CN109954000B - 驴乳在制备食品或者药物中的用途、治疗溃疡性结肠炎的食品和药物 - Google Patents

Abstract

本发明提出了驴乳在制备食品或者药物中的用途、治疗溃疡性结肠炎的食品和药物。所述食品或者药物适于治疗溃疡性结肠炎。本发明的含有驴乳的食品或者药物能够有效地治疗溃疡性结肠炎，为溃疡性结肠炎的治疗提供方向，同时为功能性驴乳产品的开发及功能成分提取提供理论支持。

Description

驴乳在制备食品或者药物中的用途、治疗溃疡性结肠炎的食 品和药物

技术领域

本发明涉及食品、医药领域。具体地，本发明涉及驴乳在制备食品或者药物中的用途、治疗溃疡性结肠炎的食品和药物。

背景技术

驴是人们比较熟悉的畜种之一，从公元前6000年开始，人们就开始驯养驴。中国是全球驴畜养量最多的国家，有1000万头以上，年产乳量超过33万吨。但由于驴多为肉用和役用，因此驴乳是作为驴产业的副产品而存在的。另外，驴乳营养价值的实际应用研究仍在起步阶段，其作为一种功能性乳品的深层次开发尚未完全开展，使得驴乳作为商品供应市场的份额很少，很难形成有一定规模的产业化生产。因此，目前驴乳实际加工量非常少，大量驴乳被浪费。那么，如何利用驴乳，发挥其营养价值，值得深入研究。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提出了驴乳在制备食品或者药物中的用途、治疗溃疡性结肠炎的食品和药物。本发明的含有驴乳的食品或者药物能够有效地治疗溃疡性结肠炎，为溃疡性结肠炎的治疗提供方向，同时为功能性驴乳产品的开发及功能成分提取提供理论支持。

为此，在本发明的一个方面，本发明提出了驴乳在制备食品或者药物中的用途。根据本发明的实施例，所述食品或者药物适于治疗溃疡性结肠炎。发明人创造性地发现，驴乳能够有效地治疗溃疡性结肠炎，为溃疡性结肠炎的缓解提供方向，同时为功能性驴乳产品的开发及功能成分提取提供理论支持。

根据本发明的实施例，上述驴乳在制备食品或者药物中的用途还可以具有下列附加技术特征：

根据本发明的实施例，所述驴乳适于降低体重下降速度以及腹泻、便血程度。由此，驴乳能够有效地治疗溃疡性结肠炎。

根据本发明的实施例，所述驴乳适于降低结肠缩短程度。由此，驴乳能够有效地治疗溃疡性结肠炎。

根据本发明的实施例，所述驴乳适于降低髓过氧化物酶的活性。由此，驴乳能够有效地治疗溃疡性结肠炎。

根据本发明的实施例，所述驴乳适于促进紧密连接相关蛋白的表达。由此，驴乳能够有效地治疗溃疡性结肠炎。

根据本发明的实施例，所述驴乳适于促进咬合蛋白的表达。由此，驴乳能够有效地治疗溃疡性结肠炎。

根据本发明的实施例，所述驴乳适于降低结肠组织损伤程度。由此，驴乳能够有效地治疗溃疡性结肠炎。

根据本发明的实施例，所述驴乳适于抑制成孔蛋白的表达。由此，驴乳能够有效地治疗溃疡性结肠炎。

根据本发明的实施例，所述驴乳适于抑制TNF-α的表达。由此，驴乳能够有效地治疗溃疡性结肠炎。

根据本发明的实施例，所述驴乳适于抑制IL-13的表达。由此，驴乳能够有效地治疗溃疡性结肠炎。

根据本发明的实施例，所述驴乳适于促进乳杆菌、毛螺菌、瘤胃球菌、拟普雷沃菌、普氏菌、棍杆菌以及梭菌至少之一增殖，抑制埃希氏杆菌、伯克氏菌、柠檬酸菌和紫单胞菌至少之一增殖。由此，驴乳能够有效地治疗溃疡性结肠炎。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种治疗溃疡性结肠炎的食品。根据本发明的实施例，所述食品中含有驴乳。发明人创造性地发现，驴乳能够有效地治疗溃疡性结肠炎，为溃疡性结肠炎的缓解提供方向，同时为功能性驴乳食品的开发提供理论支持。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种治疗溃疡性结肠炎的药物。根据本发明的实施例，所述药物中含有驴乳。发明人创造性地发现，驴乳能够有效地治疗溃疡性结肠炎，为溃疡性结肠炎的缓解提供方向，同时为含驴乳的药物开发提供理论支持。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的各组小鼠造模后体重变化情况；

图2显示了根据本发明一个实施例的各组结肠炎小鼠DAI评分变化；

图3显示了根据本发明一个实施例的各组小鼠结肠形态和长度；

图4显示了根据本发明一个实施例的各组小鼠组织损伤情况，(A)正常组HE染色切片100×；(B)生理盐水组HE染色切片100×；(C)牛乳组HE染色切片100×；(D)驴乳组HE染色切片100×；(E)驴乳乳清蛋白组HE染色切片100×；(F)各组小鼠组织损伤评分；

