CN109925334A - 异叶青兰在防治关节损伤/类风湿性关节炎药物中的应用 - Google Patents

异叶青兰在防治关节损伤/类风湿性关节炎药物中的应用 Download PDF

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王蒲
汪亚兰
邹晓华
王启兰
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Abstract

本发明提供一种异叶青兰在防治关节损伤/类风湿性关节炎药物中的应用。本发明提供的异叶青兰作为防治类风湿性关节炎的药物,其通过抑制关节损伤和肿胀,显著下调脾脏,爪子等重要炎症部位促炎细胞因子TNF‑α、IL‑6和IL‑1β水平,同时降低细胞因子TNF‑α或/和IL‑6水平血清水平,缓解小鼠关节炎/关节损伤,防治类风湿性关节炎。本发明提供的异叶青兰对机体自身性免疫反应引起的关节损伤/类风湿性关节炎有显著的治疗作用,其副作用小、治疗效果显著,且材料分布广泛,资源量丰富,易于批量备料。

Description

异叶青兰在防治关节损伤/类风湿性关节炎药物中的应用
技术领域
本发明属于医药技术领域,具体涉及一种有效能够防治关节损伤/类风湿性关节炎的中药物质及其在防治类风湿性关节炎药物中的应用。
背景技术
类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性炎症性疾病,其特征是滑膜炎症,软骨和骨质破坏。RA的发病率随着年龄的增长而增加,女性比男性更容易患这种疾病。全世界大约有0.5-0.8%的人患有RA。虽然RA的病因复杂,但据信易感基因与环境损伤,表观遗传修饰或翻译后修饰一起引起RA发展过程中自身免疫反应的激活。活化的树突细胞和巨噬细胞迁移到滑膜室中,并分泌炎性细胞因子和趋化因子,其进一步激活内皮细胞并吸引自身反应性T细胞和B细胞积聚到滑膜室中。累积证据表明TNF-α,IL-6,IL-1β,IL-12,IL23,IL-17和IFN-γ在滑膜室的炎症环境中起关键作用。自身免疫性关节炎的动物模型已被证明是用于研究该疾病的致病机制以及用于测试新疗法的有价值的研究工具。胶原诱导的关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)是最广泛研究的类风湿性关节炎(RA)模型。
目前用于RA的治疗产品包括:1)常规合成疾病调节抗风湿药(DMARD),例如甲氨蝶呤(Mtx),柳氮磺胺吡啶,来氟米特和羟氯喹;2)生物DMARDs,如TNF抑制剂,抗B细胞,抗T细胞和抗IL6R抗体;3)靶向合成DMARDs,如Janus激酶抑制剂。然而,这些西药具有明显的缺点,且副作用较多。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够有效防治关节损伤/类风湿性关节炎的中药物质及其在防治关节损伤/类风湿性关节炎药物中的应用。
为实现上述目的,本发明提供一种异叶青兰在防治关节损伤/类风湿性关节炎药物中的应用。
异叶青兰(Dracocephalum heterophyllum,DH)系唇形科青兰属植物。具有广泛的药理作用,提高缺氧耐力:可降低由缺氧引起的红细胞体积增大,而且还可以降低红细胞的数量,从而降低血液的粘滞性,改善血循环。对低氧环境下动物的某些器官和组织有明显的地保护作用,初步认为是有前途的抗低氧中草药。镇咳、祛痰作用:有止咳(氨水喷雾引咳法)和祛痰(酚红法)作用,但无平喘作用(豚鼠组织胺喷雾法)。抑菌作用:对流感杆菌、肺炎球菌、白色葡萄球菌、卡他球菌、甲型及乙型链球菌等有抑制作用。
较佳地,所述异叶青兰可作为药物有效成分与载体制成防治关节损伤/类风湿性关节炎的药用制剂。载体可为药学上可接受的任何载体。
较佳地,所述异叶青兰有效成分的提取方法为:
