CN109963593A - 进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制或治疗剂 - Google Patents

进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制或治疗剂 Download PDF

Info

Publication number
CN109963593A
CN109963593A CN201780071607.0A CN201780071607A CN109963593A CN 109963593 A CN109963593 A CN 109963593A CN 201780071607 A CN201780071607 A CN 201780071607A CN 109963593 A CN109963593 A CN 109963593A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
substance
expression
demyelinating disease
zbtb20
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201780071607.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109963593B (zh
Inventor
大木伸司
山村隆
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Institute For Mental And Neurological Research National Research And Development Corp
Original Assignee
National Institute For Mental And Neurological Research National Research And Development Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Institute For Mental And Neurological Research National Research And Development Corp filed Critical National Institute For Mental And Neurological Research National Research And Development Corp
Publication of CN109963593A publication Critical patent/CN109963593A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109963593B publication Critical patent/CN109963593B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5058—Neurological cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6875—Nucleoproteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/54—Interleukins [IL]
    • G01N2333/5425—IL-9
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/555—Interferons [IFN]
    • G01N2333/56—IFN-alpha
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/555—Interferons [IFN]
    • G01N2333/565—IFN-beta
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/715—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • G01N2333/7158—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for chemokines
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/285—Demyelinating diseases; Multipel sclerosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease

Abstract

本发明提供一种进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制或治疗剂，其含有抑制或阻碍催乳素产生的物质作为有效成分。

