CN104341487A - 一种葛根蛋白及其纳米颗粒制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种葛根蛋白及其纳米颗粒制备方法。经过Tris-HCl缓冲液抽提、乙醇分级沉降、离子交换色谱分离，获得了葛根蛋白，序列为DFVYDMCGNVLN。该葛根蛋白的水溶液在蛋白浓度为1mg/mL，pH6.05条件下，经过100℃加热60min后，制备得到葛根蛋白纳米颗粒，葛根蛋白纳米颗粒在体外均显示了较低的细胞毒性。葛根蛋白纳米颗粒冻干品流动性佳，易于稳定保存。本发明涉及的葛根蛋白来源于食品，安全性高。其纳米颗粒的制备方法不涉及任何交联剂，且其成品广泛存在于各类使用葛根的汤剂中，为广大人群服用多年，安全性高。本发明涉及的葛根蛋白纳米颗粒有望应用于多种药物的体内递送。

Description

一种葛根蛋白及其纳米颗粒制备方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域中的蛋白药物新剂型和制剂技术，具体涉及到一种葛根蛋白及其纳米颗粒制备方法。

背景技术

依据美国国家纳米科技启动计划(National Nanotechnology Initiative, NNI)中的定义，粒径在1-100 nm尺度范围内的颗粒称为纳米颗粒。近几十年来，纳米颗粒被大量应用于药物运输体系的开发研究中，其中包括金属聚集体、无机颗粒、超支化聚合物、聚合物胶束等各种不同材料制备的纳米药物载体。在各种纳米药物载体在逐渐展现靶向性和穿透性等优点的同时，也暴露出在生物相容性、细胞毒性和可降解性方面的缺点。经过材料的纳米化后，纳米材料的物化性质（光学、电学、表面活性等）均会呈现与原始材料截然不同的性质。目前应用与纳米药物载体研究的生物大分子（如血清白蛋白、丝蛋白等）皆没有可以参照的天然研究模型，获得纳米颗粒的物化性质及其相关生物安全性也需要长期的观测，才能得到全面评估。纳米药物载体发展带来的潜在风险引起了科学界广泛的担忧。

“汤”给生物大分子自组装纳米颗粒提供了丰富的研究模型：从食品到中药，许多汤中都存在胶体体系，河蚬汤的胶体颗粒较为均一，平均粒径为78 nm；苦瓜汤中的胶体颗粒组成较为复杂，平均粒径分布范围较大，其中间值为347 nm；对几十种中药汤剂的胶体学调查也表明纳米尺度的颗粒在中药汤剂中的广泛存在。这些在汤中存在的天然纳米颗粒与蛋白质，特别是非酶促糖基化的蛋白质的自组装行为密切相关。各种汤在人类历史上饮用的时间之长、受众之广，从风险管理的角度可以被认为是安全的（Generally Recognized as Safe，GRAS)。对汤的煎煮过程中自组装形成的纳米颗粒的研究可以解决现阶段纳米药物载体研究缺乏研究原型和对安全性担忧方面的问题。

葛根是一种我国人民长期使用的食品原料和中药药材，在中药汤剂，特别是中药复方汤剂中具有非常重要的用途。葛根具有升阳止泻，解肌退热，生津透疹的作用，在现代医学上具有降血糖、抗氧化自由基、降血压、抗肿瘤、抗心律失常、降低血脂等效用，在方剂“葛根芩连汤”中，葛根作为“君药”发挥方剂中主要药效。但是到目前为止，有关葛根蛋白纳米颗粒的研究国内外尚未见文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种葛根蛋白及其纳米颗粒制备方法，对汤的煎煮过程中自组装形成的纳米颗粒的研究可以解决现阶段纳米药物载体研究缺乏研究原型和对安全性担忧方面的问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种葛根蛋白，氨基酸序列为DFVYDMCGNVLN。

所述蛋白的制备方法为经过Tris-HCl缓冲液水相抽提，离子交换色谱Macro-Prep® High-Q，从葛根中药饮片中分离得到一个电泳纯的葛根蛋白。

一种葛根蛋白在制备葛根蛋白纳米颗粒上的应用。

所述纳米颗粒的制备方法为将该葛根蛋白配制为1 mg/mL的Tris-盐酸盐溶液，经过60-100℃加热1小时，经过6000 g超滤5 min，即获得葛根蛋白纳米颗粒溶液；并应用动态光散射技术动态光散射、多角度激光光散射和电子扫描显微镜对葛根蛋白纳米颗粒进行性质研究。

