CN109943659B - 一种鉴定津研快绿1号小白菜种子纯度的引物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴定津研快绿1号小白菜种子纯度的SSR标记引物，它为SEQ ID NO:1‑2所示的核苷酸序列。本发明进一步公开了利用SSR标记引物鉴定津研快绿1号小白菜杂交种种子纯度的方法。本发明提供的特异性引物及方法，可以在实验室3‑5小时完成津研快绿1号杂交种的种子纯度鉴定，具有快速、稳定、不受环境影响等优点，能替代传统田间种子纯度鉴定方法，有利于津研快绿1号种子高效准确的质量控制。

Description

一种鉴定津研快绿1号小白菜种子纯度的引物及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及鉴定津研快绿1号小白菜种子纯度的SSR标记引物及应用。

背景技术

小白菜（Brassica rapa L. ssp. chinensis）属十字花科芸薹属，属于不结球白菜，其含有丰富的蛋白质、糖类、膳食纤维、胡萝卜素、维生素和钙、磷、铁等。与传统的大白菜相比，小白菜生长周期短，几乎一年四季都可种植、上市，其纤维含量少，质地柔嫩，味甘而清香，从幼苗到成株皆可食用，是我国栽培面积最大，分布最广的大众化蔬菜之一，在保证我国蔬菜供应中起重要作用。

优质品种是保证小白菜正常生产和供应的关键，种子纯度是品种优劣的重要判定标准。目前，一般采用小白菜自交不亲和材料生产杂交种，在制种过程中，存在母本材料偶尔自交、外来花粉混入或其他原因导致的杂交种纯度降低的现象，严重影响了种子的质量，给育种企业和农民造成了很大损失。所以，在种子销售之前都必须鉴定种子的纯度，以保证种子的质量。传统的种子纯度鉴定方法，采用在田间直接观察作物特定生长发育阶段的特性和一致性，存在周期较长、工作量大且易受环境影响等因素，经常与种子的销售旺季相冲突，造成种子库存积压。近年来，随着分子生物学的发展，基于 SSR、InDel等分子标记的检测技术，具有标记数目多、周期短、重复性高、不受环境影响等优点，在种子纯度鉴定方面的应用越来越广泛。

津研快绿1号是天津科润农业科技股份有限公司蔬菜研究所育成的小白菜品种之一，植株较直立，叶色浅绿，叶长倒卵形，叶全缘，无茸毛，高抗花叶病毒病和软腐病、抗霜霉病，耐热耐湿，生育期约30天，适宜夏、秋季种植及南方冬季种植。该品种之前一直采用田间直接观察生长性状的方法检测种子纯度，随着播种面积和种子需求量的增加，需要一种快速检测方法检测该品种的种子纯度。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测津研快绿1号小白菜杂交种种子纯度的引物序列及应用。为实现该目的，本发明采用以下技术方案：

一种鉴定津研快绿1号小白菜种子纯度的SSR标记引物，其特征在于它为SEQ IDNO:1-2所示的核苷酸序列：

TCCTCGAGTTTCGCTTCATATCCTG SEQ ID NO:1

AGTCTGGAAACTTACATGGAAGTAAAATACAAAAC SEQ ID NO:2。

本发明进一步公开了所述的SSR标记引物鉴定津研快绿1号小白菜杂交种的种子纯度的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）提取津研快绿1号杂交种待测样品的基因组DNA；

（2）以上述样品的基因组DNA为模板，以SSR标记引物为特异性引物进行PCR扩增；PCR反应采用10 µL体系包括：10×PCR Buffer，1.0 µL；2.5 mM dNTP，0.2 µL；10 µmol·L-1 primers，0.4 µL；5 U·µL-1 Taq，0.2 µL；50 ng·µL-1 DNA，1.5 µL；ddH2O，6.7 µL；PCR反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，57℃复性30 s，72℃延伸30 s，35 个循环；72℃终延伸 5 min；所述的SSR标记引物为：