Description

进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制或治疗剂
技术领域
本发明涉及进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制或治疗剂。
背景技术
多发性硬化症(Multiple Sclerosis：MS)是自身免疫疾病之一，引发以髓鞘和神经轴突为靶的多发性炎症，是引起因广泛的脱髓鞘导致的神经传导障碍的疾病。随着多发性硬化症的病理进展，会出现运动障碍、视觉障碍等严重的神经症状。
多发性硬化症有反复急性恶化和缓解的复发缓解型MS(RR-MS)和进展型MS。在进展型MS中，已知有原发进展型MS(PP-MS)和在RR-MS病理持续一定期间后向进展性的病理转移的继发进展型MS(SP-MS)、以及一边反复复发一边进展的进展复发型MS(PR-MS)(非专利文献1～3)。
作为RR-MS的疾病修饰性治疗药(disease-modifying drugs：DMD)，已知有1型干扰素、抗炎剂、免疫抑制剂等。另一方面，即使对进展型MS应用RR-MS的DMD也没有效果，目前尚未得知对进展型MS有效的DMD。作为进展型MS的治疗方针，巴氯芬的髓注、持续性4-氨基吡啶制剂的给药等对症疗法占重要的位置。
到目前为止，进展型MS病理的形成机理、包括与RR-MS病理的形成机理的异同并不明确。另一方面，非专利文献4中报告了在SP-MS患者的中枢神经***(CNS)中，多个细胞或组织中发生了障碍，并且该障碍不仅会到达白质，还会波及灰质。另外，非专利文献4还报告了在多发性硬化症患者的脑内，属于PAR(Protease-activated receptors，蛋白酶激活受体)受体家族的PAR2受体的表达量发生变化，PAR2受体与神经的炎症症状相关。
本发明者们发现，在诱导了单相型的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的NR4A2缺失小鼠中，在诱导早期未观察到伴随着通常的四肢***EAE病理，而在诱导晚期(诱导后约28天以后)观察到EAE病理(以下也称为“晚期EAE病理”)；以及晚期EAE病理成为进展型MS病理的模型(专利文献1)。另外，本发明者们还发现，包含神经变性的晚期EAE病理认为起因于伴随着刺激的颗粒酶B的释放所导致的持续性的神经细胞障碍，通过使用PAR1受体拮抗剂等来抑制PAR 1受体，晚期EAE病理得以改善(专利文献2)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2016/002827号
专利文献2：国际公开第2016/114386号
非专利文献
非专利文献1：Nature Reviews Neurology 2012，8，647-656。
非专利文献2：Nature Reviews Neurology 2013，9，496-503。
非专利文献3：Multiple Sclerosis Journal 2013，19，1428-1436。
非专利文献4：Biochimica et Biophysica Acta 1802(2010)，66-79。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明是鉴于这些情况而完成的，本发明的主要目的在于提供进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制或治疗剂。本发明的目的还在于提供一种预防或抑制向进展型免疫性脱髓鞘病进展的方法。
用于解决课题的手段
本发明者们新发现了，在NR4A2缺失小鼠的晚期EAE病理下，通过CNS来源的抗原呈递细胞的刺激，Th细胞的Eomes分子的表达得到诱导，抗原呈递细胞产生的催乳素促进Eomes分子的表达诱导。本发明是基于这些新发现的发明。需要说明的是，催乳素已知不仅由脑垂体产生，还可以由除脑垂体以外的脑组织、乳腺、***组织、胎盘、子宫、免疫组织(例如淋巴细胞、胸腺、脾脏)等产生。这些催乳素为了与来自脑垂体的催乳素区别，也被称为异位性催乳素。
即，本发明提供以下的(1)～(15)。
(1)一种进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制或治疗剂，其含有抑制或阻碍催乳素产生的物质作为有效成分。
(2)根据(1)所述的进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制或治疗剂，其中，所述物质包含抑制或阻碍Zbtb20生成的物质。
(3)根据(1)所述的进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制或治疗剂，其中，所述物质包含多巴胺受体激动剂或多巴胺受体部分激动剂。
(4)根据(1)～(3)中任一项所述的进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制或治疗剂，其中，所述进展型免疫性脱髓鞘病为继发进展型多发性硬化症。
(5)一种预防或抑制向进展型免疫性脱髓鞘病进展的方法，其包含向对象给药抑制或阻碍催乳素产生的物质。
(6)根据(5)所述的方法，其中，所述物质包含抑制或阻碍Zbtb20生成的物质。
(7)根据(5)所述的方法，其中，所述物质包含多巴胺受体激动剂或多巴胺受体部分激动剂。
(8)根据(5)～(7)中任一项所述的方法，其中，所述进展型免疫性脱髓鞘病为继发进展型多发性硬化症。
(9)抑制或阻碍催乳素产生的物质在用于制造进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制或治疗剂中的用途。
(10)根据(9)所述的用途，其中，所述物质包含抑制或阻碍Zbtb20生成的物质。
(11)根据(9)所述的用途，其中，所述物质包含多巴胺受体激动剂或多巴胺受体部分激动剂。
(12)根据(9)～(11)中任一项所述的用途，其中，所述进展型免疫性脱髓鞘病为继发进展型多发性硬化症。
(13)一种进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制或治疗剂，其含有抑制或阻碍CX3CR1受体活化的物质作为有效成分。
(14)根据(13)所述的进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制或治疗剂，其中，所述物质是抗CX3CR1抗体或其抗原结合片段。
(15)一种收集用于诊断向进展型免疫性脱髓鞘病进展的数据的方法，其包含：从人对象采集小神经胶质细胞后，测定IL-9、IFN-α和IFN-β1中的至少1种的表达量。
发明效果
根据本发明，能够提供进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制或治疗剂、以及提供预防或抑制向进展型免疫性脱髓鞘病进展的方法。
附图说明
图1是表示与诱导了单相型EAE的NR4A2缺失小鼠的CNS中浸润的抗原呈递细胞(CD19+ B细胞和非B/classII+细胞)共培养的Th细胞的CD107a及Eomes表达的细胞图。
图2是表示与诱导了单相型EAE的NR4A2缺失小鼠的CNS中浸润了的抗原呈递细胞(CD19+ B细胞和非B/classII+细胞)共培养的Th细胞的Eomes表达量的图表(图1的概要数据)。
图3中，图3(a)是表示采集各进展度的EAE病理下的脑以及脊髓的时期的图表，3个虚线分别表示相当于早期EAE病理、中期EAE病理、晚期EAE病理的采集时期。图3(b)是表示各进展度的EAE病理下的T细胞的细胞图和Eomes+ CD4+ T细胞的比例的图表。
图4是表示各进展度的EAE病理下的CD19+ B细胞和CD19― classII+细胞的细胞图和各细胞的比例的图表。
图5是表示诱导了单相型EAE的NR4A2缺失小鼠的CNS中浸润的抗原呈递细胞(CD19+ B细胞和非B/classII+细胞)中的催乳素及生长激素的表达量的图表。
图6是表示各进展度的EAE病理下的CSF中的催乳素及生长激素的表达量的图表。
图7是表示催乳素共存下培养对Eomes表达的影响的图表。
图8是表示催乳素共存下培养对Eomes表达的影响的图表。
图9是表示诱导了单相型EAE的NR4A2缺失小鼠的CNS中浸润的抗原呈递细胞中的催乳素及Zbtb20的基因表达量的图表。
图10是表示诱导了单相型EAE的NR4A2缺失小鼠的CNS中浸润的抗原呈递细胞中的Zbtb20的蛋白表达的细胞图。
图11是表示诱导了单相型EAE的NR4A2缺失小鼠的CNS中浸润的抗原呈递细胞中的Zbtb20和催乳素的蛋白表达的图表。
图12是表示从晚期EAE病理小鼠的CNS采集的B细胞中的IL-10和Zbtb20的基因表达水平的细胞图和图表。
图13是表示从晚期EAE病理小鼠的CNS采集的非B抗原呈递细胞中的Zbtb20的基因表达水平的细胞图和图表。
图14是表示脑垂体中的催乳素和生长激素的表达量的图表。
图15是表示在催乳素存在下或不存在下培养的脾脏来源的Th细胞中的Eomes表达量的图表。
图16是表示在催乳素存在下或不存在下培养的脾脏来源的CD226+ Th细胞中的Eomes表达的细胞图。
图17表示对诱导了单相型EAE的NR4A2缺失小鼠给药溴隐亭时的EAE评分的图表。
图18表示对诱导了单相型EAE的NR4A2缺失小鼠给药溴隐亭后CNS中浸润的Th细胞的Eomes表达的图表。
图19是表示溴隐亭给药后的Eomes+ CD4+ T细胞的比例的图表。
图20是表示对诱导了单相型EAE的NR4A2缺失小鼠给药溴隐亭时的CNS中浸润的Th细胞中的CD107a及Eomes表达的细胞图。
图21是表示溴隐亭给药后的Eomes+ CD4+ T细胞的比例和CD107a+ CD4+ T细胞的比例的图表。
图22是表示多巴胺给药后的Eomes基因的表达的图表。
图23是表示左旋多巴给药后的EAE病理小鼠的临床评分的图表。
图24是表示左旋多巴给药后的Eomes蛋白和Zbtb20蛋白的表达的图表。
图25是表示左旋多巴给药后的催乳素基因的表达水平的图表。
图26是表示对诱导了单相型EAE的NR4A2缺失小鼠给药抗CX3CR1抗体时的EAE评分的图表。
图27是表示对诱导了单相型EAE的NR4A2缺失小鼠给药抗CX3CR1抗体时的Eomes+CD4+ Th细胞相对于CD4+ Th细胞的比例的图表。
图28是表示Zbtb20特异性siRNA给药后的EAE病理小鼠的临床评分的图表。
图29是表示Zbtb20特异性siRNA给药后的Eomes蛋白和Zbtb20蛋白的表达的图表。
图30是表示Zbtb20特异性siRNA给药后的催乳素基因及Zbtb20基因的表达的图表。
图31中，图31(a)及(b)是表示抗CD20抗体给药后的EAE病理小鼠的临床评分的图表。图31(c)是表示抗CD20抗体给药后的Zbtb20蛋白的表达的图表。
图32是表示抗CD20抗体给药后的Eomes蛋白和Zbtb20蛋白的表达的图表。
图33是表示在各种细胞因子存在下的培养中的Zbtb20蛋白的表达的图表。
图34是表示在各种细胞因子存在下的培养中的Zbtb20基因及催乳素基因的表达的图表。
图35是表示伴随着EAE病理进展的各种细胞因子表达的变化的图表。
图36是表示伴随着EAE病理进展的各种细胞因子表达的变化的图表。
图37是表示从晚期EAE病理小鼠采集的小神经胶质细胞存在下的培养中的催乳素基因及Zbtb20基因的表达的细胞图和图表。
图38是表示伴随着EAE病理进展的各种细胞因子表达的变化的图表。
图39是表示伴随着EAE病理进展的各种细胞因子表达的变化的图表。
图40是表示伴随着EAE病理进展的各种趋化因子表达的变化的图表。
具体实施方式
〔定义〕
在本说明书中，“进展型免疫性脱髓鞘病”是指由于起因于免疫反应的髓鞘的障碍而发生的疾病，是不缓解地持续进展的疾病。进展型免疫性脱髓鞘病优选为中枢神经***的进展型免疫性脱髓鞘病。作为进展型免疫性脱髓鞘病，例如可列举出PP-MS、SP-MS及PR-MS等进展型多发性硬化症。
