CN109535101B - 一类水杨酸衍生物的制备方法及其在肿瘤治疗方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体提供了一类新型水杨酸衍生物的制备方法以及在肿瘤治疗方面的应用。我们运用化学合成方法得到了一系列新型水杨酸衍生物类的化合物。我们生物活性鉴定发现该类化合物对乳腺癌、肺癌、白血病等多种细胞株有明显的拮抗效果，我们的抗肿瘤机制研究发现该类化合物对STAT3细胞信号传导有显著的抑制作用，显示了这些化合物在治疗STAT3信号传导异常类型癌症方面具有重大意义。

Description

一类水杨酸衍生物的制备方法及其在肿瘤治疗方面的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一类新型水杨酸化合物的制备方法和衍生物、其药学上可接受的盐、所述衍生物的溶剂合物、或者所述盐的溶剂合物在肿瘤治疗方面的应用。

背景技术

恶性肿瘤是威胁人类健康的“头号杀手”，全球肿瘤的发病率正在呈现迅猛增长趋势。世界卫生组织预计，未来20年全球新发病例数将增加70%，由2012年1400万人，逐年递增至2025年1900万人、2035年2400万人（Freddie Bray,et al. CA CANCER J CLIN 2018;0:1–31）。药物治疗对癌症治疗一直具有很重要的意义。按照药物种类来看，过去10年全球抗肿瘤领域的用药结构从激素转向了靶向治疗：70年代金属铂类和抗生素类抗癌药物，使临床化疗技术向根治性目的迈进了一大步；90年代，植物提取物如紫杉醇、喜树碱类应用于临床，使得肿瘤细胞免疫和抑癌基因的研究进入白热化阶段；直至21世纪，真正开启了肿瘤靶向治疗的时代。靶向药物的一大特点是针对特定靶点产生作用，每个病人的情况各不相同，可以选用的靶向药物也各有不同，一定程度上实现对肿瘤的个体化治疗。从药品的需求趋势来看，疗效显著、副作用小是未来产品发展的主要需求方向，在这种市场需求驱动下，靶向抗肿瘤药物的研发与临床应用将是抗肿瘤药物行业未来主要发展方向之一（Lippman SM, et al. Journal of Clinical Oncology, 2005, 23(2):346-356）。

灭绦灵是一种已上市的药物，临床上主要用于寄生虫的治疗。根据大量文献报道，发现它是一种潜在的***的药物，国内***绕其进行了大量的相关研究，对其进行相关结构改造得到的化合物部分具有良好的抗肿瘤生物活性。根据文献报道（Li Y, et al.Cancer Letters, 2014, 349(1):8-14），其可能的信号通路方式有：Wnt/β-catenin、mTORC1、STAT3、NF-κB、Notch。这些大量的研究报道为我们开发这类药物提供了丰富的数据，也为我们开发靶向性药物提供了借鉴。

灭绦灵的主体结构为邻位羟基苯甲酰苯胺的结构，依据其结构特点,我们对苯环上的取代基进行结构改造，得到了多个化合物，根据这些化合物的活性，得到相关的构效关系。我们尝试在羟基位置进行一些变化，通过化学合成方法得到部分化合物。这些具有良好的抗肿瘤生物活性，而且对不同肿瘤细胞显示出了巨大的活性差异，具有一定的靶向性。

STAT3-JAK信号传导通路对肿瘤细胞的生长有正向调控的作用，STAT3蛋白作为治疗癌症的生物学靶点近十年备受青睐，截止2017年，美国FDA批准在临床测试的STAT3信号传导通路抑制类抗癌药物有30余种（Johnson D E, et al. Nature Reviews ClinicalOncology, 2018, 15(4):234.）。STAT3抑制剂类抗癌靶向药物有靶点新和抗癌谱宽等特点，近期的临床测试结果显示了此类药物在未来肿瘤临床治疗方面具有巨大的开发潜力和广阔的市场空间。申请人发现的邻位羟基苯甲酰苯胺化合物属于STAT3抑制剂，该类化合物抑制STAT3活化的机制清晰、拮抗肿瘤细胞生长的效果显著。本化合物系列由河南省锐达医药科技有限公司研发。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供了一类新型水杨酸衍生物的制备方法及其在肿瘤治疗方面的应用。

