如，图2B中所示的风扇组合体220)。
在一些实施方案中，所述一个或更多个盒舱可以以任何组合处理核酸制备盒。在一些实施方案中，每个盒舱例如由操作者或机器人组合体加载。图3描绘了微流体盒舱组合体300的示例性图。在一些实施方案中，当舱处于打开位置时，通过将盒放入载板(carrierplate)370中以形成载板组合体304而将盒加载到舱中。在一些实施方案中，载板本身是可以从盒舱移除的独立组件。该盒舱将盒保持在相对于仪器的已知位置。在一些实施方案中，盖328(例如，加热盖)包含一个或更多个孔330，以便于处理和/或监测在一个或更多个容器中发生的反应。在一些实施方案中，在将新盒加载到仪器上之前，可将引物匣安装到盒上。在一些实施方案中，引物匣将与盒分开包装。在一些实施方案中，可将引物匣置于盒中。在一些实施方案中，将标识引物匣和盒二者，以使得将它们放置在仪器上允许仪器读取它们(例如，使用条码扫描仪)并启动与匣相关的方案。
在一些实施方案中，在将载体安装到仪器中之前，可将大量试剂加载到载体中。在一些实施方案中，可以通过仪器或远程样品加载站上的界面告知使用者或机器人组合体要加载哪些试剂以及将它们加载在何处。在一些实施方案中，在将具有引物匣的盒加载到仪器中之后，使用者具有选择某些反应条件(例如，PCR循环次数)和/或要在盒上运行的样品量的选择权。在一些实施方案中，每个盒可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个样品的容量。
在一些实施方案中，本文中所提供的***可配置成处理RNA。然而，在一些实施方案中，该***可配置成处理DNA。在一些实施方案中，可以在***内连续或并行处理不同的核酸。在一些实施方案中，盒可用于以自动化方式进行基因融合测定，例如，以检测ALK、RET或ROS1中的遗传改变。这样的测定在本文中以及在2013年11月14日公开的美国专利申请公开号US 2013/0303461和2013年7月20日公开的美国专利申请公开号US 2015/02011050中进行了公开，其各自的内容通过引用整体并入本文中。在一些实施方案中，本文中所提供的***可以以自动化方式处理来自Integrated DNA Technologies的Xgen方案或其他类似的核酸处理方案。
在一些实施方案中，盒和匣将具有实施特定方案所需的所有试剂。在一些实施方案中，一旦载体被加载到盒舱中，就关闭该舱的访问门，并且任选地，盖(例如，加热盖)可以自动降低。在一些实施方案中，盖(例如，加热盖)的降低迫使(或放置)盒向下到加热器护套阵列上，其符合盒中的一个或更多个温度控制器皿的组中的每一个。在一些实施方案中，这将盒垂直地放置在抽屉组合体中的已知位置。在一些实施方案中，盖的降低迫使盒向下进入这样的位置，在该位置，盒中存在的旋转阀能够与控制盒中阀的旋转位置的相应驱动器衔接。在一些实施方案中，提供自动化组件以确保旋转阀与其驱动器正确衔接。
在本文中所提供的方法的一些实施方案中，存在于盒中(例如，在匣的容器内)的核酸样品将与冻干球体混合。在一些实施方案中，冻干球体将包含将连接于样品的荧光团。在一些实施方案中，在冻干球体中还将存在“参照物质”，其含有已知量的分子(例如，合成DNA)。在一些实施方案中，连接于“参照物质”的是另一荧光团，其将发射与样品荧光团不同波长的光。在一些实施方案中，使用的荧光团可以通过嵌入染料(例如SYBR Green)或报道子/猝灭剂化学(例如TaqMan等)连接于样品或“参照物质”。在一些实施方案中，在定量PCR(qPCR)循环期间，将监测两种荧光团的荧光，并随后用于通过比较CT方法确定样品中核酸(例如DNA，cDNA)的量。
有利地，本文中所述的某些***可以包含模块化组件(例如匣)，其可以允许定制要进行的特定反应和/或步骤。在一些实施方案中，用于进行特定类型反应的某些匣包括在盒中。例如，盒中可以存在包含含有用于进行PCR反应多个步骤的不同试剂的冻干球体的容器的匣。框架或盒还可包含空区域，以供使用者***包含用于在盒中进行的特定反应(或反应组)的特定流体和/或试剂的一个或更多个匣。例如，使用者可将包含特定缓冲液、试剂、醇和/或引物的一个或更多个匣***框架或盒中。作为替代地，使用者可以将包含不同的流体和/或试剂组的不同的匣组***框架或匣的空区域中，以进行不同的反应和/或实验。在将匣***框架或盒中之后，它们可以与用于运输流体的通道***形成流体连通，以进行反应/分析。
在一些实施方案中，可通过将不同的匣***盒中来同时或依次进行多个分析。例如，本文中所述的***和方法可有利地提供分析两个或更多个样品而无需打开***或更换盒的能力。例如，在一些情况下，可以并行进行使用一个或更多个样品的一个或更多个反应(例如，并行进行两个或更多个PCR反应)。这样的模块性和灵活性可以允许分析多个样品，每个样品可需要在单个流体***内进行一个或数个反应步骤。因此，可以使用本文中所述的***和方法进行多个复杂的反应和分析。
与某些现有的流体***和方法不同，本文中所述的***和方法可以是可重复使用的(例如，可重复使用的载板)或一次性的(例如，包括匣和多种流体组件的可消耗组件)。在一些情况下，与用于进行类似反应和实验的某些现有流体***相比，本文中所述的***可占据相对小的占用空间(footprint)。
在一些实施方案中，匣和/或盒包含与一个或更多个样品进行特定反应或分析(或者反应或分析的组)所需的储存的流体和/或试剂。匣的实例包括但不限于试剂匣、引物匣、缓冲液匣、废物匣、样品匣和输出匣。可以使用其他合适的模块或匣。这样的匣可以以在使用储存的试剂之前防止或消除那些试剂的污染或损失的方式进行配置。其他优点在下面更详细地描述。
在一个实施方案中，如图4A和4B中举例说明性地示出的，盒400包含框架410和匣420、422、424、426、428、430、432和440。在一些实施方案中，这些匣中的每一个可以与通道***(例如定位在匣下方，未示出)流体连通。在一些实施方案中，匣428(例如试剂匣)、430(例如试剂匣)和432(例如试剂匣)中的至少一个可由使用者***到框架410中，以使得匣与通道***流体连通。例如，在一些实施方案中，匣428、430和432中的一个是包含反应缓冲液(例如Tris缓冲液)的试剂匣。在某些实施方案中，匣428、430和/或432可包含用于反应或反应的组的一种或更多种试剂和/或反应容器。在一些实施方案中，模块440包含多个样品孔和/或输出孔(例如，配置成接收一个或更多个样品的样品孔)。在一些情况下，匣420、422、424和426可包含一种或更多种储存的试剂或反应物(例如，冻干球体)。例如，匣420、422、424和426中的每一个可包含用于进行分开的反应的不同的储存试剂或反应物组。例如，匣420可包含用于进行第一PCR反应的第一试剂组，并且匣422可包含用于进行第二PCR反应的第二试剂组。第一和第二反应可以同时(例如并行)或依次进行。
在一些实施方案中，如图4A中举例说明性地示出的，载板组合体480包含载板470和包含模块450、452、454、456、458和460的另外的匣。在一个示例性实施方案中，匣450、452、454、456、458和460可各自包含一种或更多种储存的试剂，和/或可配置和布置成接收一种或更多种流体(例如，模块458可以是配置成收集反应废液的废物模块)。在一些实施方案中，匣450、452、454、456、458和460中的一个或更多个可以是可再填充的。
图5是根据一组实施方案的示例性盒500的分解图。盒500包含引物匣510和引物匣515，其可***框架520中的一个或更多个开口中。盒500还包含流体层组合体540，其包含与框架520相邻且不整合的通道***。在一些实施方案中，一组匣532(例如，包含一个或更多个引物匣、缓冲液匣、试剂匣和/或废物匣，每个任选地包含一个或更多个容器)、一组反应匣534(其包含反应容器)、输入/输出匣533(其包含样品输入容器536和输出容器538)可***到框架520中的一个或更多个开口中。在一些实施方案中，盒500包含阀板550。在一些实施方案中，阀板550连接(例如按扣(snap))进入框架520并将框架520中的流体层组合体540和匣532、533和534保持就位。在某些实施方案中，如本文中所述，盒500包含阀560和多个密封件(seal)565。在一些情况下，框架520和/或一个或更多个模块可被覆盖物570、572和/或574覆盖。
本申请的一些方面涉及用于分析生物样品(例如，通过核酸测序和随后的测序结果分析)的工作流技术，其包括通过形成一个或更多个文库制备用于分析的生物样品。
更特别地，在本文中所述的一些实施方案中，生物样品分析***布置成自配置以实施分析工作流，以操作***的一个或多个组件从而制备用于分析的样品和/或对样品进行分析。例如，在一些实施方案中，使用者可以选择生物样品并选择在制备用于后续分析的样品中使用的资源。一旦将样品和资源指定给生物样品分析***，与用于分析生物样品的常规过程相比，该***可以实施工作流而无需进一步的使用者干预，或者需要降低的使用者干预。工作流可包括确定要对生物样品实施的文库制备方案，使用文库制备***实施文库制备方案，配置文库的后续分析(其包括通过提供关于文库制备方案的结果的信息)，以及触发对文库的后续分析。如下面详细讨论的，在一些实施方案中，可以唯一地标识要由生物样品分析***使用的材料，并且材料的唯一标识可以使***能够配置其自身以实施一个或更多个操作。例如，生物样品分析***可以基于对要使用的材料的唯一标识符的评价来确定要实施的操作和/或如何实施操作。以这种方式，可以消除或降低生物样品分析中的使用者干预。
在一些实施方案中，生物分析***可包含文库制备***(例如图2A和2B中所示的***200)，以对生物样品进行文库制备方案从而产生用于分析生物样品的一个或更多个文库。文库可包含核酸(例如RNA，DNA)片段，其可与特定的生物来源(例如细胞、组织、生物体)相关。核酸片段可以是对生物样品进行的扩增过程(例如，聚合酶链式反应(PCR)程序)的产物。文库可以适用于核酸测序，并且扩增过程可以改善测序结果，例如通过扩增文库中核酸片段的数量。文库的制备可包括制备具有期望长度的核酸片段和/或将期望的一个或更多个核苷酸序列(例如衔接子)***核酸区段中以使片段适于核酸测序。以下进一步讨论与核酸制备、扩增和衔接子***处理方案相关的另外的细节。
为了形成文库，可以对生物样品进行动作序列(例如，添加试剂，将样品保持在特定温度下)。动作序列可称为“文库制备方案”。文库制备方案可在动作、动作中使用的资源类型(例如设备，或材料例如引物、试剂、聚合酶)和这些动作的参数(例如温度，持续时间)方面变化。不同的文库制备方案可以以不同的方式制备生物样品，例如用于不同类型的后续分析。例如，通过某种类型的测序装置制备用于核酸测序的生物样品可包括对生物样品进行文库制备方案，该方案以某种方式制备文库以通过一种类型的测序装置进行测序。因此，对样品实施的文库制备方案可取决于包括以下的一种或更多种因素：样品类型、对样品进行的测定类型、测序装置的类型以及用于对核酸进行测序的操作类型。
本发明人已识别并认识到生物分析***的优点，该生物分析***在没有或有限的使用者干预的情况下实施文库制备方案的动作。更特别地，本发明人已识别并认识到这样的自配置***，其通过选择要对生物样品实施的文库制备方案并配置***以实施所选择的方案。通过以这种方式将***布置为自配置，可以减少或消除方案的配置或实施中的人为误差，这可使得产生用于分析的正确文库的可能性提高和/或生物分析***的吞吐量(throughput)提高。另外，通过在制备文库过程中降低或消除人为干预，可以释放人使用者(例如实验室技术人员)以进行其他任务，从而进一步提高实验室的吞吐量。
本发明人已另外识别并认识到，唯一地标识生物样品分析***要使用的每种材料可以实现这样的自配置生物分析***。例如，如上所讨论的，本发明人已识别并认识到可以对不同的生物样品或者可以使用不同的资源(如不同的试剂或不同的设备)实施不同的文库制备方案。本发明人进一步识别并认识到，可以基于要对其实施文库制备方案的样品和在实施该方案中使用的资源的评价来确定性地标识该方案。例如，当为生物样品分析***提供生物样品的唯一标识符、待用于文库制备的设备以及待用于文库制备的材料(例如引物，试剂)时，***可评价唯一标识符并确定性地标识要实施的文库制备方案。具体地，***可以确定性地标识包含要实施的动作、要在动作中使用的资源以及动作的参数的文库制备方案。因此，作为一个具体实例，生物分析***可以基于对唯一标识符的评价来确定要实施的方案，包括实施多个PCR循环并且另外包括加热动作，以及加热动作的持续时间和温度。生物分析***基于生物样品的唯一标识符和要使用的资源的这样的自配置可以显著降低文库制备中的人为误差，特别是对于包含人手动地先前指定的详细动作的冗长序列的文库制备方案。如下面详细讨论的，唯一标识符可以是编码标识符(例如以2D和/或3D条码编码的标识符)，和/或近场通信(NFC)标签(如射频识别(Radio-Frequency Identification，RFID)标签)。
因此，在一些实施方案中，生物分析***可以是可配置成对不同的生物样品实施不同的文库制备方案，以制备用于不同的后续分析的那些样品。文库制备***可以包含可帮助对生物样品实施文库制备方案的组件。文库制备***的微流体***可以将流体从一个位置运输到另一个位置。根据文库制备方案，装置的加热板可以在一定温度下将装置内的区域保持一段时间。配置成在文库制备方案的实施期间容纳生物样品、包含多个样品孔的模块(例如图4A和4B中所示的模块440)可以与文库制备***接合，以使得文库制备***的组件(例如微流体***，加热板)可以对样品实施方案的步骤。在一些实施方案中，文库制备***可以对位于相同盒中或不同盒上的多个样品实施文库制备方案。
如上所讨论的，文库制备***可以制备待进行一种或更多种类型的后续分析(其可以是或包括一种或更多种类型的测定)的生物样品的文库。一种这样的类型的后续测定可以包括对文库进行核酸测序，测序过程的结果标识生物样品的核酸序列。在这样的一些实施方案中，测定装置可以是测序装置(例如下一代测序仪)，其配置成对生物样品的文库进行测序过程。由测序仪实施的测序过程可取决于样品的类型和/或如何制备样品用于测序(例如，核酸片段的长度，核酸片段中的衔接子的类型)。
文库制备***可以产生标识生物样品的样品信息和/或对生物样品实施的文库制备方案。测定装置(例如，测序装置)可以接收样品信息并配置对通过对生物样品实施文库制备方案而产生的文库进行的测定过程。样品信息可包括由文库制备***接收到的信息(例如由与样品相关的编码标识符接收到的信息)的链接。测定装置可以使用存储在样品信息中的链接来访问和检索存储在文库制备***上的信息。由文库制备***产生的样品信息可以以任何合适的格式存储，其中用于对文库进行测定过程的测定装置可以检索信息。在一些实施方案中，样品信息可以存储为样品表。由文库制备***产生的样品表可以由测定装置基于测定装置从样品标识符接收信息而自动访问。样品表可包含用于存储测定结果(例如，FASTQ文件)的数据位置。分析装置可监测数据位置以确定测定装置是否已完成测定过程。
以下在测序的背景下描述实施例。然而，应理解的是，核酸测序仅仅是测定的一个实例，并且一些实施方案不限于与测序一起使用。相反，可以使用任何合适的测定装置对所制备的文库进行测定。
