CN109971685B - 一种副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型的构建方法 - Google Patents

一种副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型的构建方法，涉及细胞感染模型技术领域。所述副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型的构建方法包括以下步骤：取副猪嗜血杆菌SH0165型标准菌株进行培养，制得细菌悬液；向猪腹膜间皮细胞中加入所述细菌悬液，感染6～12h后，即得副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型，所述细菌悬液中副猪嗜血杆菌感染所述猪腹膜间皮细胞的感染比为(90～110)：1。本发明旨在构建一种副猪嗜血杆菌SH0165型感染猪腹膜间皮细胞的体外感染模型。

Description

一种副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型的构建方法
技术领域
本发明涉及细胞感染模型技术领域，特别涉及一种副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型的构建方法。
背景技术
副猪嗜血杆菌病，也称格拉泽氏病，是近年来严重危害全球养猪业的主要细菌性疾病之一。该病的病原为副猪嗜血杆菌，副猪嗜血杆菌入侵到宿主机体内部并导致发病是一个多因素共同参与的复杂过程，需要多种不同的机制共同作用来造成感染和引发疾病。通过构建理想的细胞感染模型，对研究副猪嗜血杆菌的致病机制有很大的帮助。
目前，已有研究人员构建了副猪嗜血杆菌HS1075型感染猪肺泡上皮细胞的模型，通过对该感染模型的研究，发现了副猪嗜血杆菌可以通过粘附和入侵宿主上皮细胞建立初步感染，进而通过降解IgA逃避宿主的天然免疫、抵抗巨噬细胞的吞噬作用和逃避补体介导的杀伤作用等维持自身的存活。副猪嗜血杆菌在宿主体内大量增殖，产生强烈的炎症反应，最终导致副猪嗜血杆菌病的发生。
迄今为止，尚未见利用猪腹膜间皮细胞构建副猪嗜血杆菌SH0165型体外感染模型的报道。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型的构建方法，旨在构建一种副猪嗜血杆菌SH0165型感染猪腹膜间皮细胞的体外感染模型。
为实现上述目的，本发明提出了一种副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型的构建方法，所述副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型的构建方法包括以下步骤：
取副猪嗜血杆菌SH0165型标准菌株进行培养，制得细菌悬液；
向猪腹膜间皮细胞中加入所述细菌悬液，感染6～12h后，即得副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型，其中，所述细菌悬液中副猪嗜血杆菌感染所述猪腹膜间皮细胞的感染比为(90～110)：1。
可选地，取副猪嗜血杆菌SH0165型标准菌株进行培养，制得细菌悬液的步骤包括：
取保存的副猪嗜血杆菌SH0165型标准菌株于TSB培养基中，以180～200r/min转速培养11～13h，得活化的副猪嗜血杆菌菌株；
取活化的副猪嗜血杆菌菌株在TSA平板上划线培养36～48h，形成菌落；
挑取单菌落接种于液体TSB培养基中，以180～200r/min转速培养11～13h，得种子液；
将所述种子液接种于TSB培养基中，以180～200r/min转速培养11～13h，得细菌悬液。
可选地，向猪腹膜间皮细胞中加入所述细菌悬液，感染6～12h后，即得副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型的步骤之前，还包括：
取猪腹膜，经酶解消化、分离、培养得猪腹膜间皮细胞。
可选地，向猪腹膜间皮细胞中加入所述细菌悬液，感染6～12h后，即得副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型的步骤包括：