图5显示了根据本发明一个实施例的各组小鼠MPO活性；

图6显示了根据本发明一个实施例的各组小鼠Claudin2表达量；

图7显示了根据本发明一个实施例的各组小鼠TNF-α表达量对比；

图8显示了根据本发明另一个实施例的各组小鼠造模后每日体重；

图9显示了根据本发明另一个实施例的各组结肠炎小鼠DAI评分变化；

图10显示了根据本发明另一个实施例的各组小鼠结肠形态和长度；

图11显示了根据本发明另一个实施例的各组小鼠组织损伤情况，(A)生理盐水组HE染色切片100×；(B)乳白乳球组HE染色切片100×；(C)5％溶菌酶组HE染色切片100×；(D)20％溶菌酶组HE染色切片100×；(E)50％溶菌酶组HE染色切片100×；(F)正常组；(G)各组小鼠组织损伤评分；

图12显示了根据本发明另一个实施例的各组小鼠MPO活性；

图13显示了根据本发明一个实施例的不同处理组小鼠肠道菌群α多样性比较；

图14显示了根据本发明一个实施例的不同处理组小鼠肠道菌群组成PCOA分析；

图15显示了根据本发明一个实施例的不同处理组小鼠肠道菌群组成差异分析；以及

图16显示了根据本发明一个实施例的不同处理组小鼠肠道菌群组成差异对比。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明提出了驴乳在制备食品或者药物中的用途、治疗溃疡性结肠炎的食品和药物。下面将分别对其进行详细描述。

驴乳在制备食品或者药物中的用途

在本发明的一个方面，本发明提出了驴乳在制备食品或者药物中的用途。根据本发明的实施例，食品或者药物适于治疗溃疡性结肠炎。发明人创造性地发现，驴乳能够有效地治疗溃疡性结肠炎，为溃疡性结肠炎的缓解提供方向，同时为功能性驴乳产品的开发及功能成分提取提供理论支持。

根据本发明的实施例，所述驴乳适于降低体重下降速度以及腹泻、便血程度。患有溃疡性结肠炎的动物(如人、小鼠等)体重会有所降低，且伴随出现腹泻、便血症状。进而，发明人通过使患病者食用或者给药驴乳，能够显著降低体重下降速度，减轻腹泻和便血症状。进而，表明驴乳能够有效地治疗溃疡性结肠炎。

根据本发明的实施例，驴乳适于降低结肠缩短程度。正常动物的肠道组织完好、肠壁紧实有韧性、肠腔内粪便成形。然而，患有溃疡性结肠炎的动物肠壁脆弱易断，肠腔内可见不成形便，部分小鼠肠腔内可见血便。进而，发明人使患病者食用或者给药驴乳后，发现患病动物肠壁不易断，肠腔内可见稀便或成型粪便，偶见血便，形态接近正常组。进而，表明驴乳能够有效地治疗溃疡性结肠炎。

根据本发明的实施例，驴乳适于降低髓过氧化物酶的活性。中性粒细胞中存在有髓过氧化物酶(MPO)，每个细胞所含的酶的量是一定的，MPO具有使过氧化氢还原的能力。因此，通过测定MPO含量，间接地反应了中性粒细胞的数目和炎症程度。相比于正常动物，溃疡性结肠炎患病者的髓过氧化物酶活性较高。进而，发明人使患病者食用或者给药驴乳后，发现髓过氧化物酶的活性显著降低，从而表明驴乳可以通过降低髓过氧化物酶的活性，起到治疗溃疡性结肠炎的效果。

根据本发明的实施例，驴乳适于促进紧密连接相关蛋白的表达。

根据本发明的实施例，驴乳适于促进咬合蛋白的表达。

咬合蛋白(Occludin)又称闭合蛋白或跨膜蛋白，包含两个细胞外环和四个跨膜区域，负责细胞骨架的形成和调控，直接参与细胞紧密连接的构成。紧密连接相关蛋白(ZO-1)又称紧密连接相关蛋白或胞质附着蛋白，位于多种上皮细胞和内皮细胞间的闭锁小带中，在胞质内有多个结合位点。Occludin与ZO-1相互作用，将跨膜蛋白和细胞骨架连接在一起，构成细胞紧密连接。进而，发明人使患病者食用或者给药驴乳后，发现咬合蛋白与紧密连接相关蛋白的表达量显著升高。由此，表明驴乳可以通过促进咬合蛋白与紧密连接相关蛋白的表达，增加肠道紧密性，起到治疗溃疡性结肠炎的效果。

根据本发明的实施例，驴乳适于降低结肠组织损伤程度。由此，驴乳能够有效地治疗溃疡性结肠炎。

根据本发明的实施例，驴乳适于抑制成孔蛋白的表达。成孔蛋白(Claudin2)能在上皮细胞间形成疏水通道，降低上皮电阻。进而，发明人使患病者食用或者给药驴乳后，发现成孔蛋白表达量显著降低。由此，表明驴乳可以通过下调Claudin2表达，降低肠道通透性，以加强肠道机械屏障，使肠道抗性增强，对有害物质的抵抗能力增强。进而起到治疗溃疡性结肠炎的效果。

根据本发明的实施例，驴乳适于抑制TNF-α的表达。TNF-α能够减少Occludin蛋白的表达，导致肠道上皮通透性增加，正负离子及大分子无选择性渗透增加。进而，发明人使患病者食用或者给药驴乳后，发现TNF-α的表达量显著降低，表明驴乳通过抑制TNF-α的表达，促进Occludin蛋白的表达，从而使得肠道上皮通透性降低，以加强肠道机械屏障，使肠道抗性增强，对有害物质的抵抗能力增强。进而起到治疗溃疡性结肠炎的效果。

