CN109988709B - 一种检测多种病原体的微流控芯片 - Google Patents
一种检测多种病原体的微流控芯片 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种检测多种病原体的微流控芯片,包括:基板,所述基板设有多个反应腔、以及分别通过多条微通道与所述反应腔连通的进样口和出气口;盖片,所述盖片固定结合于所述基板表面,将所述反应腔和微通道密封;所述反应腔的侧壁设置为阶梯结构,且所述反应腔的底面面积小于其顶面开口的面积,每个所述反应腔内均收容有用于检测一种或多种病原体的冻干试剂,且每个反应腔内收容的所述试剂分别对应检测不同种类的病原体。本发明的微流控芯片通过设置多个反应腔,可实现一次加样检测多种病原体。此外,反应腔的侧壁上设置阶梯结构,该阶梯结构能够阻挡液体试剂在点样和冻干时扩散进入到微通道中,避免冻干后微通道堵塞,使后续实验能够顺利进行。
Description
技术领域
本发明涉及微流控技术领域。更具体地,涉及一种微流控芯片。
背景技术
微流控芯片是微流控技术实现的主要平台。微流控芯片指的是将化学和生物等领域中所涉及的样本制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块很小的芯片上,由微通道形成网络,以可控流体贯穿整个***,用以实现常规化学或生物实验室的各种功能。微流控芯片能快速、准确地将样品分成若干个独立的单元,并进行多步平行反应,成本低、体积小、通量高。
常见的PCR微流控芯片主要有两种:微反应腔式和连续流动式。微反应腔式PCR芯片是指在芯片上加工一个腔体用来储存实验试剂,通过加热器件和降温器件对腔体加热和降温来达到PCR扩增各阶段所需要的温度,经过一次温度循环完成一次扩增过程。
荧光定量PCR扩增反应试剂在保存、运输和使用过程中要求在低温条件下进行,否则诊断试剂容易失效,因此试剂盒的长期保存和长途运输将会受到很大的限制,容易因诊断试剂保存不当而使其敏感性下降甚至完全失效,最终导致疫病的检测不及时而造成疫病流行。因此,目前通常在将试剂加入到反应腔后,将试剂降温冻结成固体,然后在真空条件下升华,将95%以上的水分蒸发掉,而保护剂作为固剂在升华时不会崩塌,保证了冻干制品的形态,使经过冻干处理后的试剂保留在反应腔内,从而使微流控芯片可以常温保存和运输。
与传统分析技术相比,微流控芯片有如下几项特点:集成型、分析速度极快、能耗低、物耗少、污染小、廉价、安全。这些特点使得微流控芯片在各个分析领域都如鱼得水,如生化医疗诊断、食品和商品检测、环境监测、刑事科学、军事科学和航天科学等重要应用领域,其中生物医学分析是热点。目前,实验室对各种病原体的确认需要大量的实验筛查,对于感染病原学复杂的检测项目,确认病原体时往往需要同步进行多个实验,有时需要同时开展十几项实验,因此就需要同时制备十几份不同的反应试剂,操作步骤繁琐,耗费时间较长,工作效率较低,而且需要有经验的专业人员操作。
此外,发明人发现在将试剂加入到反应腔后,液态的试剂会沿着与反应腔连通的微通道扩散,造成留存在反应腔内冻干试剂的数量减少,更严重的会造成微通道堵塞,样本液无法加入反应腔内。
发明内容
本发明的目的在于提供一种一次加样可检测多种病原体的微流控芯片,同时,该芯片的反应腔还能够使试剂不会扩散到微通道中,从而使得反应腔中经冻干处理后试剂的数量精确。
根据本发明的一个方面,提供了一种检测多种病原体的微流控芯片,包括:基板,所述基板设有多个反应腔、以及分别通过多条微通道与所述反应腔连通的进样口和出气口;
盖片,所述盖片固定结合于所述基板表面,将所述反应腔和微通道密封;
所述反应腔的侧壁设置为阶梯结构,且所述反应腔的底面面积小于其顶面开口的面积,每个所述反应腔内均收容有用于检测多种病原体的经冻干处理的试剂,且每个反应腔内收容的所述试剂分别对应检测不同种类的病原体。