用无菌PBS缓冲液洗涤猪腹膜间皮细胞后，加入含胎牛血清的DMEM/F-12培养液，再加入所述细菌悬液，置于二氧化碳培养箱中孵育6～12h，得感染细胞；
用无菌PBS缓冲液洗涤所述感染细胞，弃去含细菌的培养基，加入多聚甲醛固定液，形成副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型。
可选地，所述副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型的构建方法还包括以下步骤：
取副猪嗜血杆菌SH0165型标准菌株进行培养，制得细菌悬液，备用；
取用无菌PBS缓冲液洗涤过的猪腹膜间皮细胞，加入含胎牛血清的DMEM/F-12培养液和所述细菌悬液，送入二氧化碳培养箱中孵育，形成细菌感染组；
设置阴性对照组；
测定并比较所述阴性对照组中炎性因子和所述细菌感染组中炎性因子的基因表达水平。
可选地，所述细菌感染组设置为不同浓度的多个细菌感染组。
可选地，测定并比较所述阴性对照组中炎性因子和所述细菌感染组中炎性因子的基因表达水平的步骤中，所述炎性因子包括IL-6、IL-1β和TNF-α。
可选地，测定并比较所述阴性对照组中炎性因子和所述细菌感染组中炎性因子的基因表达水平的步骤包括：
分别收集所述阴性对照组的细胞和所述细菌感染组的感染细胞，并用无菌PBS缓冲液洗涤；
分别向洗涤后的所述细胞和所述感染细胞中加入总RNA提取试剂裂解细胞，对应获得对照液和感染液；
提取所述对照液和所述感染液中的总RNA，反转录合成对照cDNA和感染cDNA；
实时荧光定量PCR检测所述对照cDNA和所述感染cDNA，测得所述阴性对照组和所述细菌感染组中炎性因子的基因表达水平；
比较所述阴性对照组和所述细菌感染组中炎性因子的基因表达水平。
本发明技术方案中，以猪腹膜间皮细胞为模型细胞，建立副猪嗜血杆菌SH0165型感染猪腹膜间皮细胞的炎症模型，真实模拟了猪腹膜间皮细胞被副猪嗜血杆菌SH0165型感染的过程，为研究副猪嗜血杆菌SH0165型体外对猪腹膜间皮细胞感染后致炎能力、诱导猪腹膜间皮细胞凋亡的能力、副猪嗜血杆菌SH0165型与宿主细胞的相互作用关系奠定了基础，也为副猪嗜血杆菌SH0165型感染所致疾病提供新的研究思路和治疗手段。同时，根据多次试验得到了副猪嗜血杆菌SH0165型的最佳感染比和感染时间，使本发明提供的构建方法成功率和准确率更高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明提出的副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型的构建方法的一实施例的流程示意图；
图2为本发明提出的副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型的构建方法的另一实施例的流程示意图；
图3至图5为实施例4中各炎性因子的基因表达水平的柱形图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
目前，已有研究人员构建了副猪嗜血杆菌HS1075型感染猪肺泡上皮细胞的模型，用以研究副猪嗜血杆菌HS1075型对猪肺泡上皮细胞的感染机制。但尚未见利用猪腹膜间皮细胞构建副猪嗜血杆菌SH0165型体外感染模型的报道。
鉴于此，本发明提出了一种副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型的构建方法，构建副猪嗜血杆菌SH0165型的体外感染模型，可以真实模拟猪腹膜间皮细胞被副猪嗜血杆菌SH0165型感染。结合图1提出的副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型的构建方法的一实施例的流程示意图，所述副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型的构建方法包括以下步骤：
步骤S10、取副猪嗜血杆菌SH0165型标准菌株进行培养，制得细菌悬液。
通常，细菌被保藏在-80℃环境下，在使用前，需要先活化、培养，制成细菌悬液。具体地，这一过程通过下述步骤实现：
