CN104946505B - 实现pcr的微流控芯片及实时pcr的病毒快速检测装置 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种实现PCR的微流控芯片，包括反应层，所述反应层内设有样本槽，所述样本槽周围设有多组反应区，每组反应区至少包括一反应槽，每个反应槽通过流道与样本槽相连，所述样本槽通过进样孔与外界相连。同时，本发明还提供了包含该微流控芯片的实时PCR的病毒快速检测装置。该微流控芯片不仅使用的样本剂量小、可靠性高，从而节约了使用成本；而且，可以根据不同的测试需要加入不同的检测试剂，从而达到标准化和规范化。同时，该检测装置不仅操作简单、使用方便，而且便于携带。

Description

实现PCR的微流控芯片及实时PCR的病毒快速检测装置
技术领域
本发明涉及微流控芯片技术领域，尤其是一种应用于生命科学领域的实现PCR的微流控芯片及实时PCR的病毒快速检测装置。
背景技术
自1990年提出微全分析***概念以来，微流控芯片技术在化学、生命科学、环境科学和食品科学等领域开辟了广阔的发展空间。微流控芯片技术以微流体控制技术为基础，引导分析仪器向小型化、集成化、自动化、高通量快速定量分析方向发展，为生化环境样本的实时检测、现场分析提供了一种可能的策略，其在医疗诊断与农业养殖***疫情监测方面具有广阔的市场前景。
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断、动物病毒与疫情快速检测或任何有DNA、RNA的地方。在临床医学和动物疫情监测***中，PCR被用于鉴别遗传疾病和快速检测病毒、病菌感染。用传统的方法，要检测病毒、病菌的感染需要把病原体培养数周才能鉴定，而采用本发明成果，可以快速判断人体与动物细胞(比如血液细胞)中是否存在病毒、病菌的DNA而确诊。
实时PCR(real-time PCR)，属于定量PCR(quantitative-PCR)的一种，以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。实时PCR定量使用荧光色素，目前有二种方法。一种是在DNA中***特异的荧光色素；另一种使用能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种荧光探针。实时PCR与逆转录PCR(reverse-transcription PCR)相结合，能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种RT-PCR的组合被称之为“定量RT-PCR(quantitative RT-PCR)”。由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，具有特异性更强、有效解决PCR污染、自动化程度高等特点。实时定量PCR是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出PCR产物进行分离。目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。
目前，实时定量PCR的反应层系常采用孔板结构作为样本的载体，这样不仅使得反应区升降温吸收和释放的热量过大，从而导致反应区升降温速度较慢；而且，孔板结构的样本载体需要的样本试剂体积量至少要在10微升级别，不利于降低使用成本；同时，在如环境监测、现场检验检疫及战地防生化等领域，需要便携式的快速分析装置，而现有技术提供的实时PCR的病毒快速检测装置体积大操作复杂不适合在野外作业。
发明内容
为解决上述现有技术所存在的问题，本发明的目的在于提供一种样本剂量使用少、可靠性高的实现PCR的微流控芯片。
为了实现上述目的，本发明的目的之一是提供一种实现PCR的微流控芯片，包括反应层，所述反应层内设有样本槽，所述样本槽周围设有多组反应区，每组反应区至少包括一反应槽，每个反应槽通过流道与样本槽相连，所述样本槽通过进样孔与外界相连。
优选地，所述微流控芯片还包括盖设于所述反应层上方的气动控制层，所述气动控制层包括多个控制阀和用于连接控制阀的气体管道，所述控制阀置于流道的上方。
优选地，所述反应层包括基板和盖设于基板上的薄膜层，所述样本槽、进样孔、反应槽以及流道设于薄膜层上朝向基板的一侧，所述气动控制层盖设于薄膜层的上方。
优选地，所述薄膜层采用PDMS材料制成。
优选地，所述微流控芯片还包括设于所述气动控制层上方的由透气材料制成的注水层。