根据本发明的实施例，驴乳适于抑制IL-13的表达。IL-13能够促进Claudin2蛋白的表达，显著增加肠道渗透性，特别是对钠离子等正离子。进而，发明人使患病者食用或者给药驴乳后，发现IL-13的表达量显著降低，同时Claudin2蛋白的表达量也显著降低。由此，表明驴乳通过抑制IL-13的表达，从而抑制Claudin2蛋白，导致肠道渗透性降低，以加强肠道机械屏障，使肠道抗性增强，对有害物质的抵抗能力增强。进而起到治疗溃疡性结肠炎的效果。

根据本发明的实施例，驴乳适于促进乳杆菌、毛螺菌、瘤胃球菌、拟普雷沃菌、普氏菌、棍杆菌以及梭菌至少之一增殖，抑制埃希氏杆菌、伯克氏菌、柠檬酸菌和紫单胞菌至少之一增殖。发明人发现，驴乳能够显著调节肠道菌群，从而起到治疗溃疡性结肠炎的效果。

本发明所使用的术语“治疗”用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病(例如预防溃疡性结肠炎)或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述驴乳的药物给药至有需要的个体。

在本文中所使用的术语“给药”指将预定量的物质通过某种适合的方式引入病人。本发明的药物以通过任何常见的途径被给药，只要它可以到达预期的组织。给药的各种方式是可以预期的，包括腹膜，静脉，肌肉，皮下，皮层，口服，局部，鼻腔和直肠，但是本发明不限于这些已举例的给药方式。

本发明药物的给药频率和剂量可以通过多个相关因素被确定，该因素包括要被治疗的疾病类型，给药途径，病人年龄，性别，体重和疾病的严重程度以及作为活性成分的药物类型。根据本发明的一些实施例，日剂量可分为适宜形式的1剂、2剂或多剂，以在整个时间段内以1次、2次或多次给药，只要达到治疗有效量即可。

术语“治疗有效量”是指化合物足以显著改善某些与疾病或病症相关的症状的量，也即为给定病症和给药方案提供治疗效果的量。例如，在溃疡性结肠炎中，减少、预防、延缓、抑制或阻滞疾病或病症的任何症状的药物或化合物应当是治疗有效的。治疗有效量的药物或化合物不需要治愈疾病或病症，但将为疾病或病症提供治疗，使得个体的疾病或病症的发作被延缓、阻止或预防，或者疾病或病症的症状得以缓解，或者疾病或病症的期限被改变，或者例如疾病或病症变得不严重，或者加速康复。

治疗溃疡性结肠炎的食品

在本发明的另一方面，本发明提出了一种治疗溃疡性结肠炎的食品。根据本发明的实施例，食品中含有驴乳。发明人创造性地发现，驴乳能够有效地治疗溃疡性结肠炎，为溃疡性结肠炎的缓解提供方向，同时为功能性驴乳食品的开发提供理论支持。

需要说明的是，本发明的食品中既可以仅含有驴乳，例如通过对生驴乳进行加工(如杀菌)，制成符合食品安全的驴乳；也可以含有一些提高风味口感、稳定性、营养价值等的可接受组分。“可接受组分”是指当给人食用时生理上可耐受的并且一般不产生过敏或相似不适当的反应，例如肠胃不适、眩晕等的分子实体和组合物。

药物

在本发明的另一方面，本发明提出了一种治疗溃疡性结肠炎的药物。根据本发明的实施例，药物中含有驴乳。发明人创造性地发现，驴乳能够有效地治疗溃疡性结肠炎，为溃疡性结肠炎的缓解提供方向，同时为含驴乳的药物开发提供理论支持。

本发明的药物还可以进一步包括药学上可接受的赋形剂，载体，辅剂，溶媒或它们的组合。术语“药学上可接受的”是指当给人施用时生理上可耐受的并且一般不产生过敏或相似不适当的反应，例如肠胃不适、眩晕等的分子实体和组合物。优选地，本文所用的术语“药学上可接受的”是指联邦监管机构或国家政府批准的或美国药典或其他一般认可的药典上列举的在动物中、更特别在人体中使用的。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

右旋葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导BALB/C小鼠溃疡性结肠炎的动物模型是目前研究溃疡性结肠炎发病机制和药物治疗效果的较理想的模型。本实施例中通过建立DSS诱导模型研究溃疡性结肠炎的发病机制和药物治疗效果。

将50只6周龄雄性Balb/c小鼠随机分成5组，正常组、模型组、驴乳喂养组、牛乳喂养组及驴乳清蛋白喂养组，每组10只，均给予无菌水和小鼠维持饲料。适应性喂养5天后，给正常组和模型组小鼠灌胃0.9％生理盐水，给驴乳组、牛乳组、驴乳乳清蛋白组分别灌胃浓缩驴乳、浓缩牛乳、现配驴乳乳清蛋白溶液，每只灌胃0.3mL，共灌胃21天。灌胃14天后，正常组继续饮用无菌水，模型组、驴乳喂养组、牛乳喂养组、驴乳乳清蛋白喂养组饮用3％DSS溶液，造小鼠溃疡性结肠炎模型。造模期间，每天记录小鼠体重变化、摄食量变化、大便性状及便血情况。造模7天，即灌胃21天后处死，保留所需组织样品，进行后续检测。