优选地,所述反应腔侧壁的阶梯结构包括一层台阶结构,所述台阶结构将反应腔侧壁分成上层侧壁和下层侧壁,所述上层侧壁和下层侧壁分别围合形成上腔室和下腔室,所述上腔室的截面面积大于所述下腔室的截面面积,所述试剂收容于所述下腔室内。
优选地,所述上腔室的深度小于所述下腔室的深度。
优选地,围合形成所述上腔室的上层侧壁进行疏水处理,围合形成所述下腔室的下层侧壁及底壁进行亲水处理。
优选地,所述反应腔设置为跑道型,包括分别相对设置的圆弧侧和直线侧,所述微通道分别与反应腔两端的圆弧侧连通。
优选地,所述一层台阶结构设置在所述反应腔圆弧侧的侧壁处。
优选地,所述试剂为反应程序相同的病原体检测试剂。
优选地,所述出气口覆盖有疏水透气膜。
优选地,所述多个反应腔交错设置在所述基板上,所述出气口的数量与所述反应腔的数量对应,所述多个反应腔分别通过各自的微通道与对应的出气口连通。
优选地,所述基板还设置有缓冲腔,所述多个反应腔分别通过各自的微通道与所述缓冲腔连通,所述缓冲腔与所述进样口连通。
本发明的有益效果如下:
本发明的检测多种病原体的微流控芯片通过设置多个反应腔,并且每个反应腔内收容有一种或多种病原体的检测试剂,可实现一次加样检测多种病原体,简化了加样程序。此外,反应腔的侧壁上设置阶梯结构,该阶梯结构能够阻挡液体试剂在点样和冻干时扩散进入到微通道中,避免冻干后微通道堵塞,降低冻干试剂损失率,保证加样成功率100%,使后续实验能够顺利进行。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出本发明的分解结构示意图。
图2示出本发明基板的结构示意图。
图3示出本发明A部的放大结构示意图。
图4示出本发明的结构示意图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明,下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解,下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的,不应以此限制本发明的保护范围。
如图1-4所示,本发明实施例提供了一种检测多种病原体的微流控芯片,该芯片包括盖片1和基板2,基板2上设置有多个交错布置的反应腔21,以及分别通过多条微通道与反应腔21连通的进样口22和出气口23。出气口设置为多个,其数量与反应腔21的数量对应,每一个反应腔21对应一个出气口23,进样口22设置为一个,分别与多个反应腔21连通,此种结构可对待测模板进行并行处理,大大提高检测速度。盖片1固定结合于基板2表面,将反应腔21和微通道密封封闭。反应腔21和微通道可以通过微机械加工工艺成型于基板2的一侧表面,盖片1通过粘接方式固定结合与基板2的该侧表面,从而将反应腔21和微通道密封。基板2可以由硅、玻璃或有机化合物制成,反应腔21和微通道采用湿法化学腐蚀、干法等离子体刻蚀或两者相结合的方法形成,这是本领域的常规技术手段,此处不再赘述。
本发明的微流控芯片具有反应池内固定扩增的结构形式,为了防止荧光定量PCR试剂加入到反应腔21中进行冷冻干燥时,试剂沿与反应腔21连通的微通道扩散。反应腔21的侧壁设置为阶梯结构,且反应腔的底面面积小于其顶面开口的面积。
本发明微流控芯片的多个反应腔21内均收容有经冷冻干燥处理后的试剂,并且每个反应腔21内的试剂分别对应检测不同种类的病原体。每个反应腔内的试剂可检测一种或多种的病原体,本领域技术人员可根据所要检测的病原体数量确定反应腔21的数量,将单一病原体的检测试剂后加入反应腔内,或将几种单一病原体的检测试剂混合后加入反应腔内。由于检测试剂位于同一芯片上,因此多种病原体检测试剂的反应程序应当相同。