NR4A2基因也被称为Nurr1基因、NOT基因或RNR1基因，是孤核受体(orphannuclear receptor)中的一种。NR4A2基因的主要表达部位是中枢神经***，特别是在中脑腹侧、脑干、脊髓中强表达。另外，NR4A2还响应***素、生长因子、炎症性细胞因子、T细胞受体交联而诱导表达，通过配体依赖性或配体非依赖性地与DNA直接结合来控制转录。人NR4A2基因的转录产物的NCBI参考序列的登录号为NM_006186.3。
Eomes基因也被称为Eomesodermin或Tbr2，是T-box转录因子家族中的一种，是与脊椎动物的产生、分化相关的蛋白。已知Eomes基因在CD8+ T细胞(细胞毒性T细胞，CTL)及NK细胞中表达。另外已知，其直接诱导穿孔素和颗粒酶B的表达。人Eomes基因的转录产物的NCBI参考序列登录号为NM_001278182.1(突变体1)、NM_005442.3(突变体2)、以及NM_001278183.1(突变体3)。
Zbtb20是属于含有C2H2Kruppel系锌指蛋白和BTB/POZ结构域的锌指蛋白的亚家族之一的蛋白。另外，Zbtb20与催乳素基因的启动子结合，促进催乳素的转录活性。Zbtb20在垂体前叶的所有成熟内分泌细胞系中高表达。Zbtb20的缺失可显著减少催乳素的表达和分泌。
〔进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制或治疗剂〕
本发明的第一实施方式的进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制或治疗剂含有抑制或阻碍催乳素产生的物质作为有效成分。
进展型免疫性脱髓鞘病优选为中枢神经***的进展型免疫性脱髓鞘病，更优选为继发进展型多发性硬化症(SP-MS)。
作为抑制或阻碍催乳素产生的物质，可以举出例如抑制催乳素基因表达的表达抑制物质、多巴胺受体激动剂、多巴胺受体部分激动剂、多巴胺重吸收抑制剂(Dopaminreuptake inhibitor)、多巴胺分解酶抑制剂、多巴胺类似化合物、或抑制或阻碍Zbtb20生成的物质。多巴胺受体激动剂或部分激动剂优选为多巴胺D2受体激动剂或部分激动剂。
抑制催乳素基因表达的表达抑制物质只要是能够抑制催乳素作为蛋白发挥功能的物质即可。作为该表达抑制物质，可以举出例如能够在转录水平或翻译水平表达抑制催乳素基因的物质、能够与催乳素的功能性部位结合而抑制功能表达的物质。
作为能够在转录水平或翻译水平表达抑制催乳素基因的物质，例如可以是抑制催乳素的基因表达的核酸、肽、糖或糖蛋白、分子量为1000以下的低分子化合物等。作为抑制催乳素基因表达的核酸，可以举出例如选自针对催乳素基因的反义寡核苷酸、siRNA、shRNA、miRNA和核酶中的至少1种。
作为能够与催乳素的功能性部位结合而抑制功能表达的物质，可以举出例如抗催乳素抗体或其抗原结合性片段(例如中和抗体)等。
抑制催乳素表达的表达抑制物质可以根据催乳素基因的基因组序列、mRNA序列、蛋白序列、蛋白的立体结构等信息，通过本技术领域中公知的方法进行设计和制造。
作为多巴胺受体激动剂，可以举出例如多巴胺、阿朴***(Apomorphine)、溴隐亭、麦卡角林、希拉多巴(Ciladopa)、二受体激动剂(Dihydrexidine)、Dinapsoline、Doxanthrine、表隐亭(Epicriptine)、麦角乙脲(Lisuride)、培高立特(Pergolide)、吡贝地尔(Piribedil)、普拉克索(Pramipexole)、丙基阿朴***(Propylapomorphine)、喹高利特(Quinagolide)、他利克索(Talipexole)、罗匹尼罗(Ropinirole)、罗替戈汀(Rotigotine)、罗克吲哚(Roxindole)、Sumanirole。
作为多巴胺受体部分激动剂，可以举出例如阿立哌唑(Aripiprazol)、依匹哌唑(Brexpiprazole)、苯环哌啶(Phencycliden)、Salvinorin A、喹吡罗(Quinpirole)。
作为多巴胺重吸收抑制剂，可以举出例如Altropane、安福萘酸(amfonelicacid)、安扑丁(Amineptine)、BTCP、DBL-583、Difluoropin和GBR-12783、GBR-12935、GBR-13069、GBR-13098、GYKI-52895、Lometopane、哌醋甲酯(Methylphenidate)、RTI-229、Vanoxerine。
作为多巴胺分解酶抑制剂，可以举出例如司来吉兰(Selegiline)、唑尼沙胺(Zonisamide)等单氨基氧化酶B抑制剂、恩他卡朋(Entacapon)等儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)抑制剂。
作为多巴胺类似化合物，可以举出例如左旋多巴(L-dopa，L-3,4-二羟基苯丙氨酸)、屈昔多巴(Droxidopa)(L-苏式-二羟基苯基丝氨酸，L-threo-dihydroxyphenylserine)。
抑制Zbtb20基因表达的表达抑制物质只要是能够抑制Zbtb20作为蛋白发挥功能的物质即可。作为该表达抑制物质，可以举出例如能够在转录水平或翻译水平表达抑制Zbtb20基因的物质、能够与Zbtb20的功能性部位结合而抑制功能表达的物质。作为能够在转录水平或翻译水平表达抑制Zbtb20基因的物质，例如可以是抑制Zbtb20的基因表达的核酸、肽、糖或糖蛋白、分子量为1000以下的低分子化合物等。作为抑制Zbtb20基因表达的核酸，可以举出例如选自针对Zbtb20基因的反义寡核苷酸、siRNA、shRNA、miRNA和核酶中的至少1种。作为能够与Zbtb20的功能性部位结合而抑制功能表达的物质，可以举出例如与Zbtb20的功能性部位结合而抑制功能表达的核酸、肽、糖或糖蛋白、分子量为1000以下的低分子化合物、抗Zbtb20抗体(例如中和抗体)或其抗原结合性片段等。
抑制Zbtb20表达的表达抑制物质可以根据Zbtb20基因的基因组序列、mRNA序列、蛋白序列、蛋白的立体结构等信息，通过本技术领域中公知的方法进行设计和制造。作为抑制Zbtb20表达的表达抑制物质，例如也可以是阻碍或抑制microRNA 122/CUX1/microRNA214/ZBTB20路径的物质。已知当使microRNA 214或microRNA 214强制表达时，Zbtb20基因的表达受到抑制(Kojima et al.Nature communications 2011，2：338，1-10)。另外，作为抑制Zbtb20表达的表达抑制物质，例如也可以是抑制LMP2A(Latent membrane protein2A，潜伏膜蛋白2A)和/或IRF4(Interferon regulatory factor 4，干扰素调节因子4)的表达的物质。已知在LMP2A表达B细胞中，Irf4和Zbtb20基因的表达亢进，由Irf4编码的蛋白IRF4与Zbtb20启动子结合，使Zbtb20基因的表达亢进(Minamitani etal.Proc.Natl.Acad.Sci.2015，112，37，11612-11617)。
本实施方式的进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制或治疗剂中的上述有效成分(抑制或阻碍催乳素产生的物质)的含量没有特别限制，例如以进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制或治疗剂的总量为基准，可以为0.001～100质量％。
进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制或治疗剂可以仅由上述有效成分构成，另外除上述有效成分以外，还可以含有在多发性硬化症的预防、发病抑制或治疗中可使用的其他药剂、制剂技术领域中常用的赋形剂、缓冲剂、稳定剂、抗氧化剂、粘合剂、崩解剂、填充剂、乳化剂及流动添加调节剂等添加剂。另外，上述其他药剂优选为通过与从催乳素受体开始的信号传递的抑制或阻碍不同的机理发挥治疗效果的药剂。
作为其他药剂，可以举出电位依赖性钠通道抑制剂(例如拉莫三嗪(Lamotrigine))、钾通道阻断剂(例如氨吡啶(Fampridine))、电位依赖性钙通道抑制剂(例如加巴喷丁(Gabapentin))、Siponimod(BAF312)、HMG-CoA抑制剂(例如Simbastatin等他汀类)、S1P受体拮抗剂(例如芬戈莫德(Fingolimod、FTY720)、c-kit受体抑制剂(例如马赛替尼(Masitinib))、MIS 416、Toeluna、钾保持性利尿剂(例如阿米洛利(Amiloride))、利鲁唑(Riluzole)、磷酸二酯酶抑制剂(例如异丁司特(Ibudilast、MN-166))、环磷酰胺(Cyclophosphamide)、类固醇(例如甲基强的松龙(methylprednisolone)、***(prednison))、拓扑异构酶II抑制剂(例如米托蒽醌(Mitoxantrone))、ELND002、MD1003、***(Ritalin)、富马酸喹硫平(Quetiapine fumarate)、NMDA受体抑制剂(例如美金刚(Memantine))、他克莫司(Tacrolimus)、特立氟胺(Teriflunomide、HMR1726)、BHT-3009-01、EGCG(表没食子儿茶素没食子酸酯)、CS-0777、醋酸格拉替雷(Glatiramer acetate)(Copoxone(注册商标))、ONO-4641、嘌呤代谢拮抗剂(例如克拉屈滨(Cladribine))、硫辛酸、肌苷、***(cannabis)、Nabiximols(Sativex(注册商标))、红细胞生成素(erythropoietin)、干扰素β-1b、肾上腺皮质刺激激素(ACTH)、雌三醇(Estriol)、合成髓磷脂碱性蛋白部分肽(例如地瑞考肽(Dirucotide、MBP8298))、单克隆抗人CD20抗体(例如利妥昔单抗(Rituximab))、人源化单克隆抗α4整合素抗体(例如那他珠单抗(Natalizumab、BG00002))、单克隆抗CD25抗体(例如达克珠单抗(Daclizumab))、人源化单克隆抗IL-12抗体、单克隆抗IL-12/23抗体(例如ABT-874(贝伐珠单抗，Briakinumab))、人源化单克隆Nogo-A抗体(例如奥扎尼珠单抗(Ozanezumab)、GSK 1223249)等。
第一实施方式的进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制或治疗剂的剂型例如可以是散剂、丸剂、颗粒剂、片剂、糖浆剂、锭片(troche)、胶囊剂、注射剂等中的任意剂型。
第一实施方式的进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制或治疗剂可以经口给药，也可以非经口给药。作为具体的给药量的一例，例如在对人成人男子(体重为60kg)进行给药的情况下，每天的进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制或治疗剂的给药量通常按有效成分换算为0.0001μg～10000mg/天/人。
上述第一实施方式也可以是预防或抑制向进展型免疫性脱髓鞘病进展的方法，其包含向需要其的人对象给药抑制或阻碍催乳素产生的物质的步骤。例如，上述第一实施方式的方法预防或抑制从复发缓解型免疫性脱髓鞘病向进展型免疫性脱髓鞘病进展。
本发明的第二实施方式的进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制或治疗剂含有抗CX3CR1抗体或其抗原结合片段作为有效成分。
进展型免疫性脱髓鞘病优选为中枢神经***的进展型免疫性脱髓鞘病，更优选为继发进展型多发性硬化症(SP-MS)。
作为抗CX3CR1抗体或其抗原结合片段，可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。抗CX3CR1抗体可以是小鼠抗体、大鼠抗体、豚鼠抗体、仓鼠抗体、兔抗体、猴抗体、狗抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体中的任一种。抗CX3CR1抗体可以是为了改善血液中滞留性等物性而实施了化学修饰的抗体。另外，抗CX3CR1抗体也可以是为了提高治疗效果而结合有放射性核素、毒素等的抗体。