为实现上述发明目的，本发明提供了下列通式的化合物的制备方法。

式I

其中，

R1选自氢，卤素，羟基，醛基，氰基，硝基，芳香基， C1-6烷基，C1-6烷氧基；

R2选自1-哌啶基，1-吡咯基， 4-***啉基；

n取***数字1-10。

本发明中使用的术语“烷基”是指饱和的直链或支链一价烃基，具有1-6个碳原子（即C1-6烷基），1-4碳原子（即C1-4烷基）或1-3个碳原子（即C1-3烷基）。“烷基”的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙级、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、新戊基、正己基、2-甲基戊基、2，2-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基等。

本发明所用的术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘，优选的卤素基团为氟、氯或溴。

本发明上述化合物的制备方法，包括如下步骤：

化合物的制备方法：化合物A与B经Misunobu反应得到中间体C。中间体C经过氢氧化锂水解后酸化得到化合物D。化合物D经过氯化亚砜处理得到酰氯E。中间体E与F反应得到目标化合物G。

其中， R1、R2、n如前所述。

本发明的生物学意义是发现了具有强STAT3细胞信号传导抑制作用且具有较低毒性的新化合物，该类化合物对肿瘤细胞的生长有显著的拮抗效果，在癌症临床治疗方面有广阔的开发空间。

本发明还涉及上述的水杨酸衍生物、其药学上可接受的盐、所述衍生物的溶剂合物、或者所述盐的溶剂合物在制备用于治疗或辅助治疗和/或预防哺乳动物的肺癌、乳腺癌以及白血病的药物中的用途。具体地，所述哺乳动物为人类。

本发明还涉及上述的水杨酸衍生物、其药学上可接受的盐、所述衍生物的溶剂合物、或者所述盐的溶剂合物在制备用于治疗或辅助治疗和/或预防哺乳动物由STAT3介导的肿瘤或由STAT3驱动的肿瘤细胞增殖和迁移药物中的用途。具体地，所述哺乳动物为人类。

本发明一个方面涉及上述的水杨酸衍生物、其药学上可接受的盐、所述衍生物的溶剂合物、或者所述盐的溶剂合物制备用于治疗和/或预防哺乳动物中与STAT3细胞信号传导相关疾病药物中的用途。具体地，所述哺乳动物为人类。

下面对本发明作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本发明，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

在本发明合成化合物的方法中，反应所用的各种原材料是本领域技术人员根据已有知识可以制备得到的，或者是可以通过文献公知的方法制得的，或者是可以通过商业购得的。以上反应方案中所用的中间体、原材料、试剂、反应条件等均可以根据本领域技术人员已有知识可以做适当改变的。

附图说明

图1是通式I附图。

图2是实施例1中化合物4-氯-2-(4-硝基苯胺甲酰基)-苯酚-4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯甲酰酯与STAT3蛋白SH2功能域虚拟分子对接的实验结果，该化合物呈现在STAT3蛋白SH2功能域作用界面上，非极性氢原子（H）均无标记，在STAT3蛋白SH2区间上面，与该化合物分子相互作用的关键氨基酸有：赖氨酸591和精氨酸609、精氨酸595和丝氨酸611、613、636和谷氨酸612、638分别用LYS591、ARG609、ARG595、SER611、GLU612、SER613、SER636和GLU638标记；STAT3蛋白SH2区间的β折叠，α螺旋和无规则卷曲分别用缓直带，螺旋带和细管表示。虚拟对接的结果显示，该化合物与STAT3蛋白SH2功能域的磷酸化作用位点的关键氨基酸ARG609、LYS591、以及ARG595均有强极性相互作用，推断该化合物为作用在STAT3磷酸化作用位点的STAT3信号传导抑制剂。