(1)取阴干的异叶青兰,置于粉碎机中粉碎;
(2)将异叶青兰粉碎物置于回流提取罐中,加入乙醇后加热回流;
(3)过滤后得滤液,减压浓缩得到异叶青兰提取物;
(4)用乙酸乙酯溶剂萃取,取乙酸乙酯部位萃取液并减压干燥。回流时可分多次操作,过滤后合并多次操作下的滤液,当然,萃取也可分多次进行,并合并取乙酸乙酯部位的萃取液。
较佳地,所述异叶青兰通过下调关节炎症部位促炎细胞因子水平,降低血清细胞因子TNF-α或/和IL-6水平防治关节损伤/类风湿性关节炎。
较佳地,所述促炎细胞因子为TNF-α、IL-6和IL-1β中的一种或多种。
本发明提供的异叶青兰作为防治类风湿性关节炎的药物,其通过抑制关节损伤和肿胀,显著下调脾脏,爪子等重要炎症部位促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平,同时降低细胞因子TNF-α或/和IL-6水平血清水平,缓解小鼠关节炎/关节损伤,防治类风湿性关节炎。本发明提供的异叶青兰对机体自身性免疫反应引起的关节损伤/类风湿性关节炎有显著的治疗作用,其副作用小、治疗效果显著,且材料分布广泛,资源量丰富,易于批量备料。
附图说明
图1为实施例2中DBA/1小鼠体重变化图;
图2为实施例2中DBA/1小鼠关节肿胀评分图;
图3为实施例3中X-ray拍照检测关节损伤图;
图4为实施例4中HE染色检测小鼠关节显微镜拍摄图像;
图5为实施例4中滑膜增生评分图;
图6为实施例4中细胞浸润评分图;
图7为实施例4中炎性渗出物评分图;
图8为实施例4中软骨和骨损伤;
图9为实施例5中RT-PCR检测脾脏细胞因子TNF-αmRNA表达水平图;
图10为实施例5中RT-PCR检测脾脏细胞因子IL-6mRNA表达水平图;
图11为实施例5中RT-PCR检测脾脏细胞因子IL-1βmRNA表达水平图;
图12为实施例5中RT-PCR检测爪子细胞因子TNF-αmRNA表达水平图;
图13为实施例5中RT-PCR检测爪子细胞因子IL-6mRNA表达水平图;
图14为实施例5中RT-PCR检测爪子细胞因子IL-1βmRNA表达水平图;
图15为实施例5中血清中TNF-α水平;
图16为实施例5中血清中IL-6水平;
图17为实施例6中血清中抗II型胶原IgG1抗体水平;
图18为实施例6中血清中抗II型胶原IgG2a抗体水平。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和有益效果,下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。需说明的是,下述实施所述方法是对本发明做的进一步解释说明,不应当作为对本发明的限制。本发明的实施例中所用的材料、试剂若无特殊说明皆可从商业途径获得。
实施例1:异叶青兰有效成分制备
取阴干的异叶青兰,置于粉碎机中粉碎,过60目筛。将异叶青兰粉碎物置于回流提取罐中,加入95%乙醇,60℃加热回流提取3次,过滤合并滤液,减压浓缩得到异叶青兰提取物浸膏。将异叶青兰提取物浸膏加水溶解,用乙酸乙酯溶剂萃取3次,合并乙酸乙酯部位萃取液并减压干燥,得到乙酸乙酯部位浸膏。
实施例2:DBA/1小鼠关节评分
将18只雄性DBA/1只小鼠随机分为以下3组(每组6只小鼠(n=6)):对照组=正常小鼠(Control组);模型组=胶原诱导的关节炎小鼠(CIA组);实验组=Dracocephalumheterophyllum治疗CIA小鼠(DH组)。简言之,将一定量的II型胶原(胶原II,CII,2mg/ml,Chondrex)与等量的完全弗氏佐剂(CFA,sigma)/不完全弗氏佐剂(IFA,sigma)混合。采用超声乳化法进行乳化,以制备CII乳液(即CII浓度为1mg/mL)并储存在4℃的冰箱中。所有小鼠在尾部的基部皮内施用0.1ml具有完全弗氏佐剂乳化的牛II型胶原(100μg)。在初次免疫后21天,动物接受了用不完全弗氏佐剂乳化的牛II型胶原(100μg)的加强注射。待小鼠出现肿胀之后,以腹腔注射的方式给药,隔天一次。