抗CX3CR1抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。另外，抗CX3CR1抗体可以是小鼠抗体、大鼠抗体、豚鼠抗体、仓鼠抗体、兔抗体、猴抗体、狗抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体中的任一种。抗CX3CR1可以是为了改善血液中滞留性等物性而实施了化学修饰的抗体。另外，抗CX3CR1抗体也可以是为了提高治疗效果而结合有放射性核素、毒素等的抗体。
作为抗原结合性片段，只要是包含抗体的抗原结合部位的抗体片段即可，可以举出例如Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、双价小抗体(diabody)等。
本实施方式的进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制或治疗剂中的上述有效成分(抗CX3CR1抗体或其抗原结合片段)的含量没有特别限制，例如以进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制或治疗剂总量为基准，可以为0.001～100质量％。
进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制或治疗剂可以仅由上述有效成分构成，另外除了上述有效成分以外，还可以含有在多发性硬化症的预防、发病抑制或治疗中可使用的其他药剂、制剂技术领域中常用的赋形剂、缓冲剂、稳定剂、抗氧化剂、结合剂、崩解剂、填充剂、乳化剂及流动添加调节剂等添加剂。另外，上述其他药剂优选是通过与从CX3CR1受体开始的信号传递的抑制或阻碍不同的机理发挥治疗效果的药剂。其他药剂与第一实施方式所示的药剂相同。
第二实施方式的进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制或治疗剂的剂型例如可以是散剂、丸剂、颗粒剂、片剂、糖浆剂、锭片(troche)、胶囊剂、注射剂等中的任意剂型。
第二实施方式的进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制或治疗剂可以经口给药，也可以非经口给药。作为具体的给药量的一例，例如在对人成人男子(体重为60kg)进行给药的情况下，每天的进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制或治疗剂的给药量通常按有效成分换算为0.0001μg～10000mg/天/人。
上述第二实施方式也可以是进展型免疫性脱髓鞘病的治疗方法、或病理的进展抑制方法，其包含向需要其的人对象给药抗CX3CR1抗体或其抗原结合片段的步骤。
在上述第一或第二实施方式中，进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制、病理的进展抑制效果通过分析Th细胞表面的Eomes表达量的增加量来判断。作为Th细胞表面的Eomes表达量的增加量的分析方法，可以举出例如对从人对象采集的含有淋巴细胞的体液中的Eomes+ CD4+ T细胞进行检测的方法。从人对象采集的体液只要是含有淋巴细胞的体液即可。作为从人对象采集的体液，可以举出例如血液、脑脊髓液。血液可以是末梢血。Eomes+CD4+ T细胞的检测可以按照本技术领域中的常规方法来进行。
Eomes+ CD4+ T细胞的检测并不限定于此，例如可以通过包含下述步骤的方法实施：由从人对象采集的含有淋巴细胞的体液样品按照常规方法分离PBMC的步骤；使PBMC与标记抗CD3抗体或其抗原结合性片段、标记抗CD4抗体或其抗原结合性片段、以及标记抗Eomes抗体或其抗原结合性片段反应，用流式细胞仪对Eomes+ CD4+ T细胞进行检测的步骤。
本发明还提供收集用于诊断向进展型免疫性脱髓鞘病进展的数据的方法，其包含从人对象采集小神经胶质细胞，对IL-9、IFN-α和IFN-β1中的至少1种的表达量进行测定。
如图36所示，在EAE病理的进展过程中，若成为中期EAE病理，则小神经胶质细胞内的IFN-α、IFN-β1、IL-9的表达量显著增加。即，在人对象的小神经胶质细胞中，这些细胞因子的表达量显著增加，可以收集用于判断向进展型免疫性脱髓鞘病进展的数据。
细胞因子的增加是指比基于不怀疑向进展型免疫性脱髓鞘病进展的人对象或健康成人的小神经胶质细胞内的细胞因子的表达量确定的阈值多。
实施例
以下，基于实施例对本发明进行更具体的说明。但是，本发明并不限定于以下的实施例。
1.NR4A2cKO小鼠的EAE分析
(1)动物
所使用的小鼠全部为6～8周龄、在无特定病原体的条件下进行饲养。使用在loxp序列中夹有NR4A2基因的靶向载体，建立NR4A2fl/fl小鼠。即，将夹在loxp序列中的NR4A2导入基因通过微注射导入到C57BL/6胚胎干细胞中。使建立***与C57BL/6FLPe小鼠(理研BioResource Center)杂交，使除去了新霉素盒的***彼此交配，制作同型结合NR4A2fl/flC57BL/6小鼠。通过使得到的小鼠与C57BL/6CD4-Cre小鼠(Taconic公司)交配，建立CD4特异性NR4A2cKO C57BL/6小鼠(C57BL/6Cre-CD4/NR4A2fl\fl小鼠)。
(2)EAE诱导(单相型EAE)
将100μg相当于MOG35-55残基的肽(在Toray Research Center、日本、东京合成，以下也称为“MOG肽”)与将1mg的结核杆菌H37Ra死菌(Difco，美国，堪萨斯州)用完全弗氏佐剂(CFA)乳化而得到者等量混合，使用均质机进行乳化，制备MOG乳液。将得到的MOG乳液注射到CD4特异性NR4A2cKO C57BL/6小鼠(Cre-CD4/NR4A2fl/fl C57BL/6小鼠、NR4A2cKO)及作为对照的NR4A2fl/fl C57BL/6小鼠(对照)的1～2处背部皮下，进行免疫。进而，在进行免疫后的第0天和第2天，向每只小鼠的腹腔内注射200ng的百日咳毒素(List BiologicalLaboratories，美国)的PBS溶液200μL。
(3)T细胞向中枢神经***的浸润
从与上述1.(2)同样地诱导了单相型EAE的NR4A2缺失小鼠(NR4A2cKO)及C57BL/6小鼠(对照)在诱导10天后(相当于早期EAE病理)及诱导14天后(相当于中期EAE病理)及诱导18天后(相当于晚期EAE病理)，采集脑和脊髓，使用流式细胞仪分离CNS中浸润的CD19+ B细胞和非B/classII+细胞。具体而言，将组织切成小的碎片后，在37℃下、在含有1.4mg/mL的胶原酶H及100μg/mL的DNaseI(Roche公司制)的RPMI 1640培养基(Invitrogen公司制)中进一步分解40分钟。将得到的组织匀浆通过70μm细胞过滤器(GE Healthcare公司制)，使用不连续Percoll密度梯度离心分离法(37％/80％)将白细胞浓缩。接着，将CNS中浸润的CD19+ B细胞和非B/classII+细胞通过使用了FACS ARIA II(BD Cytometry Systems公司制)的FACS分类法分离。将分离出的CD19+ B细胞和非B/classII+细胞分别与脾脏来源的CD226+Th细胞共培养8小时。培养后，用流式细胞仪对所回收的Th细胞的Eomes和CD107a的表达量的变化进行分析。分离时所用的抗体使用抗CD3抗体(Biolegend公司制)、抗Eomes抗体(eBioscience公司制)、抗CD107a抗体(Biolegend公司制)。
将结果示于图1和图2。根据图1，可见在诱导18天后的EAE发病小鼠(相当于晚期EAE病理)中，CNS来源的抗原呈递细胞对Th细胞具有显著的Eomes表达诱导能力。
(4)EAE病理的各进展度时的Eomes表达
从与上述1.(2)同样地诱导了单相型EAE的野生型C57BL/6小鼠在诱导10天后(早期EAE病理)、14天后(中期EAE病理)、18天后(晚期EAE病理)，采集脑和脊髓，使用流式细胞仪分离CNS中浸润的CD4+ T细胞。其中，采集时期相当于图3(a)的图表中的早期、中期、晚期。具体而言，将组织切成小的碎片后，在37℃下、在含有1.4mg/mL的胶原酶H及100μg/mL的DNaseI(Roche公司制)的RPMI 1640培养基(Invitrogen公司制)中进一步分解40分钟。将得到的组织匀浆通过70μm细胞过滤器(GE Healthcare公司制)，使用不连续Percoll密度梯度离心分离法(37％/80％)将白细胞浓缩。接着，将CNS中浸润的CD4+ T细胞通过使用了FACSARIA II(BD Cytometry Systems公司制)的FACS分类法分离。
用流式细胞仪对分离出的CD4+ T细胞的Eomes表达量的变化进行分析。检测时所用的抗体使用抗CD4抗体(Biolegend公司制)、抗Eomes抗体(eBioscience公司制)。
接着，对各CD4+ T细胞进行细胞内染色，测定Eomes表达量。将结果示于图3(b)。图3(b)的图表表示病理的各进展度时的Eomes+ T细胞相对于CD4+ T细胞的比例(％)。在晚期EAE病理下，观测到Eomes+ CD4+ T细胞的比例显著增加。
另外，使用流式细胞仪从所采集的脑及脊髓中分离CNS中浸润的CD45hi细胞、CD19+B细胞、CD19―B细胞。将分离出的CD45hi细胞、CD19+ B细胞、CD19―B细胞分别通过FACS分类法分离。检测时所用的抗体使用抗CD45抗体(Biolegend公司制)、抗CD19抗体(Biolegend公司制)、抗TCRβ抗体(Biolegend公司制)、抗MHCclassII抗体(Biolegend公司制)。
将结果示于图4。在中期EAE病理下，CD19+ B细胞、CD19-非B/classII+抗原呈递细胞向CNS的浸润显著增加，在晚期EAE病理下，观测到这些细胞与中期EAE病理相比减少。
(5)EAE病理时的催乳素和生长激素的基因表达量
与上述1.(3)同样地，从EAE发病小鼠的CNS经时地提取CD19+ B细胞和非B/classII+细胞，通过定量PCR法分析催乳素(Prl)和生长激素(Gh)的基因表达量。作为催乳素和生长激素的引物，分别使用Mm_Prl_1_SG QuantiTect Primer Assay和Mm_Gh_1_SGQuantiTect Primer Assay(均为QIAGEN公司)。
将结果示于图5。图5中，“EB”是指在早期EAE状态下提取的CD19+ B细胞，“ED”是指在早期EAE状态下提取的非B/classII+细胞，“MB”是指在中期EAE状态下提取的CD19+ B细胞，“MD”是指在中期EAE状态下提取的非B/classII+细胞，“LB”是指在晚期EAE状态下提取的CD19+ B细胞，“LD”是指在晚期EAE状态下提取的非B/classII+细胞。根据图5，在晚期EAE状态的CNS来源的抗原呈递细胞中，观测到催乳素和生长激素的表达量显著增加。
(6)EAE病理的各进展度时的CSF中的催乳素和生长激素的表达
将三种混合***(美托咪定、咪达***、布托啡诺)通过腹腔内给药(ip)对小鼠进行麻醉。小鼠使用无处置小鼠、早期EAE病理的小鼠、中期EAE病理的小鼠、晚期EAE病理的小鼠。将各小鼠后头部的皮肤箭镞状切开，仔细地分离皮下组织和肌肉，使覆盖小脑延髓池的硬膜的表面露出。将玻璃毛细管穿刺到露出的硬膜中，利用毛细管现象收集CSF。将得到的CSF在―80℃的冷冻库中保存。
使用Luminex system(Luminex Corporation制)测定所采集的CSF中的催乳素(PRL)和生长激素(GH)的蛋白表达量。
将结果示于图6。中期EAE病理下，生长激素的蛋白表达量增加，晚期EAE病理下，观测到催乳素和生长激素的蛋白表达量增加。
(7)催乳素共存下培养对Eomes表达的影响