1、造模小鼠体重变化情况

结果如图1所示。体重变化率表示小鼠体重变化程度，研究结果表明3％DSS造模结束后，造模组与正常组小鼠相比，体重均出现不同程度的降低，变化明显(P<0.05)。其中在造模组各组中，生理盐水组和牛乳组体重下降最剧烈，二者间无显著性差异(P>0.05)约为6.3％和6.2％，驴乳组和驴乳清蛋白组小鼠体重下降较缓，且无显著性差异(P>0.05)约为2.4％和3.3％，与牛乳组和生理盐水组相比体重下降程度显著降低(P>0.05)。正常组小鼠体重正常波动，整体呈现体重上升趋势，约上升3.9％。

2、造模小鼠疾病活动指数(DAI)

结果如图2所示，造模结束后，记录小鼠体重减轻程度、大便性状以及便血状况，并根据评分标准对小鼠进行疾病活动指数(DAI)评分(根据Hamamoto等(Inhibition ofdextran sulphate sodium(DSS)-induced colitis in mice by intracolonicallyadministered antibodies against adhesion molecules(endothelial leucocyteadhesion molecule-1(ELAM-1)or intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1)))的方法进行评分，再将小鼠体重变化、大便性状及便血情况的评分相加后除以3，即为小鼠疾病活动指数(DAI))。正常小鼠DAI评分为0.50±0.18，造模组DAI评分均显著高于正常小鼠(P<0.05)，说明造模成功，小鼠均出现炎症反应。其中具体表现为，生理盐水组和牛乳组评分分别为3.33±0.50和3.05±0.49，二者没有显著性差异(P>0.05)。驴乳组DAI评分为1.57±0.57，驴乳乳清蛋白组DAI评分为1.93±0.36，二者没有显著性差异(P>0.05)，且均显著低于生理盐水组和牛乳组，说明口服驴乳和驴乳乳清蛋白可以显著缓解DSS诱导的溃疡性结肠炎的疾病症状。

3、造模小鼠结肠长度变化

如图3所示，造模结束后处死小鼠，并取结肠后拍照记录各组小鼠结肠形态和长度。正常组小鼠结肠长度为9.93±0.38cm，且肠道组织完好、肠壁紧实有韧性、肠腔内粪便成形；造模组中生理盐水组与牛乳组结肠长度无显著性差异(P>0.05)，分别为6.17±0.83cm和6.34±0.79cm，显著低于正常组小鼠(P<0.05)，且肠壁脆弱易断，肠腔内可见不成形便，部分小鼠肠腔内可见血便；驴乳组和驴乳乳清蛋白组小鼠结肠长度无显著性差异，分别为7.63±0.68cm和7.19±0.64cm，显著低于正常组小鼠，但显著高于生理盐水组和牛乳组(P<0.05)，且肠壁不易断，肠腔内可见稀便或成型粪便，偶见血便，形态接近正常组。

4、小鼠结肠组织损伤情况

结果如图4所示。造模完成后，处死小鼠，取小鼠结肠肠段组织制成切片进行HE染色，在显微镜下观察，并进行组织病理学评分。发现：正常组小鼠结肠隐窝结构清晰、完整，排列整齐紧密，未见溃疡弥散情况，其组织病理学评分为1.14±0.41，显著低于造模组各组(P<0.05)。造模组中，生理盐水组和牛乳组组织损伤明显，病变范围大于80％，部分小鼠结肠病变范围达到100％，全部隐窝受损，失去原有形状，溃烂呈弥散状，病变深度达整个黏膜层，部分累及黏膜下层，组织病理学评分分别为11.57±0.51和11.00±1.67；驴乳乳清蛋白组小鼠结肠组织损伤轻于生理盐水组和牛乳组，隐窝勉强可辨认出原有形状，组织损伤评分为4.86±1.26；驴乳组组织损伤最轻，接近正常组小鼠组织形态，隐窝仍可以保持原有形状，组织损伤评分为3.86±0.82，显著低于生理盐水组和牛乳组(P<0.05)。

5、髓过氧化物酶(MPO)活性

结果见图5所示。正常组小鼠结肠组织MPO活性最低为0.85±0.12U/g，显著低于造模组各组；造模组中生理盐水组和牛乳组髓过氧化物酶活性分别为2.76±0.23U/g和2.60±0.22U/g，无显著性差异(P>0.05)；驴乳组和驴乳乳清蛋白组髓过氧化物酶活性分别为1.38±0.36U/g和1.62±0.41U/g，此二者无显著性差异(P>0.05)，但显著高于正常组，显著低于生理盐水组和牛乳组(P<0.05)。中性粒细胞中存在有MPO，每个细胞所含的酶的量是一定的，MPO具有使过氧化氢还原的能力。因此，通过测定MPO活性，间接地反映了中性粒细胞的数目和炎症程度。

6、Claudin2表达量

结果如图6所示。造模结束后，取小鼠结肠组织，检测Claudin2的表达。发现正常组小鼠Claudin2表达量为0.65±0.09ng/mg，显著低于造模组各组(P<0.05)；造模组各组中，生理盐水组和牛乳组Claudin2表达量上升最剧烈，分别为2.56±0.29ng/mg和2.32±0.16ng/mg，二者没有显著性差异(P>0.05)；驴乳组和驴乳乳清蛋白组Claudin2表达量分别为1.31±0.22ng/mg和1.61±0.22ng/mg，其表达量显著高于正常组，但显著低于生理盐水组和牛乳组(P<0.05)。

7、TNF-α表达量

结果图7所示。造模结束后，取小鼠结肠组织，检测TNF-α的表达，发现正常组小鼠TNF-α表达量为0.18±0.02ng/mg，显著低于造模组各组(P<0.05)；造模组各组中，生理盐水组和牛乳组TNF-α表达量上升最剧烈，分别为0.39±0.03ng/mg和0.35±0.02ng/mg，二者没有显著性差异(P>0.05)；驴乳组和驴乳乳清蛋白组TNF-α表达量分别为0.22±0.02ng/mg和0.24±0.05ng/mg，其表达量显著高于正常组，但显著低于生理盐水组和牛乳组(P<0.05)。