加强免疫后每7天监测CIA的关节炎严重程度。使用爪子的关节炎严重程度评分来反映关节炎的严重程度。分数分为0(正常关节),1(1爪肿胀或关节炎),2(2或3爪肿胀或轻微的爪肿胀),3(4爪以上肿胀,整个爪子中度肿胀)),4(爪的严重肿胀和变形)。隔天观察评分并称重,结果如图1、图2所示。实验数据用平均值±标准误表示,与胶原诱导的模型组(CIA,n=6)相比*P<0.05和#P<0.01表示差异显著。图1:体重变化。图2:关节炎严重程度评分,坐标评分为四肢关节评分之和。结果表明,实验期间,Control组小鼠显示出光滑的毛发,灵活的运动和正常的饮食。CIA组小鼠体重明显减轻并缓慢增加,但Control组小鼠稳定增加,并且在第45天后,与CIA组相比显着增加(*p<0.05,#p<0.01)。相比之下,DH治疗组的体重减轻但随后迅速增长,并且与CIA组相比增加,在第63天后显示出显着不同(*p<0.05)。这表明着DH组缓解了小鼠的体重减轻。图2关节炎评分结果显示,CIA组关节炎严重程度持续增加,第47天,与Control组比较差异有统计学意义(#p<0.01)。与CIA组相比,DH组的关节炎评分减轻,并且在第61天后显示出显著差异(*p<0.05)。因此,DH显示出对RA的治疗效果。
实施例3:DBA/1小鼠X光检查
在实验的第73天,通过小动物活组织检查成像技术拍摄小鼠的踝关节和足关节的图像。然后,进行成像检查和分析。观察CIA小鼠给予或不给药关节软组织肿胀程度和关节骨破坏情况。
在实验结束的前一天,将不同分组的小鼠用水合氯醛麻醉后用X射线扫描并拍照,结果如图3所示。结果表明,在Control组中,关节软组织未肿胀,关节未受损。在CIA组,关节软组织明显肿胀,关节受损。相比之下,DH治疗组,关节软组织肿胀和关节结构损伤明显缓解。
实施例4:HE染色及评分
处死小鼠,右后肢关节,踝关节及其周围组织用4%多聚甲醛固定48h。进行六周的脱钙,不同浓度的梯度乙醇脱水,石蜡包埋组织的切片(3-5μm)和H&E染色。在显微镜下观察小鼠踝和脾的病理变化并拍摄图像。根据从轻到重的病变,关节病理评分从0到3分级,包括有无滑膜增生(Synovitis score)、细胞浸润(Cell infiltration score)、软骨和骨损伤(Cartilage and bone damage score)和炎性渗出物(Inflammatory exudate score)。具体评分规则如下:
0:无滑膜增生,无血管痉挛形成,无细胞浸润,关节腔无炎性渗出物,软骨和骨无损伤;
1:轻度滑膜增生,血管壁形成有限,细胞浸润较少,关节腔内炎性渗出物较少,软骨和骨质损伤较小;
2:中度滑膜增生的中度滑膜增生,中度血管形成,中度细胞浸润,关节腔中的中度炎性渗出物,软骨和骨中度损伤;
3:严重的滑膜,严重的血管形成,更多的细胞浸润,关节腔内更多的炎性渗出物,对软骨和骨广泛损伤。
显微镜拍摄图像如图4所示,图中,红色箭头:滑膜增生和炎症细胞浸润;绿色箭头:血管翳生成;蓝色箭头:软骨和骨损伤;黄色箭头:炎症渗出物。关节病理评分如图5-8所示。实验数据用平均值±标准误表示,与胶原诱导的模型组(CIA,n=4)相比*P<0.05和**P<0.01表示差异显著。图5:滑膜增生评分。图6:炎性细胞浸润评分。图7:关节腔内炎症渗出物评分。图8:软骨和骨损伤评分。结果表明,在Control组中,滑膜未增殖,没有炎性细胞浸润,关节软骨表面光滑且结构完整。在CIA组中,滑膜增殖并粘附在软骨表面形成血管翳,大量炎性细胞浸润,在关节腔内可见少量炎性渗出物。但是来自DH处理的小鼠的软骨和滑膜组织结构显示出更少的损伤(图4)。H&E染色的关节病理学评分表明DH组小鼠滑膜增生(图5),炎性细胞浸润(图6),关节腔内炎症渗出物(图7)软骨和骨损伤(图8)有所减少,并且与CIA组相比,滑膜增生(**p<0.01),炎性细胞浸润(p<0.05)和软骨和骨损伤(p<0.05)评分显示出显著差异。