图3是实施例4中化合物4-氯-2-(4-硝基苯胺甲酰基)-苯酚-4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯甲酰酯蛋白免疫印迹的结果。蛋白免疫印迹实验的结果以将电泳分离后的细胞总蛋白质从凝胶转移到固相支持物膜上，根据抗原抗体特异原理，分别通过STAT3、p-STAT3、β-Actin抗体检测相应蛋白表达量。结果如图，可以看到在药物作用下，随药物浓度增加，MCF-7表达STAT3、β-Actin蛋白量不变，而p-STAT3表达量呈下降趋势，该化合物明显抑制p-STAT3的表达。

具体实施方式

实施例1：化合物合成实验

化合物合成方法以化合物4-氯-2-(4-硝基苯胺甲酰基)-苯酚-4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯甲酰酯为例：

4-氯-2-(4-硝基苯胺甲酰基)-苯酚-4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯甲酰酯的制备：

N-羟乙基哌啶1.3g，4-羟基苯甲酸甲酯1.67g，加入到100mL圆底烧瓶中，再加入30mL四氢呋喃溶解。再向反应体系中加入三苯基膦3.9g，于0℃度下搅拌10min。然后缓慢向反应体系中滴加偶氮二甲酸二异丙酯3.0g。滴加完毕，于室温下反应过夜。反应完毕，减压去除溶剂，加入2mol/L的盐酸溶液150mL，搅拌10min。加入乙酸乙酯100mL分液，所得的水相调pH至9左右，水相用乙酸乙酯萃取（80mL*2），合并有机相，饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥，浓缩得产品2.1g。

将上述所得的产品0.65g，加入乙醇10mL、水10mL溶解。向反应体系中加入氢氧化锂0.25g，反应过夜。反应完毕减压除去乙醇，补加水10mL，盐酸调pH至4，继续搅拌30min，过滤得到羧酸，干燥后直接用于下一步。

取所得的羧酸0.5g，加入氯化亚砜10mL，于80℃下反应6h，反应完毕，减压除去溶剂，直接用于下一步。

取酰氯0.53g，加入20mL二氯甲烷溶解，再加入5-氯-2-羟基-N-(4-硝基)-苯甲酰苯胺0.55g，三乙胺0.5mL，于室温下反应4h。反应完毕减压除去溶剂，加入乙酸乙酯，饱和食盐水分液，有机相浓缩后过柱（DCM/MeOH=15/1），得到目标产物0.35g。1H-NMR（6d-DMSO）: δ11.11(s，1H),8.22-8.19(d，2H), 8.03-8.00(d，2H),7.97-7.94(d，1H), 7.89-7.86(m，3H),7.52-7.49(d，1H)，7.11-7.08(d，2H)， 4.26-4.22(t，2H), 2.92(s，2H), 2.67(s，4H),1.57-1.55(d，4H), 1.43-1.42(d，2H)。

表1 化合物相关信息

实施例2：分子对接（docking）实验

方法：为了验证式1中化合物与 STAT3蛋白的相互作用机制，发明人用 STAT3 SH2区的磷酸化络氨酸（pY-705）结合区域作为计算机虚拟模拟（docking）的蛋白质模板，虚拟对接区域主要集中在磷酸化酪氨酸作用位点ARG609 和LYS591附近区域。STAT3 SH2的结构坐标取于蛋白质结构数据库（PDB data bank, ID:1BG1）。分子对接（docking）的方法：所有的计算机配位模拟（docking）的实验均在sybyl X2.1.1的操作平台上完成，所用的计算机配位模拟（docking）的工具为SUEFLEX DOCK。依据所选的位点（主要包括磷酸化酪氨酸作用位点ARG609 、LYS591以及ARG595）进行计算，确定势能面（potential gradient）并作计算机配位模拟（docking）的实验。依据模拟（docking）的分数（Score）和构象及相互作用进行分析。