小结：

DSS诱导溃疡性结肠炎后，灌胃驴乳、驴乳乳清蛋白、牛乳的小鼠与灌胃生理盐水组的小鼠相比，在体重降低程度上都有一定的缓解，其中驴乳组最为显著。此外，在小鼠精神状态、腹泻、便血方面也有一定程度的缓解。本研究用疾病活动指数(DAI)评分表示小鼠疾病严重程度，发现驴乳和驴乳乳清蛋白组的小鼠患病程度明显低于生理盐水和牛乳灌胃的小鼠(P<0.05)。造模结束后，取各组小鼠结肠，发现驴乳和驴乳乳清蛋白组小鼠结肠缩短程度明显低于生理盐水与牛乳组(P<0.05)。取小鼠结肠组织检测其髓过氧化物酶(MPO)活性、组织损伤以及相关蛋白表达都发现灌胃驴乳和驴乳乳清蛋白的小鼠表现优于灌胃生理盐水和牛乳的小鼠，且有显著性差异(P<0.05)。

取灌胃两周后，造模之前的小鼠结肠组织，检测成孔蛋白Claudin2和炎症因子TNF-α的表达，发现灌胃驴乳和驴乳乳清蛋白的小鼠较灌胃生理盐水和牛乳的小鼠相比，Claudin2和TNF-α的表达水平均有所下调，说明口服驴乳可以调节正常小鼠的免疫，增加肠屏障紧密性。同时以上研究我们发现，灌胃驴乳乳清蛋白的效果与灌胃驴乳的效果无显著性差异(P>0.05)，因此也说明，驴乳中对缓解溃疡性结肠炎发挥主要作用的物质在乳清蛋白中。

实施例2

发明人发现，驴乳和牛乳的乳清蛋白中溶菌酶的含量差别较大，其中驴乳中溶菌酶含量较多。进而，发明人推测是溶菌酶起到缓解溃疡性结肠炎的效果。为了明确驴乳中的活性成分是否为溶菌酶，发明人采用采取等电点沉淀的方法富集驴乳中的溶菌酶，得到溶菌酶含量为50％的蛋白混合物并检测活性，之后配制成溶菌酶含量为0％、5％、20％及50％的蛋白溶液灌胃小鼠并诱导溃疡性结肠炎。具体结果如下：

1、造模小鼠体重变化情况

如图8所示，体重变化率表示小鼠体重变化程度，研究结果表明3％DSS造模结束后，造模组各组小鼠与正常组相比体重均发生不同程度的降低，变化显著(P<0.05)，其中灌胃生理盐水和乳白乳球蛋白的两组小鼠体重减轻最明显且无显著性差异(P>0.05)，约下降11.8％和11.5％，其余各组较生理盐水组都有不同程度的缓解，并且随着溶菌酶含量的增加，体重减轻程度逐渐变显著(P<0.05)：5％溶菌酶组约下降7.4％，20％溶菌酶组约下降6.4％，50％溶菌酶组小鼠体重下降最缓，约为5.9％。正常组小鼠体重整体呈现体重上升趋势，约上升3.9％。

2、造模小鼠疾病活动指数(DAI)

如图9所示，造模结束后，记录各组小鼠体重减轻程度、大便性状以及便血状况，并根据评分标准对小鼠进行疾病活动指数(DAI)评分。正常小鼠DAI评分为0.57±0.25，造模组DAI评分均显著高于正常小鼠(P<0.05)，说明造模成功，小鼠均出现炎症反应。其中具体表现为，生理盐水组和乳白乳球组评分分别为3.57±0.25和3.33±0.23，二者没有显著性差异(P>0.05)；50％溶菌酶组DAI评分最低，为1.79±0.75，显著高于正常组但显著低于生理盐水组和乳白乳球组(P<0.05)；20％溶菌酶组DAI评分低于5％溶菌酶组(P>0.05)，显著低于生理盐水组和乳白乳球组(P<0.05)，高于50％溶菌酶组。

3、造模小鼠结肠长度变化

如图10所示，造模结束后处死小鼠，并取结肠后拍照记录各组小鼠结肠形态和长度，发现正常组小鼠结肠长度为9.18±0.53cm，显著高于造模组各组(P<0.05)，且肠道组织完好、肠壁紧实有韧性、肠腔内粪便成形；造模组中生理盐水组与乳白乳球组结肠长度无显著性差异(P>0.05)，分别为5.53±1.13cm和5.71±1.29cm，显著低于20％溶菌酶组(7.17±1.25cm)和50％溶菌酶组(7.85±1.09cm)(P<0.05)；5％溶菌酶结肠长度为6.19±1.19cm，低于20％溶菌酶组，高于生理盐水组与乳白乳球组(P>0.05)，显著低于50％溶菌酶组(P<0.05)。

