CN109988125B

CN109988125B - 一类新型苯甲酰苯胺化合物的制备方法和在肿瘤治疗上的应用

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Publication number: CN109988125B
Application number: CN201811297818.9A
Authority: CN
Inventors: 汪洋; 徐学军; 林昇; 杨超
Original assignee: Henan university huaihe hospital; Henan Radiomedical Science And Technology Co ltd
Current assignee: Henan university huaihe hospital; Henan Radiomedical Science And Technology Co ltd
Priority date: 2018-10-25
Filing date: 2018-10-25
Publication date: 2022-03-18
Anticipated expiration: 2038-10-25
Also published as: CN109988125A

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体提供了一类新型苯甲酰苯胺化合物的制备方法以及在肿瘤治疗方面的应用。我们运用化学合成方法得到了一系列新型苯甲酰苯胺化合物。我们生物活性鉴定发现该类化合物对乳腺癌和肺癌等多种细胞株的生长和繁殖有明显的拮抗效果，我们的抗肿瘤机制研究发现该类化合物对STAT3细胞信号传导有显著的抑制作用，显示了这些化合物在治疗STAT3信号传导异常类型疾病方面有潜在的重大意义。

Description

一类新型苯甲酰苯胺化合物的制备方法和在肿瘤治疗上的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一类新型苯甲酰苯胺化合物的制备方法和衍生物、其药学上可接受的盐、所述衍生物的溶剂合物、或者所述盐的溶剂合物在肿瘤治疗方面的应用。

背景技术

恶性肿瘤是威胁人类健康的“头号杀手”，全球肿瘤的发病率正在呈现迅猛增长趋势。世界卫生组织预计，未来20年全球新发病例数将增加70％，由2012年1400万人，逐年递增至2025 年1900万人、2035年2400万人(Freddie Bray，et al.CA CANCER J CLIN 2018；0：1-31)。药物治疗对癌症治疗一直具有很重要的意义。按照药物种类来看，过去10年全球抗肿瘤领域的用药结构从激素转向了靶向治疗，70年代金属铂类和抗生素类抗癌药物，使临床化疗技术向根治性目的迈进了一大步，90年代，植物提取物如紫杉醇、喜树碱类应用于临床，使得肿瘤细胞免疫和抑癌基因的研究进入白热化阶段，直至21世纪，真正开启了肿瘤靶向治疗的时代。靶向药物的一大特点是针对特定与疾病相关的生物靶点产生作用，每个病人的情况各不相同，可以选用的特定基因型靶向药物也各有不同，一定程度上实现对肿瘤的个体化治疗。从药品的需求趋势来看，疗效明显、副作用小是未来产品发展的主要需求方向，在这种市场需求驱动下，靶向抗肿瘤药物的研发与临床应用将是抗肿瘤药物行业未来主要发展方向之一 (Lippman S M，et al.Journal of Clinical Oncology，2005，23(2)：346-356)。

灭绦灵是一种已上市的药物，临床上主要用于寄生虫的治疗。根据大量文献报道，发现它是一种潜在的***的药物，国内***绕其进行了大量的相关研究，对其进行相关结构改造得到的化合物部分具有良好的抗肿瘤生物活性。根据文献报道(Li Y，etal.Cancer Letters， 2014，349(1)：8-14)，其可能的信号通路方式有：Wnt/β-catenin、mTORC1、STAT3、NF-κB、 Notch。这些大量的研究报道为我们开发这类药物提供了丰富的数据，也为我们开发靶向性药物提供了借鉴。

灭绦灵的主体结构为苯甲酰苯胺的结构，依据其结构特点，我们对苯环上的取代基进行结构改造，得到了多个化合物，根据这些化合物的活性，得到相关的构效关系。通过化学合成方法得到全新结构的化合物。其中部分化合物具有良好的抗肿瘤生物活性，而且对不同肿瘤细胞显示出了巨大的活性差异，具有一定的靶向性。

STAT3-JAK信号传导通路对肿瘤细胞的生长有正向调控的作用，STAT3蛋白作为治疗癌症的生物学靶点近十年备受青睐，截止2017年，美国FDA批准在临床测试的STAT3信号传导通路抑制类抗癌药物有30余种(Johnson D E，et al.Nature Reviews ClinicalOncology，2018，15(4)：234.)。STAT3抑制剂类抗癌靶向药物有靶点新和抗癌谱宽等特点，近期的临床测试结果显示了此类药物在未来肿瘤临床治疗方面具有巨大的开发潜力和广阔的市场空间。申请人发现的苯甲酰苯胺化合物属于STAT3抑制剂，该类化合物抑制STAT3活化的机制清晰、拮抗肿瘤细胞生长的效果显著。本化合物系列由河南省锐达医药科技有限公司研发。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供了一类新型苯甲酰苯胺化合物的制备方法及其在肿瘤治疗方面的应用。