可以分析来自测定的结果以标识与生物样品相关的结果中列出的信息。例如，可以分析作为测序过程的结果获得的序列读取，以标识在生物样品中检测到的一种或更多种核酸序列。序列读取可以指示文库片段的核苷酸(例如，A、T、G、C)的顺序。还可获得与序列读取相关的质量评分作为测序过程的结果。质量评分可包括与作为特定类型的核苷酸的单独核苷酸的同一性的准确性相关的值。例如，质量评分可提供对为A、T、G或C的序列中核苷酸的置信度的指示。使用可根据制备样品用于测序的方式定制或以其他方式配置的分析过程，和/或用于对样品进行测序的过程，可以分析单独的序列读取及相关的质量评分以标识生物样品的核苷酸序列。在一些实施方案中，不同于测序装置的分析装置可以实施对来自测序过程的序列读取进行的分析过程。
在一些实施方案中，分析装置可配置成基于样品信息、文库制备方案的结果和/或测序结果来进行分析过程。例如，文库制备方案的结果可提供向测定装置提供的文库质量的指示，并且分析装置可基于文库制备方案的结果配置测定结果的分析过程。分析装置可接收标识样品的信息并检索文库制备方案的结果以调整分析过程的配置，从而对测定结果实施。调整的分析过程配置可以考虑文库的质量(例如生物样品中扩增发生的程度)以自配置分析过程，这可减少或消除使用者干预，作为分析测定结果的一部分。在一些实施方案中，分析装置可监测存储测定结果的数据位置，并自动对测定结果实施经配置分析过程而无需使用者输入启动分析过程。
因此，以下所述的是生物样品分析***的一些实施方案，所述生物样品分析***可以是自配置的以实施与生物样品的分析相关的操作。***的自配置可以通过对要在处理的文库制备中使用的样品和资源的***的初始标识来触发。一旦指定了样品和资源，生物样品分析***可自配置成对生物样品实施工作流，而无需或降低使用者在工作流中的干预。然而，应理解的是，实施方案不限于根据以下示例进行操作，因为其他实施方案是可能的。
扩增(AMP)方法
本文中描述的是确定与已知的靶核苷酸序列邻接的核苷酸序列的方法。可以使用本文中所公开的***以自动化方式实施所述方法。传统的测序方法随机地(例如，“鸟枪”测序)或在用于设计引物的两个已知序列之间产生序列信息。相比之下，在一些实施方案中，本文中所述的某些方法允许以高水平的特异性和灵敏度确定已知序列的单个区域的上游或下游的核苷酸序列(例如，测序)。
在一些实施方案中，本文中所提供的***可配置成例如以自动化方式实施使用下一代测序技术在确定核苷酸序列之前富集特定核苷酸序列的方法。在一些实施方案中，本文中所提供的方法可涉及富集包含脱氧核糖核酸(DNA)的样品。在一些实施方案中，本文中所提供的方法包括：(a)将包含已知靶核苷酸序列的靶核酸与通用寡核苷酸尾部衔接子(tail-adapter)连接；(b)用第一衔接子引物和第一靶特异性引物扩增靶核酸的一部分和通用寡核苷酸尾部衔接子的扩增链；(c)用第二衔接子引物和第二靶特异性引物扩增从步骤(b)得到的扩增子的一部分；以及(d)将DNA溶液转移至使用者。在一些实施方案中，所述方法的一个或更多个步骤可在本文中所提供的盒的不同容器内进行。在一些实施方案中，盒中的微流体通道和阀有利于反应材料/流体从盒中的一个容器转移至另一个容器，以允许反应以自动化方式进行。在一些实施方案中，随后可使用下一代测序技术用第一和第二测序引物对DNA溶液进行测序。
在一些实施方案中，使用本文中所提供的***处理的样品包含基因组DNA。在一些实施方案中，包含基因组DNA的样品包括在步骤(a)之前的片段化步骤。在一些实施方案中，每个连接和扩增步骤可任选地包括随后的纯化步骤(例如，步骤(a)与步骤(b)之间的样品纯化，步骤(b)与步骤(c)之间的样品纯化，和/或在步骤(c)之后的样品纯化)。例如，富集包含基因组DNA的样品的方法可包括：(a)基因组DNA片段化；(b)将包含已知靶核苷酸序列的靶核酸与通用寡核苷酸尾部衔接子连接；(c)连接后样品纯化；(d)用第一衔接子引物和第一靶特异性引物扩增靶核酸的一部分和通用寡核苷酸尾部衔接子的扩增链；(e)扩增后样品纯化；(f)用第二衔接子引物和第二靶特异性引物扩增从步骤(d)得到的扩增子的一部分；(g)扩增后样品纯化；以及(h)将经纯化DNA溶液转移至使用者。在一些实施方案中，所述方法的步骤可在本文中所提供的盒的不同容器内进行。在一些实施方案中，盒中的微流体通道和阀以自动化方式有利于反应材料/流体从盒中的一个容器转移至另一个容器。随后可使用下一代测序技术用第一和第二测序引物对经纯化样品进行测序。
在一些实施方案中，本文中所提供的***和方法可用于处理核酸，如图1中的示例性工作流中所示。提供了核酸样品120。在一些实施方案中，样品包含RNA。在一些实施方案中，样品包含DNA(例如，双链互补DNA(cDNA)和/或双链基因组DNA(gDNA)102)。在一些实施方案中，使核酸样品经历包括核酸末端修复(end repair)和/或dA加尾(dA tailing)的步骤102。在一些实施方案中，使核酸样品经历包含衔接子连接(adapter ligation)的步骤104。在一些实施方案中，通用寡核苷酸衔接子122与核酸样品中的一种或更多种核酸连接。在一些实施方案中，连接步骤包括平端连接。在一些实施方案中，连接步骤包括黏端连接。在一些实施方案中，连接步骤包括突出端连接。在一些实施方案中，连接步骤包括TA连接。在一些实施方案中，进行dA加尾步骤102以在核酸样品中产生与通用寡核苷酸衔接子中的突出端互补的突出端(例如，TA连接)。在一些实施方案中，将通用寡核苷酸衔接子与核酸样品中的一个或更多个核酸的两端连接，以产生侧翼为通用寡核苷酸衔接子的核酸124。在一些实施方案中，使用衔接子引物130和第一靶特异性引物132进行初始一轮扩增。在一些实施方案中，使用衔接子引物和第二靶特异性引物134对经扩增样品进行第二轮扩增。在一些实施方案中，第二靶特异性引物相对于第一靶特异性引物是嵌套的。在一些实施方案中，第二靶特异性引物包含位于杂交序列5’的另外序列(例如共同序列)，其可包含条码(barcode)、索引(index)、衔接子序列或测序引物位点。在一些实施方案中，第二靶特异性引物还与另外的引物接触，所述引物与第二靶特异性引物的共同序列杂交，如134所示。在一些实施方案中，第二轮扩增产生核酸126，其适用于核酸测序(例如，下一代测序方法)。
在一些实施方案中，本文中所提供的***和方法可用于处理核酸，如以下中所述：于2017年9月15日提交的PCT国际申请No.PCT/US2017/051924，并且其根据35 U.S.C.§119(e)要求于2016年9月15日提交的美国临时专利申请No.62/395,339的优先权；以及于2017年9月15日提交的PCT国际申请No.PCT/US2017/051927，并且其根据35 U.S.C.§119(e)要求于2016年9月15日提交的美国临时专利申请No.62/395,347的优先权，其中与核酸文库制备相关的每一项的全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，使用本文中所提供的***处理的样品包含核糖核酸(RNA)。在一些实施方案中，本文中所提供的***可用于通过包括以下的方法处理RNA：(a)在杂交条件下使包含已知靶核苷酸序列的靶核酸分子与随机引物群接触；(b)进行模板依赖性延伸反应，该反应由杂交的随机引物引发并使用杂交位点下游的靶核酸分子的部分作为模板；(c)在杂交条件下使步骤(b)的产物与初始靶特异性引物接触；(d)进行模板依赖性延伸反应，该反应由杂交的初始靶特异性引物引发并使用靶核酸分子作为模板；(e)对核酸进行末端修复、磷酸化和腺苷酸化；(f)将包含已知靶核苷酸序列的靶核酸与通用寡核苷酸尾部衔接子连接；(g)用第一衔接子引物和第一靶特异性引物扩增靶核酸的一部分和通用寡核苷酸尾部衔接子的扩增链；(h)用第二衔接子引物和第二靶特异性引物扩增从步骤(g)得到的扩增子的一部分；以及(i)将cDNA溶液转移至使用者。在一些实施方案中，所述方法的一个或更多个步骤可在本文中所提供的盒的不同容器内进行。在一些实施方案中，随后可使用下一代测序技术用第一和第二测序引物对cDNA溶液进行测序。
在一些实施方案中，每个连接和扩增步骤可任选地包括随后的样品纯化步骤(例如，步骤(f)与步骤(g)之间的样品纯化步骤，步骤(g)与步骤(h)之间的样品纯化步骤，和/或步骤(h)之后的样品纯化)。例如，富集包含RNA之样品的方法可包括：(a)在杂交条件下使包含已知靶核苷酸序列的靶核酸分子与随机引物群接触；(b)进行模板依赖性延伸反应，该反应由杂交的随机引物引发，并使用杂交位点下游的靶核酸分子的部分作为模板；(c)在杂交条件下使步骤(b)的产物与初始靶特异性引物接触；(d)进行模板依赖性延伸反应，该反应由杂交的初始靶特异性引物引发并使用靶核酸分子作为模板；(e)对核酸进行末端修复、磷酸化和腺苷酸化；(f)将包含已知靶核苷酸序列的靶核酸与通用寡核苷酸尾部衔接子连接；(g)连接后样品纯化；(h)用第一衔接子引物和第一靶特异性引物扩增靶核酸的一部分和通用寡核苷酸尾部衔接子的扩增链；(i)扩增后样品纯化；(j)用第二衔接子引物和第二靶特异性引物扩增从步骤(h)得到的扩增子的一部分；(k)扩增后样品纯化；以及(1)将经纯化cDNA溶液转移至使用者。在一些实施方案中，所述方法的一个或更多个步骤可在本文中所提供的盒的不同容器内进行。随后可使用下一代测序技术用第一和第二测序引物对经纯化样品进行测序。
在一些实施方案中，本文中所提供的***可配置成例如以自动化方式实施富集核苷酸序列的方法，所述核苷酸序列包含未知核苷酸序列的邻近区下游的已知靶核苷酸序列(例如，包含含有未知序列的5′区和含有已知序列的3′区的核苷酸序列)。在一些实施方案中，该方法包括：(a)在杂交条件下使包含已知的靶核苷酸序列的靶核酸分子与初始靶特异性引物接触；(b)进行模板依赖性延伸反应，该反应由杂交的初始靶特异性引物引发并使用靶核酸分子作为模板；(c)在杂交条件下使步骤(b)的产物与加尾的随机引物群接触；(d)进行模板依赖性延伸反应，该反应由杂交的加尾的随机引物引发并使用杂交位点下游的靶核酸分子部分作为模板；(e)用第一尾部引物和第一靶特异性引物扩增靶核酸分子的一部分和加尾的随机引物序列；(f)用第二尾部引物和第二靶特异性引物扩增从步骤(e)得到的扩增子的一部分；以及(g)将cDNA溶液转移至使用者。随后可使用下一代测序技术用第一和第二测序引物对cDNA溶液进行测序。在一些实施方案中，加尾的随机引物群包含单链寡核苷酸分子，其具有与第一测序引物相同的5′核酸序列和包含约6至约12个随机核苷酸的3′核酸序列。在一些实施方案中，第一靶特异性引物包含可在退火温度下与靶核酸的已知靶核苷酸序列特异性退火的核酸序列。在一些实施方案中，第二靶特异性引物包含3′部分，其包含可与从步骤(e)得到的扩增子所包含的已知靶核苷酸序列的一部分特异性退火的核酸序列；以及5′部分，其包含与第二测序引物相同的核酸序列，并且第二靶特异性引物相对于第一靶特异性引物是嵌套的。在一些实施方案中，第一尾部引物包含与加尾的随机引物相同的核酸序列。在一些实施方案中，第二尾部引物包含与第一测序引物的一部分相同的核酸序列，并且相对于第一尾部引物是嵌套的。在一些实施方案中，该方法的一个或更多个步骤可在本文中所提供的盒的不同容器内进行。
在一些实施方案中，本文中所提供的***可配置成例如以自动化方式实施富集核苷酸序列的方法，所述核苷酸序列包含未知核苷酸序列的邻近区上游的已知靶核苷酸序列(例如，包含含有已知序列的5′区和含有未知序列的3′区的核苷酸序列)。在一些实施方案中，该方法包括：(a)在杂交条件下使包含已知的靶核苷酸序列的靶核酸分子与加尾的随机引物群接触；(b)进行模板依赖性延伸反应，该反应由杂交加尾的随机引物引发，并使用杂交位点下游的靶核酸分子部分作为模板；(c)在杂交条件下使步骤(b)的产物与初始靶特异性引物接触；(d)进行模板依赖性延伸反应，该反应由杂交的初始靶特异性引物引发并使用靶核酸分子作为模板；(e)用第一尾部引物和第一靶特异性引物扩增靶核酸分子的一部分和加尾的随机引物序列；(f)用第二尾部引物和第二靶特异性引物扩增从步骤(e)得到的扩增子的一部分；以及(g)将cDNA溶液转移至使用者。随后可使用下一代测序技术用第一和第二测序引物对cDNA溶液进行测序。在一些实施方案中，加尾的随机引物群包含单链寡核苷酸分子，其具有与第一测序引物相同的5′核酸序列和包含约6至约12个随机核苷酸的3′核酸序列。在一些实施方案中，第一靶特异性引物包含可在退火温度下与靶核酸的已知靶核苷酸序列特异性退火的核酸序列。在一些实施方案中，第二靶特异性引物包含3′部分，其包含可与从步骤(c)得到的扩增子所包含的已知靶核苷酸序列的一部分特异性退火的核酸序列；以及5′部分，其包含与第二测序引物相同的核酸序列，并且第二靶特异性引物相对于第一靶特异性引物是嵌套的。在一些实施方案中，第一尾部引物包含与加尾的随机引物相同的核酸序列。在一些实施方案中，第二尾部引物包含与第一测序引物的一部分相同的核酸序列并且相对于第一尾部引物是嵌套的。在一些实施方案中，该方法的一个或更多个步骤可在本文中所提供的盒的不同容器内进行。在一些实施方案中，该方法还包括在初始靶特异性引物延伸之后使样品与RNA酶接触的步骤。在一些实施方案中，加尾的随机引物可形成发夹环结构。在一些实施方案中，初始靶特异性引物和第一靶特异性引物是相同的。在一些实施方案中，加尾的随机引物还包含条码部分，其包含位于与第一测序引物相同的5′核酸序列与包含6至12个随机核苷酸的3′核酸序列之间的6至12个随机核苷酸。
通用寡核苷酸尾部衔接子
本文中使用的术语“通用寡核苷酸尾部衔接子”是指由两条链(阻断链和扩增链)构成并包含第一可连接双链体末端和第二未配对末端的核酸分子。通用寡核苷酸尾部衔接子的阻断链包含5′双链体部分。扩增链包含未配对的5′部分、3′双链体部分、3′T突出端，以及与第一和第二测序引物相同的核酸序列。阻断链和扩增链的双链体部分基本上互补，并形成包含3′T突出端的第一可连接双链体末端，并且双链体部分具有足够的长度以在连接温度下保持双链体形式。
在一些实施方案中，包含与第一和第二测序引物相同的核酸序列的扩增链的部分可至少部分地包含在扩增链的5′未配对部分中。
在一些实施方案中，通用寡核苷酸尾部衔接子可包含双链体部分和未配对部分，其中未配对部分仅包含扩增链的5′部分，即整个阻断链是双链体部分。
在一些实施方案中，通用寡核苷酸尾部衔接子可具有“Y”形，即未配对部分可包含未配对的阻断链和扩增链二者的部分。阻断链的未配对部分在长度上可以比扩增链的未配对部分更短、更长或相等。在一些实施方案中，阻断链的未配对部分可以比扩增链的未配对部分更短。Y形通用寡核苷酸尾部衔接子的优点是，在PCR方案期间，阻断链的未配对部分不会经历3′延伸。
在一些实施方案中，通用寡核苷酸尾部衔接子的阻断链还可包含3′未配对部分，其基本上不与扩增链的5′未配对部分互补；并且其中阻断链的3′未配对部分基本上不与任何引物互补或基本上不与任何引物相同。在一些实施方案中，通用寡核苷酸尾部衔接子的阻断链还可包含3′未配对部分，其在退火温度下不与扩增链的5′未配对部分特异性退火；并且其中阻断链的3′未配对部分在退火温度下不会与任何引物或其互补物特异性退火。
第一扩增步骤
本文中使用的术语“第一靶特异性引物”是指包含这样的核酸序列的单链寡核苷酸，所述核酸序列可在合适的退火条件下与具有靶核酸特征链的核酸模板特异性退火。
在一些实施方案中，引物(例如，靶特异性引物)可包含5′标签序列部分。在一些实施方案中，反应中存在的多种引物(例如，所有第一靶特异性引物)可包含相同的5′标签序列部分。在一些实施方案中，在多重PCR反应中，不同的引物种类可以以脱靶方式彼此相互作用，导致引物延伸并随后通过DNA聚合酶扩增。在这样的一些实施方案中，这些引物二聚体倾向于短，并且它们的有效扩增可超过反应并占优势，导致所期望靶序列的扩增差。因此，在一些实施方案中，在引物中(例如，在靶特异性引物上)包含5′标签序列可导致形成在两端含有相同互补尾部的引物二聚体。在一些实施方案中，在随后的扩增循环中，这样的引物二聚体将变性为单链DNA引物二聚体，每个在其两端包含由5′标签引入的互补序列。在一些实施方案中，代替与这些单链DNA引物二聚体退火的引物，可发生分子内发夹(锅柄样结构，panhandle like structure)形成，这是由于互补标签在同一引物二聚体分子上的最近可及性而不是在分开的分子上与新引物的分子间相互作用。因此，在一些实施方案中，这些引物二聚体可被低效地扩增，以使得引物不会被二聚体指数地消耗用于扩增；相反，标记的引物可保持高且足够的浓度，用于期望的靶序列特异性扩增。在一些实施方案中，引物二聚体的积累在多路复用扩增的情况下可以是不期望的，因为它们竞争并消耗反应中的其他试剂。