TCCTCGAGTTTCGCTTCATATCCTG SEQ ID NO:1

AGTCTGGAAACTTACATGGAAGTAAAATACAAAAC SEQ ID NO:2；

（3）将上述PCR的扩增产物，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、银染；

（4）统计上述银染结果：所检测津研快绿1号杂交种纯度（%）=（检测种子总粒数-非杂交种粒数）/（检测种子总粒数）×100%。

本发明更进一步公开了上述鉴定方法在用于快速准确鉴定津研快绿1号小白菜种子纯度方面的应用。实验结果显示：本发明可以快速、准确地鉴定津研快绿1号小白菜种子的纯度。

本发明主要解决了津研快绿1号种子纯度传统田间鉴定方法用时长、易受环境影响等缺点，主要的难点在于开发津研快绿1号父本与母本间具有多态性、稳定性好、易区分的SSR分子标记引物。

本发明公开的鉴定津研快绿1号小白菜种子纯度的SSR标记引物与现有技术相比，所具有的积极效果在于：本发明提供的特异性引物及方法，可以在实验室3-5小时完成津研快绿1号杂交种的种子纯度鉴定，具有快速、稳定、不受环境影响等优点，能替代传统田间种子纯度鉴定方法，有利于津研快绿1号种子高效准确的质量控制。

附图说明

图1为SSR引物A09-17在津研快绿1号父本、母本及杂交种样品的电泳图；M表示DNAMarker，1-3为津研快绿1号父本的三个重复材料，4-5为津研快绿1号母本材料的三个重复材料，7-9为津研快绿1号杂交种的三个重复材料；

图2 为SSR引物检测津研快绿1号杂交种46个样品纯度的电泳图；M表示DNAMarker，P₁表示父本材料，P₂表示母本材料，其余为待测的杂交种材料，其中三角所在位置表示该材料为非杂交种材料，其余都为杂交种材料。

具体实施方式

除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。以下实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的仪器、材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。所用到的父本材料JL520、母本材料JA714可向天津科润农业科技股份有限公司蔬菜研究所大白菜课题组索取，津研快绿1号杂交种有市售。

实施例1

一、材料

父本材料、母本材料、及津研快绿1号杂交种各3个单株，用于引物筛选。随机取制种基地6家签约农户生产的津研快绿1号杂交种各92粒种子，进行种子纯度鉴定。

二、SSR引物的筛选

根据大白菜基因组重测序数据，设计多对引物，对津研快绿1号、母本材料、父本材料进行多态性检测，筛选出具有共显性差异的引物对A09-17，序列如下:

F: 5’- TCCTCGAGTTTCGCTTCATATCCTG -3’ (SEQ ID NO:1)

R: 5’- AGTCTGGAAACTTACATGGAAGTAAAATACAAAAC -3’ (SEQ ID NO:2)

该标记重复性好、条带清晰，以该引物为特异性引物，以待测样品的基因组DNA为模板进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳分离并染色检测，结果显示：在父本材料中可扩增出122 bp的特异性条带，在母本材料中能够扩增出154 bp的特异性条带，津研快绿1号杂交种材料中同时扩增出154 bp和122 bp的特异性条带。

三、基因组DNA的提取及PCR扩增

（1）用CTAB法提取父本材料、母本材料及津研快绿1号杂交种各3个单株的基因组DNA，作为模板用于引物筛选；制种基地6家签约农户生产的津研快绿1号杂交种在田间播种，正常管理，各92株，进行统一编号，提取基因组DNA，用于种子纯度鉴定。

具体步骤为：取幼嫩叶片0.2 g入1.5 mL离心管中，加50 μL 2% CTAB提取缓冲液，研磨，后补齐至400 μL，65℃水浴30 min；加入400 μL氯仿：异戊醇（24:1），轻摇5 min。12000 rpm离心5 min；取上清200 μL，加入预冷的异丙醇200 μL混匀，-20℃放置20 min；12000 rpm离心10 min；弃上清，加入150 μL预冷乙醇，轻轻混匀洗净，10,000 rpm离心5min；弃上清，晾干或吹干；加蒸馏水100 μL溶解DNA，室温放置1 h；用蒸馏水将DNA稀释到50ng/μL，作为PCR模板使用或-20℃保存备用。