将从未处置的野生型B6小鼠采集的脾脏来源的CD226+ CD4+ T细胞在催乳素不存在下或特定量的催乳素存在下培养4小时或8小时。使用流式细胞仪或定量实时PCR测定培养后的各细胞的Eomes表达量。检测时所用的抗体使用抗CD4抗体(Biolegend公司制)、抗Eomes抗体(eBioscience公司制)。
将结果示于图7。无论培养时间如何，当在30、100ng/mL的催乳素存在下进行培养时，均观测到CD4+Eomes+ T细胞的比例显著增加。图8(a)是基于图7所示的各流式细胞图、将Eomes+细胞的比例整理到图表中而成的图。图8(b)是将各细胞的催乳素蛋白的相对表达量图表化的图。在图8中也观察到当在30ng/mL的催乳素存在下进行培养时，催乳素蛋白的表达量增加。
(8)伴随着EAE病理进展的催乳素和Zbtb20的基因表达量的变化
与上述1.(3)同样地，从EAE发病小鼠的CNS经时地提取CD19+ B细胞和非B/classII+细胞，通过定量PCR法分析催乳素和Zbtb20的基因表达量。作为催乳素和Zbtb20的引物，分别使用Mm_Prl_1_SG QuantiTect Primer Assay和Mm_Zbtb20_1_SG QuantiTectPrimer Assay(均为QIAGEN公司)。
将结果示于图9。图9中的“EB”、“MB”、“LB”、“ED”、“MD”及“LD”分别与图5中的定义相同。根据图9，在晚期EAE状态的CNS来源的抗原呈递细胞中，观测到催乳素和Zbtb20的基因表达量增加。
(9)伴随着EAE病理进展的催乳素和Zbtb20的蛋白表达量的变化
从与上述1.(2)同样地诱导了单相型EAE的NR4A2缺失小鼠(NR4A2cKO)及C57BL/6小鼠(对照)在诱导9天后(相当于早期EAE病理)及诱导19天后(相当于晚期EAE病理)，采集脑和脊髓，使用流式细胞仪分离CNS中浸润的CD19+ B细胞和非B/classII+细胞。具体而言，将组织切成小的碎片后，在37℃下、在含有1.4mg/mL的胶原酶H及100μg/mL的DNaseI(Roche公司制)的RPMI 1640培养基(Invitrogen公司制)中进一步分解40分钟。将得到的组织匀浆通过70μm细胞过滤器(GE Healthcare公司制)，使用不连续Percoll密度梯度离心分离法(37％/80％)将白细胞浓缩。接着，使用FACS CANTO II(BD Cytometry Systems公司制)对CNS中浸润的CD19+ B细胞和非B/classII+细胞进行分析。用流式细胞仪对分离出的CD19+ B细胞和非B/classII+细胞中的Zbtb20的表达量的变化进行分析。检测时所用的抗体使用抗Zbtb20抗体(BD Bioscience公司制)。
将结果示于图10和图11。根据图10，在晚期EAE病理下，观测到Zbtb20的表达量显著性地增加。另外，图11(a)是将Zbtb20+细胞的比例图表化的图，在晚期EAE病理下，观测到Zbtb20表达显著增加。另外，如图11(b)所示，对B细胞和非B抗原呈递细胞中的催乳素基因(Prl)的表达量进行了测定，结果观察到在晚期EAE病理下，催乳素基因(Prl)的相对表达量显著增加。
另外，将从晚期EAE病理小鼠的CNS采集的B细胞在10ng/mL的脂多糖(LPS)和BDGolgiPlug的存在下培养6小时。根据CD1d和CD5基因的染色状态，将所培养的B细胞如图12(a)所示，分离成4种级分(Fr1、Fr2、Fr3、Fr4)。使用FACS Plot测定来自各级分的IL-10和Zbtb20的基因表达水平。将其结果示于图12(b)。
进而，将从晚期EAE病理小鼠的CNS采集的非B抗原呈递细胞染色，进行FACS分析。根据CD11c和PDCA-1基因的染色状态，将非B抗原呈递细胞如图13(a)所示，分离成3种级分(Fr1、Fr2、Fr3)。使用FACS PLOT测定来自各级分的Zbtb20的基因表达水平。检测时所用的抗体使用抗CD11c抗体(Biolegend公司制)、抗PDCA-1抗体(eBioscience公司制)、抗Zbtb20抗体(Becton Dickinson公司制)。
将其结果示于图13(a)。另外，将各级分中的Zbtb20+细胞的比例示于图13(b)。
(10)脑垂体中的催乳素和生长激素的表达
从无处置或者早期、中期或晚期EAE病理小鼠切出脑垂体，分离总RNA后，使用定量性实时PCR测定催乳素基因(Prl)的表达水平。将其结果示于图14(a)。
另外，采集小鼠的血清，使用Luminex system测定血清中的催乳素(PRL)和生长激素(GH)的蛋白水平。将其结果示于图14(b)。在任一进展度的EAE病理下，均观测到血清中的催乳素(PRL)水平与无处置小鼠的情况相比显著低。
进而，使用FACS ARIA从无处置或者早期、中期或晚期EAE病理小鼠的CNS中精制CD19+ B细胞、PDCA-1+ CD11c+转化细胞样树突状细胞(pDC)、CD45int CD11b+小神经胶质细胞，使用定量性实时PCR测定这些催乳素基因(Prl)和zbbb20基因的表达水平。检测时所用的抗体使用抗CD19抗体(Biolegend公司制)、抗PDCA-1抗体(eBioscience公司制)、抗CD45抗体(Biolegend公司制)、抗CD11c抗体(Biolegend公司制)、抗Zbtb20抗体(BectonDickinson公司制)。Prl和GH的定量使用了Mouse pituitary magnetic bead panel(Millipore公司制)。
将结果示于图14(c)。在晚期EAE病理下，在CD19+ B细胞和PDCA-1+B220+pDC中，观测到催乳素基因的表达水平显著增加。另外，在CD19+ B细胞和CD45int CD11b+小神经胶质细胞中，观察到zbbb20基因的表达水平随着EAE病理进展而增加。
2.由催乳素引起的晚期EAE病理的变化
(1)催乳素添加和Eomes基因的表达增强1
将未处理小鼠的脾脏来源的Th细胞在重组催乳素不存在下或存在下培养8小时。培养后，从Th细胞中提取总RNA。从得到的总RNA中，使用First Strand cDNA合成试剂盒(TAKARA公司制)合成cDNA。在Light Cycler装置中，在使用了Light Cycler-FastStartDNA Master SYBR Green I Kit(Roche Diagnostics公司制)的条件下，或在ABI 7300实时PCR装置中，在使用了Power SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems公司制)的条件下，使用市售的引物(QuantiTect Primer Assay，QT01074332，Qiagen公司制)进行定量实时PCR。Eomes基因表达量基于GAPDH管家基因的表达量进行校正。
将结果示于图15。图15中，1是指不添加催乳素培养的细胞，2是指在低浓度的催乳素的存在下培养的细胞，3是指在高浓度的催乳素的存在下培养的细胞。图15的纵轴表示Eomes相对于管家基因(β2微球蛋白)的相对表达量，Eomes表达量与催乳素的浓度依赖性地增加。
(2)催乳素添加和Eomes蛋白的表达增强2
将脾脏来源的CD226+ Th细胞在催乳素不存在下或存在下培养8小时或48小时。培养后，将CD226+ Th细胞用抗CD226抗体、抗Eomes抗体染色，CD226+Eomes+ T细胞、CD226+Eomes―T细胞和CD226―T细胞使用FACS CANTO II(BD Cytometry Systems公司制)进行分析。分析时使用的抗体是抗CD226抗体(Biolegend公司制)和抗Eomes抗体(Biolegend公司制)。
将结果示于图16。与催乳素不存在下培养的细胞相比，在催乳素存在下培养的细胞中，48小时后的Eomes表达量显著地增加。
(3)D2受体激动剂引起的晚期EAE病理的抑制
对与上述1.(2)同样地诱导了单相型EAE的CD4-Cre/NR4A2fl/fl小鼠及对照小鼠(对照)从诱导4天后隔日腹腔内注射溴隐亭。注射后，按照以下所示的EAE评价基准，每天评价小鼠的EAE病理。
<EAE评价基准>
0：无临床症状
1：尾的部分麻痹
2：松弛的尾
3：后肢的局部麻痹
4：全后肢的麻痹
5：后肢和前肢的麻痹
将结果示于图17。图17中的箭头表示给药溴隐亭的日子。通过给药溴隐亭，晚期EAE病理显著性地得到抑制。
(4)D2受体激动剂(溴隐亭)给药对Eomes蛋白的表达抑制1
在与上述1.(2)同样地诱导了单相型EAE的CD4-Cre/NR4A2fl/fl小鼠中，从诱导4天后隔日从静脉内注射了溴隐亭的小鼠和未注射的小鼠采集脑和脊髓，使用流式细胞仪，将CNS中浸润的Th细胞分离。具体而言，将组织切成小的碎片后，在37℃下、在含有1.4mg/mL的胶原酶H及100μg/mL的DNaseI(Roche公司制)的RPMI 1640培养基(Invitrogen公司制)中进一步分解40分钟。将得到的组织匀浆通过70μm细胞过滤器(GE Healthcare公司制)，使用不连续Percoll密度梯度离心分离法(37％/80％)将白细胞浓缩。然后，将CNS中浸润的Th细胞通过使用了FACS ARIA II(BD Cytometry Systems公司制)的FACS分类法分离。用流式细胞仪对所回收的Th细胞的Eomes和CD4的表达量的变化进行分析。分离时所用的抗体使用抗CD4抗体(Biolegend公司制)、抗Eomes抗体(eBioscience公司制)。
将结果示于图18和图19。如图18所示，通过给药溴隐亭，CNS浸润Th细胞中的Eomes蛋白的表达量显著性地被抑制。图19是表示Eomes+ CD4+ T细胞的比例和实际细胞数的变化的图表。
(5)D2受体激动剂(溴隐亭)对Eomes基因的表达抑制2
在与上述1.(3)同样地诱导了单相型EAE的CD4-Cre/NR4A2fl/fl小鼠中，从诱导4天后隔日从静脉内注射了溴隐亭的小鼠及未注射的小鼠采集脑和脊髓至诱导27天后，将CNS中浸润的CD19+ B细胞和非B/classII+细胞通过使用了FACS ARIA II(BD CytometrySystems公司制)的FACS分类法分离。将分离出的CD19+ B细胞和非B/classII+细胞分别与脾脏来源的CD4+ Th细胞共培养8小时。培养后，用流式细胞仪对所回收的Th细胞的Eomes和CD107a的表达量的变化进行分析。检测时所用的抗体使用抗Eomes抗体(eBioscience公司制)、抗CD107a抗体(Biolegend公司制)。
将结果示于图20。根据图20，通过给药溴隐亭，CNS来源的抗原呈递细胞对Th细胞的Eomes蛋白表达和CD107a表达诱导能力显著性地被抑制。
(6)D2受体激动剂(溴隐亭)给药对Eomes基因和CD107a基因的表达
在与上述1.(3)同样地诱导了单相型EAE的CD4-Cre/NR4A2fl/fl小鼠中，从诱导4天后隔日腹腔内注射溴隐亭或安慰剂(DMSO和PBS)。诱导32天后采集脑和脊髓，将CNS中浸润的CD19+ B细胞和CD19―CD45hi非B/classII+抗原呈递细胞通过使用了FACS ARIA II(BDCytometry Systems公司制)的FACS分类法分离。将分离出的细胞在FITC结合抗CD107a抗体的存在下，与从类基因***的未处置小鼠来源的脾脏通过FACS分类法分离出的CD4+ T细胞共培养。共培养8小时后，将各细胞染色，对Eomes表达进行分析。检测时所用的抗体使用抗CD4抗体(Biolegend公司制)、抗Eomes抗体(eBioscience公司制)、抗CD45抗体(Biolegend公司制)、FITC结合抗CD107a抗体(Biolegend公司制)。
将结果示于图21。经共培养的CD4+ T细胞的细胞表面的Eomes基因和CD107a基因的表达量即使在与CD19+ B细胞和CD19―CD45hi非B/classII+抗原呈递细胞中的任一者共培养的情况下，也观测到因溴隐亭的给药而减少。
(7)D2受体激动剂(多巴胺)给药对Eomes基因的表达抑制
从晚期EAE病理小鼠中通过FACS分类法精制CD19+ B细胞和CD19― CD45hi非B/classII+抗原呈递细胞。将精制的各细胞在多巴胺不存在下或特定量的多巴胺存在下培养24、48、96小时。回收培养后的细胞，使用定量性实时PCR对催乳素基因(Prl)和Zbtb20基因的表达量进行分析。