实施例3：诱导乳腺癌、肺癌和白血病癌细胞凋亡的MTT实验

材料：96孔细胞培养板，MDA-MB-231、MCF-7、PC9、PC9-AR、PC9-GR、MOLT-13、Jurkat细胞株，四甲基偶氮唑蓝（MTT）， 胎牛血清。

方法：细胞按照常规培养方法培养。试验时，收集对数生长期乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MCF-7，结肠癌细胞株HCT-116和HT-29，肺癌细胞株PC9、PC9-AR、PC9-GR 和HCC827，白血病细胞株Jurkat和MOLT-13，计数，调整细胞悬液浓度为40000个/mL，每孔加入200μL细胞悬液即每孔8000个细胞；细胞株加化合物处理，终浓度分别为0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100 μM九个梯度，并设空白对照，继续培养48h；药物处理后，每孔加入噻唑蓝试剂20μL（5mg/mL)，37℃孵育4h；孵育结束后弃去孔中液体，沥干水份，用滤纸吸净残留液，然后加入100ul 二甲基亚砜，在水平震荡器上反应7-8min，至蓝紫色结晶完全溶解；用酶标仪测定在吸收波长为570nm的OD值，记录结果。

抑制率（%）=（对照孔平均OD值-实验孔平均OD值）/对照孔平均OD值×100%

由GrapHPad Prism 7 对数据进行统计，计算IC50值。

表2 化合物作用于肿瘤细胞的IC50值

注：表中数值为三次实验平均值；“±”后的数值代表标准偏差

实施例4：蛋白免疫印迹（Westernblot）实验检测化合物对细胞p-STAT3表达的影响

材料： 6孔细胞培养板， MCF-7细胞株，胎牛血清，RIPA细胞裂解液，蛋白测定试剂盒，聚偏氟乙烯（PVDF）膜，STAT3/p-STAT3/β-Actin一抗，STAT3/p-STAT3/β-Actin二抗。

方法：

1、细胞培养及加药

（1）取对数生长期MDA-MB-231细胞，以胰酶消化后，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基制成密度为300000个/mL的单细胞悬液，以每孔加入2mL细胞悬液接种至6孔细胞培养板中。

（2）37℃、5% CO₂培养箱孵育，待细胞贴壁后，加入化合物终浓度分别为1、3、10和30 μM，并设空白对照组。1h后除空白对照组外，各组均加入浓度为1mg/mL白介素-6（IL-6）30μL刺激细胞，白介素6（IL-6）终浓度为30ng/mL。

2、细胞裂解、蛋白提取和蛋白含量测定

（1）去除上层培养基，六孔细胞培养板中用磷酸盐缓冲液（PBS）洗两次。加入预冷的RIPA细胞裂解液（蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂和苯甲基磺酰氟与裂解液均以1：100的比例提前加入混匀）100μL。用提前洗净的细胞刮子将细胞裂解液刮下来，收集到一个干净的1.5mL离心管中。

（2）在冰上放置，裂解30 min，每隔6min涡旋一次。

（3）4℃，12000rpm，离心12 min。

（4） 离心完后，收集细胞上清，分两部分：取5μL加入到1.5mL的离心管中，用于BCA测蛋白含量，再加入45μL的1×磷酸盐缓冲液（PBS）混匀备用；剩余的细胞上清定量取60μL，加入5×SDS 上样缓冲液（Loading Buffer）15μL，混匀后在沸水中煮沸8min，离心后-20℃冰箱中保存。