优选地，所述薄膜层上的反应槽和流道内涂覆有隔离层，所述隔离层采用不透气材料。
优选地，所述气动控制层采用弹性材料制成，所述气动控制层的厚度为20～50μm。
优选地，所述反应层包括底板和盖设于底板上的盖板，所述样本槽、反应槽以及流道设于底板上朝向盖板的一侧，所述进样孔设于盖板上相对于样本槽的位置，所述底板和盖板均采用塑料材料制成。
本发明的另一目的是提供一种实时PCR的病毒快速检测装置，包括：
如上所述的微流控芯片；
动力机构：用于为所述微流控芯片提供旋转动力；
温度控制单元：用于控制并监测反应区的温度；
信号探测单元：用于探测反应区内的信号，并传输给数据处理及控制单元进行处理；
数据处理及控制单元：实现对温度控制单元和信号探测单元数据的采集、处理、存储和显示，同时控制所述动力机构的运动。
优选地，所述温度控制单元包括分别设于反应区周围的多个半导体温控片和多个温度传感器，所述半导体温控片用于控制反应区的温度，所述温度传感器用于检测反应区的温度；所述信号探测单元包括激发光源、光学传输单元和光电探测器；所述激发光源用于发出激发光并照射反应区，使反应区内的样本发出荧光；光学传输单元用于传输激发光和收集样本的荧光；所述光电探测器用于探测荧光信号，并将光信号转换成电信号传输到数据处理及控制单元进行处理。
有益效果：
本发明提供的实现PCR的微流控芯片，不仅使用的样本剂量小、可靠性高，从而节约了使用成本；而且，可以根据不同的测试需要加入不同的检测试剂，从而达到标准化和规范化。同时，本发明还提供了包含该微流控芯片的实时PCR的病毒快速检测装置，该检测装置不仅操作简单、使用方便，而且便于携带。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的实现PCR的微流控芯片的结构示意图，其中，图1a为反应层中基板的结构示意图；图1b为反应层中薄膜层的结构示意图；图1c为气动控制层的结构示意图；图1d为注水层的结构示意图。
图2本发明实施例提供的实时PCR的病毒快速检测装置的示意图。
图3为本发明实施例2提供的实现PCR的微流控芯片的结构示意图，其中，图3a为反应层中基板的结构示意图；图3b反应层中薄膜层的结构示意图；图3c为气动控制层的结构示意图。
图4为本发明实施例3提供的实现PCR的微流控芯片的结构示意图，其中，图4a为反应层中底板的结构示意图；图4b反应层中盖板的结构示意图。
具体实施方式
如前所述，本发明的目的在于提供一种实现PCR的微流控芯片，包括反应层，所述反应层内设有样本槽，所述样本槽周围设有多组反应区，每组反应区至少包括一反应槽，每个反应槽通过流道与样本槽相连，所述样本槽通过进样孔与外界相连。同时，本发明的另一目的在于提供一种包含该微流控芯片的实时PCR的病毒快速检测装置。
为了更好地阐述本发明的技术特点和结构，以下结合附图对本发明的优选实施例进行详细描述。
实施例1
参阅图1，本实施例提供的实现PCR的微流控芯片包括反应层和设于反应层上方的气动控制层20。其中，参阅图1a和图1b，反应层包括基板110和盖设于基板110上的薄膜层120。其中，基板110为如玻璃等硬性透明材料制成，薄膜层120采用弹性材料制成。在一种优选地实施例中，薄膜层120采用聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)材料制成，其具有良好的光学透明、良好的粘附性、化学惰性等优点。薄膜层120上朝向基板110的一侧设有用于盛放样本的样本槽123和设于样本槽123周围的反应区121，其中，样本通过设于样本槽123内的进样孔124进入样本槽123内。在本实施例中，反应层包括12组反应区121，其中每组反应区121包括三个反应槽1211，每个反应槽1211和样本槽123之间通过流道122相连。样本槽123用于放置包括聚合酶、酶抗体、碱基对以及针对某种病毒或者细菌所设计的引物等的反应试剂，优选地，同一组反应区121内的反应槽1211放置相同的反映试剂，而不同组反应区121之间的反应槽1211内放置不同的反映试剂，这样不仅可以通过重复性测试而提高检测的准确度，同时，还可以在一次检测试验中对样本进行多样检测，从而提高了该微流控芯片的应用范围。
参阅图1c，气动控制层20包括多个控制阀210和用于连接控制阀210的气体管道220，其中，气动控制层20盖设于反应层的薄膜层120的上方，控制阀210设于流道122的上方。控制层20采用弹性材料制成，优选地，其采用PDMS材料制成，其厚度为20～50μm。气体管道220上设有一进气口221，该进气口221与加压气体相连。当从进气口221充入气体时，在气压的作用下，控制阀210产生形变，从而使反应层中的薄膜层120很好地贴合在基板110上，进而封闭住流道122，阻止样本进入反应区121。