将-80℃保存的副猪嗜血杆菌SH0165型标准菌株接种于TSB培养基中，置于37℃恒温培养震荡器中，以180～200r/min转速培养11～13h，得活化的副猪嗜血杆菌菌株；取活化的副猪嗜血杆菌菌株在TSA平板上划线，于37℃恒温培养箱中倒置培养36～48h，形成菌落；然后于无菌条件下挑取单个菌落接种于液体TSB培养基中，置于37℃恒温培养震荡器中，以180～200r/min转速培养11～13h，得到种子液；再将所述种子液接种于TSB培养基中，置于37℃恒温培养震荡器中，以180～200r/min转速培养11～13h，得到副猪嗜血杆菌SH0165型造模所需的细菌悬液。
步骤S20、向猪腹膜间皮细胞中加入所述细菌悬液，感染6～12h后，即得副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型，所述细菌悬液中副猪嗜血杆菌感染所述猪腹膜间皮细胞的感染比为(90～110)：1。
经多次试验，发明人发现副猪嗜血杆菌SH0165型感染猪腹膜间皮细胞的最佳感染比，即副猪嗜血杆菌SH0165型在感染猪腹膜间皮细胞时，细菌数与细胞数的最佳比值为(90～110)：1，且以100:1最优选；最佳感染时间为6～12h，且以12h效果最好。因此，在本实施例中，所述细菌悬液中副猪嗜血杆菌感染所述猪腹膜间皮细胞的感染比为(90～110)：1，优选为100:1。
本发明技术方案中，以猪腹膜间皮细胞为模型细胞，建立副猪嗜血杆菌SH0165型感染猪腹膜间皮细胞的炎症模型，真实模拟了猪腹膜间皮细胞被副猪嗜血杆菌SH0165型感染的过程，为研究副猪嗜血杆菌SH0165型体外对猪腹膜间皮细胞感染后致炎能力、诱导猪腹膜间皮细胞凋亡的能力、副猪嗜血杆菌SH0165型与宿主细胞的相互作用关系，以及为研究副猪嗜血杆菌SH0165型导致的猪浆膜炎症(包括但不限于腹膜炎)的损伤过程及分子机制奠定了基础，也为治疗副猪嗜血杆菌SH0165型感染所致疾病提供新的研究思路和治疗手段。同时，根据多次试验得到了副猪嗜血杆菌SH0165型的最佳感染比和感染时间，使本发明提供的构建方法成功率和准确率更高。
为进一步提高造模成功率，在实施步骤S20时，具体可以包括以下步骤：
步骤S210、用无菌PBS缓冲液洗涤猪腹膜间皮细胞后，加入含胎牛血清的DMEM/F-12培养液，再加入所述细菌悬液，置于二氧化碳培养箱中孵育6～12h，得感染细胞。
所述细菌悬液的具体浓度在本实施例中不作限定，在操作时可以根据实际需要调整至所需要的浓度，只需使孵育时，副猪嗜血杆菌SH0165型感染细胞的感染比在(90～110)：1的范围内，即可。例如，实际操作时，可以将猪腹膜间皮细胞以5×105U每孔接种于六孔细胞培养板中，再加入浓度为1×108cfu/ml的副猪嗜血杆菌SH0165型菌液150ul开始孵育。
而由于孵育时间为6～12h，为便于实验人员合理分配工作和休息时间，步骤S210中，猪腹膜间皮细胞在取出后，可以先置于培养箱中过夜，再进行洗涤、感染，具体为：先将猪腹膜间皮细胞接种于细胞培养板中，置于37℃5％CO2的二氧化碳培养箱中过夜，再使用无菌PBS缓冲液洗涤细胞多次。
此外，步骤S210中，含胎牛血清的DMEM/F-12培养液是针对猪腹膜间皮细胞的培养而配制的，所述含胎牛血清的DMEM/F-12培养液可以是含10～15％(v/v)胎牛血清的DMEM/F-12培养液；所述二氧化碳培养箱为CO2含量保持在5％的二氧化碳培养箱；孵育温度为37℃。
步骤S220、用无菌PBS缓冲液洗涤所述感染细胞，弃去含细菌的培养基，加入多聚甲醛固定液，形成副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型。
其中，多聚甲醛固定液的浓度可以为5％多聚甲醛固定液。
此外，所述猪腹膜间皮细胞可以购买，也可以自行培养获得，因此，在步骤S20之前，还可以包括以下步骤：取猪腹膜，经酶解消化、分离、培养得猪腹膜间皮细胞。所述酶解消化时，采用的消化液可以是胰酶消化液。
进一步地，本发明提供的副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型的构建方法还可以包括测定构建的细胞模型的相关指标的步骤，通过测定相关指标，可以对构建出的细胞模型进行评价，由此判断出造模是否成功、以及在造模成功时的最佳感染比和最佳感染时间。因此，在本发明的另一实施例中，结合图2展示的流程图，所述构建方法还可以包括以下步骤：