实施例5:促炎细胞因子检测
RT-PCR检测脾脏和爪子(左后爪)细胞因子mRNA表达,ELISA检测血清细胞因子水平。具体包括以下步骤:
1)血清制备:从小鼠眼眶取血约100μL,血样室温静置1h,离心分离血清,血清样品保存于-20℃待测。
2)RT-PCR检测脾脏和爪子细胞因子mRNA表达
第74天,处死小鼠,收集脾脏和爪子组织并用液氮研磨成粉末。根据制造商的说明提取总RNA并逆转成cDNA。用于实时PCR的引物序列如下:肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)、白细胞介素(IL-1β)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。
取小鼠脾脏,爪子有液氮研磨,使用组织RNA提取试剂盒,按照制造商的说明,提取RNA并反转录成cDNA。RT-PCR扩增的程序程序是在95℃下预变性5min,在95℃下进行40个循环10秒,在55℃下进行30秒。熔解曲线证实了扩增的特异性。所有样品一式三份进行测试,并将细胞因子mRNA表达标准化为GAPDH信使RNA(mRNA)。使用比较Ct(ΔCt)方法测定研究组之间基因表达的相对差异。使用公式ΔCt计算倍数表达。
检测结果如图9-14所示。实验数据用平均值±标准误表示,与胶原诱导的模型组(CIA,n=4)相比*P<0.05和**P<0.01表示差异显著。图9-11:脾脏组织细胞因子mRNA水平。图12-14:爪子(左后爪)细胞因子mRNA水平。
3)ELISA检测血清中TNF-α、IL-6水平:
a、于试剂盒中每孔加入待测样本50μL,设置阴、阳性对照各3孔,每孔加入阴性对照(或阳性对照)各50μL,并设置空白对照3孔;
b、每孔加入酶结合物(辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠IgG二抗)50μL(空白对照孔除外),充分混匀,封板,置37℃孵育30min;
c、洗板:弃去孔内液体,用洗涤液(20mM磷酸盐缓冲液,含0.05%的吐温20)注满每孔,静置5秒,甩干,重复3次后拍干;
d、每孔加显色剂A液(H2O2)和显色剂B液(四甲基联苯胺TMB)各50μL,充分混匀,封板,置37℃孵育15min;
e、每孔加入终止液(2M H2SO4溶液)50μL,混匀;
f、用酶标仪读数,取波长450nm,先用空白孔校零,然后读取各孔OD值。
检测结果如图15、图16所示。实验数据用平均值±标准误表示,与胶原诱导的模型组(CIA,n=4)相比*P<0.05和**P<0.01表示差异显著。图15:TNF-α血清水平。图16:IL-6血清水平。
结果表明,与CIA组小鼠相比,DH处理组小鼠的脾脏(图9-11)和爪子(图12-14)中TNF-α,IL-6和IL-1β的mRNA表达显著降低(*P<0.05,**P<0.01)。同样地,DH治疗也显著下调了TNF-α(图15)和IL-6(图16)水平血清(**P<0.01)。DH给药组细胞因子水平的下调与CIA的严重程度降低有关。
实施例6:血清中抗II型胶原特异性IgG抗体检测
ELISA检测血清抗II型胶原特异性IgG抗体水平,将牛II型胶原(2mg/ml)在4℃下在ELISA板上过夜。使用具有标准蛋白质浓度的Ⅱ型胶原IgG1/IgG2a抗体的连续稀释液制备ELISA标准曲线。将来自小鼠的血清以1:2稀释度加入,并在37℃下孵育90min。以1:700稀释度使用山羊抗小鼠IgG1或IgG2a作为第一检测试剂。HRP缀合的抗山羊抗体以1:1500稀释度用作第二检测试剂。抗II型胶原抗体的浓度显示为每毫升单位。