在一些实施方案中，5′标签序列可以是富含GC的序列。在一些实施方案中，5′标签序列可包含至少50％的GC含量、至少55％的GC含量、至少60％的GC含量、至少65％的GC含量、至少70％的GC含量、至少75％的GC含量、至少80％的GC含量或更高的GC含量。在一些实施方案中，标签序列可包含至少60％的GC含量。在一些实施方案中，标签序列可包含至少65％的GC含量。
本文中使用的术语“第一衔接子引物”是指包含与第一测序引物的5′部分相同的核酸序列的核酸分子。由于第一尾部衔接子引物因此与扩增链的至少一部分序列相同(与互补相反)，因此它将不能与通用寡核苷酸尾部衔接子本身的任何部分特异性退火。
在第一扩增步骤的第一PCR扩增循环中，第一靶特异性引物可与包含已知靶核苷酸序列的任何核酸的模板链特异性退火。取决于设计第一靶特异性引物的取向，将已知靶核苷酸序列上游或下游的序列合成为与模板链互补的链。如果在PCR的延伸阶段期间，模板链的5′末端终止于连接的通用寡核苷酸尾部衔接子，则新合成的产物链的3′末端将包含与第一尾部衔接子引物互补的序列。在随后的PCR扩增循环中，第一靶特异性引物和第一尾部衔接子引物二者都将能够与靶核酸序列的适当链特异性退火，并且已知的核苷酸靶序列与通用寡核苷酸尾部衔接子之间的序列可被扩增(即，复制)。
第二扩增步骤
本文中使用的术语“第二靶特异性引物”是指包含3′部分和5′部分的单链寡核苷酸，所述3′部分包含可以与由在前的扩增步骤产生的扩增子所包含的已知靶核苷酸序列的一部分特异性退火的核酸序列，并且所述5′部分包含与第二测序引物相同的核酸序列。第二靶特异性引物可通过与第二靶特异性引物的共同序列杂交的另外的引物(例如，具有3′测序衔接子/索引序列的引物)进一步接触。在一些实施方案中，另外的引物可包含位于杂交序列5′的另外的序列，其可包含条码、索引、衔接子序列或测序引物位点。在一些实施方案中，另外的引物是通用测序衔接子/索引引物。第二靶特异性引物相对于第一靶特异性引物是嵌套的。在一些实施方案中，第二靶特异性引物相对于第一靶特异性引物嵌套至少3个核苷酸，例如3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个或者15个或更多个核苷酸。
在一些实施方案中，反应中存在的所有第二靶特异性引物包含相同的5′部分。在一些实施方案中，第二靶特异性引物的5′部分可用于抑制引物二聚体，如针对上文中所述的第一靶特异性引物的5′标签所述。
在一些实施方案中，第一和第二靶特异性引物与靶核酸的相同链基本上互补。在一些实施方案中，与已知的靶序列特异性退火的第一和第二靶特异性引物的部分可包含已知靶核苷酸序列的总共至少20个独特碱基，例如20个或更多个独特碱基、25个或更多个独特碱基、30个或更多个独特碱基、35个或更多个独特碱基、40个或更多个独特碱基、或者50个或更多个独特碱基。在一些实施方案中，与已知的靶序列特异性退火的第一和第二靶特异性引物的部分可包含已知的靶核苷酸序列的总共至少30个独特碱基。
本文中使用的术语“第二衔接子引物”是指包含与第一测序引物的一部分相同的核酸序列的核酸分子，并且相对于第一衔接子引物是嵌套的。因为第二尾部衔接子引物因此与扩增链的至少一部分序列相同(与互补相反)，其将不能与通用寡核苷酸尾部衔接子本身的任何部分特异性退火。在一些实施方案中，第二衔接子引物与第一测序引物相同。
第二衔接子引物应相对于第一衔接子引物是嵌套的，即，第一衔接子引物包含与扩增链相同的核酸序列，其不包含在第二衔接子引物中并且位于比与包含在第二衔接子引物中的扩增链相同的任何序列更靠近扩增引物之5′末端的位置。在一些实施方案中，第二衔接子引物嵌套至少3个核苷酸，例如3个核苷酸、4个核苷酸、5个核苷酸、6个核苷酸、7个核苷酸、8个核苷酸、9个核苷酸、10个核苷酸或更多。
在一些实施方案中，第一衔接子引物可包含与通用寡核苷酸尾部衔接子的扩增链的约20个最5′碱基相同的核酸序列，并且第二衔接子引物可包含与通用寡核苷酸尾部衔接子的扩增链的约30个碱基相同的核酸序列，其5′碱基是扩增链的5′端3′的至少3个核苷酸。
在一些实施方案中，可使用嵌套的引物组。在一些实施方案中，使用嵌套的衔接子引物消除了产生可扩增的最终扩增子的可能性(例如，在桥式PCR或乳液PCR期间)但不能使用某些技术有效测序。在一些实施方案中，可使用半嵌套引物组。
样品纯化步骤
在一些实施方案中，可在方法的任何适当步骤之前和/或之后从酶、引物或缓冲组分中分离靶核酸和/或其扩增产物。可使用任何合适的分离核酸的方法。在一些实施方案中，分离可包括固相可逆固定化(Solid Phase Reversible Immobilization，SPRI)净化。用于SPRI净化的方法是本领域中公知的，例如Agencourt AMPure XP-PCR Purification(目录号A63880，Beckman Coulter；Brea，CA)。在一些实施方案中，酶可通过热处理失活。
在一些实施方案中，可使用适当的方法(例如，纯化、消化等)从核酸制备物中去除未杂交的引物。在一些实施方案中，核酸酶(例如，核酸外切酶I)用于从制备物中去除引物。在一些实施方案中，这样的核酸酶在引物消化后被热失活。一旦核酸酶失活，可将另一组引物与其他合适的组分(例如，酶，缓冲液)一起添加以进行进一步的扩增反应。
测序
在一些方面中，本文中所述的技术涉及富集核酸样品用于寡核苷酸测序的方法。在一些实施方案中，可通过下一代测序方法进行测序。本文中使用的“下一代测序”是指寡核苷酸测序技术，由于并行进行和读出数千至数百万个测序反应，其能够在高于通过常规测序方法(例如，Sanger测序)可能的速率的速率下对寡核苷酸进行测序。下一代测序方法/平台的非限制性实例包括大规模平行签名测序(Massively Parallel SignatureSequencing)(Lynx Therapeutics)；454焦磷酸测序(454 Life Sciences/RocheDiagnostics)；固相可逆染料-终止子测序(Solexa/Illumina)；SOLiD技术(AppliedBiosystems)；离子半导体测序(ION Torrent)；DNA纳米球测序(Complete Genomics)；以及可从Pacific Biosciences、Intelligen Bio-systems和Oxford Nanopore Technologies获得的技术。在一些实施方案中，测序引物可包含与所选择的下一代测序方法相容的部分。下一代测序技术以及相关测序引物的限制和设计参数是本领域中公知的(参见，例如，Shendure等，“Next-generation DNA sequencing，”Nature，2008，第26卷，第10期，1135-1145；Mardis，“The impact of next-generation sequencing technology ongenetics”，Trends in Genetics，2007，第24卷，第3期，第133至141页；Su等，“Next-generation sequencing and its applications in molecular diagnostics”，ExpertRev Mol Diagn，2011，11(3)：333-43；Zhang等，“The impact of next-generationsequencing on genomics”，J Genet Genomics，2011，38(3)：95-109；(Nyren，P等，AnalBiochem 208：17175(1993)；Bentley，D.R.Curr Opin Genet Dev 16：545-52(2006)；Strausberg，R.L.等，Drug Disc Today 13：569-77(2008)；美国专利No.7,282,337；美国专利No.7,279,563；美国专利No.7,226,720；美国专利No.7,220,549；美国专利No.7,169,560；美国专利No.6,818,395；美国专利No.6,911,345；美国公开号2006/0252077；2007/0070349；以及20070070349；其通过引用整体并入本文)。
在一些实施方案中，测序步骤依赖于使用第一和第二测序引物。在一些实施方案中，选择第一和第二测序引物以与本文中所述的下一代测序方法相容。
将测序读取与基因组和/或cDNA序列的已知序列数据库比对的方法是本领域中公知的，并且该过程的软件可商购获得。在一些实施方案中，没有完整地定位到野生型序列数据库的读取(较少的测序引物和/或衔接子核苷酸序列)可以是基因组重排或大的***缺失突变(indel mutation)。在一些实施方案中，包含定位于基因组中多个位置的序列的读取(较少的测序引物和/或衔接子核苷酸序列)可以是基因组重排。
AMP引物
在一些实施方案中，设计四种类型的引物(第一和第二靶特异性引物以及第一和第二衔接子引物)，以使得它们将在约61℃至72℃(例如，约61℃至69℃、约63℃至69℃、约63℃至67℃、约64℃至66℃)的退火温度下与其互补序列特异性退火。在一些实施方案中，设计四种类型的引物使得它们将在低于72℃的退火温度下与其互补序列特异性退火。在一些实施方案中，设计四种类型的引物使得它们将在低于70℃的退火温度下与其互补序列特异性退火。在一些实施方案中，设计四种类型的引物使得它们将在低于68℃的退火温度下与其互补序列特异性退火。在一些实施方案中，设计四种类型的引物使得它们在约65℃的退火温度下与其互补序列特异性退火。在一些实施方案中，本文中所提供的***配置成改变容器温度(例如，通过在不同温度范围之间循环)以有利于引物退火。
在一些实施方案中，与已知靶核苷酸序列特异性退火的靶特异性引物的部分将在约61℃至72℃(例如，约61℃至69℃、约63℃至69℃、约63℃至67℃、约64℃至66℃)的温度下特异性退火。在一些实施方案中，与已知的靶核苷酸序列特异性退火的靶特异性引物的部分将在PCR缓冲液中在约65℃的温度下特异性退火。
在一些实施方案中，本文中所述的引物和/或衔接子不能包含经修饰碱基(例如，引物和/或衔接子不能包含阻断3′胺)。
核酸延伸、扩增和PCR
在一些实施方案中，本文中所述的方法包括延伸方案或步骤。在这样的实施方案中，延伸可从一个或更多个杂交的加尾的随机引物使用所述引物与之杂交的核酸分子作为模板进行。本文中描述了延伸步骤。在一些实施方案中，一个或更多个加尾的随机引物可与样品中的基本上所有核酸杂交，其中许多核酸可不包含已知靶核苷酸序列。因此，在一些实施方案中，由于与不包含已知靶核苷酸序列的模板杂交，可发生随机引物的延伸。
在一些实施方案中，本文中所述的方法可涉及聚合酶链式反应(PCR)扩增方案，其涉及一个或更多个扩增循环。本文中所述的方法的扩增步骤可各自包含PCR扩增方案，即一组聚合酶链式反应(PCR)扩增循环。在一些实施方案中，本文中所提供的***配置成改变容器温度(例如，通过在不同温度范围之间循环)以有利于不同的PCR步骤，例如解链、退火、延伸等。
在一些实施方案中，本文中所提供的***配置成以自动化方式实施扩增方案。本文中使用的术语“扩增方案”是指特异性扩增(提高其丰度)目的核酸的过程。在一些实施方案中，当先前聚合酶延伸的产物充当连续轮次延伸的模板时，发生指数扩增。在一些实施方案中，根据本文中所公开的方法的PCR扩增方案可包含至少一个，并且在一些情况下至少5个或更多个迭代循环。在一些实施方案中，每个迭代循环包括以下步骤：1)链分离(例如，热变性)；2)寡核苷酸引物与模板分子退火；以及3)退火引物的核酸聚合酶延伸。应当理解，可使用这些步骤中的每一个中涉及的任何合适的条件和时间。在一些实施方案中，所选择的条件和时间可取决于长度、序列含量、解链温度、二级结构特征或者与反应中使用的核酸模板和/或引物相关的其他因素。在一些实施方案中，根据本文中所述方法的扩增方案在热循环仪中进行，该热循环仪中的许多是可商购的。
在一些实施方案中，核酸延伸反应涉及使用核酸聚合酶。本文中使用的短语“核酸聚合酶”是指催化核苷三磷酸的模板依赖性聚合以形成与模板核酸序列互补的引物延伸产物的酶。核酸聚合酶在退火的引物的3′末端开始合成，并在朝向模板的5′末端的方向上进行。许多核酸聚合酶是本领域中已知的并且是可商购的。一组核酸聚合酶是热稳定的，即它们在经受足以使互补核酸的退火链变性的温度(例如94℃，或有时更高)之后保持功能。用于扩增的方案的非限制性实例涉及在以下条件下使用聚合酶(例如，Phoenix Taq，VeraSeq)：98℃持续30秒，随后是14至22个循环，每个循环包括在98℃下解链10秒，随后在68℃下退火30秒，接着在72℃下延伸3分钟，然后在4℃下保持反应。然而，也可使用其他适当的反应条件。在一些实施方案中，可调节退火/延伸温度以引起盐浓度的差异(例如，高3℃以得到更高的盐浓度)。在一些实施方案中，减慢升温速率(例如，1℃/s、0.5℃/s、0.28℃/s、0.1℃/s或更慢)，例如，从98℃至65℃，改善了高度多路复用样品的引物性能和覆盖均匀性。在一些实施方案中，本文中所提供的***配置成改变容器温度(例如，通过在不同温度范围之间循环，具有受控的升温或降温速率)以有利于扩增。
在一些实施方案中，核酸聚合酶在酶进行模板依赖性延伸的条件下使用。在一些实施方案中，核酸聚合酶是DNA聚合酶I、Taq聚合酶、Phoenix Taq聚合酶、Phusion聚合酶、T4聚合酶、T7聚合酶、Klenow片段、Klenow exo-、phi29聚合酶、AMV逆转录酶、M-MuLV逆转录酶、HIV-1逆转录酶、VeraSeq ULtra聚合酶、VeraSeq HF 2.0聚合酶、EnzScript或其他合适的聚合酶。在一些实施方案中，核酸聚合酶不是逆转录酶。在一些实施方案中，核酸聚合酶作用于DNA模板。在一些实施方案中，核酸聚合酶作用于RNA模板。在一些实施方案中，延伸反应涉及对RNA进行逆转录以产生互补DNA分子(RNA依赖性DNA聚合酶活性)。在一些实施方案中，逆转录酶是小鼠莫洛尼鼠白血病病毒(mouse moloney murine leukemia virus，M-MLV)聚合酶、AMV逆转录酶、RSV逆转录酶、HIV-1逆转录酶、HIV-2逆转录酶或其他合适的逆转录酶。
在一些实施方案中，核酸扩增反应涉及包括链分离步骤的循环，其通常包括加热反应混合物。本文中使用的术语“链分离”或“对链进行分离”意指处理核酸样品，以使得互补的双链分子分离成可用于与寡核苷酸引物退火的两条单链。在一些实施方案中，根据本文中所述方法的链分离通过将核酸样品加热至高于其解链温度(Tm)来实现。在一些实施方案中，对于在适合于核酸聚合酶的反应制备物中的含有核酸分子的样品，加热至94℃足以实现链分离。在一些实施方案中，合适的反应制剂含有一种或更多种盐(例如，1至100mMKCl，0.1至10mM MgCl2)、至少一种缓冲剂(例如，1至20mM Tris-HCl)和载体(例如，0.01％至0.5％BSA)。合适缓冲液的非限制性实例包含50mM KCl，10mM Tris-HCl(在25℃下pH8.8)，0.5至3mM MgCl2和0.1％BSA。