4、小鼠结肠组织损伤情况

如图11所示，造模完成后，处死小鼠，取小鼠结肠肠段组织制成切片进行HE染色，在显微镜下观察发现：正常组小鼠结肠隐窝结构清晰、完整，排列整齐紧密，未见溃疡弥散情况，其组织病理学评分为1.25±0.46，显著低于造模组各组(P<0.05)。造模组中，生理盐水组和乳白乳球组织损伤明显，病变范围大于80％，部分小鼠结肠病变范围达到100％，全部隐窝受损，波及上表皮，隐窝失去原有形状，溃烂呈弥散状，病变深度达整个黏膜层，部分累及黏膜下层，组织病理学评分分别为11.37±1.30和11.64±1.64，显著高于溶菌酶各组(P<0.05)；溶菌酶处理组中，5％溶菌酶组织病理学评分为7.88±1.25，显著低于生理盐水与乳白乳球组(P<0.05)，隐窝弥散程度低于也低于该两组，具有完整的上表皮，病变范围缩小；20％溶解和50％溶菌酶组组织病理学评分分别为4.88±1.73和3.63±0.92，该两组之间无显著性差异(P>0.05)，显著高于造模组其余各组。20％溶菌酶组可辨别出隐窝具体形状，结肠内病变范围小于5％溶菌酶组，炎症症状减轻；50％溶菌酶组可明显分辨出隐窝形状，与正常组形态相似。

5、髓过氧化物酶(MPO)活性测定

如图12所示，中性粒细胞中存在有MPO，每个细胞所含的酶的量是一定的，MPO具有使过氧化氢还原的能力。因此，通过测定MPO含量，间接地反应了中性粒细胞的数目和炎症程度。正常组小鼠结肠组织MPO活性最低为0.92±0.16U/g，显著低于造模组各组(P<0.05)；造模组中，生理盐水组与乳白乳球组髓过氧化物酶活性分别为2.87±0.15U/g和2.79±0.17U/g，二者没有显著性差异(P>0.05)；20％溶菌酶和50％溶菌酶髓过氧化物酶活性分别为1.61±0.18U/g和1.36±0.22U/g，二者无显著性差异(P>0.05)，但显著低于生理盐水组与乳白乳球组(P<0.05)；5％溶菌酶组髓过氧化物酶活性为2.06±0.28U/g，显著高于20％溶菌酶组和50％溶菌酶组，显著低于生理盐水组与乳白乳球组(P<0.05)。

小结：

Balb/c小鼠自由饮用3％DSS，第三四天左右，体重下降、腹泻、便血等症状，第7天时，症状最为严重。解剖后发现造模组小鼠结肠长度明显短于正常组小鼠(P<0.05)，且肠壁变薄，肠腔内可见不成形便，部分小鼠肠腔内有暗红色血便。HE染色后在显微镜下观察可见结肠内部大面积溃疡，隐窝破坏呈弥散状，固有层受损，大量炎症细胞浸润，呈现明显的急性溃疡性结肠炎症状，表明造模成功。

造模期间观察小鼠状态，发现不同物质灌胃的小鼠其毛发散乱、精神不振、懒动、体重减轻、腹泻及便血程度不同。根据疾病活动指数(DAI)评分对不同组小鼠患病严重程度进行比较分析，发现灌胃物质中含有溶菌酶的小鼠的疾病反应普遍低于灌胃物质中不含溶菌酶的小鼠，且对疾病反应的缓解作用随体系中溶菌酶含量的升高而加强，不含溶菌酶的蛋白溶液与生理盐水在疾病反应的缓解效果上无显著性差异(P>0.05)。造模结束后，取各组小鼠结肠，发现灌胃物质中含有溶菌酶的各组小鼠其结肠缩短程度明显低于生理盐水与溶菌酶含量为0的蛋白溶液(P<0.05)。取小鼠结肠组织检测其髓过氧化物酶(MPO)活性，分析小鼠结肠组织损伤并评分，发现一定范围内，随着体系中溶菌酶含量的不断增加，体系对小鼠溃疡性结肠炎的缓解作用逐渐增强，且与不含溶菌酶的各组有显著性差异(P<0.05)。

本实施例结果表明驴乳溶菌酶对小鼠溃疡性结肠炎确有缓解效果，其缓解效果随溶菌酶含量的增加而逐渐显著。此外，α-乳白蛋白和β-乳球蛋白对溃疡性结肠炎无明显缓解作用。

实施例3

在该实施例中，通过检测服用溶菌酶后小鼠结肠紧密连接蛋白表达量、炎症因子表达量、肠道菌群组成等的变化，探究溶菌酶缓解小鼠溃疡性结肠炎的作用机制。具体结果如下：

1、紧密连接蛋白表达(Occludin，ZO-1，Claudin2)

结果如表1所示。造模结束后，取小鼠结肠组织，检测紧密连接蛋白Occludin，ZO-1，Claudin2等的表达，发现，Occludin和ZO-1在正常组小鼠中表达显著高于造模组各组，Claudin2在正常组小鼠中的表达显著低于造模组各组(P<0.05)。在造模组各组中，生理盐水组和乳白乳球组在三种紧密连接蛋白的表达上无显著性差异(P>0.05)；与溶菌酶处理组相比，发现溶菌酶的存在可以促进紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的表达，抑制Claudin2的表达，并且随着溶菌酶含量的增加，促进/抑制效果增强，其中20％溶菌酶组和50％溶菌酶组中Occludin和ZO-1的表达量显著高于生理盐水组和乳白乳球组，Claudin2的表达量显著低于生理盐水组和乳白乳球组(P<0.05)。

表1各组紧密连接蛋白表达变化(ng/mg)