检测结果如图17、图18所示。实验数据用平均值±标准误表示,与胶原诱导的模型组(CIA,n=4)相比,*P<0.05和**P<0.01表示差异显著。图17:IgG1抗体血清水平。图18:IgG2a抗体血清水平。结果表明,DH处理的小鼠血清中的抗II型胶原IgG1和IgG2a抗体水平显著降低(**p<0.01),这表明免疫反应减轻。
在此需说明的是,本发明提供的异叶青兰也可用于防治关节损伤的药物。
本发明提供的异叶青兰作为防治类风湿性关节炎的药物,其通过抑制关节损伤和肿胀,显著下调脾脏,爪子等重要炎症部位促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平,同时降低细胞因子TNF-α或/和IL-6水平血清水平,缓解小鼠关节炎/关节损伤,防治类风湿性关节炎。本发明提供的异叶青兰对机体自身性免疫反应引起的类风湿性关节炎有显著的治疗作用,其副作用小、治疗效果显著,且材料分布广泛,资源量丰富,易于批量备料。
最后所应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 江西华普康明生物科技有限公司
<120> 异叶青兰在防治关节损伤/类风湿性关节炎药物中的应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tagctcccag aaaagcaagc 20
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttttctggag ggagatgtgg 20
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccacttcaca agtcggaggc tta 23
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<400> 5
ttgacggacc ccaaaagatg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aggtcggtgt gaacggattt g 21
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgtagaccat gtagttgagg tca 23

Claims (5)

1.一种异叶青兰在防治关节损伤/类风湿性关节炎药物中的应用。
2.如权利要求1所述的异叶青兰在防治关节损伤/类风湿性关节炎药物中的应用,其特征在于,所述异叶青兰可作为药物有效成分与载体制成防治关节损伤/类风湿性关节炎的药用制剂。
3.如权利要求2所述的异叶青兰在防治关节损伤/类风湿性关节炎药物中的应用,其特征在于,所述异叶青兰有效成分的提取方法为:
(1)取阴干的异叶青兰,置于粉碎机中粉碎;
(2)将异叶青兰粉碎物置于回流提取罐中,加入乙醇后加热回流;
(3)过滤后得滤液,减压浓缩得到异叶青兰提取物;
(4)用乙酸乙酯溶剂萃取,取乙酸乙酯部位萃取液并减压干燥。
4.如权利要求1所述的异叶青兰在防治关节损伤/类风湿性关节炎药物中的应用,其特征在于,所述异叶青兰通过下调关节炎症部位促炎细胞因子水平、降低血清细胞因子TNF-α或/和IL-6水平防治关节损伤/类风湿性关节炎。
5.如权利要求4所述的异叶青兰在防治关节损伤/类风湿性关节炎药物中的应用,其特征在于,所述促炎细胞因子为TNF-α、IL-6和IL-1β中的一种或多种。
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