步骤S310、取副猪嗜血杆菌SH0165型标准菌株进行培养，制得细菌悬液，备用。
这一过程同样可以通过下述步骤实现：
将-80℃保存的副猪嗜血杆菌SH0165型标准菌株接种于TSB培养基中，置于37℃恒温培养震荡器中，以180r/min转速培养13h，得活化的副猪嗜血杆菌菌株；取活化的副猪嗜血杆菌菌株在TSA平板上划线，于37℃恒温培养箱中倒置培养48h，形成菌落；然后于无菌条件下挑取单个菌落接种于液体TSB培养基中，置于37℃恒温培养震荡器中，以180r/min转速培养13h，得到种子液；再将所述种子液接种于TSB培养基中，置于37℃恒温培养震荡器中，以180r/min转速培养13h，得到副猪嗜血杆菌SH0165型造模所需的细菌悬液。
步骤S320、设置细菌感染组：取用无菌PBS缓冲液洗涤过的猪腹膜间皮细胞，加入含胎牛血清的DMEM/F-12培养液和所述细菌悬液，送入二氧化碳培养箱中孵育6～12h，形成细菌感染组。
其中，所述细菌感染组可以设置成不同浓度的多个细菌感染组。通过多个不同浓度的细菌感染组和阴性对照组进行对比，可以进一步加深对构建的炎症模型的认识，进而不断调整感染比，构建出最理想的炎症模型。
此外，在本实施例中，所述细菌感染组中，副猪嗜血杆菌感染所述猪腹膜间皮细胞的感染比为(90～110)：1。
步骤S330、设置阴性对照组。
设置所述阴性对照组时，先取用无菌PBS缓冲液洗涤过的猪腹膜间皮细胞，加入含胎牛血清的DMEM/F-12培养液，再送入二氧化碳培养箱中孵育6～12h，即得。
需要说明的是，阴性对照组与细菌感染组应同步进行，二者采用的培养液和孵育时间均保持一致，且二者所使用的猪腹膜间皮细胞均为同一代培养的间皮细胞。此外，上述含胎牛血清的DMEM/F-12培养液为含10～15％(v/v)胎牛血清的DMEM/F-12培养液；所述二氧化碳培养箱为CO2含量保持在5％的二氧化碳培养箱；孵育温度为37℃。
步骤S340、测定并比较所述阴性对照组中炎性因子和所述细菌感染组中炎性因子的基因表达水平。
其中，所述炎性因子包括IL-6、IL-1β和TNF-α。
炎性细胞因子是指参与炎症反应的各种细胞因子，包括白细胞介素(Interleukin，IL)、肿瘤坏死因子(Tumor-Necrosis Factor，TNF)等。在众多炎症细胞因子中，起主要作用的是TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β、IL-8等。其中，IL-6能诱导B细胞分化和产生抗体，并诱导T细胞活化增殖、分化，参与机体的免疫应答，是炎性反应的促发剂；IL-1β广泛参与了机体组织破坏、水肿形成等多种病理损伤过程；TNF-α是炎症反应过程中出现最早、最重要的炎性介质，能激活中性粒细胞和淋巴细胞，使血管内皮细胞通透性增加，调节其他组织代谢活性并促使其他细胞因子的合成和释放。副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞时，炎性因子的表达量比静止期明显升高，因此，在本实施例中，发明人采用炎性因子的基因表达变化来判断副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞后的造模是否成功，具有较高的准确性。
在实施步骤S340时，具体通过如下步骤实现，且阴性对照组和细菌感染组均按照如下步骤S3410至步骤S3440进行操作：
步骤S3410、收集细胞，并用无菌PBS缓冲液洗涤，获得洗涤后的细胞。
步骤S3420、向洗涤后的细胞中加入总RNA提取试剂裂解细胞，获得对照液或感染液。
所述对照液为阴性对照组经上述处理后得到的混合液；感染液为细菌感染组经上述处理后得到的混合液。
步骤S3430、提取对照液或感染液中的总RNA，反转录合成cDNA。
在本实施例中，总RNA提取试剂为RNAiso Plus(广谱型Total RNA提取试剂)，提取对照液(感染液)中的总RNA的步骤可以按照RNAiso Plus说明书进行；cDNA合成可以按照
Figure BDA0002021819900000081