为实现上述发明目的，本发明提供了下列通式的化合物的制备方法。

式I

其中，

R1选自氢，卤素，羟基，醛基，氰基，硝基，芳香基，C1-6烷基，C1-6烷氧基；

R2选自1-哌啶基，1-吡咯基，4-***啉基；

n取***数字1-10。

本发明中使用的术语“烷基”是指饱和的直链或支链一价烃基，具有1-6个碳原子(即 C1-6烷基)，1-4碳原子(即C1-4烷基)或1-3个碳原子(即C1-3烷基)。“烷基”的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙级、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、新戊基、正己基、2- 甲基戊基、2，2-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基等。

本发明所用的术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘，优选的卤素基团为氟、氯或溴。

本发明上述化合物的制备方法，包括如下步骤：

化合物的制备方法：化合物A与B经Misunobu反应得到中间体C。中间体C经过氢化铝锂还原得到中间体D。中间体D与E反应得到目标化合物F。

其中，R1、R2、n如前所述。

本发明的生物学意义是发现了具有强STAT3细胞信号传导抑制作用且具有较低毒性的新化合物，该类化合物对肿瘤细胞的生长和繁殖有显著的拮抗效果，在肿瘤治疗方面有广阔的应用前景。

本发明还涉及上述的苯甲酰苯胺衍生物、其药学上可接受的盐、所述衍生物的溶剂合物、或者所述盐的溶剂合物在制备用于治疗或辅助治疗和/或预防哺乳动物的肺癌、乳腺癌药物中的用途。具体地，所述哺乳动物为人类。

本发明还涉及上述的苯甲酰苯胺衍生物、其药学上可接受的盐、所述衍生物的溶剂合物、或者所述盐的溶剂合物在制备用于治疗或辅助治疗和/或预防哺乳动物由STAT3细胞信号传导介导的肿瘤或由STAT3驱动的肿瘤细胞增殖和迁移药物中的用途。具体地，所述哺乳动物为人类。

本发明一个方面涉及上述的苯甲酰苯胺衍生物、其药学上可接受的盐、所述衍生物的溶剂合物、或者所述盐的溶剂合物制备用于治疗和/或预防哺乳动物中与STAT3细胞信号传导相关疾病药物中的用途。具体地，所述哺乳动物为人类。

下面对本发明作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本发明，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

在本发明合成化合物的方法中，反应所用的各种原材料是本领域技术人员根据已有知识可以制备得到的，或者是可以通过文献公知的方法制得的，或者是可以通过商业购得的。以上反应方案中所用的中间体、原材料、试剂、反应条件等均可以根据本领域技术人员已有知识可以做适当改变的。

附图说明

图1是通式I附图。

图2是实施例1中化合物5-氯-N-(4-硝基苯)-2-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯甲氧基]苯甲酰胺与STAT3蛋白SH2功能域虚拟分子对接的实验结果，该化合物呈现在STAT3蛋白SH2功能域作用界面上，非极性氢原子(H)均无标记，在STAT3蛋白SH2区间上面，与该化合物分子相互作用的关键氨基酸有：赖氨酸591和精氨酸609和丝氨酸611、613、636和谷氨酸612、 638，分别用LYS591、ARG609、SER611、GLU612、SER613、SER636和GLU638标记；STAT3 蛋白SH2区间的β折叠，α螺旋和无规则卷曲分别用缓直带，螺旋带和细管表示。虚拟对接的结果显示，该化合物与STAT3蛋白SH2功能域的关键磷酸化作用位点ARG609和氨基酸 ARG595均有强极性相互作用，推断该化合物为作用在STAT3磷酸化作用位点的STAT3信号传导抑制剂。

图3是化合物实施例4中化合物5-氯-N-(4-硝基苯)-2-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯甲氧基] 苯甲酰胺作用于MDA-MB-231的反转录聚合酶链式反应试验(PCR)结果。利用半定量 RT-PCR测定相关抗调亡基因表达情况，验证药物不同浓度作用MDA-MB-231后，相关基因的表达情况。不同浓度的药物作用MDA-MB-231细胞后，通过RNA样品抽提、RNA含量测定、样品反转录为eDNA、PCR扩增β-Actin和Survivin基因、凝胶电泳测定基因表达量，对比抗调亡基因在不同药物浓度作用下的表达情况。可以看出随着药物浓度的增加该化合物对Survivin表达有明显抑制作用。

具体实施方式

实施例1：化合物合成实验

化合物合成方法以化合物5-氯-N-(4-硝基苯)-2-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯甲氧基]苯甲酰胺为例：

5-氯-N-(4-硝基苯)-2-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯甲氧基)苯甲酰胺的制备：