进一步地，为了减小测试时反应区121内水分的蒸发，从而提高测试的可靠性，该微流控芯片还包括设于气动控制层20上方的注水层30。该注水层30采用透气材料制成，优选地，其采用PMDS材料制成。参阅图1d，本实施例提供的注水层30总体呈梳子状，但并不限于此。整个注水层30为一个腔体结构，其上设有注水口310，在使用时，将蒸馏水从注入口310注入到注水层30的腔体内，注水层30内的水分蒸发并通过PMDS材料进入到反应层的上方，使反应区121处在饱和蒸汽压氛围下，从而达到抑制反应区121内的水分蒸发的目的。
参阅图2，基于同一发明构思，本发明还提供一种实时PCR的病毒快速检测装置，包括：如上所述的微流控芯片1；动力机构4：用于为所述微流控芯片1提供旋转动力；温度控制单元5：用于控制并监测反应区121的温度；信号探测单元6：用于探测反应区内的信号，并传输给数据处理及控制单元进行处理。数据处理及控制单元7：实现对温度控制单元5和信号探测单元6数据的采集、处理、存储和显示，同时控制动力机构4的运动。
其中，温度控制单元5包括分别置于各个反应区121周围的半导体温控片51和温度传感器52。优选地，每个反应区121的下方设有一半导体温控片51，各个半导体温控片51分别由数据处理及控制单元7控制；每个反应槽1211的周围均设有一温度传感器52，各个温度传感器52分别由数据处理及控制单元7控制。
信号探测单元6包括激发光源61、光学传输单元62和光电探测器63。其中，激发光源61用于发出激发光并照射反应区121，使其内的样本发出荧光；光学传输单元62用于传输激发光和收集样本的荧光；光电探测器63用于探测荧光信号，并将光信号转换成电信号传输到数据处理及控制单元7进行处理。
在使用时，将样本经过蒸馏水稀释后从进样孔124加入到样本槽123，在数据处理及控制单元7的控制下，动力机构4带动微流控芯片旋转，使样本通过流道122进入到反应槽1211内，此时，整个反应区121内的样本总量在几十纳升到几百纳升的范围之间。当样品进入到反应槽1211后，关闭动力机构4，同时对控制层20充气，直到控制阀210将流道122关闭，此时反应区121成为一封闭的反应体系；同时，将蒸馏水注入到注水层30，从而防止反应区121内的水分蒸发。开启温度控制单元5，半导体温控片51在数据处理及控制单元7的控制下对各个反应区121进行升温或者降温；同时，温度传感器52在数据处理及控制单元7的控制下监控各个反应槽1211的温度。此时，各个反应区可以根据反应试剂的不同而具有不同的反应温度。反应完全后，数据处理及控制单元7控制信号探测单元6工作，并对采集到的荧光信号进行处理，最后输出结果。
本实施例提供的微流控芯片，可以在各个反应区121内加入多组不同的反应试剂，从而满足各种不同的需求，进而达到标准化和规范化。而且，该微流控芯片使用的样本剂量小，可靠性高，从而节约了使用成本。同时，该检测装置操作简单、使用方便、便于携带。
实施例2
参阅图3，本实施例提供的实现PCR的微流控芯片包括反应层、设于反应层上方的气动控制层20，其中，反应层和气动控制层20具有实施例1中相同的结构。与实施例1不同的是，本实施例提供的反应层中的薄膜层120采用PMDS材料制成，其在反应槽1211和流道122内涂覆有采用如聚对二甲苯等不透气材料制成的隔离层，该隔离层用于阻止反应区121内水分的蒸发。
本实施例提供的微流控芯片，通过设于反应槽1211和流道122内的隔离层来代替注水层，从而抑制反应区121内水分的蒸发，不仅结构简单，使用方便，而且还降低了成本。
实施例3
参阅图4，本实施例提供的实现PCR的微流控芯片包括反应层，其中，反应层包括底板130和盖设于底板130上的盖板140，所述底板130和盖板140均采用塑料材料制成。底板130朝向盖板140的一侧设有用于盛放样本的样本槽123和设于样本槽123周围的反应区121，其中，样本通过设于盖板140上相对于样本槽123的位置的进样孔124进入样本槽123内。在本实施例中，反应层包括12组反应区121，其中每组反应区121包括三个反应槽1211，每个反应槽1211和样本槽123之间通过流道122相连。优选地，反应区121的位置高于样本槽123，这样使得样品易于从样本槽123内流入反应区121，相反地，反应区121内的样本难以流回到样本槽123，从而省去了控制阀的使用。