葛根蛋白粗提液的制备：葛根饮片经小型高速粉碎机粉碎。以质量比1:5将葛根粉末和含0.1 mol/L Tris-盐酸缓冲液（0.02 mol/L、pH7.2）混合均匀，置于4 ℃，搅拌浸提12 h。用二层纱布过滤得到的葛根浸提液，弃去滤渣。将滤液在4 ℃下经10,000 g离心15 min，收集上清液。将上清液置于4℃下，边搅拌边缓慢预冷的无水乙醇，使乙醇终浓度达到20%。静置4 h，以10,000 g离心15 min，收集沉淀。沉淀用Tris-盐酸缓冲液（0.02 mol/L、pH8.1）充分溶解后以相同浓度Tris-盐酸缓冲液透析过夜，得到的溶液即为葛根蛋白粗提液。

葛根蛋白的离子交换色谱分离：将100 mL葛根蛋白粗提液流加至以Tris-盐酸缓冲液（0.02 mol/L、pH8.1）平衡Macro-Prep® High-Q色谱柱（Bio-RAD公司，柱体积：10*250 mm），以同样浓度Tris-盐酸缓冲液继续平衡3倍柱体积后，再以含0～0.3 mol/L NaCl的Tris-盐酸缓冲液（0.02 mol/L、pH8.1）线性梯度洗脱200 mL，最后用含0.3 mol/L NaCl 的Tris-盐酸缓冲液（0.02 mol/L、pH8.1）洗脱1个柱体积。流速0.8 mL/min，紫外分光光度计测量波长为280 nm，经过色谱分离的组分以自动分布收集仪收集，后以SDS-PAGE进行蛋白成分鉴定。

葛根蛋白的基本性质表征：以MALDI-TOF质谱测定该经纯化得到的葛根蛋白的分子量大小，以等点聚焦测定该葛根蛋白的等电点，以Edman degradation测定该葛根蛋白的N-端一级结构序列。

葛根蛋白纳米颗粒的制备：将该葛根蛋白配制为1 mg/mL的Tris-盐酸盐溶液，经过60-100℃加热1小时，经过6000 g超滤5 min，即可获得葛根蛋白纳米颗粒溶液。并应用动态光散射技术动态光散射、多角度激光光散射和电子扫描显微镜对葛根蛋白纳米颗粒进行性质研究，本发明制备得到的葛根蛋白纳米颗粒平均粒径为150±1.0 nm，表面电荷呈负性，zeta电位值为-23±0.5 mV。

以该葛根蛋白为载体制备的小檗碱-葛根蛋白纳米颗粒，装载率为44.2%，平均粒径为150±1.0 nm。葛根蛋白纳米颗粒在体外均显示了较低的细胞毒性。

本发明的优点在于：本发明涉及的葛根蛋白来源于食品，安全性高。其纳米颗粒的制备方法不涉及任何交联剂，且其成品广泛存在于各类使用葛根的汤剂中，为广大人群服用多年，安全性高。本发明涉及的葛根蛋白纳米颗粒有望应用于多种药物的体内递送。

附图说明

附图1葛根蛋白粗提液离子交换色谱。其中OD280为在280nm下的OD值，Time为时间，C(NaCl)为NaCl的浓度。

附图2葛根蛋白SDS-PAGE电泳图。其中M为Maker。

附图3葛根蛋白纳米颗粒粒径分布图。

附图4葛根蛋白纳米颗粒细胞毒性。其中L02为正常肝细胞，Hep-G2为人肝癌细胞。

具体实施方式

实施例 1 ：葛根蛋白的提取

葛根饮片经小型高速粉碎机粉碎。以质量比1:5将葛根粉末和含0.1 mol/L Tris-盐酸缓冲液（0.02 mol/L、pH7.2）混合均匀，置于4 ℃，搅拌浸提12 h。用二层纱布过滤得到的葛根浸提液，弃去滤渣。将滤液在4 ℃下经10,000 g离心15 min，收集上清液。将上清液置于4℃下，边搅拌边缓慢预冷的无水乙醇，使乙醇终浓度达到20%。静置4 h，以10,000 g离心15 min，收集沉淀。沉淀用Tris-盐酸缓冲液（0.02 mol/L、pH8.1）充分溶解后以相同浓度Tris-盐酸缓冲液透析过夜，得到的溶液即为葛根蛋白粗提液。