N-羟乙基哌啶1.3g，4-羟基苯甲酸甲酯1.67g，加入到100mL圆底烧瓶中，再加入30mL 四氢呋喃溶解。再向反应体系中加入三苯基膦3.9g，于0℃下搅拌10min。然后缓慢向反应体系中滴加偶氮二甲酸二异丙酯3.0g。滴加完毕，于室温下反应过夜。反应完毕，减压去除溶剂，加入2mol/L的盐酸溶液150mL，搅拌10min。加入乙酸乙酯100mL分液，所得的水相调pH至9左右，水相用乙酸乙酯萃取(80mL*2)，合并有机相，饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥，浓缩得产品2.1g。

将上述所得的产品1.3g，加入干燥的四氢呋喃溶解。分批向反应体系中加入氢化铝锂 0.4g，于室温下反应6h。反应完毕，向反应体系中加入水0.4mL，搅拌10min，再加入15％的氢氧化钠溶液0.4mL，水1.2mL，继续搅拌30min，过滤，滤饼用少量四氢呋喃冲洗，浓缩滤液，得到产品0.95g。

4-(2-(1-哌啶基)乙氧基)苄醇0.47g，5-氯-2-羟基-N-(4-硝基)-苯甲酰苯胺0.52g，加入到50mL圆底烧瓶中，再加入15mL四氢呋喃溶解。再向反应体系中加入三苯基膦0.8g，于0℃下搅拌10min。然后缓慢向反应体系中滴加偶氮二甲酸二异丙酯0.6g。滴加完毕，于室温下反应过夜。反应完毕，减压去除溶剂，加入乙酸乙酯，饱和食盐水分液，有机相浓缩后过柱(DCM/MeOH＝15/1)，得到目标产物0.4g。1H-NMR(6d-DMSO)：δ10.08(s，1H)，8.25-8.22(d，2H)，7.86-7.83(d，2H)，7.66-7.65(d，1H)，7.61-7.57(m，1H)，7.43-7.40(d，2H)，7.35-7.32(d，1H)，6.93-6.90(d，2H)，5.14(s，2H)，4.07-4.03(t，2H)，2.67(s，2H)，2.46(s，4H)，1.49-1.48(d，4H)，1.38-1.37(d，2H)。

表1 化合物相关信息

实施例2：分子对接(docking)实验

方法：为了验证式1中化合物与STAT3蛋白的相互作用机制，发明人用STAT3SH2区的磷酸化络氨酸(pY-705)结合区域作为计算机虚拟模拟(docking)的蛋白质模板，虚拟对接区域主要集中在磷酸化酪氨酸作用位点ARG609、LYS591以及ARG595附近区域。STAT3 SH2的结构坐标取于蛋白质结构数据库(PDB data bank，ID：1BG1)。分子对接(docking)的方法：所有的计算机配位模拟(docking)的实验均在sybyl X2.1.1的操作平台上完成，所用的计算机配位模拟(docking)的工具为SUEFLEX DOCK。依据所选的位点(主要包括磷酸化酪氨酸作用位点ARG609、LYS591和ARG595)进行计算，确定势能面(potential gradient) 并作计算机配位模拟(docking)的实验。依据模拟(docking)的分数(Score)和构象及相互作用进行分析。

实施例3：诱导乳腺癌和肺癌癌细胞凋亡的MTT实验

材料：96孔细胞培养板，MDA-MB-231、MCF-7、PC9、PC9-AR、PC9-GR、HCC827 细胞株，四甲基偶氮唑蓝(MTT)，胎牛血清。

方法：细胞按照常规培养方法培养。试验时，收集对数生长期乳腺癌细胞株MDA-MB-231 和MCF-7，肺癌细胞株PC9、PC9-AR、PC9-GR和HCC827，计数，调整细胞悬液浓度为40000 个/mL，每孔加入200μL细胞悬液即每孔8000个细胞；细胞株加化合物处理，终浓度分别为 0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100μM九个梯度，并设空白对照，继续培养48h；药物处理后，每孔加入噻唑蓝试剂20μL(5mg/mL)，37℃孵育4h；孵育结束后弃去孔中液体，沥干水份，用滤纸吸净残留液，然后加入100ul二甲基亚砜，在水平震荡器上反应7-8min，至蓝紫色结晶完全溶解；用酶标仪测定在吸收波长为570nm的OD值，记录结果。

抑制率(％)＝(对照孔平均OD值-实验孔平均OD值)/对照孔平均OD值×100％

由GraphPad Prism 7对数据进行统计，计算IC50值。

表2 化合物作用于肿瘤细胞的IC50值

注：表中数值为三次实验平均值；“±”后的数值代表标准偏差

实施例4：逆转录聚合酶链式反应试验(RT-PCR)