（5）蛋白浓度测定，具体步骤：

A、用1×磷酸盐缓冲液（PBS）稀释蛋白标准品，按下表操作：

B、BCA工作液配制：根据标准品和待测样品的个数，计算出总共所需A与B混合工作液的量。按BCA试剂A与B体积比50：1的比例，配制好工作液，涡旋振荡混匀备用。

C、将蛋白标准液和用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释好的样品上清液（10倍稀释），各取25μL加入到新的96孔板中。然后再分别加入200μL提前配好的BCA工作液，充分混匀。切记不要吹打产生气泡，盖紧96孔板板盖，在37℃恒温箱中反应30min。

D、取出96孔板恢复至室温，3-5min，在酶标仪上测定562nm波长下的吸光度值，作出标准曲线并计算出每个样品的1μL/Protein含量以备蛋白上样。

3、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

（1）固定制胶板，配制12%的SDS-PAGE分离胶。

按照下表配制分离胶：10 mL

（2）将混好的分离胶分别加入到2块胶板中，加到离顶部1.0cm的位置，用无水乙醇填满胶板，静置30-45min。

（3）分离胶凝好后，倒出剩余的无水乙醇，并用滤纸将剩余无水乙醇吸干净。

（4）按照下表配制5% 浓缩胶：5 mL

（5）将配制好的浓缩胶缓慢地加入胶板中，避免产生气泡，***样品梳，静置30-45min。

（6）取出蛋白样品，100℃水浴加热5min，转速10000rpm，离心10min。

（7）将胶板固定到电泳槽中，加入SDS-PAGE电泳缓冲液，拔出样品梳，按照顺序将处理好的蛋白样品加入到样品槽中。

（8）80 V电泳40min。

（9）换电压120 V电泳大约1.5 h，直至溴酚蓝跑出胶体。

4、转膜

（1）将电泳完毕的SDS-PAGE胶放入TBST缓冲液中漂洗一次，蛋白胶放到转膜缓冲液中浸泡。

（2）将一层海绵垫在膜转移缓冲液中浸湿，用镊子夹到转膜仪上，按照海绵垫，三层滤纸，蛋白胶，聚偏氟乙烯（PVDF）膜，三层滤纸，海绵垫，顺序放好，对齐，夹起放到转膜仪上，操作时，滤纸、海绵垫均要在转膜缓冲液中浸湿。每层之间若有气泡应用玻璃试管轻轻滚动将其赶出。

（3）打开转膜仪，300mA转膜75min。

（4）将膜取出，放入TBST缓冲液中，60rpm水平震荡仪漂洗3次，每次8min。

（5）用5%牛血清白蛋白（BSA）封闭液20mL，60rpm水平震荡仪室温封闭2h。

（6）用加有3μL一抗（STAT3和p- STAT3 1:1000）的3 mL抗体孵育液，4℃ 60rpm水平震荡仪过夜孵育。

（7）用10 mL TBST，常温 60rpm水平震荡仪洗涤pvdf膜三次，每次10min。

（8）用加有2μL二抗的20 mL抗体孵育液，常温60rpm水平震荡仪孵育PVDF膜2 h。

（9）用10 mL TBST，常温 60rpm水平震荡仪洗涤PVDF膜三次，每次10min。

（10）取化学发光底物试剂溶液A和溶液B各1mL，室温显色5min。

（11）用滤纸将膜上的液体吸干，显影。

Claims (4)

1.一类水杨酸衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述衍生物的结构如式I所示：

式I

其中，R₁选自卤素或 C1-6烷基；R₂选自1-哌啶基。

2.制备权利要求1中任一所述化合物的方法，其特征在于：包括如下步骤：

化合物的制备方法：化合物A与B经Mitsunobu反应得到中间体C；中间体C经过氢氧化锂水解后酸化得到化合物D；化合物D经过氯化亚砜处理得到酰氯E；中间体E与F反应得到目标化合物G。

3.权利要求1中所述化合物及其药学上可接受的盐在制备肿瘤治疗药物中的应用，其特征在于，在制备治疗由STAT3介导的肿瘤或由STAT3驱动的肿瘤细胞增殖和迁移药物中的用途。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为乳腺癌、肺癌或白血病。