（2）以上述基因组DNA为模板，用该发明提供的引物为特异性引物进行PCR扩增，获得扩增产物。PCR反应采用10 µL体系，包括：10×PCR Buffer，1.0 µL；2.5 mM dNTP，0.2 µL；10 µmol·L-1 primers，0.4 µL；5 U·µL-1 Taq，0.2 µL；50 ng·µL-1 DNA，1.5 µL；ddH2O，6.7 µL。采用的程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，57℃复性30 s，72℃延伸30 s，35 个循环；72℃终延伸 5 min。

四．PCR扩增产物的电泳分离及银染显色

利用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对PCR扩增产物进行电泳分离，然后银染显色，统计电泳条带的大小。

五、结果观察及统计

利用合成的若干对引物对津研快绿1号母本材料、父本材料，及杂交种各3个单株进行筛选，发现引物A09-17在母本材料、父本材料间具有多态性，且杂交种中同时含有母本材料、父本材料条带，可以用于杂交种的纯度鉴定，如图1所示。

利用引物A09-17对制种基地6户签约农户生产的津研快绿1号杂交种各随机92粒种子进行PCR扩增，电泳及染色，同时含有母本材料和父本材料条带的样品为杂交种，只含有母本材料或父本材料条带的样品，为非杂交种，如图2。经统计获得6户签约农户生产的津研快绿1号种子纯度如表1所示：

表1 不同农户生产的津研快绿1号种子SSR分子标记纯度鉴定结果

1号农户生产的津研快绿1号种子纯度为98.9%，2号农户生产的津研快绿1号种子纯度为100%，3号农户生产的津研快绿1号种子纯度为97.8%，4号农户生产的津研快绿1号种子纯度为98.9%，5号农户生产的津研快绿1号种子纯度为98.9%，6号农户生产的津研快绿1号种子纯度为97.8%。

在田间，通过植株的生长特性及统一性等特点，利用传统方法鉴定制种基地6户签约农户生产的津研快绿1号杂交种的种子纯度，结果与分子标记的鉴定结果一致。

实施例2

比较试验：

将制种基地6户签约农户生产的津研快绿1号商品种待检测样品，每户随机取种约100粒，田间露地开沟，按每平方米200株的密度播种，播种后大约3天出齐苗，待生长到7叶1心阶段，根据待检测样品的株高、叶色、叶形，叶柄颜色及长度、宽度等表现性状是否符合津研快绿1号商品种的统一性和一致性，判断是否为津研快速1号商品种，统计待测样品的种子纯度。

结论：通过本发明提供的SSR分子标记引物鉴定津研快绿1号种子纯度，与通过传统的田间鉴定方法鉴定种子纯度，结果一致，本发明提供的方法，具有用时短、不受环境影响等优点，可以替代传统方法，用于津研快绿1号的种子纯度鉴定。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津科润农业科技股份有限公司

<120> 一种鉴定津研快绿1号小白菜种子纯度的引物及应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcctcgagtt tcgcttcata tcctg 25

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agtctggaaa cttacatgga agtaaaatac aaaac 35

Claims (1)

1.一种采用SSR标记引物鉴定津研快绿1号小白菜杂交种的种子纯度的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）提取津研快绿1号杂交种待测样品的基因组DNA；

（2）以上述样品的基因组DNA为模板，以SSR标记引物为特异性引物进行PCR扩增；PCR反应采用10 µL体系包括：10×PCR Buffer，1.0 µL；2.5 mM dNTP，0.2 µL；10 µmol·L-1primers，0.4 µL；5 U·µL-1 Taq，0.2 µL；50 ng·µL-1 DNA，1.5 µL；ddH2O，6.7 µL；PCR反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，57℃复性30 s，72℃延伸30 s，35 个循环；72℃终延伸 5 min；所述的SSR标记引物为：

TCCTCGAGTTTCGCTTCATATCCTG SEQ ID NO:1

AGTCTGGAAACTTACATGGAAGTAAAATACAAAAC SEQ ID NO:2

（3）将上述PCR的扩增产物，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、银染，津研快绿1号杂交种材料中，同时扩增出154bp和122bp的特异性条带；

（4）统计上述银染结果：所检测津研快绿1号杂交种纯度（%）=（检测种子总粒数-非杂交种粒数）/（检测种子总粒数）×100%。

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