在一些实施方案中，核酸扩增涉及将引物与具有靶核酸特征链的核酸模板退火。在一些实施方案中，靶核酸链可用作模板核酸。
本文中使用的术语“退火”是指在两个核酸之间形成一个或更多个互补碱基对。在一些实施方案中，退火涉及杂交在一起的两条互补或基本上互补的核酸链。在一些实施方案中，在延伸反应的情况下，退火涉及引物与模板的杂交，从而形成模板依赖性聚合酶的引物延伸底物。在一些实施方案中，退火(例如，在引物与核酸模板之间)的条件可基于引物的长度和序列而变化。在一些实施方案中，退火的条件基于引物的Tm(例如，所计算的Tm)。在一些实施方案中，延伸方案的退火步骤涉及在链分离步骤后将温度降低至基于引物的Tm(例如，所计算的Tm)的温度，持续足以允许这种退火的时间。在一些实施方案中，可使用许多算法中的任何一种来确定Tm(例如，OLIGOTM(Molecular Biology Insights Inc.Colorado)引物设计软件和VENTRO NTITM(Invitrogen，Inc.California)引物设计软件和可获自互联网的程序，包括Primer3、Oligo Calculator和NetPrimer(Premier Biosoft；Palo Alto，CA；并且可免费获自万维网(例如，在premierbiosoft.com/netprimer/netprlaunch/Help/xnetprlaunch.html))。在一些实施方案中，引物的Tm可使用下式计算，该公式由NetPrimer软件使用并且在Frieir等的PNAS 1986 83：9373-9377中更详细地描述，该文献通过引用整体并入本文。
Tm＝ΔH/(ΔS+R*ln(C/4))+16.6 log([K+]/(1+0.7[K+]))-273.15
其中：ΔH是螺旋形成的焓；ΔS是螺旋形成的熵；R是摩尔气体常数(1.987cal/℃*mol)；C是核酸浓度；[K+]是盐浓度。对于大多数扩增方案，退火温度选择为比预测的Tm低约5℃，尽管可使用接近和高于Tm(例如，比预测的Tm低1℃至5℃或比预测的Tm高1℃至5℃)的温度，同样可使用例如比预测的Tm低超多5℃的温度(例如，低6℃、低8℃、低10℃或更低)。在一些实施方案中，退火温度越接近Tm，退火越具有特异性。在一些实施方案中，在延伸反应期间(例如，在PCR扩增方案的情况下)用于引物退火的时间至少部分地基于反应的体积来确定(例如，其中较大体积涉及较长时间)。在一些实施方案中，在延伸反应期间(例如，在PCR扩增方案的情况下)用于引物退火的时间至少部分地基于引物和模板浓度来确定(例如，其中较高的引物与模板的相对浓度涉及比较低相对浓度更短的时间)。在一些实施方案中，取决于体积和相对引物/模板浓度，延伸反应中(例如，在扩增方案的情况下)的引物退火步骤可以是1秒至5分钟、10秒至2分钟、或30秒至2分钟。本文中使用的“基本上退火”是指当在PCR扩增方案的上下文中使用时，在两个核酸之间形成互补碱基对的程度足以产生可检测水平的特异性扩增产物。
本文中使用的术语“聚合酶延伸”是指通过核酸聚合酶将至少一个互补核苷酸模板依赖性地添加至与核酸模板退火的引物的3′末端。在一些实施方案中，聚合酶延伸添加多于一个核苷酸，例如，直至并包含对应于模板全长的核苷酸。在一些实施方案中，聚合酶延伸的条件至少部分地基于所用聚合酶的特性。在一些实施方案中，用于聚合酶延伸的温度基于酶的已知活性性质。在一些实施方案中，其中退火温度低于酶的最佳温度，使用较低的延伸温度可以是可接受的。在一些实施方案中，在低于其最佳延伸温度的情况下，酶可保持至少部分活性。在一些实施方案中，聚合酶延伸(例如，用热稳定聚合酶(例如Taq聚合酶及其变体)进行)在65℃至75℃或68℃至72℃下进行。在一些实施方案中，本文中所提供的方法涉及引物的聚合酶延伸，所述引物在PCR扩增方案的每个循环时与核酸模板退火。在一些实施方案中，使用具有相对强的链置换活性的聚合酶进行聚合酶延伸。在一些实施方案中，出于检测融合(例如，5’融合)的目的，具有强链置换的聚合酶可用于制备核酸。
在一些实施方案中，引物延伸在允许退火的寡核苷酸引物延伸的条件下进行。本文中使用的术语“允许退火的寡核苷酸延伸以使得产生延伸产物的条件”是指一组条件(例如，温度、盐和辅因子浓度、pH和酶浓度)，在该条件下核酸聚合酶催化引物延伸。在一些实施方案中，这样的条件至少部分地基于所用的核酸聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶可在合适的反应制备物中进行引物延伸反应。在一些实施方案中，合适的反应制备物含有一种或更多种盐(例如，1至100mM KCl，0.1至10mM MgCl2)、至少一种缓冲剂(例如，1至20mMTris-HCl)、载体(例如，0.01％至0.5％BSA)，和一种或更多种NTP(例如，dATP、dTTP、dCTP和dGTP各自10至200μM)。一组非限制性条件是在72℃下，50mM KCl，10mM Tris-HCl(在25℃下，pH 8.8)，0.5至3mM MgCl2，200μM每种dNTP和0.1％BSA，在该温度下聚合酶(例如，Taq聚合酶)催化引物延伸。在一些实施方案中，起始和延伸的条件可包括在合适的缓冲液中存在一种、两种、三种或四种不同的脱氧核苷三磷酸(例如，选自dATP、dTTP、dCTP和dGTP)和聚合诱导剂(例如DNA聚合酶或逆转录酶)。在一些实施方案中，“缓冲液”可包含溶剂(例如，水性溶剂)加合适的辅因子和影响pH、离子强度等的试剂。
在一些实施方案中，本文中所提供的***配置成以自动化方式实施多个核酸扩增循环。在一些实施方案中，核酸扩增涉及多至5轮、多至10轮、多至20轮、多至30轮、多至40轮或更多轮(循环)的扩增。在一些实施方案中，核酸扩增可包括一组长度为5个循环至20个循环的PCR扩增方案的循环。在一些实施方案中，扩增步骤可包括一组长度为10个循环至20个循环的PCR扩增方案的循环。在一些实施方案中，每个扩增步骤可包括一组长度为12个循环至16个循环的PCR扩增方案的循环。在一些实施方案中，退火温度可低于70℃。在一些实施方案中，退火温度可低于72℃。在一些实施方案中，退火温度可为约65℃。在一些实施方案中，退火温度可为约61℃至约72℃。
在多种实施方案中，本文中所述的方法和组合物涉及用本文中所述的一种或更多种类型的引物进行PCR扩增方案。本文中使用的“引物”是指这样的寡核苷酸，其能够与核酸模板特异性退火并提供充当模板依赖性聚合酶之底物的3’端，以产生与模板互补的延伸产物。在一些实施方案中，引物是单链的，以使得引物及其互补物可退火以形成两条链。根据本文中所述的方法和组合物的引物可包含杂交序列(例如，与核酸模板退火的序列)，其长度为小于或等于300个核苷酸，例如，长度为小于或等于300、或250、或200、或150、或100、或90、或80、或70、或60、或50、或40、或30或更少、或20或更少、或15或更少，但至少6个核苷酸。在一些实施方案中，引物的杂交序列的长度可以为6至50个核苷酸、6至35个核苷酸、6至20个核苷酸、10至25个核苷酸。
任何合适的方法可用于合成寡核苷酸和引物。在一些实施方案中，商业来源提供了适合于提供用于本文中所述方法和组合物之引物的寡核苷酸合成服务(例如，INVITROGENTM定制DNA寡核苷酸(Life Technologies，Grand Island，NY)或来自IntegratedDNA Technologies(Coralville，IA)的定制DNA寡核苷酸)。
DNA剪切/片段化
本文中使用的核酸(例如，在测序之前)可被剪切，例如机械或酶促地剪切，以产生具有任何期望尺寸的片段。机械剪切过程的非限制性实例包括超声处理、雾化和可从Covaris(Woburn，MA)获得的AFATM剪切技术。在一些实施方案中，可通过超声处理机械剪切核酸。在一些实施方案中，此处所提供的***可具有一个或更多个容器(例如，装在盒内的匣内)，核酸在其中被剪切，例如机械或酶促地剪切。
在一些实施方案中，靶核酸未经剪切或消化。在一些实施方案中，制备步骤的核酸产物(例如，延伸产物、扩增产物)未经剪切或酶促消化。
在一些实施方案中，当靶核酸是RNA时，可对样品进行逆转录酶方案以产生DNA模板，并可随后剪切DNA模板。在一些实施方案中，可在进行逆转录酶方案之前剪切靶RNA。在一些实施方案中，包含靶RNA的样品可用于本文所述的方法中，其使用从新鲜或降解的试样中提取的总核酸；无需去除基因组DNA以进行cDNA测序；无需耗尽核糖体RNA以进行cDNA测序；在任何步骤中都无需机械或酶促剪切；通过使用随机六聚体对RNA进行双链cDNA合成。
靶核酸
本文中使用的术语“靶核酸”是指目的核酸分子(例如，待分析的核酸)。在一些实施方案中，靶核酸包含靶核苷酸序列(例如，已知或预先确定的核苷酸序列)和待确定的相邻核苷酸序列(其可被称为未知序列)二者。靶核酸可具有任何合适的长度。在一些实施方案中，靶核酸是双链的。在一些实施方案中，靶核酸是DNA。在一些实施方案中，靶核酸是基因组或染色体DNA(gDNA)。在一些实施方案中，靶核酸可以是互补DNA(cDNA)。在一些实施方案中，靶核酸是单链的。在一些实施方案中，靶核酸可以是RNA(例如，mRNA、rRNA、tRNA、长非编码RNA、微RNA)。
在一些实施方案中，靶核酸可由基因组DNA构成。在一些实施方案中，靶核酸可由核糖核酸(RNA)(例如mRNA)构成。在一些实施方案中，靶核酸可由cDNA构成。许多适用于本文中所述方法的测序方法提供了具有数十至数百个核苷酸碱基的最佳读取长度的测序运行(例如，Ion Torrent技术可产生200至400bp的读取长度)。由例如基因组DNA或mRNA构成的靶核酸可由基本上长于该最佳读取长度的核酸分子构成。为了使由第二扩增步骤产生的扩增的核酸部分具有适合用于特定测序技术的长度，已知的靶核苷酸序列与通用寡核苷酸尾部衔接子可与之连接的靶核酸末端之间的平均距离应尽可能接近所选技术的最佳读取长度。例如，如果给定测序技术的最佳读取长度是200bp，则根据本文中所述方法扩增的核酸分子应具有约400bp或更短的平均长度。由例如基因组DNA或mRNA构成的靶核酸可被剪切，例如机械或酶促地剪切，以产生具有任何期望尺寸的片段。机械剪切过程的非限制性实例包括超声处理、雾化和可从Covaris(Woburn，MA)获得的AFATM剪切技术。在一些实施方案中，可通过超声处理机械剪切由基因组DNA构成的靶核酸。
在一些实施方案中，当靶核酸由RNA构成时，可对样品进行逆转录酶方案以产生DNA模板，并且随后可以剪切DNA模板。在一些实施方案中，可在进行逆转录酶方案之前剪切靶RNA。在一些实施方案中，包含靶RNA的样品可用于本文所述的方法中，其使用从新鲜或降解的试样中提取的总核酸；无需去除基因组DNA以进行cDNA测序；无需耗尽核糖体RNA以进行cDNA测序；在任何步骤中都无需机械或酶促剪切；通过使用随机六聚体对RNA进行双链cDNA合成；以及通过使核酸进行末端修复、磷酸化和腺苷酸化。
在一些实施方案中，已知的靶核苷酸序列可由基因重排构成。本文中所述的方法适用于确定基因重排的存在和/或身份，因为基因重排的仅一半必须先前已知(即，将被基因特异性引物靶向的基因重排的一半)。在一些实施方案中，基因重排可包含癌基因(oncogene)。在一些实施方案中，基因重排可包含融合癌基因。
本文中使用的术语“已知的靶核苷酸序列”是指靶核酸的一部分，其序列(例如，核酸的核苷酸碱基的身份和顺序)是已知的。例如，在一些实施方案中，已知的靶核苷酸序列是核酸的核苷酸序列，其是已知的或在询问核酸的相邻未知序列之前已经确定的。已知的靶核苷酸序列可具有任何合适的长度。
在一些实施方案中，靶核苷酸序列(例如，已知的靶核苷酸序列)长度为10个或更多个核苷酸、30个或更多个核苷酸、40个或更多个核苷酸、50个或更多个核苷酸、100个或更多个核苷酸、200个或更多个核苷酸、300个或更多个核苷酸、400个或更多个核苷酸、500个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，靶核苷酸序列(例如，已知的靶核苷酸序列)长度为10至100个核苷酸、10至500个核苷酸、10至1000个核苷酸、100至500个核苷酸、100至1000个核苷酸、500至1000个核苷酸、500至5000个核苷酸。
在一些实施方案中，本文中提供了用于确定核酸的邻接(或相邻)部分的序列的方法。本文中使用的术语“与……邻接的核苷酸序列”是指紧邻另一核苷酸序列(例如，已知的核苷酸序列)的上游或下游的核酸分子(例如，靶核酸)的核苷酸序列。在一些实施方案中，与已知的靶核苷酸序列邻接的核苷酸序列可具有任何合适的长度。在一些实施方案中，与已知的靶核苷酸序列邻接的核苷酸序列包含1kb或更短的核苷酸序列，例如1kb或更短的核苷酸序列、750bp或更短的核苷酸序列、500bp或更短的核苷酸序列、400bp或更短的核苷酸序列、300bp或更短的核苷酸序列、200bp或更短的核苷酸序列、100bp或更短的核苷酸序列。在一些实施方案中，其中样品包含含有已知的靶核苷酸序列的不同靶核酸(例如，其中已知的靶核苷酸序列在其基因组中或在分开的、不同的染色体上多次出现的细胞)，存在包含“与已知的靶核苷酸序列邻接的核苷酸序列”的多个序列。本文中使用的术语“确定(所述)核苷酸序列”是指确定核酸的核苷酸碱基的身份和相对位置。
在一些实施方案中，已知的靶核酸可含有由基因重排产生的融合序列。在一些实施方案中，本文中所述的方法适合于确定基因重排的存在和/或身份。在一些实施方案中，基因重排的一部分的身份是先前已知的(例如，将由基因特异性引物靶向的基因重排的部分)，并且其他部分的序列可使用本文中所公开的方法确定。在一些实施方案中，基因重排可涉及癌基因。在一些实施方案中，基因重排可包含融合癌基因。
样品
在一些实施方案中，靶核酸存在于或获自合适的样品(例如，食物样品、环境样品、生物样品(例如血液样品)等)中。在一些实施方案中，靶核酸是获自对象的生物样品。在一些实施方案中，样品可以是获自对象的诊断样品。在一些实施方案中，样品还可包含蛋白质、细胞、流体、生物流体、防腐剂和/或其他物质。作为非限制性实例，样品可以是颊部拭子(cheek swab)、血液、血清、血浆、痰、脑脊液、尿液、泪液、肺泡分离物、胸膜液、心包液、囊液、肿瘤组织、组织、活检物、唾液、吸出物、或其组合。在一些实施方案中，可通过切除或活检获得样品。
在一些实施方案中，样品可获自需要治疗与遗传改变相关的疾病(例如，癌症或遗传性疾病)的对象。在一些实施方案中，已知的靶序列存在于疾病相关基因中。
在一些实施方案中，样品获自需要治疗癌症的对象。在一些实施方案中，样品包含肿瘤细胞群，例如至少一个/种肿瘤细胞。在一些实施方案中，样品包含肿瘤活检物，包括但不限于未经处理的活检物组织或经处理的活检物组织(例如，***固定的和/或石蜡包埋的活检物组织)。
在一些实施方案中，样品是新鲜收集的。在一些实施方案中，在用于本文中所述的方法和组合物之前储存样品。在一些实施方案中，样品是未经处理的样品。本文中使用的“未经处理的样品”是指除了在溶液中稀释和/或悬浮之外没有进行任何先前样品预处理的生物样品。在一些实施方案中，样品获自对象并在用于本文中所述的方法和组合物之前进行保存或加工。作为非限制性实例，样品可包埋在石蜡中、冷藏或冷冻。根据本文中所述的方法和组合物，在确定核酸的存在之前，可将冷冻的样品解冻。在一些实施方案中，样品可以是经加工或处理的样品。用于处理或加工样品的示例性方法包括但不限于离心、过滤、超声处理、均化、加热、冷冻和解冻、与防腐剂(例如，抗凝剂或核酸酶抑制剂)接触，及其任意组合。在一些实施方案中，可用化学和/或生物试剂处理样品。可使用化学和/或生物试剂以在加工和/或储存期间保护样品或样品所包含的核酸，和/或维持样品或样品所包含的核酸的稳定性。作为补充或替代，可使用化学和/或生物试剂以从样品的其他组分释放核酸。作为非限制性实例，在用于本文中所述的方法和组合物之前，可用抗凝剂对血液样品进行处理。用于核酸分析的样品的加工、保存或处理的合适方法和过程可用于本文中所公开的方法中。在一些实施方案中，样品可以是经澄清的流体样品。在一些实施方案中，可通过低速离心(例如，3,000×g或更低)使样品澄清并收集包含经澄清流体样品的上清液。