将结果示于图22。图22(a)表示CD19+ B细胞中的基因表达量，图22(b)表示CD19―CD45hi非B/classII+抗原呈递细胞中的基因表达量。在任一情况下，无论是否在多巴胺共存下进行培养，均观测到催乳素及Zbtb20基因的表达量显著降低。
(8)多巴胺前体物质(左旋多巴)给药对Eomes基因的表达抑制
在与上述1.(3)同样地诱导了单相型EAE的CD4-Cre/NR4A2fl/fl小鼠中，从诱导4天后隔日腹腔内注射左旋多巴或安慰剂(DMSO以及PBS)。
各小鼠的EAE评分如图23所示。观测到通过反复给药左旋多巴，EAE评分显著改善。在图23的右图中，虚线表示95％可信区间。在累积EAE评分的比较中，也确认到通过左旋多巴的反复给药带来的EAE评分的改善。
接着，在诱导32天后，从各小鼠采集脑和脊髓，将CNS中浸润的CD4+ T细胞、CD19+ B细胞和CD19―CD45hi非B/classII+抗原呈递细胞通过使用了FACS ARIAII(BD CytometrySystems公司制)的FACS分类法分离。对分离出的各细胞进行染色，分析Eomes及Zbtb20基因的表达。检测时所用的抗体使用抗CD4抗体(Biolegend公司制)、抗Eomes抗体(eBioscience公司制)、抗CD19抗体(Biolegend公司制)、抗Zbtb20抗体(Becton Dickinson公司制)。
将结果示于图24。如图24(a)所示，在CD4+ T细胞中观测到，通过左旋多巴的反复给药，CD4+Eomes+ T细胞的比例显著减少。另外，如图24(b)和(c)所示，在CD19+ B细胞和CD19―CD45hi非B/classII+抗原呈递细胞中，观测到通过左旋多巴的反复给药，Zbtb20+细胞的比例也减少。
接着，使用定量性实时PCR对分别从左旋多巴给药小鼠和非给药小鼠的CNS和脾脏分离出的CD19+ B细胞和CD19―CD45hi非B/classII+抗原呈递细胞中的催乳素基因(Prl)的表达水平进行分析。检测时所用的抗体使用抗CD19抗体(Biolegend公司制)、抗CD45抗体(Biolegend公司制)。
将结果示于图25。在CNS来源的B细胞和非B/classII+抗原呈递细胞中，观测到催乳素基因的表达水平显著高，通过左旋多巴的反复给药，其表达水平降低。
3.抗CX3CR1抗体给药对Eomes基因的表达抑制
对与上述1.(3)同样地诱导了单相型EAE的NR4A2缺失小鼠在诱导10天后(相当于晚期EAE病理)给药抗CX3CR1抗体(Biolegend公司制)或其同型物(Biolegend公司制)，按照上述的EAE评价基准，每天评价小鼠的EAE病理。
将结果示于图26。如图26所示，通过给药抗CX3CR1抗体(CX3CR1)，与给药了同型物的情况相比(Isotype)，晚期EAE病理显著性地改善。
另外，在诱导22天后和诱导28天后采集给药了抗CX3CR1抗体或其同型物的小鼠的CNS，分离CD4+细胞。测定得到的CD4+细胞中的Eomes+ CD4+细胞和Eomes++ CD4+细胞(Eomes强阳性CD4阳性Th细胞)相对于CD4+细胞的比例和绝对量。
将结果示于图27。如图27所示，在Eomes+ CD4+细胞和Eomes++ CD4+细胞中的任一者中，通过抗CX3CR1抗体给药，晚期EAE病理下的Eomes阳性Th细胞相对于CD4+细胞的比例和绝对量显著性地减少。
4.Zbtb20特异性siRNA给药对Eomes基因的表达抑制
(1)EAE病理的临床评分的变化
对与上述1.(3)同样地诱导了单相型EAE的NR4A2缺失小鼠在诱导7天后(相当于早期EAE病理)通过静脉内注射给药用去端肽胶原基质稳定化了的Zbtb20特异性siRNA(株式会社高研制)或对照错义siRNA(株式会社高研制)，按照上述的EAE评价基准，每天评价小鼠的EAE病理。
将其结果示于图28。图28的右图的纵轴表示累积临床评分。观测到在对照错义siRNA给药小鼠中是与未处理小鼠同等的临床评分，而在Zbtb20特异性siRNA给药小鼠中临床评分显著降低。图28的右图是将累积临床评分图表化的图，虚线表示95％可信区间。
(2)Zbtb20特异性siRNA给药对Eomes及Zbtb20基因的表达抑制
采集与上述4.(1)同样地处置的未处理小鼠、Zbtb20特异性siRNA给药小鼠及对照错义siRNA给药小鼠的脑和脊髓，分离CD4+ T细胞和B细胞。使用流式细胞仪对得到的各小鼠组的CD4+ T细胞和B细胞中的Eomes或Zbtb20基因的表达进行分析。检测时所用的抗体使用抗CD4抗体(Biolegend公司制)、抗Eomes抗体(eBioscience公司制)、抗CD19抗体(Biolegend公司制)、抗Zbtb20抗体(Becton Dickinson公司制)。
将结果示于图29。如图29(a)所示，在Zbtb20特异性siRNA给药小鼠中，观测到CD4+T细胞中的Eomes基因的表达、B细胞中的Zbtb20基因的表达均被显著抑制。图29(b)是为了比较各小鼠组的Eomes和Zbtb20的表达细胞的比例而图表化的图。
(3)Zbtb20特异性siRNA给药对催乳素基因的表达抑制
使用与上述4.(1)同样地处置的未处置小鼠、Zbtb20特异性siRNA给药小鼠和对照错义siRNA给药小鼠，从晚期EAE病理小鼠的CNS分离抗原呈递细胞。从得到的抗原呈递细胞通过使用了FACS ARIA II(BD Cytometry Systems公司制)的FACS分类法精制CD19―CD45hi非B/classII+抗原呈递细胞。向精制的细胞中转导Zbtb20特异性siRNA或对照错义siRNA，在LPS的存在下培养24小时后，使用定量性实时PCR测定Zbtb20和催乳素(Prl)的表达水平。检测所用的抗体使用抗CD4抗体(Biolegend公司制)、抗Eomes抗体(eBioscience公司制)、抗CD19抗体(Biolegend公司制)、抗CD45抗体(Biolegend公司制)。
将结果示于图30。观测到通过Zbtb20特异性siRNA的给药，Zbtb20基因及Prl基因的表达水平显著降低。
5.抗CD20抗体给药对Eomes基因的表达抑制
(1)EAE病理的临床评分的变化
在与上述1.(3)同样地诱导了单相型EAE的NR4A2缺失小鼠中、在诱导7天后或诱导13天后(相当于晚期EAE病理)，分别通过静脉内注射给药抗CD20抗体或对照IgG，按照上述的EAE评价基准，每天评价小鼠的EAE病理。
将结果示于图31(a)及(b)。图31(a)及(b)中的箭头表示给药抗体的日子。图31(a)表示诱导7天前给药抗体的结果，图31(b)表示诱导13天后给药抗体的结果。如图31(b)所示，通过诱导13天后给药抗CD20抗体，临床评分显著改善。图31(b)的右图是将累积临床评分图表化的图，虚线表示95％可信区间。
(2)抗CD20抗体对Eomes及Zbtb20基因的表达抑制
采集与上述5.(1)同样地处置的未处置小鼠、抗CD20抗体和对照IgG给药小鼠的大脑和脊髓，分离CD4+ T细胞和B细胞。使用流式细胞仪对得到的各小鼠组的CD4+ T细胞和B细胞中的Eomes或Zbtb20基因的表达进行分析。检测时所用的抗体使用抗CD4抗体(Biolegend公司制)、抗Eomes抗体(eBioscience公司制)、抗CD20抗体(Biolegend公司制)、抗CD45抗体(Biolegend公司制)、抗Zbtb20抗体(Becton Dickinson公司制)。
将结果示于图31(c)和32。如图31(c)所示，在抗CD20抗体给药小鼠中，观测到CD4+T细胞中的Eomes基因的表达、B细胞中的Zbtb20基因的表达均被显著抑制。图32是为了比较各小鼠组的Eomes和Zbtb20的表达细胞的比例而图表化的图。
6.各种细胞因子引起的Zbtb20基因表达的变化
(1)各种细胞因子引起的Zbtb20基因表达的变化
将脾脏来源的CD19+ B细胞分离，通过使用了FACS ARIAII(BD CytometrySystems公司制)的FACS分类法进行精制。将精制后的B细胞在LPS的存在下，在图33(a)所示的细胞因子的共存下或非共存下培养24小时。培养后，测定各细胞中的Zbtb20基因的表达水平。检测时所用的抗体使用抗CD19抗体(Biolegend公司制)、抗Zbtb20抗体(BectonDickinson公司制)。
将结果示于图33和34中。在图33(a)中，用灰色的图形表示在细胞因子非共存下培养的细胞中的Zbtb20基因的表达水平，用黑线图形表示在各种细胞因子共存下培养时的表达水平。当在所示的细胞因子共存下培养时，Zbtb20基因的表达增加，在IFNα或IFNβ1的共存下培养时，观测到Zbtb20基因的表达增加最显著。图33(b)是将各条件下的Zbtb20+细胞的比例图形化的图。图34表示通过FACS PLOT在各种细胞因子共存下培养时，与细胞因子非共存下培养时相比，Zbtb20+细胞或Prl+细胞的比例增加到几倍。
(2)伴随着EAE病理进展的各种细胞因子表达的变化1
采集各进展度(早期EAE病理、中期EAE病理、晚期EAE病理)时的小鼠的CSF及血浆，使用Luminex system测定各种细胞因子的表达水平。另外，同样地使用定量性实时PCR测定CNS来源的B细胞、pDC、小神经胶质细胞中的1型干扰素(IFNα2、IFNβ1)、IL-6、IL-9、Cxcl13的表达水平。IFNα和IFNβ的检测使用ProcartaPlex Mouse IFNa/b(ThermoFisher公司制)，其他的细胞因子的检测使用BioPlex Pro Cytokine GI 23-plex panel和BioPlex PrCytokine GIII TH17 8-plex B panel(BioRad公司制)。
将结果示于图35、36。图35表示IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-9、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IFN-γ的表达水平。图35(a)表示IFN-α、IFN-β的表达水平。图35(b)表示CNS来源的B细胞、pDC、小神经胶质细胞中的IFNα2或IFNβ1的表达量，图35(c)表示CNS来源的B细胞、pDC、小神经胶质细胞中的IL-6、IL-9、Cxcl13的表达量。如图35(b)和(c)所示，观测到当达到中期EAE病理时，在小神经胶质细胞内IFN-α2、IFN-β1、IL-9的表达量显著增加。
(3)晚期EAE病理小鼠来源的小神经胶质细胞对Zbtb20表达的影响
通过FACS分类法从类基因***的未处理小鼠的脾脏分离CD19+ B细胞，与未处理小鼠或晚期EAE病理小鼠来源的小神经胶质细胞一起共培养24小时。使用流式细胞仪测定培养后的B细胞中的Zbtb20基因的表达量。另外，用FACS分类法精制B细胞，使用实时PCR检测Zbtb20和Prl的RNA水平。检测时所用的抗体使用抗CD19抗体(Biolegend公司制)、抗Zbtb20抗体(eBioscience公司制)。
将结果示于图37。如图37(a)所示，观测到当将CD19+ B细胞与晚期EAE病理小鼠的小神经胶质细胞共培养时，Zbtb20基因的表达显著增强。另外，如图37(b)所示，观测到Zbtb20和Prl的RNA水平也相对地增加。
(4)伴随着EAE病理进展的各种细胞因子表达的变化
从未处理或各进行度的EAE病理小鼠采集CSF及血浆，使用Luminex system测定各种细胞因子(IL-2、IL-4、IL-3、IL-5、IL-10、IL-13，IL-17、G-CSF、GM-CSF、TNF-α、嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)、KC、MCP-1、MIP-1b、RANTES、MIP-1a)的蛋白水平。检测使用BioPlex Pro Cytokine GI 23-plex panel和BioPlex Pr Cytokine GIII TH17 8-plex Bpanel(BioRad公司制)。
将结果示于图38～40。