分组	Occludin	ZO-1	Claudin2
				正常组	18.23±1.38<sup>c</sup>	9.76±0.94<sup>d</sup>	0.68±0.18<sup>a</sup>
生理盐水组	8.53±1.40<sup>a</sup>	3.51±0.54<sup>a</sup>	2.33±0.47<sup>d</sup>
				乳白乳球组	8.86±1.13<sup>a</sup>	3.64±1.03<sup>a</sup>	2.20±0.57<sup>cd</sup>
5％溶菌酶组	10.14±1.57<sup>a</sup>	5.58±1.00<sup>b</sup>	1.63±0.39<sup>bc</sup>
				20％溶菌酶组	13.18±1.26<sup>b</sup>	6.66±0.92<sup>bc</sup>	1.30±0.30<sup>b</sup>
50％溶菌酶组	14.44±2.55<sup>b</sup>	7.52±1.02<sup>c</sup>	1.05±0.32<sup>b</sup>

注：不同字母表示组间有显著性差异(P<0.05)。

2、炎症因子表达(TNF-α、IL-13)

结果如表2所示。造模结束后，取小鼠结肠组织，检测TNF-α、IL-13等炎症因子的表达，发现正常组小鼠TNF-α、IL-13表达量均显著低于造模组中生理盐水组和乳白乳球组(P<0.05)，与50％溶菌酶组无显著性差异(P>0.05)；生理盐水组和乳白乳球组在TNF-α、IL-13两种因子的表达上无显著性差异(P>0.05)；溶菌酶组各组均对TNF-α、IL-13两个因子的表达有下调作用，并对溶菌酶含量的升高，下调作用增强，其中20％溶菌酶组和50％溶菌酶组中TNF-α、IL-13的表达量较生理盐水组和乳白乳球组显著降低(P<0.05)。

表2各组炎症因子表达量变化(ng/mg)

注：不同字母表示组间有显著性差异(P<0.05)。

3、不同处理组肠道菌群差异性检测

(1)菌群多样性分析

如图13所示，对不同处理组的小鼠结肠内容物进行高通过量测序分析其肠道菌群，ace指数表明肠道菌群多样性，其数值越大说明菌群多样性程度越高。发现3％DSS造模组小鼠菌群多样性显著低于正常组小鼠(P<0.05)；在造模组三组中，灌胃生理盐水与灌胃溶菌酶含量为0％的溶液的小鼠在菌群多样性上无显著性差异(P>0.05)且均显著低于灌胃50％溶菌酶的小鼠(P<0.05)。说明溶菌酶可以缓解DSS诱导的溃疡性结肠炎所造成的菌群多样性减少。

(2)溶菌酶对小鼠肠道菌群组成的影响

如图14所示，比较了生理盐水组、0％溶菌酶组、50％溶菌酶组和正常组小鼠的肠道菌群组成，PC1和PC2分别解释了总变异的51.55％和16.23％。由该图可以看出，造模后，造模组各组小鼠肠道菌群组成与正常组小鼠相比，存在较大差异，说明DSS诱导小鼠溃疡性结肠炎能明显改变小鼠肠道菌群组成。此外，0％溶菌酶组与生理盐水组小鼠在肠道菌群组成上差异不大，而50％溶菌酶组小鼠肠道菌群组成与这两组相比有较大变化，说明溶菌酶对小鼠肠道菌群组成有影响。

如图15所示，显示属水平上，不同处理组中相对丰度>1％的各菌属。具体分析各菌属占比变化，正常组小鼠中拟杆菌S24-7(Bacteroidales_S24-7)为优势菌，约占41.6％，而造模组各组小鼠拟杆菌S24-7比例较正常组显著下降，罗氏菌(Roseburia)含量为3.4％，而在造模组各组中罗氏菌含量<1％；埃希氏杆菌(Escherichia-Shigella)、伯克氏菌(Blautia)、柠檬酸菌(Citrobacter)、紫单胞菌(Parabacteroides)在正常组和50％溶菌酶组中相对丰度低于1％，而在生理盐水和0％溶菌每组中埃希氏杆菌分别占16.1％和16.3％、伯克氏菌属分别占11.8％和10.0％、柠檬酸菌分别占2.3％和1.2％、紫单胞杆菌属分别占5.9％和1.5％，显著高于正常组和50％溶菌酶组；拟普雷沃菌(Alloprevotella)在正常组和50％溶菌酶小鼠肠道菌群中分别占7.2％和4.4％、棍杆菌(Alistipes)分别占3.3％和2.9％、普氏菌_UCG-001(Prevotellaceae_UCG-001)分别占4.8％和2.0％、瘤胃球菌_UCG-014(Ruminococcaceaae_UCG-014)分别占2.9％和3.6％、梭菌_vadinBB60(Clostridiales_vadinBB60)分别占3.2％和2.5％，而在生理盐水组和0％溶菌每组中，这些菌所占比例显著减少；此外，毛螺菌_NK4A136(Lachnospiraceae_NK4A136)、瘤胃球菌_UCG-014、、乳杆菌等所占比例在50％溶菌酶组小鼠中含量有所上升，其中毛螺菌_NK4A136、乳杆菌(Lactobacillus)变化较显著。

(3)溶菌酶对小鼠肠道菌相对丰度的影响

如图16所示，对不同物质喂养的小鼠结肠内容物进行高通量测序，检测其菌群种类，在菌群属水平上进行对比分析，组间聚类树表明生理盐水组小鼠和0％溶菌酶组小鼠在肠道菌群组成上与50％溶菌酶组和正常组小鼠间存在差异，而生理盐水组小鼠与0％溶菌酶组小鼠在菌群组成上相似，50％溶菌酶组小鼠与正常小鼠在肠道菌群组成上相似。