在一些实施方案中，可在用于本文中所述的方法和组合物之前分离、富集或纯化样品中存在的核酸。可以使用从样品中分离、富集或纯化核酸的合适方法。例如，用于从多种样品类型中分离基因组DNA的试剂盒是可商购的(例如，目录号51104、51304、56504和56404；Qiagen；Germantown，MD)。在一些实施方案中，本文中所述的方法涉及富集靶核酸的方法，例如，在靶核酸测序之前。在一些实施方案中，在测序之前不知道待富集的靶核酸的一端的序列。在一些实施方案中，本文中所述的方法涉及在使用下一代测序技术确定核苷酸序列之前富集特定核苷酸序列的方法。在一些实施方案中，富集特定核苷酸序列的方法不包括杂交富集。
靶基因(ALK、ROS1、RET)和治疗应用
在本文中所述方法的一些实施方案中，确定与已知的寡核苷酸靶序列邻接的序列可提供与疾病治疗相关的信息。因此，在一些实施方案中，本文中所公开的方法可用于帮助治疗疾病。在一些实施方案中，样品可以来自需要治疗与遗传改变相关之疾病的对象。在一些实施方案中，已知的靶序列是疾病相关基因(例如，癌基因)的序列。在一些实施方案中，与已知的寡核苷酸靶序列邻接的序列和/或该已知的寡核苷酸靶序列可包含与疾病相关的突变或遗传异常，例如SNP、***、缺失和/或基因重排。在一些实施方案中，样品中存在的与已知靶序列邻接的序列和/或已知的靶序列包含基因重排产物的序列。在一些实施方案中，基因重排可以是癌基因，例如融合癌基因。
某些癌症治疗对于包含某些癌基因的肿瘤特别有效，例如，靶向给定融合癌基因的作用或表达的治疗剂可对包含该融合癌基因的肿瘤有效但对缺乏该融合癌基因的肿瘤无效。本文中所述的方法可有助于确定揭示癌基因状态(例如，突变、SNP和/或重排)的特定序列。在一些实施方案中，本文中所述的方法还可允许在侧翼区域的序列已知时确定特定序列，例如，本文中所述的方法可确定涉及已知基因(例如癌基因)之基因重排的存在和身份，其中在实施本文中所述的方法之前，精确位置和/或重排配偶体是未知的。
在一些实施方案中，对象需要治疗肺癌。在一些实施方案中，例如，当从需要治疗肺癌的对象获得样品时，已知的靶序列可包含来自选自ALK、ROS1和RET的基因的序列。因此，在一些实施方案中，基因重排导致涉及ALK、ROS1或RET的融合。涉及ALK、ROS1或RET的基因排列的非限制性实例描述于例如Soda等，Nature 2007 448561-6：Rikova等，Cell 2007131：1190-1203；Kohno等，Nature Medicine 2012 18：375-7；Takouchi等，NatureMedicine 2012 18：378-81；其通过引用整体并入本文。然而，应理解的是，基因重排的精确位置和参与重排的第二基因的身份可以不是事先已知的。因此，在本文中所述的方法中，可检测这种重排的存在和身份，而不必须知道重排的位置或参与基因重排的第二基因的身份。
在一些实施方案中，已知的靶序列可包含来自选自以下的基因的序列：ALK、ROS1和RET。
在一些实施方案中，从对象的肿瘤获得的样品中ALK的基因重排的存在可表明肿瘤易于用选自以下的治疗进行治疗：ALK抑制剂；克唑替尼(crizotinib)(PF-02341066)；AP26113；LDK378；3-39；AF802；IPI-504；ASP3026；AP-26113；X-396；GSK-1838705A；CH5424802；ALK激酶活性的二氨基和氨基嘧啶抑制剂，例如NVP-TAE684和PF-02341066(参见，例如，Galkin等，Proc Natl Acad Sci USA，2007，104：270-275；Zou等，Cancer Res，2007，67：4408-4417；Hallberg和Palmer F1000 Med Reports 2011 3：21；Sakamoto等，Cancer Cell 201119：679-690；以及WO 04/079326中公开的分子)。所有前述参考文献都通过引用整体并入本文。ALK抑制剂可包括降低ALK或其一部分之表达和/或激酶活性的任何药剂，包括例如降低ALK或其一部分之表达和/或活性的寡核苷酸、小分子和/或肽。本文中使用的“间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase)”或“ALK”是指通常以野生型形式参与神经元调节的跨膜tyROS1ine激酶。ALK基因和mRNA的核苷酸序列对于许多物种，包括人(例如，如根据NCBI基因ID：238所注释)是已知的。
在一些实施方案中，从对象的肿瘤获得的样品中ROS1的基因重排的存在可表明肿瘤易于用选自下组的治疗进行治疗：ROS1抑制剂和如上所述的ALK抑制剂(例如，克唑替尼)。ROS1抑制剂可包括降低ROS1或其一部分之表达和/或激酶活性的任何药剂，包括例如降低ROS1或其一部分之表达和/或活性的寡核苷酸、小分子和/或肽。本文中使用的“c-ros癌基因1”或“ROS1”(在本领域中也称为ros-1)是指sevenless亚家族的跨膜酪氨酸激酶，其与PTPN6相互作用。ROS1基因和mRNA的核苷酸序列对于许多物种，包括人(例如，如根据NCBI基因ID：6098所注释)是已知的。
在一些实施方案中，从对象的肿瘤获得的样品中RET的基因重排的存在可表明肿瘤易于用选自以下的治疗进行治疗：RET抑制剂；DP-2490、DP-3636、SU5416；BAY 43-9006、BAY 73-4506(瑞戈非尼)、ZD6474、NVP-AST487、索拉非尼、RPI-1、XL184、凡德他尼、舒尼替尼、伊马替尼、帕唑帕尼、阿西替尼、莫特塞尼、吉非替尼和醉茄素A(withaferin A)(参见，例如，Samadi等，Surgery 2010 148∶1228-36；Cuccuru等，JNCI 2004 13：1006-1014；Akeno-Stuart等，Cancer Research 2007 67：6956；Grazma等，J Clin Oncol 2010 28：15s5559；Mologni等，J Mol Endocrinol 2006 37：199-212；Calmomagno等，Journal NCI 200698：326-334；Mologni，Curr Med Chem 2011 18：162-175；以及WO 06/034833；美国专利公开2011/0201598和美国专利8,067,434中公开的化合物)。所有前述参考文献都通过引用整体并入本文。RET抑制剂可包含降低RET或其一部分之表达和/或激酶活性的任何药剂，包括例如降低RET或其一部分之表达和/或活性的寡核苷酸、小分子和/或肽。本文中使用的“在转染期间重排”或“RET”是指钙黏蛋白超家族的受体酪氨酸激酶，其参与神经嵴发育并识别神经胶质细胞系来源的神经营养因子家族信号传导分子。RET基因和mRNA的核苷酸序列对于许多物种，包括人(例如，如根据NCBI基因ID：5979所注释)是已知的。
本文中所述的方法的应用的另一些非限制性实例包括检测血液恶性标志物及其组(例如，包括检测淋巴瘤和白血病中的基因组重排的那些)、检测肉瘤相关的基因组重排及其组；以及检测IGH/TCR基因重排及其组用于淋巴瘤测试。
在一些实施方案中，本文中所述的方法涉及用针对癌症的治疗来治疗患有或诊断为患有例如癌症的对象。患有癌症的对象可由医生使用当前诊断癌症的方法来识别。例如，表征这些病症并有助于诊断的肺癌症状和/或并发症是本领域中公知的，其包括但不限于呼吸微弱(weak breathing)、锁骨上***肿大、肺部异常声音、当胸部被敲击时有浊音，以及胸部疼痛。可以帮助诊断例如肺癌的测试包括但不限于X射线、针对高水平的某些物质(例如钙)的血液测试、CT扫描和肿瘤活检。肺癌的家族史或暴露于肺癌的风险因素(例如，吸烟或暴露于烟雾和/或空气污染)也可有助于确定对象是否可能患有肺癌或有助于进行肺癌的诊断。
癌症可包括但不限于癌，包括腺癌、淋巴瘤、母细胞瘤、黑素瘤、肉瘤、白血病、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、胶质母细胞瘤、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、包括胶质母细胞瘤和髓母细胞瘤在内的脑癌；乳腺癌、***、绒毛膜癌；结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌、子宫内膜癌；食管癌、胃癌；多种类型的头颈部癌症、包括鲍恩病(Bowen’s disease)和佩吉特病(Paget’s disease)在内的上皮内肿瘤；包括急性淋巴细胞白血病和急性髓细胞性白血病在内的血液肿瘤(hematologicalneoplasm)；卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、毛细胞白血病；慢性髓细胞性白血病、艾滋病相关白血病和成人T细胞白血病淋巴瘤；肾癌，例如肾细胞癌、T细胞急性淋巴细胞白血病/淋巴瘤、包括霍奇金病和淋巴细胞淋巴瘤在内的淋巴瘤；肝癌例如肝癌(hepaticcarcinoma)和肝细胞瘤(hepatoma)、梅克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma)、黑素瘤、多发性骨髓瘤；神经母细胞瘤；包括鳞状细胞癌在内的口腔癌；包括由上皮细胞引起的那些在内的卵巢癌、包括平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、fibROS1肉瘤和骨肉瘤在内的肉瘤；胰腺癌；包括黑素瘤、***、生殖细胞和间充质细胞在内的皮肤癌；pROS1tate癌症，直肠癌；外阴癌，包括腺癌在内的肾癌；睾丸癌，其包括生殖肿瘤(germinal tumor)，例如***瘤、非***瘤(畸胎瘤、绒毛膜癌)、间质瘤和生殖细胞肿瘤；包括甲状腺腺癌和髓样癌在内的甲状腺癌；食管癌、唾液腺癌和肾母细胞瘤(Wilms’tumor)。在一些实施方案中，癌症可以是肺癌。
多路复用方法
本文中所述的方法可以以多路复用形式使用。在本文中所述方法的一些实施方案中，多路复用应用可包括确定与一种或更多种已知的靶核苷酸序列邻接的核苷酸序列。本文中使用的“多路复用扩增”是指涉及在一个或更多个反应容器中同时扩增多于一种靶核酸的过程。在一些实施方案中，方法涉及随后使用一组或更多组引物确定多路复用扩增产物的序列。多路复用可指在单个反应中检测约2至1,000个不同的靶序列。本文中使用的多路复用是指在单个反应中检测2至1,000个不同的靶序列之间的任何范围，例如，5至500、25至1,000或10至100个不同的靶序列。术语“多路复用”应用于PCR意味着在同一PCR反应中存在对至少两种不同靶序列具有特异性的引物。
在一些实施方案中，可用多种引物(例如，多个第一和第二靶特异性引物)扩增样品中的靶核酸或样品的分开的部分。在一些实施方案中，多种引物(例如，多种第一和第二靶特异性引物)可存在于单一反应混合物中，例如，可在同一反应混合物中产生多种扩增产物。在一些实施方案中，多个引物(例如，多组第一和第二靶特异性引物)可与由单独的基因构成的已知的靶序列特异性退火。在一些实施方案中，至少两组引物(例如，至少两组第一和第二靶特异性引物)可与已知的靶序列的不同部分特异性退火。在一些实施方案中，至少两组引物(例如，至少两组第一和第二靶特异性引物)可与单个基因所包含的已知靶序列的不同部分特异性退火。在一些实施方案中，至少两组引物(例如，至少两组第一和第二靶特异性引物)可与包含已知靶序列的基因的不同外显子特异性退火。在一些实施方案中，多个引物(例如，第一靶特异性引物)可包含相同的5′标签序列部分。
在本文中所述方法的一些实施方案中，多路复用应用可包括在一个测序反应或测序运行中确定与多个样品中的一个或更多个已知靶核苷酸序列邻接的核苷酸序列。在一些实施方案中，多个样品可以具有不同的来源，例如来自不同组织和/或不同对象。在这样的实施方案中，引物(例如，加尾的随机引物)还可包含条码部分。在一些实施方案中，可以将具有独特条码部分的引物(例如，加尾的随机引物)添加至每个样品中并与其中的核酸连接；随后可以合并样品。在这样的实施方案中，扩增产物的每个所得测序读取将包含条码，其标识含有扩增产物所来源的模板核酸的样品。
分子条码
在一些实施方案中，引物可包含另外的序列，例如标识符序列(例如条码，索引)、测序引物杂交序列(例如，Rd1)和衔接子序列。在一些实施方案中，衔接子序列是与下一代测序***一起使用的序列。在一些实施方案中，衔接子序列是基于Illumina的测序技术的P5和P7序列。在一些实施方案中，衔接子序列是与Ion Torrent测序技术兼容的P1和A。
在一些实施方案中，本文中使用的“分子条码”、“分子条码标签”和“索引”可互换使用，并且通常是指核酸的核苷酸序列，其可用作标识符，例如源标识符、位置标识符、日期或时间标识符(例如，采样或处理的日期或时间)，或者核酸的其他标识符。在一些实施方案中，这样的分子条码或索引序列可用于标识核酸群中存在的核酸的不同方面。在一些实施方案中，分子条码或索引序列可提供靶核酸的来源或位置标识符。例如，分子条码或索引序列可用于标识从其获得核酸的患者。在一些实施方案中，分子条码或索引序列使得能够在单个反应(例如，在单个流动单元中进行)对多个不同样品进行测序。在一些实施方案中，索引序列可用于对序列成像仪进行定向以用于检测个体测序反应。在一些实施方案中，分子条码或索引序列的长度可以为2至25个核苷酸、2至15个核苷酸、2至10个核苷酸、2至6个核苷酸。在一些实施方案中，条码或索引包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或至少25个核苷酸。
在一些实施方案中，当根据本文中所述的方法使用加尾的随机引物群时，在扩增之后可存在多种可区分的扩增产物。在一些实施方案中，因为加尾的随机引物在样品的所有核酸分子中的多个位置杂交，一组靶特异性引物可使由多于1个杂交事件产生的延伸产物杂交(和扩增)，例如，一个加尾的随机引物可在与靶特异性引物杂交位点相隔第一距离(例如，100个核苷酸)处杂交，并且另一个加尾的随机引物可以在与靶特异性引物杂交位点相隔第二距离(例如，200个核苷酸)处杂交，从而产生了两种扩增产物(例如，包含约100bp的第一扩增产物和包含约200bp的第二扩增产物)。在一些实施方案中，可使用下一代测序技术对这些多重扩增产物中的每一种进行测序。在一些实施方案中，这些多重扩增产物的测序是有利的，因为其提供了多个重叠序列读取，其可彼此比较以检测在扩增或测序过程中引入的序列错误。在一些实施方案中，可比对单独的扩增产物，并且当它们在特定碱基处存在的序列不同时，可存在PCR和/或测序的伪象(artifact)或错误。
计算机和控制设备
本文中所提供的***包含数个组件，包括传感器、环境控制***(例如加热器，风扇)、机器人(例如，XY***)等，其可以在计算机、处理器、微控制器或其他控制器的控制下一起操作。组件可包括例如XY***、液体处理装置、微流体泵、线性致动器、阀驱动器、门操作***、光学组合体、条码扫描仪、成像或检测***、触摸屏界面等。