将100 mL葛根蛋白粗提液流加至以Tris-盐酸缓冲液（0.02 mol/L、pH8.1）平衡Macro-Prep® High-Q色谱柱（Bio-RAD公司，柱体积：10×250 mm），以同样浓度Tris-盐酸缓冲液继续平衡3倍柱体积后，再以含0～0.3 mol/L NaCl的Tris-盐酸缓冲液（0.02 mol/L、pH8.1）线性梯度洗脱200 mL，最后用含0.3 mol/L NaCl 的Tris-盐酸缓冲液（0.02 mol/L、pH8.1）洗脱1个柱体积。葛根蛋白粗提液High-Q色谱图及各组分SDS-PAGE电泳图见附图1。

葛根蛋白基本生化性质，其特征为分子量为20731.6 Da、等电点为6.34，N-端一级结构序列为DFVYDMCGNVLN。

实施例 2 ：葛根蛋白纳米颗粒的制备

将该葛根蛋白配制为1 mg/mL的Tris-盐酸盐溶液，经过60-100℃加热1小时，经过6000 g超滤5min后，即可获得葛根蛋白纳米颗粒。

用激光粒度仪测定其粒度及表面电位，测得其粒径为150±1.0 nm，表面电位为-23±0.5 mV。葛根蛋白纳米颗粒粒度分布图见附图3.

实施例 3 ：葛根蛋白纳米颗粒的体外细胞毒性测定

采用了正常肝细胞（L-02）、人肝癌细胞（Hep-G2）、测定葛根蛋白纳米颗粒的体外细胞毒性。细胞皆使用含20%小牛血清RPMI1640培养液，于37℃，5% CO2培养环境中培养。测定时，细胞按4×10⁴个/mL接于96孔板，200 µL /孔，每组设6个平行孔。培养24小时，弃去培养基，将已倍比稀释后的样品以每孔100 μL量加入。同时加不含血清的培养基100 µL，用做空白对照。继续培养24 h后以MTT法测定细胞增殖率，计算公式如下：

存活率=（A590加样组-A590空白组）/A590空白组×100%

葛根蛋白纳米颗粒细胞毒性试验表明，纳米颗粒浓度低于89 ug/mL对并不会抑制并不会抑制细胞的增值，而对人正常肝细胞L-02的无毒性更明显。葛根蛋白纳米颗粒的体外细胞毒性见附图4。

实施例5：葛根蛋白纳米颗粒装载小檗碱能力测定

精确配制10 mg/mL的小檗碱标准液（溶于色谱纯的甲醇），取50 µL标准液加入1.995 mL葛根蛋白样品中，使得小檗碱终浓度为0.25 mg/mL。取含有0.25 mg/mL小檗碱和不含小檗碱的葛根蛋白液体各1.6 mL，于100℃下保温60 min。取含小檗碱（0.25 mg/mL）的葛根蛋白1 mL，加入100 kDa超滤管 25℃，5000 g离心60 min。加入Tris-盐酸（0.02 mol/L，pH8.1）1 mL，反复冲洗超滤管上部样品池后，5000 g离心60min，待液体完全透过超滤膜后，测定小檗碱含量，即为游离小檗碱含量。药物装载率计算公式如下：

装载率=（总AST含量-游离AST含量）/总AST含量

经测定，在上述实验条件下葛根蛋白对小檗碱装载率为44.8%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 一种葛根蛋白及其纳米颗粒制备方法

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 葛根蛋白

<400> 1

Asp Phe Val Tyr Asp Met Cys Gly Asn Val Leu Asn

1 5 10

Claims (4)

1.一种葛根蛋白，其特征在于：所述蛋白的氨基酸序列为DFVYDMCGNVLN。

2.根据权利要求1所述的一种葛根蛋白，其特征在于：所述蛋白的制备方法为经过Tris-HCl缓冲液水相抽提，离子交换色谱Macro-Prep High-Q，从葛根中药饮片中分离得到一个电泳纯的葛根蛋白。

3.一种如权利要求1所述的一种葛根蛋白在制备葛根蛋白纳米颗粒上的应用。

4.根据权利要求3所述的一种葛根蛋白的应用，其特征在于：所述纳米颗粒的制备方法为将该葛根蛋白配制为1 mg/mL的Tris-盐酸盐溶液，经过60-100℃加热1小时，经过6000 g超滤5 min，即获得葛根蛋白纳米颗粒溶液；并应用动态光散射技术动态光散射、多角度激光光散射和电子扫描显微镜对葛根蛋白纳米颗粒进行性质研究。