具体的,如图2和图3所示,本实施方式在基板2的表面通过刻蚀方法加工形成反应腔21和微通道。反应腔21的形状设置为跑道型,包括相对设置的圆弧侧和直线侧,微通道位于反应腔21的两侧,一端分别与圆弧侧连通,另一端分别与进样口22和出气口23连通。反应腔21侧壁的阶梯结构包括一层台阶结构,该台阶结构将反应腔侧壁分成上层侧壁和下层侧壁,上层侧壁和下层侧壁分别围合形成上腔室24和下腔室25,也就是上腔室24和下腔室25共同形成了反应腔21。上腔室24的截面面积大于下腔室25的截面面积,试剂加入到反应腔21中时,位于下腔室内,由于液体、气体、固体接触面上表面张力的作用,液体会沿反应腔侧壁爬升。在对液态的试剂进行冷冻干燥时,由于反应腔21侧壁的阶梯结构具有阻挡液体爬升的作用,该阶梯结构能够阻挡液体沿侧壁爬升,液态的试剂难以沿反应腔21的侧壁扩散,试剂无法扩散进入微通道,从而保证了留在下腔室25内的试剂数量,最终全部液态试剂经冻干处理后保留在下腔室25内。
进一步地,由于本实施方式中微通道的一端与反应腔21的圆弧侧连通,因此,台阶结构仅设置在跑道型反应腔21的圆弧侧,也就是仅在反应腔21的两端设置台阶结构。此种结构可提高下腔室25的容积,而又使试剂难以扩散进入微通道中。
为了降低加工芯片的难度,提高芯片的成品率,本实施方式中阶梯结构仅包括一层台阶结构,在另一实施方式中,阶梯结构可以包括多层台阶结构,从而反应腔21也包括多个腔室。
进一步地,为了更好达到阻止试剂扩散到微通道内的效果,本实施方式中,上腔室24的深度小于下腔室25的深度,围合形成上腔室24的上层侧壁进行疏水处理,围合形成下腔室25的下层侧壁进行亲水处理,从而提高上层侧壁对试剂扩散流动的阻挡作用。
进一步地,进样口22和出气口23贯穿于基板2,并分别与微通道连通,在对试剂进行冻干后,将盖片1与基板2固定结合,将反应腔21和微通道、以及进样口22和出气口23的一侧开口封闭。为进一步隔绝试剂与空气的接触,在出气口23上覆盖粘贴有疏水透气膜3。在使用本发明的微流控芯片时,只需在进样口22加入待测模板即可上机检测。操作时,将待测模板加入进样口22,待测模板通过微通道进入反应腔21与冻干后的试剂反应,反应腔21和微通道内的空气通过出气口23排出,然后上机检测,操作简单,无需专业人员操作。
如图2所示,本实施方式进一步地在基板2的表面还刻蚀加工有缓冲腔26,该缓冲腔26一端与进样口22连通,另一端通过微通道分别与多个反应腔21连通。缓冲腔26能够保证待测模板持续稳定地进入反应腔21内,提高试验的准确性。
下面通过对呼吸道感染检测说明本发明的微流控芯片的使用方法。呼吸道感染病原学复杂,包括细菌、病毒、支原体、衣原体、真菌等,其中80%以上是病毒性的。该病四季、任何年龄均可发病,通过含有病毒的飞沫、雾滴,或经污染的用具进行传播。常于机体抵抗力降低时,如受寒、劳累、淋雨等情况,原已存在或由外界侵入的病毒或/和细菌,迅速生长繁殖,导致感染,一般5-7天痊愈。常继发支气管炎、肺炎、副鼻窦炎,少数人可并发急性心肌炎、肾炎、风湿热等。呼吸道感染是世界范围内低龄儿童(<5岁)死亡的首位原因,每年可造成约5百万儿童死亡。儿童上呼吸道感染的患病次数平均为3-8次/年,下呼吸道感染率比URTI低,在1岁儿童中感染的比例约1~3%,学龄儿童至5%~10%。呼吸道病毒习惯上是指侵害呼吸道的病毒,至少涉及到8个科,200多种型别的病毒。
本实施方式的微流控芯片可同时检测15种呼吸道病原体,包括:呼吸道合胞病毒A型(RSVA)、呼吸道合胞病毒B型(RSVB)、副流感病毒1型(PIV1)、副流感病毒2型(PIV2)、副流感病毒3型(PIV3)、冠状病毒NL63、冠状病毒HKU1、冠状病毒229E、冠状病毒OC43、鼻病毒(hRV)、人偏肺病毒(hMPV)、人博卡病毒(hBoV)、腺病毒(AdV)、甲型流感病毒(FluA)和乙型流感病毒(FluB)。