材料：MDA-MB-231细胞，胎牛血清，6孔细胞培养板，TRIZOL，特异性引物，cDNA 合成试剂盒，反转录试剂盒，RNA提取试剂盒。

方法：

1、细胞培养及加药：

(1)取对数生长期MDA-MB-231细胞，通过胰酶消化后，用含10％胎牛血清的 RPMI-1640培养基制成密度为100000个/mL的单细胞悬液，以每孔加入2mL细胞悬液接种至6孔细胞平底培养板中。

(2)37℃、5％CO₂培养箱孵育，待细胞贴壁后，更换新鲜培养基，实验组加入含不同浓度的药物1、3、10、30(μM)，并加入浓度为1mg/mL白介素-6(IL-6)30μL刺激细胞，白介素-6(IL-6)终浓度为30ng/mL。

(3)继续培养24h后，按照RNA提取试剂盒说明提取各组细胞的总RNA。

2、RNA样品制备：

(1)培养24h后，弃去上清，每孔加TRIZOL 1mL，摇匀，冰上消化5min，使用移液枪头吹打，吸取各孔液体到1.5mL离心管中。

(2)加0.2mL氯仿，轻摇15s，室温静置3min。

(3)4℃，12000rpm离心，15min。离心后液体分为三层，上层为无色水样层RNA，中间白色为DNA，底层红色为蛋白质，小心吸取上层无色液体转移至一个新的离心管中。

(4)取上清约0.4mL加入等体积异丙醇，室温静置10min。

(5)4℃，12000rpm，离心10min。

(6)弃去离心管中液体，加入75％乙醇1mL。

(7)4℃，7500rpm，离心5min，小心弃去上清，放在超净台中，鼓风干燥5-10min。

(8)加入20-30μL焦炭酸二乙酯(DEPC)水溶液，分装保存于-70℃冰箱备用。

(9)取2μL的总RNA用K5500超微量分光光度计检测浓度与纯度。根据OD260/OD280的比值鉴定总RNA纯度。OD260/OD280介于1.8-2.0之间说明纯度较好。

(10)取5μL的总RNA与上样缓冲液1μL混合，经1％琼脂糖凝胶(含G1eRed)，120V，电泳30min(电泳缓冲液为1×TAE)，凝胶成像分析***下观察RNA的质量。如果RNA无降解可行下一步实验。

3、cDNA的合成

逆转录聚合酶链式反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)，实验原理：首先提取各组细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，在逆转录酶的催化作用下，在随机引物或多聚胸腺嘧啶(Oligo(dT))或基因特异性引物的引导下合成互补的DNA 单链cDNA。再以此cDNA为模板，在特异引物的引导下，进行目的基因的PCR扩增反应。由于该cDNA是以mRNA为模板逆转录得到的，所以扩增的目的基因序列为不包含内含子的可编码基因序列。

(1)cDNA的合成

A.取无RNA酶的离心管在冰浴下依次加入以下溶液：

脱氧核糖核苷三磷酸混合物(dNTP Mix)2.5mM/each 4μL；引物混合物(PrimerMix)2μL； RNA模板(RNA Template)1μg；无RNA酶水(RNase-Free Water)加至15μL。反应条件： 70℃孵育10min，迅速冰浴2min。

B.在冰浴中依次加入以下组份：

5倍第一链缓冲液(5×First-Strand buffer)4μL；逆转录酶(M-MLV)1μL。反应条件：42℃温浴50min，85℃加热5min，终止反应。

C.取2-3μL直接用于PCR反应或保存于-20℃。

(2)半定量PCR扩增目的基因

A.在冰上按顺序在PCR管里加入以下反应体系：

cDNA 2.5μL；正向引物(Forward primer)(10mM)1μL；反向引物(Reverse primer)(10mM) 1μL；2倍PCR预混酶(2×Taq PCR Mix)12.5μL；双蒸水(ddH₂O)补至25μL。

B.PCR反应循环条件

按以下温度循环：

1)预变性94℃5min；2)变性94℃30s；3)退火61℃30s；4)延伸72℃1min；5)重复2-4步骤30个循环；6)延伸72℃5min；7)4℃保存。

C.结果检测：反应结束后取5μL反应产物，进行琼脂糖凝胶电泳分离鉴定。

Claims

1.具有以下结构式I的化合物：

式I

或其药学上可接受的盐；

其中，R1为氯；R2为1-哌啶基；n为1。

2.制备权利要求1所述化合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

化合物A与B经Misunobu反应得到中间体C；中间体C经过氢化铝锂还原得到中间体D；中间体D与E反应得到目标化合物F；

所述化合物的合成路线为：

其中，R1为氯；R2为1-哌啶基；n为1。

3.权利要求1所述化合物及其药学上可接受的盐在制备肿瘤治疗药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为乳腺癌或肺癌。