在一些情况下，可以使用硬件、软件或其组合来实现操作，例如控制***和/或其中提供的或与其接合的组件的操作。当在软件中实现时，软件代码可以在任何合适的处理器或处理器集合上执行，无论是在单个组件中提供还是在多个组件之间分布。这样的处理器可以集成电路实施，其中集成电路组件中具有一个或更多个处理器。可以使用任何合适形式的电路来实施处理器。
计算机可以体现为多种形式中的任何一种，例如机架式计算机(rack-mountedcomputer)、台式计算机、膝上计算机或平板计算机。另外，计算机可嵌入通常不被视为计算机但具有合适处理能力的装置中，包括个人数字助理(PDA)，智能电话或者任何其他合适的便携式、移动或固定电子装置，包括***本身。
在一些情况下，计算机可具有一个或更多个输入和输出装置。这些装置尤其可用于呈现使用者界面。可用于提供使用者界面的输出装置的实例包括用于输出视觉呈现的打印机或显示屏，以及用于输出可听呈现的扬声器或其他声音产生装置。可用于使用者界面的输入装置的实例包括键盘，以及指向装置例如鼠标、触摸板和数字平板。在另一些实例中，计算机可通过语音识别或以其他可听形式、通过可见手势、通过触觉输入(例如，包括振动、触觉和/或其他力)或其任意组合来接收输入信息。
一个或更多个计算机可通过一个或更多个网络以任何合适的形式互连，包括作为局域网或广域网(例如企业网络或因特网)。这样的网络可以基于任何合适的技术，并且可以根据任何合适的协议进行操作，并且可以包括无线网络、有线网络或光纤网络。
本文中概述的多种方法或过程可以被编码为可在采用多种操作***或平台中的任何一种的一个或更多个处理器上执行的软件。可以使用许多合适的编程语言和/或编程或脚本工具中的任何一种来编写这样的软件，并且可以将这样的软件编译为在框架或虚拟机上执行的可执行机器语言代码或中间代码。
用于控制本文中所提供的方法或过程的一种或更多种算法可以体现为用一个或更多个程序编码的可读存储介质(或多个可读介质)(例如，计算机存储器、一个或更多个软盘、压缩盘(compact disc，CD)、光盘、数字视频盘(DVD)、磁带、闪存、现场可编程门阵列(Field Progammable Gate Array)或其他半导体装置中的电路排布，或者其他有形存储介质)，当在一个或更多个计算机或其他处理器上执行时，其执行实现本文中所述的多种方法或过程的方法。
在一些实施方案中，计算机可读存储介质可将信息保留足够的时间以提供非过渡形式的计算机可执行指令。这样的计算机可读存储介质可以是可移动的，使得存储在其上的程序可以加载到一个或更多个不同的计算机或其他处理器上，以实现本文中所述方法或过程的多个方面。本文中使用的术语“计算机可读存储介质”仅涵盖可被视为产品(例如，制品)或机器的计算机可读介质。作为替代或补充，本文中所述的方法或过程可以体现为除计算机可读存储介质之外的计算机可读介质，例如传播信号。
术语“程序”或“软件”在本文中以一般含义使用，以指可用于对计算机或其他处理器进行编程以实现本文中所述方法或过程的多个方面的任何类型的代码或可执行指令集。另外，应当理解，根据本实施方案的一个方面，在执行时实施本文中所述的方法或过程的一个或更多个程序不需要驻留在单个计算机或处理器上，而是可以以模块化方式分布在许多不同的计算机或处理器中以实现多种过程或操作。
可执行指令可以为许多形式，例如程序模块，由一个或更多个计算机或其他装置执行。通常，程序模块包含执行特定任务或实现特定抽象数据类型的例程、程序、对象、组件、数据结构等。通常，在不同的实施方案中，程序模块的功能可根据所期望地组合或分布。
而且，数据结构可以以任何合适的形式存储在计算机可读介质中。数据存储的非限制性实例包括结构化、非结构化、本地化、分布式、短期和/或长期存储。可用于通信数据的协议的非限制性实例包括专有和/或行业标准协议(例如，HTTP、HTML、XML、JSON、SQL、web服务、文本、电子表格等，或其任意组合)。为了简单的说明，可以将数据结构显示成具有通过数据结构中的位置相关的字段。这样的关系同样可以通过对具有传达字段之间关系的计算机可读介质中的位置的字段分配存储来实现。然而，可以使用任何合适的机制来建立数据结构的字段中的信息之间的关系，包括通过使用指针(pointer)、标签或建立数据要素之间关系的其他机构。
在一些实施方案中，与***的操作相关的信息(例如，温度、成像或光学信息、荧光信号、组件位置(例如加热盖位置、旋转阀位置)、液体处理状态、条码状态、舱访问门位置或者其任意组合)可以从与***相关的一个或更多个传感器或读写器(例如，位于***内)获得，并且可以存储在计算机可读介质中以提供关于过程(例如，自动化文库制备过程)期间的条件的信息。在一些实施方案中，可读介质包含数据库。在一些实施方案中，所述数据库包含来自单个***(例如，来自一个或更多个舱)的数据。在一些实施方案中，所述数据库包含来自多个***的数据。在一些实施方案中，以使其防篡改(tamper-proof)的方式存储数据。在一些实施方案中，存储由***生成的所有数据。在一些实施方案中，存储数据的子集。
实施例
以下实施例旨在举例说明本文中所述的某些实施方案，包括本发明的某些方面，但不是示例本发明的全部范围。
以下描述的是***和方法的实例，利用所述***和方法可以在实施方案中实现用以配置和操作生物分析***的实施方案和技术。然而，应理解的是，实施方案不限于根据以下任何实施方案进行操作，并且其他实施方案也是可能的。
图6示出了在其中可以操作一些实施方案的生物分析***600。图6的生物分析***600包含文库制备装置602，其配置成实施多个文库制备方案以制备用于测序的生物样品。多个文库制备方案中的文库制备方案包括不同的文库制备操作组。文库制备装置602，例如图2A和2B中所示的***200，可配置成接收具有匣420、430和450以及模块440的盒400。匣420、430和450可包含配置成含有在对生物样品进行文库制备方案的操作期间使用的一个或更多个资源的容器。本文中讨论了盒中所包含的合适资源的实例，并且所述实例包括引物、试剂和缓冲液。生物样品606可以例如由使用者置于模块440的样品孔中。以这种方式，盒400可以包含至少一部分生物样品606和设置在一个或更多个匣中用于对生物样品606实施文库制备方案的至少一个资源二者。盒400可以与文库制备装置602接合，例如通过使文库制备装置602经由盒舱610接收盒400。文库制备装置602可以对位于盒400的样品孔内的生物样品606实施文库制备方案。与生物样品606相关的文库可以由实施文库制备方案而产生。
生物分析***600还可包含测定装置618，其配置成对与生物样品相关的文库进行后续测定。后续测定可以是测序过程，并且测定装置618可以是测序装置。生物分析***600还可包含分析装置620，其配置成分析由测定装置618对生物样品进行的测定的结果，其可以包含与由文库制备装置602制备的生物样品相关的文库。在一些实施方案中，分析装置可以分析测序结果以确定生物样品中包含的核酸序列。
本申请的一些方面涉及提供文库制备装置602、测定装置618和/或分析装置620的自配置的技术。这些自配置技术可允许选择文库制备方案，产生用于测定装置的配置信息和/或配置分析过程而无需人为干预。
一种类型的技术包括接收指示与生物样品和由文库制备装置使用的至少一种资源相关的标识符(包括编码标识符)的信息。接收到的信息可用于选择要对生物样品实施的文库制备方案。指示与生物样品相关的标识符的所接收信息可以标识生物样品(例如，样品ID)、组织类型、与生物样品相关的患者(例如，患者ID)。指示与资源相关的标识符的所接收信息可以将资源标识为要用于实施文库制备方案的试剂、缓冲液或引物的类型。可以基于所接收的信息来选择要实施的文库制备方案。
如图6中所示，标识符608与生物样品606相关，并且标识符612与盒400相关。作为补充或替代，一个或更多个标识符可以与盒的匣(例如盒400的匣420、430和450)相关。从一组制备方案选择用以对生物样品实施的文库制备方案可以基于指示标识符的信息。指示标识符的信息可以允许基于标识符自动选择文库制备方案。与生物样品和资源相关的标识符可以包括电子可读标识符、条码和近场通信(NFC)标签。如图6中所示，生物分析***600还可包含扫描仪604或其他合适的询问装置。扫描仪604可以具有扫描设施，其允许扫描标识符以接收指示标识符的信息。在一些实施方案中，扫描仪604是条码扫描仪，并且可以通过扫描条码来接收指示与生物样品和/或资源相关的条码的信息。在一些实施方案中，生物分析***600包含NFC询问器，并且可以通过询问NFC询问器来接收指示与生物样品和/或资源相关的NFC标签的信息。
扫描或询问标识符可以在不同的时间或位置处发生。在一些实施方案中，在将盒加载到文库制备装置中之前，通过文库制备装置外部的扫描仪或询问器扫描或询问与生物样品相关的标识符。在这样的实施方案中，使用者可以在将盒加载到文库制备装置中之前扫描与生物样品相关的标识符和与至少一个资源相关的标识符。通过扫描或询问接收的信息可以以将关于生物样品的信息与关于资源的信息相关联的方式存储在文库制备装置或其他合适的计算装置中。在一些实施方案中，文库制备装置包含扫描仪和/或询问器，其配置成在盒被加载到文库制备装置中时扫描或询问与盒或加载在盒中的资源相关的标识符。
文库制备方案的选择可包括至少部分地基于指示盒的信息选择方案，其可包括关于加载在盒中的引物、试剂和缓冲液的类型的信息。在一些实施方案中，所接收的信息可以标识生物样品606和/或配置成在文库制备方案的实施期间容纳生物样品的盒400。在一些实施方案中，指示盒的信息可包括标识生物样品和/或生物样品类型的信息。如先前所讨论的，盒400可配置成与一个或更多个文库制备方案一起使用。盒400可包含预先设置在盒400内的材料，其用于实施一个或更多个文库制备方案。与盒400相关的标识符612可以提供标识盒的信息，包括标识盒的类型的信息。盒的类型可以与特定的文库制备方案相关。在一些实施方案中，文库制备方案的选择可以基于标识盒的类型的信息。在一些实施方案中，指示标识符的所接收信息可以包括标识文库制备方案要使用的至少一种材料的信息，并且文库制备方案的选择可以基于标识至少一种材料的信息。
在一些实施方案中，可以基于与配置成容纳生物样品的盒相关的标识符，从数据存储区中检索标识生物样品的信息和标识文库制备方案要使用的至少一种资源的信息。文库制备方案的选择可以基于检索到的信息。作为一个实例，例如在文库制备装置602上的数据存储区可以存储标识与标识一个或更多个资源的信息相关的生物样品的信息。在接收与配置成容纳生物样品和一个或更多个资源的盒400相关的信息(例如通过用扫描仪604扫描条码612)之后，所接收的信息可用于配置文库制备装置602以从数据存储区检索标识生物样品和一个或更多个资源的信息。
提供文库制备装置的自配置以操作所选择的文库制备方案的另一种类型的技术包括为实施文库制备方案的文库制备装置的操作制定时间表，并根据时间表执行文库制备装置的操作。文库制备装置的操作可包括将一定体积的材料从一个位置转移到另一个位置，打开和关闭阀以允许在微流体***内转移流体，以及加热靠近样品孔的区域以根据所选择的文库制备方案将设置在样品孔中的生物样品在一定温度下暴露一段时间。在一些实施方案中，确定操作文库制备装置的时间表可以包括评价用于使用文库制备装置实施方案的文库制备操作的多个时间表选项的估计完成时间。时间表选项可以考虑实施文库制备方案的完成时间的变化。在一些实施方案中，可以并行实施文库制备装置的操作以减少完成方案的总时间。在一些实施方案中，文库制备装置的操作顺序可以改变完成时间。因此，一些实施方案涉及基于评价估计完成时间的结果来确定时间表。在一些实施方案中，对多个时间表选项的估计完成时间的评价可以包括从选项中标识具有最小估计完成时间的时间表选项，并且可以操作文库制备装置以实施所标识的时间表选项。
估计的完成时间可以基于文库制备方案的一个或更多个操作(例如加热至某个温度、打开阀门、运输流体)的估计实施持续时间来确定。操作的估计实施持续时间可以是在先由文库制备装置根据测量文库制备装置实施操作的时间段实施单独操作的预定时间。估计的实施持续时间可以存储在合适的数据存储区，包括与文库制备装置602相关的数据存储区中。估计文库制备方案的完成时间可以包括使用预先确定的时间计算用于根据方案实施操作的完成时间。
在一些实施方案中，确定时间表可以考虑后续操作之间的时间量的容差。在一些情况下，例如，所制备的与生物样品相关的文库的质量可以取决于在操作后将生物样品保持在特定温度下的持续时间。在开始后续操作之前的持续时间的容差可以使得提供合适的时间表选项的益处与所制备的文库的质量之间取得平衡。持续时间的容差可以是作为使用者输入提供的一个或更多个值，并且在一些实施方案中，基于标识生物样品的信息和/或标识至少一个资源的信息。在一些实施方案中，确定操作文库制备装置的时间表可以包括对于文库制备方案的文库制备操作的至少第一部分，评价关于估计的实施持续时间的存储信息，以及对于文库文件制备操作的第二部分，评价对于完成操作之后开始后续操作之前的持续时间的容差的存储信息。
一些实施方案涉及对不同的生物样品并行操作多个文库制备方案。在这样的实施方案中，为实施文库制备方案的操作制定时间表可以考虑同时实施不同方案的操作。因此，确定在盒的第一样品孔中实施文库制备方案的时间表可以包括评价对相同盒或不同盒中任一个的第二样品孔中的第二生物样品实施第二文库制备方案的第二时间表。
一些实施方案包括提供文库制备方案是否完成的指示。该指示可以包括视觉指示(例如光、符号、文本显示)和/或可听指示(例如特征性噪音)。在一些实施方案中，文库制备装置可以在盒被***盒舱中时锁定盒舱的开口，并且当文库制备方案被指示为完成时解锁开口。
在文库制备装置具有多个盒舱的一些实施方案中，可以防止对一个盒舱的访问，同时对位于另一个盒舱中的盒中的生物样品实施文库制备方案。在一些实施方案中，文库制备装置可以在第一盒舱中实施文库制备方案，并且在第一室中实施文库制备方案的至少一部分期间防止对第二盒舱的访问。
在一些实施方案中，文库制备装置602配置成对生物样品和/或与生物样品相关的文库进行定量PCR(qPCR)。文库制备装置可以进行qPCR，将其作为选择对生物样品实施的文库制备方案的一部分。
提供生物分析***600的自配置的另一种类型的技术包括在文库制备装置600、测定装置618和/或分析装置620之间发送和接收信息。数据中心(data hub)616可有利于共享、转移和存储指示生物样品、由文库制备装置602用于实施方案的至少一种资源、对生物样品实施的文库制备方案，以及对生物样品实施方案的结果(例如，qPCR结果)的信息。根据一些实施方案，数据中心616可以是与文库制备装置602、测定装置618和分析装置620分离的计算装置。在一些实施方案中，文库制备装置602可以具有提供数据中心616的功能的一个或更多个计算装置。
测定装置618可以接收这样的信息并确定对与由文库制备装置602制备的生物样品相关的文库进行的测定过程。使用者可以在完成文库制备方案之后将所制备的文库从盒400物理转移至合适的容器以通过测定装置618进行测定。测定装置618可以基于从数据中心616接收的信息确定要进行的测定过程，这可以允许确定测定过程而无需使用者提供与所制备的文库相关的另外的信息。在一些实施方案中，与所制备的文库中包含的核酸片段相关的分子条码可用作标识与所制备的文库相关的另外信息的指示。在一些实施方案中，使用者可以向测定装置618提供作为所制备文库的指示(例如标识生物样品的信息(例如，样品ID))的输入，并且测定装置618可以从用于确定所制备文库的测定过程的数据中心616接收另外的信息。