首先分别制备上述15种病原体检测试剂,将Buffer、引物、探针、dNTPs、酶混合液、冻干保护剂置于容器中,充分混合均匀,放置于2~8℃冰箱备用。本实施方式中反应腔21的数量设置为8个,其中7个反应腔中各加入两种病原体检测试剂,另一个反应腔中加入一种病原体检测试剂和内参试剂,每个反应腔的试剂使用两种荧光标记。本实施方式将两种病原体检测试剂混合,在其它实施方式中本领域技术人员可根据需要混合两种以上的检测试剂。
然后将添加了混合试剂的微流控芯片移入冻干机中进行冷冻干燥处理。
冻干程序设置:
-40℃预冻3h±0.5h;
主干燥阶段,用5min抽真空到1mbar,20~40min将隔板温度升高至-25℃;
解析干燥阶段,真空保持1mbar,2h±0.5h将隔板温度升高至30℃;然后抽真空至0.01mbar,保持2h±0.5h。
最后从冻干机中取出芯片,将盖片1粘接在基板2表面,然后真空封装。
如图4所示,使用本发明的微流控芯片时,撕开真空包装袋,在进样口22加入待测样本,待测样本通过缓冲腔26和微通道后进入反应腔21,与反应腔21内的冻干试剂混合后即可上机实验,待测样本中含有上述15种病原体中的一种或多种病原体,均能同时检测出。这样就实现了一次加样,可同时检测多种病原体。
显然,本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例,而并非是对本发明的实施方式的限定,对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动,这里无法对所有的实施方式予以穷举,凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (8)
1.一种检测多种病原体的微流控芯片,包括:
基板,所述基板设有多个反应腔以及分别通过多条微通道与所述反应腔连通的进样口和出气口;
盖片,所述盖片固定结合于所述基板表面,将所述反应腔和微通道密封;
其特征在于,所述反应腔的侧壁设置为阶梯结构,且所述反应腔的底面面积小于其顶面开口的面积,每个所述反应腔内均收容有用于检测一种或多种病原体的冻干试剂,且每个反应腔内收容的所述试剂分别对应检测不同种类的病原体;
所述反应腔侧壁的阶梯结构包括一层台阶结构,所述台阶结构将反应腔侧壁分成上层侧壁和下层侧壁,所述上层侧壁和下层侧壁分别围合形成上腔室和下腔室,所述上腔室的截面面积大于所述下腔室的截面面积,所述试剂收容于所述下腔室内;
所述出气口覆盖有疏水透气膜。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片,其特征在于,所述上腔室的深度小于所述下腔室的深度。
3.根据权利要求1所述的微流控芯片,其特征在于,围合形成所述上腔室的上层侧壁进行疏水处理,围合形成所述下腔室的下层侧壁及底壁进行亲水处理。
4.根据权利要求1所述的微流控芯片,其特征在于,所述反应腔设置为跑道型,包括分别相对设置的圆弧侧和直线侧,所述微通道分别与反应腔两端的圆弧侧连通。
5.根据权利要求4所述的微流控芯片,其特征在于,所述一层台阶结构设置在所述反应腔圆弧侧的侧壁处。
6.根据权利要求1所述的微流控芯片,其特征在于,所述试剂为反应程序相同的病原体检测试剂。
7.根据权利要求1所述的微流控芯片,其特征在于,所述多个反应腔交错设置在所述基板上,所述出气口的数量与所述反应腔的数量对应,所述多个反应腔分别通过各自的微通道与对应的出气口连通。
8.根据权利要求7所述的微流控芯片,其特征在于,所述基板还设置有缓冲腔,所述多个反应腔分别通过各自的微通道与所述缓冲腔连通,所述缓冲腔与所述进样口连通。
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