RT reagent Kit With gDNAEraser(cDNA合成试剂盒)(Takara，宝生物工程(大连)有限公司)说明书进行。
步骤S3440、实时荧光定量PCR检测cDNA，测得其中炎性因子的基因表达水平。
实时荧光定量PCR检测cDNA的步骤可以按照real-time PCR试剂盒给出的方法完成，在本实施例中，按照TB
Figure BDA0002021819900000082
Premix Ex
Figure BDA0002021819900000083
(Tli RNaseH Plus)(real-timePCR试剂盒，Takara，宝生物工程(大连)有限公司)方法步骤完成。
其中，设计的引物序列如表1所示。
表1 引物序列
Figure BDA0002021819900000084
Figure BDA0002021819900000091
其中，β-actin为内对照基因。
步骤S3450、将测得的阴性对照组中炎性因子的基因表达水平和细菌感染组中炎性因子的基因表达水平进行比较。
通过将阴性对照组中炎性因子的基因表达水平和细菌感染组中炎性因子的基因表达水平进行比较，当细菌感染组中炎性因子的基因表达水平显著升高时，说明细菌感染组造模成功。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
制备细菌悬液：将-80℃保存的副猪嗜血杆菌SH0165型标准菌株接种于TSB培养基中，置于37℃恒温培养震荡器中，以180r/min转速培养12h，得活化的副猪嗜血杆菌菌株；取活化的副猪嗜血杆菌菌株在TSA平板上划线，于37℃恒温培养箱中倒置培养36h，形成菌落；然后于无菌条件下挑取单个菌落接种于液体TSB培养基中，置于37℃恒温培养震荡器中，以200r/min转速培养12h，得到种子液；再将所述种子液接种于TSB培养基中，置于37℃恒温培养震荡器中，以180r/min转速培养12h，得到副猪嗜血杆菌SH0165型造模所需的细菌悬液。
细胞培养：取猪腹膜，经酶解消化、分离、培养得猪腹膜间皮细胞。
建立细胞模型：将猪腹膜间皮细胞接种于六孔细胞培养板中，置于37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱中过夜。使用无菌PBS缓冲液洗涤细胞三次后加入含15％胎牛血清的DMEM/F-12培养液，再以感染比为100:1加入细菌悬液。将六孔细胞培养板置于37℃、5％CO2的二氧化碳培养箱中孵育12h。孵育后，用无菌的PBS液洗涤细胞三次，弃去含细菌的培养基，随即在六孔细胞培养板中加入5％多聚甲醛固定液固定细胞，完成副猪嗜血杆菌SH0165型感染猪腹膜间皮细胞模型的建立。
实施例2
制备细菌悬液：将-80℃保存的副猪嗜血杆菌SH0165型标准菌株接种于TSB培养基中，置于37℃恒温培养震荡器中，以190r/min转速培养11h，得活化的副猪嗜血杆菌菌株；取活化的副猪嗜血杆菌菌株在TSA平板上划线，于37℃恒温培养箱中倒置培养40h，形成菌落；然后于无菌条件下挑取单个菌落接种于液体TSB培养基中，置于37℃恒温培养震荡器中，以180r/min转速培养11h，得到种子液；再将所述种子液接种于TSB培养基中，置于37℃恒温培养震荡器中，以200r/min转速培养11h，得到副猪嗜血杆菌SH0165型造模所需的细菌悬液。
细胞培养：取猪腹膜，经酶解消化、分离、培养得猪腹膜间皮细胞。
建立细胞模型：将猪腹膜间皮细胞接种于六孔细胞培养板中，置于37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱中过夜。使用无菌PBS缓冲液洗涤细胞三次后加入含15％胎牛血清的DMEM/F-12培养液，再以感染比为90:1加入细菌悬液。将六孔细胞培养板置于37℃、5％CO2的二氧化碳培养箱中孵育6h。孵育后，用无菌的PBS液洗涤细胞三次，弃去含细菌的培养基，随即在六孔细胞培养板中加入5％多聚甲醛固定液固定细胞，完成副猪嗜血杆菌SH0165型感染猪腹膜间皮细胞模型的建立。
实施例3