在一些实施方案中，测定装置618是测序装置并配置成对生物样品和/或与生物样品相关的文库进行测序过程以确定生物样品中包含的至少一种核酸序列，所述生物样品包含核酸片段。测序过程的配置可以包括接收由对生物样品实施文库制备方案以制备用于测序的生物样品的文库制备装置602产生的样品信息，和处理所述样品信息以产生测序装置的配置信息。测序装置的配置信息可以存储在至少一个数据存储区中，例如与数据中心616和/或测定装置618相关的数据存储区中。
样品信息可包括标识生物样品、组织类型、与生物样品相关的患者、对生物样品实施的文库制备方案、文库制备方案的实施结果(包括qPCR结果)的信息。在信息包括qPCR结果的一些实施方案中，该信息可以包括关于qPCR过程的结果强度的信息。关于qPCR结果的信息可包括一种或更多种核酸序列以及与一种或更多种核酸序列相关的一种或更多种质量评分。在一些实施方案中，从文库制备装置602接收样品信息。在另一些实施方案中，由文库制备装置实施产生配置信息，并且从文库制备装置的数据存储区接收样品信息。
一些实施方案涉及用于通过生成样品表来产生测定装置618的配置信息的技术。样品表可具有针对不同测定装置而变化的格式，这可允许生物分析***包含多种类型的测定装置。在一些实施方案中，文库制备装置602可以产生与适合于不同测序装置的一种或更多种生物样品相关的所制备文库。例如，所制备的文库可以在核酸片段长度的分布、片段的平均长度和用于标记单独片段的分子条码方面有所不同。与单独的所制备文库相关的样品表的格式可根据欲将哪种测序装置用于对所制备的文库进行测序而不同。因此，产生测序装置的配置信息可以包括确定要使用的测序装置并以该测序装置接收输入信息的格式生成样品表。样品表可包含标识生物样品的信息和/或标识对生物样品实施的文库制备方案的信息。可以向测定装置618提供样品表，例如通过由数据中心616提供便利的网络并通过网络与测定装置通信。
在一些实施方案中，生物分析***600包含分用装置，其配置成对测序过程的结果进行分用过程。分用过程可包括基于与分子条码相关的核酸序列对测序结果进行分选，所述分子条码用于标记所制备的文库中包含的核酸片段。在一些实施方案中，分用装置和测序装置在同一装置上。数据中心616可以接收关于分用过程的结果的信息并存储结果。
分析装置620可配置成分析对生物样品进行的测序过程的结果，以确定生物样品中所包含的核酸序列。分析装置620可以接收由文库制备装置602产生的样品信息和对生物样品进行的测序过程的结果。样品信息可以标识生物样品和对生物样品实施的文库制备方案。测序过程的结果可以标识定在测序过程期间在生物样品中检测到的至少一种核酸序列。可以基于样品信息来配置由分析装置620所进行的分析过程。在一些情况下，可以使用生物样品的类型(例如RNA，DNA)来配置分析过程，因为对测序结果进行的分析的类型可以根据类型而不同。分析装置620可以用经配置分析过程来分析测序过程的结果，并存储经配置分析过程的结果。
数据中心616可有利于分析装置620接收样品信息和/或测序过程的结果。在一些实施方案中，样品信息由分析装置620从文库制备装置602接收。在一些实施方案中，测序过程的结果由分析装置620从由样品信息所标识的数据存储区的位置接收。数据存储区的位置可以在数据中心616和/或测定装置618上。在一些实施方案中，当通过监测数据存储区的位置确定测序过程完成时，自动接收测序过程的结果。以这种方式，数据存储区的位置可以被分析装置620视为监视位置，以使得当测序结果被存储在分析装置620监测的位置处以确定测序过程何时完成。完成后，由分析装置620访问测序结果以对测序结果进行分析过程而无需人为干预。
图7示出了可以在一些实施方案中实现的示例性过程700以使用自配置生物分析***(例如图6中所示的***600)来分析生物样品。过程700开始于框710，其中扫描设施扫描要使用的生物样品和资源和/或引物的标识符作为制备用于后续测定的生物样品的一部分。来自生物样品的标识符的信息可包括生物样品的样品类型(例如，RNA、DNA)。来自资源和/或引物的标识符的信息可包括关于与盒相关的资源和/或引物的类型的信息。
在框720中，基于标识符，制备设施使用资源配置文库制备装置以对生物样品实施文库制备方案，并且自动化设施自动实施该配置过程。
在框730中，制备设施操作文库制备装置以对生物样品实施文库制备方案。制备设施可以根据由调度设施(sheduling facility)确定的时间表实施文库制备方案。
在框740中，测定装置(例如核酸测序装置)对生物样品进行测序过程。
在框750中，分析设施分析测序过程的结果。
在框760中，将来自分析设施进行的分析的信息输出到生物分析***的数据存储区和/或使用者界面。
图8示出了可以在一些实施方案中实现的示例性过程800以标识对生物样品实施的文库制备方案。过程800开始于框810，其中接收标识生物样品的信息。扫描设施可用于接收标识生物样品的信息，例如通过扫描编码标识符。
在框820中，文库制备装置接收具有其中设置有生物样品之样品孔的盒，例如图4A和4B中所示的盒的模块440中的样品孔。盒可以被接收在文库制备装置的盒舱中，例如图2B中所示的盒舱210。
在框830中，扫描设施可以接收标识要在文库制备方案中使用的一种或更多种试剂的信息。由扫描设施操作的扫描设备可以集成到文库制备装置中，例如条码扫描仪，作为图2B所示的光学模块226的一部分。然而，在一些实施方案中，扫描设备可包含位于文库制备装置外部的一个或更多个扫描装置。在一些实施方案中，扫描设施可以通过扫描与匣相关的条码来接收标识试剂的信息，所述匣包含配置成含有和/或接收试剂的一个或更多个储存器。
应认识到，接收标识生物样品的信息和接收标识要在文库制备方案中使用的一种或更多种试剂的信息可以在不同的时间和/或用不同的扫描设备进行。在一些实施方案中，扫描与生物样品相关的标识符和与一种或更多种试剂相关的标识符可以通过外部扫描设备在文库制备装置外部进行。所接收的标识生物样品的信息可以与所接收的标识一种或更多种试剂的信息相关地存储。在一些实施方案中，可以在将生物样品设置于样品孔中并将盒加载到文库制备装置中之后进行标识符的扫描。与盒相关的标识符可以提供标识定生物样品和一种或更多种试剂的信息。位于文库制备装置内的扫描设备可以扫描与盒相关的标识符以接收标识生物样品和一种或更多种试剂的信息。
在框840中，方案确定设施评价接收到的信息以标识文库制备方案。在一些实施方案中，方案确定设施可以基于标识生物样品的信息和/或标识一种或更多种试剂的信息从多个文库制备方案中选择文库制备方案。所接收的信息可以提供对文库制备方案的标识和/或选择过程的约束。
在框850中，方案确定设施存储指示与盒相关的所标识的文库制备方案的信息。
图9示出了可以在一些实施方案中实现的示例性过程900以通过操作文库制备装置对生物样品执行文库制备方案来制备用于后续分析的生物样品。该过程开始于框910，其中接收标识生物样品的信息。标识生物样品的信息可以由扫描设施接收。
在框920中，扫描设施接收标识一个或更多个资源的信息。
在框930中，方案确定设施检索用于生物样品和一个或更多个资源的文库制备方案。
在框940中，调度设施确定操作文库制备装置以实施文库制备方案的时间表。
在框950中，制备设施对生物样品执行时间表。自动化设施可以指示制备设施在确定了时间表之后对生物样品自动执行时间表，而无需另外的使用者干预。
在框960中，制备设施将结果输出至数据存储区和/或使用者界面。
图10示出了可以在一些实施方案中实现的示例性过程1000以基于通过处理来自样品表的样品信息而产生的配置信息，对与生物样品相关的文库进行测序过程。测序过程可以由测序仪或其他测定装置，例如图6中所示的测定装置618进行。在过程1000开始之前，可以通过文库制备装置对生物样品实施文库制备方案以形成与生物样品相关的文库。文库制备装置可已经接收到标识生物样品的信息，其可已被评价以标识文库制备方案。
过程1000开始于框1010，其中数据中心生成样品表以包括由文库制备装置接收的样品信息。样品信息可包括标识生物样品的信息。
在框1020中，数据中心将待由测序装置使用的样品表格式化。在一些实施方案中，可基于样品信息标识测序装置的类型，所述样品信息可包括对生物样品实施的文库制备方案。样品表的格式可以允许所标识类型的测序装置访问存储在样品表中的信息。
在框1030中，数据中心处理样品信息以生成测序装置的配置信息。
在框1040中，数据中心使用配置信息执行测序装置，以对与生物样品相关的文库进行测序过程。自动化设施可有利于自动执行测序过程而无需使用者干预。
在框1050中，数据中心将测序结果输出至数据存储区和/或使用者界面。
图11示出了可以在一些实施方案中实现的示例性过程1100以分析测序结果。过程1100可以由分析装置(例如分析装置620)实施。在过程1100开始之前，可以通过文库制备装置对生物样品实施文库制备方案以形成与生物样品相关的文库。对文库进行的测序过程可以提供与生物样品相关的测序结果。
在框1110中，分析装置接收包含由文库制备装置接收的生物样品之样品信息的样品表。
在框1120中，分析装置可检索由文库制备装置对生物样品实施的文库制备方案。检索文库制备方案可包括标识从样品表标识样品信息并标识与所标识的生物样品相关的文库制备方案。
在框1130中，配置设施分析样品表和文库制备方案以调整分析过程的配置从而对与生物样品相关的测序结果实施。
在框1140中，分析设施使用经调整配置来分析测序结果。
在框1150中，分析设施将结果输出至数据存储区和/或使用者界面。
图12示出了计算装置1200形式的计算装置的一个示例性实施，该计算装置可用于实现本文中所述技术的***，但也可用于其他***。计算装置1200可以操作文库制备装置并控制文库制备装置的功能。计算装置1200可以集成在文库制备装置内或远程操作文库制备装置。应理解的是，图12既不旨在描绘用于根据本文中所述原理进行操作的计算装置的必要组件，也不是全面的描绘。
计算装置1200可以包含至少一个处理器1202、网络适配器1204和计算机可读存储介质1206。计算装置1200可以是例如台式或膝上个人计算机、个人数字助理(PDA)、智能移动电话、服务器或者任何其他合适的计算装置。网络适配器1204可以是任何合适的硬件和/或软件，以使计算装置1200能够通过任何合适的计算网络与任何其他合适的计算装置进行有线和/或无线通信。计算网络可以包括无线接入点、交换机、路由器、网关和/或其他网络设备以及用于在两个或更多个计算机之间交换数据的任何合适的有线和/或无线通信介质，包括因特网。计算机可读介质1206可以适于存储要处理的数据和/或要由处理器1202执行的指令。处理器1202使得能够处理数据并执行指令。数据和指令可以存储在计算机可读存储介质1206上，并且可以例如实现计算装置1200的组件之间的通信。
存储在计算机可读存储介质1206上的数据和指令可以包括实现根据本文中所述原理进行操作之技术的计算机可执行指令。在图12的实例中，计算机可读存储介质1206存储实现多种设施并存储如上所述多种信息的计算机可执行指令。计算机可读存储介质1206可以存储扫描设施1208、方案确定设施1210、调度设施1212、自动化设施1214和制备设施1216，其中每一个都可以实现上述技术。
图13示出了计算装置1300形式的计算装置的一个示例性实施，该计算装置可用于实现本文中所述技术的***，但也可用于其他***。计算装置1300可以操作测定装置并控制测定装置的功能。计算装置1300可以集成在测定装置内或远程操作测定装置。应理解的是，图13既不旨在为描绘用于根据本文中所述原理进行操作的计算装置的必要组件，也不是全面的描绘。
计算装置1300可以包含至少一个处理器1302、网络适配器1304和计算机可读存储介质1306。计算装置1300可以是例如台式或膝上个人计算机、个人数字助理(PDA)、智能移动电话、服务器或者任何其他合适的计算装置。网络适配器1304可以是任何合适的硬件和/或软件，以使计算装置1300能够通过任何合适的计算网络与任何其他合适的计算装置进行有线和/或无线通信。计算网络可以包括无线接入点、交换机、路由器、网关和/或其他网络设备以及用于在两个或更多个计算机之间交换数据的任何合适的有线和/或无线通信介质，包括因特网。计算机可读介质1306可以适于存储要处理的数据和/或要由处理器1302执行的指令。处理器1302使得能够处理数据并执行指令。数据和指令可以存储在计算机可读存储介质1306上，并且可以例如实现计算装置1300的组件之间的通信。
存储在计算机可读存储介质1306上的数据和指令可以包括实现根据本文中所述原理进行操作之技术的计算机可执行指令。在图13的实例中，计算机可读存储介质1306存储实现多种设施并存储如上所述的多种信息的计算机可执行指令。计算机可读存储介质1306可以存储自动化设施1308，其可以实现上述技术。
图14示出了计算装置1400形式的计算装置的一个示例性实施，该计算装置可用于实现本文中所述技术的***，但也可用于其他***。计算装置1400可以作为数据中心(例如图6中所示的数据中心616)进行操作。计算装置1400可以集成在文库制备装置、测定装置和/或分析装置内。在一些实施方案中，计算装置1400可作为远程装置进行操作。应理解的是，图14既不旨在描绘用于根据本文中所述原理进行操作的计算装置的必要组件，也不是全面的描绘。
计算装置1400可以包含至少一个处理器1402、网络适配器1404和计算机可读存储介质1406。计算装置1400可以是例如台式或膝上个人计算机、个人数字助理(PDA)、智能移动电话、服务器或者任何其他合适的计算装置。网络适配器1404可以是任何合适的硬件和/或软件，以使计算装置1400能够通过任何合适的计算网络与任何其他合适的计算装置进行有线和/或无线通信。计算网络可以包括无线接入点、交换机、路由器、网关和/或其他网络设备以及用于在两个或更多个计算机之间交换数据的任何合适的有线和/或无线通信介质，包括因特网。计算机可读介质1406可以适于存储要处理的数据和/或要由处理器1402执行的指令。处理器1402使得能够处理数据并执行指令。数据和指令可以存储在计算机可读存储介质1406上，并且可以例如实现计算装置1400的组件之间的通信。
存储在计算机可读存储介质1406上的数据和指令可以包括实现根据本文中所述原理进行操作之技术的计算机可执行指令。在图14的实例中，计算机可读存储介质1406存储实现多种设施并存储如上所述多种信息的计算机可执行指令。计算机可读存储介质1406可以存储分析设施1408和配置设施1410，其中每一个都可以实现上述技术。
尽管未在图12、13和14中示出，计算装置1200、1300和1400可以另外具有一个或更多个组件和***设备(peripheral)，包括输入和输出装置。这些装置尤其还可用于呈现使用者界面。可用于提供使用者界面的输出装置的实例包括用于视觉呈现输出的打印机或显示屏，以及用于可听呈现输出的扬声器或其他声音产生装置。可用于使用者界面的输入装置的实例包括键盘，以及指向装置例如鼠标、触摸板和数字平板。作为另一个实例，计算装置可以通过语音识别或以其他可听形式接收输入信息。
已经描述了以电路和/或计算机可执行指令实现这些技术的实施方案。应当理解，一些实施方案可以是方法的形式，其中已经提供了至少一个实例。作为方法的一部分实施的动作可以以任何合适的方式排序。因此，可以构建这样的实施方案，其中以不同于所示的顺序实施动作，其可以包括同时实施一些动作，即使其在举例说明性实施方案中示为顺序动作。
