CN109966780B - 一种水生贝类蒸煮汤中功能性纳米颗粒的分离方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种水生贝类蒸煮汤中功能性纳米颗粒的分离方法。该分离方法包括如下步骤：水生贝类热加工制备水生贝类蒸煮汤；对水生贝类蒸煮汤进行离心处理，获得上清液；凝胶排阻色谱联合动态光散射仪对上清液进行分离，获得水生贝类蒸煮汤中功能性纳米颗粒。本发明的纳米颗粒能够有效装载如牛磺酸、鸟氨酸、植物甾醇等活性成分，可应用在调节机体免疫与肝疾病相关的药品或食品中。本发明具有分离快速，产率高，对样品无损，分辨率高，过程安全、绿色，应用领域广泛等优点。

Description

一种水生贝类蒸煮汤中功能性纳米颗粒的分离方法
技术领域
本发明属于食品与纳米材料技术领域，特别是涉及一种水生贝类蒸煮汤中功能性纳米颗粒的分离方法。
背景技术
水生贝类，如河蚬(Corbicula fluminea)是双壳类软体动物，外壳或呈黄绿色、棕黄色，或呈黑褐色，隶属于瓣鳃纲(Lamellibranchia)中真瓣鳃目(Eulamellibranchia)的异齿亚目(Heterodontta)的蚬科(Corbiculidae)中的蚬属(Corbicula)，又称黄蚬、金蚶、扁螺等。河蚬是我国重要经济贝类之一，广泛分布在温暖湿润的淡水或微咸水河湖环境之中，例如东南部的浙江、福建、江苏、台湾等省份。河蚬软体部分(蚬肉)不仅味道鲜美，而且具有相当显著的保健价值。
纳米材料因其纳米尺寸所带来的巨大优势而被广泛应用于各个研究领域，如脂质体，水凝胶，微乳液等。而这些人造纳米材料因存在机体安全性检验而存在距离实际应用的较长周期，同时，由于体内复杂的环境，这些人造纳米材料的实际效益还需要进一步验证。而如河蚬汤这一类传统食品中的微纳米颗粒，其功能性与安全性受到了几千年来民众的检验，有较大的市场应用前景。此前已证明河蚬汤中微纳米颗粒存在牛磺酸、鸟氨酸、植物甾醇等这些活性成分，即河蚬纳米颗粒具备活性成分的装载能力，能够与消化道巨噬细胞的直接作用，且能有效降血脂与护肝效果。因此，如何将这些功能性纳米颗粒进行分离成为了研究者研究的热点。
申请人在先研究通过静态多角度激光光散射、尺寸排阻色谱分离或离子交换色谱等手段虽然能够较好的将河蚬中的纳米颗粒进行分离，从而获得功能性纳米颗粒冻干粉。但上述分离手段仍然存在不足。例如，静态多角度激光光散射的灵敏度较低，造价较为昂贵，分离成本高；尺寸排阻色谱分离耗时较长，分离效率低下；离子交换色谱的高盐洗脱过程可能对河蚬以外的体系造成一定干扰，较高的离子强度易造成一些蛋白的变性与活性成分的丢失并可能不适用于一般样品的保存。
因此，基于在先的分离方法存在的缺陷，本申请开发出一种水生贝类蒸煮汤中功能性纳米颗粒的分离方法，该分离方法采用凝胶排阻色谱联合动态光散射，不仅分离灵敏度较高，而且具有成本低，效率高等优点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种水生贝类蒸煮汤中功能性纳米颗粒的分离方法。为了达到上述的目的，本发明提供以下技术方案：
一种水生贝类蒸煮汤中功能性纳米颗粒的分离方法，包括如下步骤：
(1)水生贝类热加工制备水生贝类蒸煮汤；
(2)对步骤(1)获得的水生贝类蒸煮汤进行离心处理，获得上清液；
(3)凝胶排阻色谱联合动态光散射仪对步骤(2)得到的上清液进行分离，获得水生贝类蒸煮汤中功能性纳米颗粒。
进一步地，所述水生贝类包括河蚬、文蛤、贻贝、北极贝双壳软体。
进一步地，所述水生贝类热加工的制备工艺为：将水生贝类用蒸馏水洗净并静养5h以上，称取获得新鲜个体，按照料液比1:1-3kg/L加入蒸馏水并煮沸0.5-2h，然后冷却至常温，最后用纱布过滤，即得到水生贝类蒸煮汤。
进一步地，所述步骤(2)离心速度为5000-10000r·min-1，离心时间为10-20min。
进一步地，所述步骤(3)具体方法为：将所述上清液通入凝胶排阻色谱柱，使功能性纳米颗粒充分结合在凝胶排阻柱上，然后用缓冲液洗脱，同时以280nm紫外波段联合在线动态光散射对洗脱液进行监测，收集紫外吸收与光散射存在共同叠加峰的洗脱液，即获得水生贝类蒸煮汤中功能性纳米颗粒。
进一步地，所述凝胶排阻色谱柱为为琼脂糖或其衍生交联物，分离范围为60KDa-20000KDa，孔径为45-165μm，耐受流速高于一般凝胶柱，主要型号为Sepharose CL-2B/4B/6B。
进一步地，所述缓冲洗脱液为磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液的浓度为0.05M，pH为7.2。
进一步地，所述水生贝类蒸煮汤中功能性纳米颗粒的粒径为40-150nm。
进一步地，所述分离方法对水生贝类蒸煮汤中功能性纳米颗粒的回收率高于90％。
本发明的优点在于：
(1)本发明涉及的组合式分离方法，快速，高产量，且分离方式温和，对样品本身无损，操作方便，绿色，安全性高，制备简单。
(2)本发明的组合式分离技术分离效果好，可从复杂的食品基质中得到功能性纳米颗粒，将其与游离成分有效分离。同时，可根据纳米颗粒大小从大到小进行连续分离，分辨率可达到1nm甚至以下，纳米颗粒整体回收率根据光散射总量进行测定，可超过90％。
(3)本发明涉及的功能性纳米颗粒本身存在活性成分，也具备装载活性成分的功能，可有效装载牛磺酸、鸟氨酸等活性产物，装载率均超过60％。
(4)本发明分离得到的功能性纳米颗粒可应用在调节机体免疫与肝疾病相关的药品或食品中，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1功能性纳米颗粒的凝胶色谱以及在线动态光散射图(A为河蚬汤上清液的凝胶色谱分离图，实线为紫外波长280nm的色谱图，虚线为光散射强度图，F1，F2为颗粒组分，F3主要为游离成分)。
图2功能性纳米颗粒TEM电镜图(A)与实物图(B)。
图3功能性纳米颗粒稀释浓度与光散射强度的线性关系图。
图4功能性纳米颗粒成分含量。
图5功能性纳米颗粒活性成分的装载情况。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
除非另作定义，本公开所使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内有一般技能的人士所理解的通常意义。
实施例1：
(1)将河蚬用蒸馏水洗净并静养5h，称取活的新鲜个体，按照料液比1kg：1L加入含蒸馏水的不锈钢锅中，并置于电磁炉上煮沸1h，冷却后纱布过滤；
(2)取粗滤液于离心机中，离心速度为15000r·min-1，在4℃下离心15min，获得上清液；
(3)上清液利用凝胶排阻色谱柱(10mm×120mm)快速分离，柱填料为SephoraseCL-4B，利用0.05M磷酸缓冲液(pH7.2)充填柱子并用以平衡，流速为：0.5mL/min，上样量为1mL，以紫外波段280nm联合在线动态激光光散射仪(SEC-DLS)检测功能性纳米颗粒的出峰(见图1)，区别于游离蛋白成分。分管收集，每管为2mL，在12-32min出现紫外吸收与光散射共同叠加峰，为功能性纳米颗粒，进一步可以分为两个主要的纳米颗粒亚群，其平均粒径分别为70.86±1.82nm，45.88±4.16nm(即图1中的F1段和F2段)，胶体性质见表1。整个分离过程快速，分离成本低。
实施例2：SEC-DLS可对河蚬汤中纳米颗粒连续分离并在线检测纳米尺寸，可得到150-40nm的纳米颗粒群，分辨率可达到1nm。分离谱图见图1，颗粒形貌见图2，图2中的对比参照Soup指的是上清液。
实施例3：SEC所得纳米颗粒与原汤颗粒相比，纳米尺寸并未急剧增大或者减小，说明SEC分离条件较为温和。分别见图3和表1。
实施例4：利用不同稀释倍数(4倍，16倍，64倍和256倍)下，河蚬汤中纳米颗粒的光散射总量随线性变化的特点，通过测定光散射，计算纳米颗粒的回收率，整个过程方法快速，准确。
实施例5：河蚬汤中纳米颗粒中含有较高含量的多糖，河蚬汤中多糖成分被证明存在显著抗氧化与免疫调节功能，同时河蚬汤中纳米颗粒也装载了牛磺酸、鸟氨酸、植物甾醇等小分子活性成分，经检测含量分别为4.48μg/mg，31.22μg/mg，111μg/g。装载率(河蚬颗粒中活性成分占汤中总活性成分含量)均超过60％。具体参见图4和图5，图4和图5中的ClamSoup指的是上清液。这些成分一方面具有免疫调节作用，另一方面存在肝疾病治疗的相关性。
表1
Figure BDA0002002779180000051