制备细菌悬液：将-80℃保存的副猪嗜血杆菌SH0165型标准菌株接种于TSB培养基中，置于37℃恒温培养震荡器中，以200r/min转速培养13h，得活化的副猪嗜血杆菌菌株；取活化的副猪嗜血杆菌菌株在TSA平板上划线，于37℃恒温培养箱中倒置培养48h，形成菌落；然后于无菌条件下挑取单个菌落接种于液体TSB培养基中，置于37℃恒温培养震荡器中，以190r/min转速培养13h，得到种子液；再将所述种子液接种于TSB培养基中，置于37℃恒温培养震荡器中，以190r/min转速培养13h，得到副猪嗜血杆菌SH0165型造模所需的细菌悬液。
细胞培养：取猪腹膜，经酶解消化、分离、培养得猪腹膜间皮细胞。
建立细胞模型：将猪腹膜间皮细胞接种于六孔细胞培养板中，置于37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱中过夜。使用无菌PBS缓冲液洗涤细胞三次后加入含15％胎牛血清的DMEM/F-12培养液，再以感染比为110:1加入细菌悬液。将六孔细胞培养板置于37℃、5％CO2的二氧化碳培养箱中孵育10h。孵育后，用无菌的PBS液洗涤细胞三次，弃去含细菌的培养基，随即在六孔细胞培养板中加入5％多聚甲醛固定液固定细胞，完成副猪嗜血杆菌SH0165型感染猪腹膜间皮细胞模型的建立。
实施例4建立副猪嗜血杆菌SH0165型感染猪腹膜间皮细胞模型的验证试验
将副猪嗜血杆菌SH0165型感染猪腹膜间皮细胞形成的细胞模型作为细菌感染组，细菌感染组按不同感染比(1:1、10:1、100:1)设置为3组，将未受感染的猪腹膜间皮细胞作为阴性对照组，按下述步骤操作：
(1)制备细菌悬液：将-80℃保存的副猪嗜血杆菌SH0165型标准菌株接种于TSB培养基中，置于37℃恒温培养震荡器中，以180r/min转速培养13h，得活化的副猪嗜血杆菌菌株；取活化的副猪嗜血杆菌菌株在TSA平板上划线，于37℃恒温培养箱中倒置培养48h，形成菌落；然后于无菌条件下挑取单个菌落接种于液体TSB培养基中，置于37℃恒温培养震荡器中，以180r/min转速培养13h，得到种子液；再将所述种子液接种于TSB培养基中，置于37℃恒温培养震荡器中，以180r/min转速培养13h，得到副猪嗜血杆菌SH0165型造模所需的细菌悬液。
(2)将猪腹膜间皮细胞接种于六孔细胞培养板中，置于37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱中过夜。使用无菌PBS缓冲液洗涤细胞三次。第一孔留作阴性对照组加入1.5ml含15％胎牛血清的DMEM/F-12培养液，第二、三、四孔作为细菌感染组先加入1.25ml含15％胎牛血清的DMEM/F-12培养液，然后分别加入实施例1中制备好的细菌悬液150μl。其中，第二孔中，感染比为1:1；第三孔中，感染比为10:1；第四孔中，感染比为100:1。将六孔细胞培养板置于37℃5％CO2的二氧化碳培养箱中孵育。孵育开始后0h、3h、6h、12h取样，分别收集阴性对照组和三个细菌感染组中的细胞，用于以下步骤(3)的检测。用无菌的PBS液洗涤细胞三次，弃去含细菌的培养基。
(3)向洗涤后的细胞中加入RNAiso Plus裂解细胞，并按照RNAiso Plus(Takara，宝生物工程(大连)有限公司)说明书提取总RNA。然后使用cDNA合成试剂盒并按照
Figure BDA0002021819900000111
RT reagent Kit With gDNA Eraser(cDNA合成试剂盒)(Takara，宝生物工程(大连)有限公司)说明书反转录合成cDNA。
(4)根据TB
Figure BDA0002021819900000121
Premix Ex
Figure BDA0002021819900000122
(Tli RNaseH Plus)(real-time PCR试剂盒，Takara，宝生物工程(大连)有限公司)给出的方法步骤，实时荧光定量PCR检测cDNA。测得炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA表达测定结果如图3至图5所示。
从图3至图5可以看出，三种炎性因子的mRNA在孵育6h、12h，感染比为100:1时均显著表达。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (6)

1.一种副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
取副猪嗜血杆菌SH0165型标准菌株进行培养，制得细菌悬液；
向猪腹膜间皮细胞中加入所述细菌悬液，感染6～12h后，即得副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型，其中，所述细菌悬液中副猪嗜血杆菌感染所述猪腹膜间皮细胞的感染比为(90～110)：1；
取用无菌PBS缓冲液洗涤过的猪腹膜间皮细胞，加入含胎牛血清的DMEM/F-12培养液和所述细菌悬液，送入二氧化碳培养箱中孵育，形成细菌感染组；
设置阴性对照组；
测定并比较所述阴性对照组中炎性因子和所述细菌感染组中炎性因子的基因表达水平；
若所述细菌感染组中炎性因子的表达量比静止期明显升高，则说明所述副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型构建成功；
其中，所述向猪腹膜间皮细胞中加入所述细菌悬液，感染6～12h后，即得副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型的步骤包括：
用无菌PBS缓冲液洗涤猪腹膜间皮细胞后，加入含胎牛血清的DMEM/F-12培养液，再加入所述细菌悬液，置于二氧化碳培养箱中孵育6～12h，得感染细胞；
用无菌PBS缓冲液洗涤所述感染细胞，弃去含细菌的培养基，加入多聚甲醛固定液，形成副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型。
2.如权利要求1所述的副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型的构建方法，其特征在于，取副猪嗜血杆菌SH0165型标准菌株进行培养，制得细菌悬液的步骤包括：
取保存的副猪嗜血杆菌SH0165型标准菌株于TSB培养基中，以180～200r/min转速培养11～13h，得活化的副猪嗜血杆菌菌株；
取活化的副猪嗜血杆菌菌株在TSA平板上划线培养36～48h，形成菌落；
挑取单菌落接种于液体TSB培养基中，以180～200r/min转速培养11～13h，得种子液；
将所述种子液接种于TSB培养基中，以180～200r/min转速培养11～13h，得细菌悬液。
3.如权利要求1所述的副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型的构建方法，其特征在于，向猪腹膜间皮细胞中加入所述细菌悬液，感染6～12h后，即得副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型的步骤之前，还包括：
取猪腹膜，经酶解消化、分离、培养得猪腹膜间皮细胞。
4.如权利要求1所述的副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型的构建方法，其特征在于，所述细菌感染组设置为不同浓度的多个细菌感染组。
5.如权利要求1所述的副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型的构建方法，其特征在于，测定并比较所述阴性对照组中炎性因子和所述细菌感染组中炎性因子的基因表达水平的步骤中，所述炎性因子包括IL-6、IL-1β和TNF-α。
6.如权利要求1所述的副猪嗜血杆菌感染猪腹膜间皮细胞模型的构建方法，其特征在于，测定并比较所述阴性对照组中炎性因子和所述细菌感染组中炎性因子的基因表达水平的步骤包括：
分别收集所述阴性对照组的细胞和所述细菌感染组的感染细胞，并用无菌PBS缓冲液洗涤；
分别向洗涤后的所述细胞和所述感染细胞中加入总RNA提取试剂裂解细胞，对应获得对照液和感染液；
提取所述对照液和所述感染液中的总RNA，反转录合成对照cDNA和感染cDNA；
实时荧光定量PCR检测所述对照cDNA和所述感染cDNA，测得所述阴性对照组和所述细菌感染组中炎性因子的基因表达水平；
比较所述阴性对照组和所述细菌感染组中炎性因子的基因表达水平。
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