肠道菌群热图显示的为，在属水平上，群落中相对丰度前20位的菌属。具体分析不同喂养组小鼠肠道菌群组成差异，发现造模组中灌胃生理盐水与灌胃0％溶菌酶溶液与灌胃50％溶菌酶溶液和正常组小鼠相比，肠道中的厌氧菌比例减少，兼性厌氧菌比例增多。具体表现为与正常组相比，生理盐水和0％溶菌酶组埃希氏-志贺氏菌、伯克氏菌属和柠檬酸杆菌显著多于50％溶菌酶组和正常组；拟普雷沃菌属和普氏菌_UCG-001显著低于50％溶菌酶组和正常组；此外，50％溶菌酶组中乳酸杆菌和毛螺菌_NK4A136略高于其余各组。

小结：

实验取各组小鼠结肠组织，检测肠道紧密连接蛋白和炎症因子等蛋白的表达，发现随溶菌酶含量的增加，紧密连接蛋白Occludin、ZO-1等因子表达量上升，紧密连接蛋白Claudin2、TNF-α、IL-13等因子的表达量下降，且变化存在剂量关系。因此，溶菌酶通过上调Occludin和ZO-1的表达，增加肠道紧密性，下调Claudin2表达，降低肠道通透性，以此加强肠道机械屏障，使肠道抗性增强，对有害物质的抵抗能力增强。此外，溶菌酶还可以调节免疫。由于炎症因子的表达与紧密连接蛋白的表达相关，由此可以推断溶菌酶对肠道紧密连接蛋白的调节作用可能是通过调节免疫来实现的。

对比生理盐水组、0％溶菌酶组、50％溶菌酶组和正常组小鼠结肠内肠道菌群多样性，发现正常组小鼠肠道内菌群多样性显著高于其余三组，生理盐水组和0％溶菌酶组肠道菌群多样性最差，二者无显著性区别，且均低于50％溶菌酶组。从属水平上分析四组肠道菌群的组成，发现与生理盐水组和0％溶菌酶组相比，50％溶菌酶组小鼠肠道菌群组成更接近正常小鼠(菌群组成越接近相交越早)，生理盐水组和0％溶菌酶组小鼠菌群组成差异不大，说明溃疡性结肠炎的发生会导致肠道菌群失调，而溶菌酶可以缓解这种菌群失调。具体分析发现，与正常组相比，生理盐水组、0％溶菌酶组和50％溶菌酶组小鼠肠道菌群中厌氧菌有所减少，兼性厌氧菌增多，此现象在生理盐水组和0％溶菌酶组中表现尤其明显。其中，拟杆菌_S24-7在正常组中为优势菌，在造模组三组中均有所减少，有文章表明拟杆菌_S24-7与肠道炎症的缓解相关，其减少表明肠炎的发生。对比50％溶菌酶组与生理盐水组和0％溶菌酶组发现，生理盐水组和0％溶菌酶组中埃希氏杆菌、伯克氏菌属、柠檬酸菌、紫单胞杆菌属等较正常组比含量上升，拟普雷沃菌属、棍杆菌、普氏_UCG-001、瘤胃球菌_UCG-014等较正常组比含量下降，而在50％溶菌酶组中，瘤胃球菌_UCG-014有所上升，其余与正常组比例相近。除常见的埃希氏杆菌会引起肠道疾病外，伯克氏菌属、柠檬酸菌、紫单胞杆菌属也会对机体产生不良影响，有文献表明，伯克氏菌属为产乙酸菌，对肠道产生不良影响；紫单胞杆菌属是一种病原菌，增多时可引起腹膜炎、阑尾炎、腹腔脓肿等多种胃肠道疾病；柠檬酸菌为条件致病菌，在机体抵抗力差时可引起腹泻等多种感染。而拟普雷沃菌属为专性厌氧，有文献发现它可以抗氧化降低心血管疾病；棍杆菌被报道可以减缓肠道炎症，减少炎性肠病的发生；普氏菌_UCG-001可以促进免疫***的构建；瘤胃球菌_UCG-014有抗氧化和调节免疫的作用，其中部分种属可能与抗抑郁有关。此外，与其余各组相比，50％溶菌酶组小鼠肠道菌群中乳杆菌和毛螺菌_NK4A163所占比例显著增加，其中乳杆菌具有显著的益生效果，可以抑制病原菌的生长，改善肠道菌群结构，增强机体免疫功能，降低胆固醇、改善血脂等作用，有利于肠道健康和免疫平衡，它还可以促进毛螺菌_NK4A163增殖，毛螺菌_NK4A163为产丁酸菌，丁酸作为肠道膳食纤维由微生物发酵的主要终末产物之一，是肠上皮细胞重要能量来源，它维持肠道内稳态，在诸多方面如调节宿主的免疫应答与氧化应激反应、增强结肠黏膜的防御屏障与改善通透性等影响着溃疡性结肠炎的发生发展过程。因此，说明溶菌酶可以通过调节肠道菌群，促进有益菌增殖，减少有害菌增殖，增强肠粘膜防御屏障，减少溃疡性结肠炎的发生。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (1)

1.驴乳在制备药物中的用途，其特征在于，所述药物适于治疗溃疡性结肠炎，所述驴乳适于促进毛螺菌、瘤胃球菌、拟普雷沃菌、普氏菌、棍杆菌以及梭菌至少之一增殖，抑制伯克氏菌、柠檬酸菌和紫单胞菌至少之一增殖。

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