虽然本文中已经描述并举例说明了本发明的几个实施方案，但本领域普通技术人员将容易预见到用于执行本文所述的功能和/或获得结果和/或一种或更多种优势的多种其他手段和/或结构，并且每种这样的改变和/或修改都被认为在本发明的范围之内。更一般性地，本领域技术人员将容易理解，本文所描述的所有参数、尺寸、材料和构造都意在为示例性的，并且实际的参数、尺寸、材料和/或构造将根据使用本发明教导的具体应用而使用。本领域技术人员将认识到，或能够仅使用常规实验确定本文所描述的本发明具体实施方案的许多等同方案。因此，应当理解的是，前面的实施方案仅仅通过实例的方式展示，并且除非特别描述并要求，本发明可以在所附权利要求范围及其等同的范围内实施。本发明涉及本文所描述的每个单独的特征、***、制品、材料、试剂盒和/或方法。此外，如果该特征、***、制品、材料、试剂盒和/或方法并非互相不一致，则任何两个或更多个该特征、***、制品、材料、试剂盒和/或方法的组合也包含在本发明的范围内。
除非明确相反指明，否则本文在说明书和权利要求中所使用的不定冠词“一个/种”应理解为意指“至少一个/种”。
本文在说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应理解为意指相关联的要素(即在某些情况下相关联存在，而在其他情况下不相关联地存在的要素)中的“任意一个或二者”。除非明确相反指明，否则除了被“和/或”分句特别地确定的要素之外，其他要素可以任选地存在，无论其与特别确定的那些要素是否相关。因此，作为一个非限制实例，当与开放性语句如“包括/包含”结合使用提及“A和/或B”时，在一个实施方案中，可指有A而没有B(任选地，包括除了B之外的要素)；在另一个实施方案中，可指有B而没有A(任选地，包括除了A之外的要素)；在另一个实施方案中，可指A与B二者(任选地，包括其他要素)；等。
本文在说明书和权利要求中使用的“或”应该理解为与上文定义的“和/或”具有相同含义。例如，当分离列表中的项时，“或”或者“和/或”应被解释为包括性的，即在许多要素或要素列表中，以及任选地另外的未列出的项中，包括至少一个/种，但也包括多于一个/种的要素。仅当术语明确相反指明，例如“只有其中之一”或“恰好其中之一”，或者当在权利要求中使用“由……组成”时，将指包含许多要素或要素列表中的恰好一个/种要素。一般而言，当前面是排他性术语如“任一”、“其中之一”、“仅其中之一”或“恰好其中之一”时，本文所使用的术语“或”应当仅被解释为排他性的选择(即，“一个或另一个，但并非二者全部”)。当在权利要求中使用“基本上由……组成”时，应当具有其用于专利法领域中的通常含义。
本文在说明书和权利要求中使用的短语“至少一个/种”涉及一系列的一个/种或更多个/种要素，应当被理解为意指在要素列表中，选自任何一个/种或更多个/种要素的至少一个/种要素，但未必包括该要素列表中具体列出的各个/种和每个/种要素中的至少一个/种，并且不排除该要素列表中的任何要素的组合。该定义也允许除了在要素列表中被具体确定的、短语“至少一个/种”所指的要素以外，其他要素可任选的存在，无论是否与具体确定的那些要素相关。因此，作为一个非限制性实例，“A和B中的至少一个/种”(或等同的，“A或B中的至少一个/种”，或等同的，“A和/或B中的至少一个/种”)在一个实施方案中可指至少一个/种(任选地包括多于一个/种)A，而不存在B(且任选地包括除B之外的要素)；在另一个实施方案中，指至少一个/种(任选地包括多于一个/种)B，而不存在A(且任选地包括除A之外的要素)；在另一个实施方案中，指至少一个/种(任选地包括多于一个/种)A，和至少一个/种(任选地包括多于一个/种)B(并且任选地包括其他要素)；等。
在权利要求以及在上述的说明书中，所有的过渡短语如“包含”、“包括”、“带有”、“具有”、“含有”、“涉及”、“保持/容纳”等应理解为开放式的，即意为包括但不限于。如美国专利局的专利审查程序手册(the UnitedStates Patent Office Manual of PatentExamining Procedures)，2111.03章所述，只有过渡短语“由……组成”和“基本上由……组成”应分别为封闭式或半封闭式过渡短语。
除非另外限定或指出，否则本文涉及以下所使用的任何术语均应理解为不要求绝对符合此类术语的数学定义：例如一个或更多个制品、结构、力、场、流、方向/轨迹和/或其子组件和/或其任意组合和/或上文未列出的可通过此类术语表征的任何其他有形或无形元件或者其之间的形状、取向、排列和/或几何关系，而应理解为指示在如此表征的主题可能的程度上符合此类术语的数学定义，如与这样的主题最密切相关领域技术人员将理解的。与形状、定向和/或几何关系相关的这些术语的实例包括但不限于描述以下的术语：形状-例如，圆形、正方形、环形的/环形、矩形的/矩形、三角形的/三角形、圆柱形的/圆柱形、椭圆的/椭圆、(n)多边形的/(n)多边形等；角定向-例如垂直、正交、平行、垂直、水平、共线等；轮廓和/或轨迹-例如，平面/平面的、共面的、半球形的、半-半球形的、线/线性、双曲线的、抛物线的、平面、弯曲的、直线的、弧形的、正弦的、切线/切线的等；方向-如北、南、东、西等；表面和/或散体材料特性(bulk material property)和/或空间/时间分辨率，和/或分布-例如，光滑、反射、透明、清晰、不透明、刚性、不可渗透、均匀、惰性、不可润湿、不溶、稳定、不变、恒定、同质等；以及相关领域技术人员显而易见的许多其他内容。作为一个实例，在本文中描述为“正方形”的制造制品不要求这样的制品具有完全平面或线性的并且以精确的90度的角度相交的面或边(实际上，这样的制品可仅作为数学抽象存在)，相反，这样的制品的形状应被解释在所记载的制造技术通常可实现或已实现的程度上为近似于数学上定义的“正方形”，如本领域技术人员所理解的或如具体描述的。作为另一个实例，在本文中描述为“对准”的两个或更多个所制造制品不要求这样的制品具有完全对准的面或边(实际上，这样的制品只可仅作为数学抽象存在)，相反，这样的制品的设置应被解释为在所记载的制造技术通常可实现或已实现的程度上为近似于数学上定义的“对准”，如本领域技术人员所理解的或如具体描述的。

Claims (47)

1.操作文库制备装置的方法，所述文库制备装置配置成实施多个文库制备方案以制备用于测序的生物样品，所述多个文库制备方案中的每一个包含不同的文库制备操作组，所述方法包括：
配置所述文库制备装置以对生物样品实施所述多个文库制备方案中的文库制备方案从而制备用于测序的生物样品，其中配置所述文库制备装置包括：
接收指示与所述生物样品和所述文库制备装置在实施所述文库制备方案中要使用的至少一种资源相关的编码标识符的信息，
至少部分地基于指示所述编码标识符的信息，从文库制备方案组选择要实施的所述文库制备方案，以及
存储指示在要对所述生物样品进行的选择中选择的所述文库制备方案的信息；以及
操作所述文库制备装置以对所述生物样品实施所述文库制备方案从而制备用于测序的生物样品。
2.权利要求1所述的方法，其中选择所述文库制备方案包括基于所述编码标识符自动选择所述文库制备方案。
3.权利要求2所述的方法，其中选择所述文库制备方案还包括在选择中在不需人为干预的情况下选择所述文库制备方案。
4.权利要求1所述的方法，其中与所述生物样品和所述至少一种资源相关的编码标识符是电子可读标识符。
5.权利要求4所述的方法，其中与所述生物样品相关的所述编码标识符是条码。
6.权利要求5所述的方法，其中接收指示所述编码标识符的信息包括扫描所述条码。
7.权利要求6所述的方法，其中：
所述文库制备装置包含条码扫描仪；并且
接收指示所述编码标识符的信息包括用所述文库制备装置的所述条码扫描仪扫描所述条码。
8.权利要求4所述的方法，其中与所述生物样品相关的编码标识符是近场通信(NFC)标签。
9.权利要求8所述的方法，其中接收指示所述编码标识符的信息包括询问所述NFC标签。
10.权利要求9所述的方法，其中：
所述文库制备装置包含NFC询问器；并且
接收指示所述编码标识符的信息包括用所述文库制备装置的所述NFC询问器询问所述NFC标签。
11.权利要求1所述的方法，其中接收指示与所述生物样品和所述至少一种资源相关的编码标识符的信息包括接收与所述生物样品相关的信息。
12.权利要求1所述的方法，其中：
接收指示与所述生物样品和所述至少一种资源相关的编码标识符的信息包括接收标识所述生物样品和标识配置成在实施所述文库制备方案期间容纳所述生物样品的盒的信息；并且
选择所述文库制备方案包括至少部分地基于指示所述盒的信息来选择所述方案。
13.权利要求12所述的方法，其中：
所述盒为配置成与所述多个文库制备方案中的一个或更多个文库制备方案一起使用的类型，所述盒布置成至少部分地通过包含预先设置在所述盒内的材料来实施，所述材料用于实施所述一个或更多个文库制备方案；
所述标识盒的信息包含标识所述盒的类型的信息；并且
选择文库制备方案包括至少部分地基于所述标识盒的类型的信息来选择所述方案。
14.权利要求1所述的方法，其中：
接收指示与所述生物样品和所述至少一种资源相关的编码标识符的信息包括接收标识要在待实施的文库制备方案中使用的至少一种材料的信息；并且
选择所述文库制备方案包括基于标识要在所述文库制备方案中使用的所述至少一种材料的信息选择所述文库制备方案。
15.权利要求1所述的方法，其中：
接收指示与所述生物样品和所述至少一种资源相关的编码标识符的信息包括接收与配置成在实施所述文库制备方案期间容纳所述生物样品的盒相关的编码标识符；
配置所述文库制备装置还包括从至少一个数据存储区并基于所述编码标识符检索标识所述生物样品和标识所述文库制备方案要使用的至少一种资源的信息；并且
选择所述文库制备方案包括基于标识所述生物样品和所述至少一种资源的检索信息来选择所述文库制备方案。
16.权利要求1所述的方法，其中配置所述文库制备装置还包括：
确定操作所述文库制备装置以实施所述文库制备方案的文库制备操作的时间表；并且
操作所述文库制备装置包括操作所述文库制备装置以根据所述时间表实施所述文库制备操作。
17.权利要求16所述的方法，其中确定所述时间表包括：
评价用于利用所述文库制备装置实施所述文库制备方案的所述文库制备操作的多个时间表选项的估计完成时间；以及
基于所述评价的结果选择所述多个时间表选项中的一个。
18.权利要求16所述的方法，其中确定所述时间表还包括评价第一存储信息，其关于实施所述文库制备方案的所述文库制备操作的至少第一部分的估计持续时间；以及对于文库制备选项的至少第二部分评价第二存储信息，其关于在完成操作之后开始后续操作之前的持续时间的容差。
19.权利要求16所述的方法，其中：
所述文库制备装置包含多个样品孔，在所述样品孔中对所述生物样品实施文库制备方案；并且
确定在所述多个样品孔中的第一样品孔中实施文库制备方案的时间表还包括评价用于在所述文库制备装置的第二样品孔中对第二生物样品实施第二文库制备方案的第二时间表。
20.权利要求1所述的方法，其中操作所述文库制备装置以对所述生物样品实施所述文库制备方案包括操作所述文库制备装置以实施文库制备操作，所述文库制备操作包括操作所述文库制备装置以将所述生物样品的至少一部分暴露在一定温度下一段时间。
21.权利要求1所述的方法，其中操作所述文库制备装置以对所述生物样品实施所述文库制备方案包括操作所述文库制备装置以实施文库制备操作，所述文库制备操作包括操作所述文库制备装置以将一定体积的材料从所述文库制备装置内的第一位置运输至第二位置。
22.权利要求1所述的方法，其还包括：
提供所述文库制备方案是否完成的指示，并且当所述文库制备方案指示为完成时解锁所述文库制备装置的开口。
23.权利要求22所述的方法，其中：
所述文库制备装置包含多个盒舱，每个盒舱配置成容纳盒，在所述盒中对生物样品实施文库制备方案；
所述方法包括配置所述文库制备装置以在位于所述多个盒舱的第一盒舱中的第一盒中实施所述文库制备方案；并且
所述方法还包括在实施所述第一盒中的所述文库制备方案的至少一部分期间防止对所述多个盒舱的第二盒舱的访问。
24.配置待对生物样品进行的测序过程以确定所述生物样品中包含的至少一种核酸序列的方法，所述方法包括：
接收由对所述生物样品实施文库制备方案的文库制备装置产生的样品信息，以制备用于测序的生物样品，所述样品信息标识包含至少一种核酸的所述生物样品；
处理由所述文库制备装置产生的所述样品信息，以产生将对所述生物样品进行测序过程的测序装置的配置信息，所述配置信息标识出被测序装置用于调节所述测序过程的进行的至少一个参数；以及
将所述测序装置的配置信息存储在至少一个数据存储区中。
25.权利要求24所述的方法，其中接收所述样品信息包括接收标识所述生物样品的信息。
26.权利要求24所述的方法，其中接收所述样品信息包括接收标识组织类型的信息。
27.权利要求24所述的方法，其中接收所述样品信息包括接收标识与所述生物样品相关的患者的信息。
28.权利要求24所述的方法，其中接收所述样品信息包括接收标识对所述生物样品实施的文库制备方案的信息。
29.权利要求24所述的方法，其中接收所述样品信息包括接收关于文库制备方案的实施结果的信息。
30.权利要求29所述的方法，其中接收所述样品信息包括接收关于对所述生物样品进行qPCR过程的结果的信息。
31.权利要求30所述的方法，其中关于qPCR结果的信息包括关于qPCR过程的结果强度的信息。
32.权利要求30所述的方法，其中关于qPCR结果的信息包括至少一种核酸序列和与所述至少一种核酸序列相关的至少一种质量评分。
33.权利要求24所述的方法，其中处理所述样品信息以产生配置信息包括产生所述测序装置的样品表。
34.权利要求33所述的方法，其中处理所述样品信息以产生配置信息还包括：
确定要使用的测序装置；以及
以所述测序装置接收输入信息的格式产生所述样品表。
35.权利要求33所述的方法，其中所述样品表包含标识所述生物样品的信息。
36.权利要求33所述的方法，其中所述样品表包含标识所述文库制备方案的信息。
37.权利要求33所述的方法，其还包括：
向所述测序装置提供所述样品表。
38.权利要求37所述的方法，其中向所述测序装置提供所述样品表包括经由网络与所述测序装置通信。
39.权利要求33所述的方法，其还包括：
向分用装置提供所述样品表，以对所述测序过程的结果实施分用过程。
40.权利要求39所述的方法，其中所述分用装置与所述测序装置是同一装置。
41.权利要求39所述的方法，其还包括：
接收关于所述分用过程的结果的信息并存储所述分用过程的结果。
42.权利要求24所述的方法，其中接收所述样品信息包括从所述文库制备装置接收所述样品信息。
43.权利要求24所述的方法，其中所述方法由所述文库制备装置实施，并且接收样品信息包括从所述文库制备装置的数据存储区接收样品信息。
44.分析对生物样品进行的测序过程的结果以确定包含在所述生物样品中的核酸序列的方法，所述方法包括：
接收由对所述样品实施文库制备方案的文库制备装置产生的样品信息，以制备用于测序的生物样品，所述样品信息标识出所述生物样品和对所述生物样品实施的文库制备方案；
接收对所述生物样品进行的所述测序过程的结果，所述结果标识在所述测序过程期间在所述生物样品中检测到的至少一种核酸序列；
至少部分地基于由所述文库制备装置产生的所述样品信息来配置对所述测序过程的结果进行的分析过程；
用经配置分析过程分析所述测序过程的结果；以及
存储所述经配置分析过程的结果。
45.权利要求44所述的方法，其中接收样品信息包括从所述文库制备装置接收所述样品信息。
46.权利要求44所述的方法，其中接收所述测序过程的结果包括从由所述样品信息所标识的数据存储区的位置接收所述结果。
47.权利要求46所述的方法，其中接收所述测序过程的结果包括在通过监测所述数据存储区的位置确定所述测序过程的完成时自动接收所述测序过程的结果。
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