本实施例提供的微流控芯片为本发明的一种最简单的实施方案，由于底板130采用塑料材料，因此样本槽、反应槽以及流道可以直通过注塑成型的方式形成于底板130上，从而简化了制备流程；而且，由于塑料本身不具有透气性，从而省去了抑制水分蒸发的设计，进一步地简化了制备流程；同时，塑料本身具有成本低、注塑简单的优点，因此还可以降低制备成本。
综上所述，本发明提供的实现PCR的微流控芯片，不仅使用的样本剂量小、可靠性高，从而节约了使用成本；而且，可以根据不同的测试需要加入不同的检测试剂，从而达到标准化和规范化。同时，本发明还提供了包含该微流控芯片的实时PCR的病毒快速检测装置，该检测装置不仅操作简单、使用方便，而且便于携带。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
虽然本发明是参照其示例性的实施例被具体描述和显示的，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不脱离由权利要求限定的本发明的精神和范围的情况下，可以对其进行形式和细节的各种改变。

Claims (8)

1.一种实现PCR的微流控芯片，其特征在于，包括反应层，所述反应层内设有样本槽(123)，所述样本槽(123)周围设有多组反应区(121)，每组反应区(121)至少包括一反应槽(1211)，每个反应槽(1211)通过流道(122)与样本槽(123)相连，所述样本槽(123)通过进样孔(124)与外界相连；所述微流控芯片还包括盖设于所述反应层上方的气动控制层(20)及设于所述气动控制层(20)上方的由透气材料制成的注水层(30)，所述注水层(30)为呈梳子状的腔体结构。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述气动控制层(20)包括多个控制阀(210)和用于连接控制阀(210)的气体管道(220)，所述控制阀(210)置于流道(122)的上方。
3.根据权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于，所述反应层包括基板(110)和盖设于基板(110)上的薄膜层(120)，所述样本槽(123)、进样孔(124)、反应槽(1211)以及流道(122)设于薄膜层(120)上朝向基板(110)的一侧，所述气动控制层(20)盖设于薄膜层(120)的上方。
4.根据权利要求3所述的微流控芯片，其特征在于，所述薄膜层(120)采用PDMS材料制成。
5.根据权利要求3所述的微流控芯片，其特征在于，所述气动控制层(20)采用弹性材料制成，所述气动控制层的厚度为20～50μm。
6.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述反应层包括底板(130)和盖设于底板(130)上的盖板(140)，所述样本槽(123)、反应槽(1211)以及流道(122)设于底板(130)上朝向盖板(140)的一侧，所述进样孔(124)设于盖板(140)上相对于样本槽(123)的位置，所述底板(130)和盖板(140)均采用塑料材料制成。
7.一种实时PCR的病毒快速检测装置，其特征在于，包括：
权利要求1-6任一所述的微流控芯片(1)；
动力机构(4)：用于为所述微流控芯片(1)提供旋转动力；
温度控制单元(5)：用于控制并监测反应区(121)的温度；
信号探测单元(6)：用于探测反应区(121)内的信号，并传输给数据处理及控制单元(7)进行处理；
数据处理及控制单元(7)：实现对温度控制单元(5)和信号探测单元(6)数据的采集、处理、存储和显示，同时控制所述动力机构(4)的运动。
8.根据权利要求7所述的病毒快速检测装置，其特征在于，所述温度控制单元(5)包括分别设于反应区(121)周围的多个半导体温控片(51)和多个温度传感器(52)，所述半导体温控片(51)用于控制反应区(121)的温度，所述温度传感器(52)用于检测反应区(121)的温度；所述信号探测单元(6)包括激发光源(61)、光学传输单元(62)和光电探测器(63)；所述激发光源(61)用于发出激发光并照射反应区(121)，使反应区(121)内的样本发出荧光；光学传输单元(62)用于传输激发光和收集样本的荧光；所述光电探测器(63)用于探测荧光信号，并将光信号转换成电信号传输到数据处理及控制单元(7)进行处理。
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