Claims (15)

1.一种进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制或治疗剂，其含有抑制或阻碍催乳素产生的物质作为有效成分。
2.根据权利要求1所述的进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制或治疗剂，其中，所述物质包含抑制或阻碍Zbtb20生成的物质。
3.根据权利要求1所述的进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制或治疗剂，其中，所述物质包含多巴胺受体激动剂或多巴胺受体部分激动剂。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制或治疗剂，其中，所述进展型免疫性脱髓鞘病为继发进展型多发性硬化症。
5.一种预防或抑制向进展型免疫性脱髓鞘病进展的方法，其包含向对象给药抑制或阻碍催乳素产生的物质。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述物质包含抑制或阻碍Zbtb20生成的物质。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述物质包含多巴胺受体激动剂或多巴胺受体部分激动剂。
8.根据权利要求5～7中任一项所述的方法，其中，所述进展型免疫性脱髓鞘病为继发进展型多发性硬化症。
9.抑制或阻碍催乳素产生的物质在用于制造进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制或治疗剂中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其中，所述物质包含抑制或阻碍Zbtb20生成的物质。
11.根据权利要求9所述的用途，其中，所述物质包含多巴胺受体激动剂或多巴胺受体部分激动剂。
12.根据权利要求9～11中任一项所述的用途，其中，所述进展型免疫性脱髓鞘病为继发进展型多发性硬化症。
13.一种进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制或治疗剂，其含有抑制或阻碍CX3CR1受体活化的物质作为有效成分。
14.根据权利要求13所述的进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制或治疗剂，其中，所述物质是抗CX3CR1抗体或其抗原结合片段。
15.一种收集用于诊断向进展型免疫性脱髓鞘病进展的数据的方法，其包含：从人对象采集小神经胶质细胞后，测定IL-9、IFN-α和IFN-β1中的至少1种的表达量。
CN201780071607.0A 2016-11-29 2017-11-28 进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制或治疗剂 Active CN109963593B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016-231364 2016-11-29
JP2016231364 2016-11-29
PCT/JP2017/042629 WO2018101261A1 (ja) 2016-11-29 2017-11-28 進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109963593A true CN109963593A (zh) 2019-07-02
CN109963593B CN109963593B (zh) 2023-02-28