Claims (8)

1.一种水生贝类蒸煮汤中功能性纳米颗粒的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)水生贝类热加工制备水生贝类蒸煮汤；
(2)对步骤(1)获得的水生贝类蒸煮汤进行离心处理，获得上清液；
(3)凝胶排阻色谱联合动态光散射仪对步骤(2)得到的上清液进行分离，获得水生贝类蒸煮汤中功能性纳米颗粒；
所述步骤(3)具体方法为：将所述上清液通入凝胶排阻色谱柱，使功能性纳米颗粒充分结合在凝胶排阻柱上，然后用缓冲液洗脱，同时以280nm紫外波段联合在线动态光散射对洗脱液进行监测，收集紫外吸收与光散射存在共同叠加峰的洗脱液，即获得水生贝类蒸煮汤中功能性纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述水生贝类包括河蚬、文蛤、贻贝、北极贝双壳软体。
3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述水生贝类热加工的制备工艺为：将水生贝类用蒸馏水洗净并静养5h以上，称取获得新鲜个体，按照料液比1:1-3kg/L加入蒸馏水并煮沸0.5-2h，然后冷却至常温，最后用纱布过滤，即得到水生贝类蒸煮汤。
4.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述步骤(2)离心速度为5000-10000r·min-1，离心时间为10-20min。
5.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述凝胶排阻色谱柱柱填料为琼脂糖或其衍生交联物，分离范围为60KDa-20000 KDa，孔径为45-165μm。
6.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述缓冲洗脱液为磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液的浓度为0.05M，pH为7.2。
7.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述水生贝类蒸煮汤中功能性纳米颗粒的粒径为40-150nm。
8.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述分离方法对水生贝类蒸煮汤中功能性纳米颗粒的回收率高于90％。
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