Family

ID=62242207

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780071607.0A Active CN109963593B (zh) 2016-11-29 2017-11-28 进展型免疫性脱髓鞘病的预防、发病抑制或治疗剂

Country Status (8)

Country Link
US (2) US20200071408A1 (zh)
EP (1) EP3549607A4 (zh)
JP (1) JP7112735B2 (zh)
CN (1) CN109963593B (zh)
AU (1) AU2017368518B2 (zh)
CA (1) CA3043818A1 (zh)
EA (1) EA201991269A1 (zh)
WO (1) WO2018101261A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2023004964A (es) 2020-11-06 2023-06-29 Nat Center Neurology & Psychiatry Agente terapéutico para enfermedades progresivas ocasionadas por el incremento en células t positivas a cd4 positivas a eomes.

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020192212A1 (en) * 2001-03-19 2002-12-19 Toshio Imai Uses of anti-CX3CR1 antibody, anti-fractalkine antibody and fractalkine
US9035029B2 (en) * 2012-02-27 2015-05-19 Boehringer Ingelheim International Gmbh CX3CR1-binding polypeptides comprising immunoglobulin single variable domains

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009509943A (ja) * 2005-09-27 2009-03-12 ステム セル セラピューティクス コーポレイション プロラクチンにより制御される乏突起膠細胞前駆体細胞の増殖
JPWO2016002827A1 (ja) 2014-07-01 2017-04-27 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター 進行型免疫性脱髄疾患治療剤
WO2016114386A1 (ja) 2015-01-15 2016-07-21 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター 進行型免疫性脱髄疾患治療剤

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020192212A1 (en) * 2001-03-19 2002-12-19 Toshio Imai Uses of anti-CX3CR1 antibody, anti-fractalkine antibody and fractalkine
US9035029B2 (en) * 2012-02-27 2015-05-19 Boehringer Ingelheim International Gmbh CX3CR1-binding polypeptides comprising immunoglobulin single variable domains

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANA I ESQUIFINO ET AL.: "Experimental allergic encephalomyelitis in pituitary-grafted Lewis rats", 《JOURNAL OF NEUROINFLAMMATION》 *
ANNA RIDDERSTAD WOLLBERG ET AL.: "Pharmacological inhibition of the chemokine receptor CX3CR1 attenuates disease in a chronic-relapsing rat model for multiple sclerosis", 《PNAS》 *
C.D. DIJKSTRA ET AL.: "THERAPEUTIC EFFECT OF THE D2-DOPAMINE AGONIST BROMOCRIPTINE ON ACUTE AND RELAPSING EXPERIMENTAL ALLERGIC ENCEPHALOMYELITIS", 《PSYCHONEUROENDOCRINOLOGY》 *
DONGMEI CAO ET AL.: "ZBTB20 is required for anterior pituitary development and lactotrope specification", 《NATURE COMMUNICATIONS》 *
KOUTOKU AIHARA ET AL.: "The novel antipsychotic aripiprazole is a partial agonist at short and long isoforms of D2 receptors linked to the regulation of adenylyl cyclase activity and prolactin release", 《BRAIN RESEARCH》 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20210230282A1 (en) 2021-07-29
US20200071408A1 (en) 2020-03-05
WO2018101261A1 (ja) 2018-06-07
EA201991269A1 (ru) 2019-10-31
AU2017368518A1 (en) 2019-06-13
AU2017368518B2 (en) 2023-05-18
JP7112735B2 (ja) 2022-08-04
JPWO2018101261A1 (ja) 2019-10-24
CN109963593B (zh) 2023-02-28
EP3549607A4 (en) 2020-10-21
CA3043818A1 (en) 2018-06-07
EP3549607A1 (en) 2019-10-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20190040154A1 (en) Methods and compositions for treatment of immune-related diseases or disorders and/or therapy monitoring
Gotthardt et al. Loss of STAT3 in murine NK cells enhances NK cell–dependent tumor surveillance
Harada et al. The 3′ enhancer CNS2 is a critical regulator of interleukin-4-mediated humoral immunity in follicular helper T cells
Jankovic et al. Conventional T-bet+ Foxp3− Th1 cells are the major source of host-protective regulatory IL-10 during intracellular protozoan infection
Liu et al. Cooperation of invariant NKT cells and CD4+ CD25+ T regulatory cells in the prevention of autoimmune myasthenia
Vargas-Inchaustegui et al. Distinct roles for MyD88 and Toll-like receptor 2 during Leishmania braziliensis infection in mice
EP3750560A2 (en) Combination therapies and uses for treatment of demyelinating disorders
Tai et al. TLR9 deficiency promotes CD73 expression in T cells and diabetes protection in nonobese diabetic mice
CN1688603A (zh) 使用4－1bb结合剂的治疗和预防
HUE031432T2 (en) Method for treating autoimmune diseases with DLL4 antagonists
Li et al. Functional interleukin-17 receptor A are present in the thyroid gland in intractable Graves disease
US20230330145A1 (en) Natural killer cells
CN102811739A (zh) T细胞活化抑制剂、含有其的药物组合物以及抑制t细胞活化的物质的筛选方法
Xiao et al. IL‐17 drives salivary gland dysfunction via inhibiting TRPC1‐mediated calcium movement in Sjögren’s syndrome
JPWO2016002827A1 (ja) 進行型免疫性脱髄疾患治療剤
US20210230282A1 (en) Prophylactic agent, onset-suppressing agent or therapeutic agent for progressive immune demyelinating diseases
Fox et al. Final results of a placebo controlled, Phase 2 multicenter study of ublituximab (UTX), a novel glycoengineered anti-CD20 monoclonal antibody (mAb), in patients with relapsing forms of multiple sclerosis (RMS)
CN101466735A (zh) 多发性硬化和/或类风湿性关节炎的治疗
AU2011291450B2 (en) TAM receptors and TAM receptor ligands in detection and modulation of neuropathological disease
TW201823471A (zh) 以視黃酸受體-α促效劑及抗CD38抗體治療病患之方法
Maślanka Effect of dexamethasone and meloxicam on counts of selected T lymphocyte subpopulations and NK cells in cattle–In vivo investigations
EP2170394A1 (en) Regulatory t cells in adipose tissue
KR20220041934A (ko) 개선된 기능을 갖는 치료용 면역 세포 및 이의 제조 방법
US20230002732A1 (en) Natural killer cells
Fazazi et al. Myelin-reactive B cells exacerbate the severity of CD4+ T cell-driven CNS autoimmunity in an IL-23-dependent manner

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant