CN109923418B - 用于毛细血管中血小板计数的方法和装置 - Google Patents
用于毛细血管中血小板计数的方法和装置 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109923418B CN109923418B CN201780069467.3A CN201780069467A CN109923418B CN 109923418 B CN109923418 B CN 109923418B CN 201780069467 A CN201780069467 A CN 201780069467A CN 109923418 B CN109923418 B CN 109923418B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sample
- edta
- dilution
- incubation
- determining
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 93
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 144
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims abstract description 141
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims abstract description 141
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 107
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 102
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 102
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims abstract description 42
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 claims abstract description 16
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 claims abstract description 15
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 78
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims description 23
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 claims description 10
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 claims description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 abstract description 6
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 abstract description 4
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 73
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 45
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 5
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 4
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 4
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 4
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 4
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 4
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 4
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N (S)-chloroquine Chemical class ClC1=CC=C2C(N[C@@H](C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 2
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004159 blood analysis Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 1
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012356 Product development Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- 230000002429 anti-coagulating effect Effects 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004401 flow injection analysis Methods 0.000 description 1
- 238000009652 hydrodynamic focusing Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 1
- 239000013026 undiluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
- G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
- G01N33/49—Blood
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/38—Diluting, dispersing or mixing samples
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
- G01N35/10—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices
- G01N35/1095—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices for supplying the samples to flow-through analysers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/38—Diluting, dispersing or mixing samples
- G01N2001/383—Diluting, dispersing or mixing samples collecting and diluting in a flow of liquid
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/01—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials specially adapted for biological cells, e.g. blood cells
- G01N2015/018—Platelets
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N2015/1486—Counting the particles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
- G01N35/10—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices
- G01N2035/1027—General features of the devices
- G01N2035/1032—Dilution or aliquotting
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
- Y10T436/25625—Dilution
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Ecology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
一种测定毛细血管血样中血小板计数的方法,包括步骤:提供在样本采集时用EDTA进行抗凝处理的毛细血管血样;在有效减少血小板聚集的量的EDTA存在下,在非溶解性缓冲液中以1:10至1:2000的稀释系数稀释所述样本;将稀释的样本孵育至少23秒;任选地,在测定来自所述孵育样本的血小板计数之前,在第二稀释步骤中稀释所述孵育样本;并从所述孵育样本中测定血小板计数。该方法在集成设备中执行。一种用于执行该方法的设备。
Description
技术领域
本发明涉及使用自动化装置分析毛细血管血液样本的领域,特别涉及从这些样本中测定血小板计数。
背景技术
用于在快速检测环境中从毛细血管血液样本确定血细胞计数的方法和装置是众所周知的。在典型的情况下,将小样本(微升)的毛细血管血液(与静脉血液相反)吸入涂有抗凝血剂(通常为EDTA)的薄玻璃毛细管中。然后将带有血液样本的玻璃毛细管置于自动装置中,该自动装置执行在等渗盐水缓冲液中的稀释,然后测定细胞计数,例如红细胞、各种类型的白细胞和血小板(thrombocytes)(也称为血小板(platelets))。
在本技术领域中,公认的问题是,当使用自动化集成仪器来通过毛细血管血液样本确定患者的血小板计数时,与使用在同一时间点来自同一患者的静脉样本获得的计数相比,其结果通常是错误性的偏低。该问题源于血小板聚集的趋势,尽管使用涂在毛细血管壁上的强力抗凝剂如EDTA。在US8,927,228中描述了该问题的建议解决方案,其中发明人已经发现向样本中加入氯喹盐缓解了聚集的问题。
一个明显单独的并非是本发明目的的问题是,EDTA依赖性假性血小板减少症(PTCP),一些患者中由于EDTA诱导的血小板聚集导致的假低血小板计数的罕见现象,可以得到解决,例如,用卡那霉素。与静脉样本相比,不寻常的PTCP现象不同于毛细血管血液样本计数较少的一般情况。
然而,本领域仍然需要提供用于使用集成的自动化装置从毛细血管血液中确定血小板的替代和/或改进的方法和装置,特别是不需要使用额外的试剂并且实施成本有效。
定义
术语EDTA是指乙二胺四乙酸,一种结合钙和其他二价金属阳离子的螯合剂。
术语血小板(thrombocyte)和血小板(platelet)可互换使用。
术语毛细血管血液是指来自受试者毛细血管的血液样本,通常是手指的穿刺/针刺。毛细血管血液与静脉血液不同,静脉血液通过从静脉取样以及从动脉取样的动脉血液来定义。除了来源之外,毛细血管血液和静脉血液的采样方法也不同,这导致每个类别的样本具有不同的特性。
术语MPA是指为Medonic M系列M32仪器和Swelab Alfa Plus仪器设计和使用的适配器设备。它旨在接收并稀释包含在两端开口的毛细管中的少量限定体积的血液样本。该技术描述于US6284548B1中。
附图说明
图1:典型的自动血小板计数程序的流程图,例如Medonic M系列M32M和SwelabAlfa Plus标准中使用的程序。椭圆形象征着手动处理样本。矩形由单元计数器自动处理。取样:通过毛细管作用将20μL血液采集到毛细管(微量移液管)中。转移:将样本放入MPA设备内。稀释1:通过用稀释剂冲洗将样本移至混合杯中,从而产生第一稀释液(约4秒)。等待1:在混合杯中等待混合物变得均匀(标准方案中约10秒)。正是在这种情况下,增加了额外的时间来稳定PLT结果。转移1:将第一稀释液移至所谓的剪切阀,该剪切阀分离20μL的该稀释液(约3秒)。稀释2:通过用稀释剂冲洗将样本移至计数室,从而产生第二稀释液(约4秒)。等待2:在计数室中,等待混合物变得均匀(约7秒)。计数:对样本中的细胞进行计数并通过库尔特原理(约13秒)进行分类。
图2:显示使用标准方法的毛细血管血液中血小板计数与静脉血液分析相比的相对差异的大型临床研究。
图3:显示使用本发明方法显示毛细血管血小板计数(其增加了15秒的孵育时间,仅用于毛细管计数程序)与静脉血液分析相比的相对差异的大型临床研究。
图4:供体349指尖样本的WBC直方图,标准MPA循环与混合室中的15s延迟。来自个体供体的说明性粒子计数图显示标准和本发明的方法之间的微小差异。开始时几乎没有明显的血小板聚集,因此程序之间几乎没有差异。
图5:供体350指尖样本的WBC直方图,标准MPA循环与混合室中的15s延迟。来自个体供体的说明性粒子计数图显示标准和本发明的方法之间的实质差异。使用标准方法存在显著的血小板聚集,但是这通过本发明的方法基本上得到缓解。
图6-9:用于测定血液样本中细胞计数的自动化集成设备的原理示意图和操作。
发明内容
本发明涉及以下项目。以下项目中公开的主题应被视为以与专利权利要求中公开主题相同的方式公开。
1.一种测定毛细血管血样中血小板计数的方法,
包括以下步骤:a.提供毛细血管血液样本,在样本采集时用EDTA进行抗凝处理;b.在非裂解缓冲液中以1:10至1:2000的稀释系数稀释所述样本;c.在有效减少血小板聚集的量的EDTA存在下,将稀释的样本孵育至少23秒的持续时间;d.任选地,在确定来自孵育样本的血小板计数之前,在第二稀释步骤中稀释所述孵育样本;和e.从所述孵育样本中测定血小板计数;
其中,步骤b、c、e和任选的d在用于血小板计数的集成装置(100)中进行。
2.根据第1项的方法,其中,所提供的毛细血管血液样本是在涂覆有EDTA的采样装置中采集的血液样本。
3.根据第2项的方法,其中,所述采样装置是涂覆有EDTA的毛细管。
4.根据前述项目中任一项的方法,其中,所述稀释系数为1:30至1:1000。
5.根据前述项目中任一项的方法,其中,所述稀释系数为1:50至1:450。
6.根据前述项目中任一项的方法,其中,所述稀释系数为1:150至1:300。
7.根据前述项目中任一项的方法,其中,所述稀释系数为1:200至1:250。
8.根据前述项目中任一项的方法,其中,所述稀释系数为1:225。
9.根据前述项目中任一项的方法,其中,在从所述孵育样本中测定血小板计数之前,对所述孵育样本进行第二稀释步骤。
10.根据第9项的方法,其中,所述第二稀释步骤包括用1:50-1:1000的第二稀释系数来稀释样本。
11.根据第10项的方法,其中,所述第二稀释步骤包括用1:100-1:300的第二稀释系数稀释样本。
12.根据第11项的方法,其中,所述第二稀释步骤包括用1:175-1:225的第二稀释系数稀释样本。
13.根据第12项的方法,其中,所述第二稀释步骤包括用1:200的第二稀释系数稀释样本。
14.根据前述项目中任一项的方法,其中,所述非裂解性缓冲液是缓冲的生理盐水溶液,例如磷酸盐缓冲盐水或HEPES缓冲盐水。
15.根据前述项目中任一项的方法,其中,所述孵育在至少0.1mM的EDTA存在下进行。
16.根据前述项目中任一项的方法,其中,所述孵育在至少0.2mM的EDTA存在下进行。
17.根据前述项目中任一项的方法,其中,所述孵育在至少0.3mM的EDTA存在下进行。
18.根据前述项目中任一项的方法,其中,所述孵育在至少0.4mM的EDTA存在下进行。
19.根据前述项目中任一项的方法,其中,所述孵育在至少0.5mM的EDTA存在下进行。
20.根据前述项目中任一项的方法,其中,所述孵育在0.2-4mM的EDTA存在下进行。
21.根据前述项目中任一项的方法,其中,所述孵育在0.3-4mM的EDTA存在下进行。
22.根据前述项目中任一项的方法,其中,所述孵育在0.3-0.7mM的EDTA存在下进行。
23.根据前述项目中任一项的方法,其中,所述孵育在0.1-5mM的EDTA存在下进行。
24.根据前述项目中任一项的方法,其中,所述孵育在0.2-4mM的EDTA存在下进行。
25.根据前述项目中任一项的方法,其中,所述孵育在0.3-3mM的EDTA存在下进行。
26.根据前述项目中任一项的方法,其中,所述孵育在0.3-2mM的EDTA存在下进行。
27.根据前述项目中任一项的方法,其中,所述孵育在0.3-1mM的EDTA存在下进行。
28.根据前述项目中任一项的方法,其中,所述孵育在0.4-0.7mM的EDTA存在下进行。
29.根据前述项目中任一项的方法,其中,所述孵育在0.4-0.6mM的EDTA存在下进行。
30.根据前述项目中任一项的方法,其中,所述孵育在0.50-0.56mM的EDTA存在下进行。
31.根据前述项目中任一项的方法,其中,所述孵育步骤持续时间为23-300秒。
32.根据前述项目中任一项的方法,其中,所述孵育步骤持续时间为25-90秒。
33.根据前述项目中任一项的方法,其中,所述孵育步骤持续时间为27-60秒。
34.根据前述项目中任一项的方法,其中,所述孵育步骤持续时间为28-40秒。
35.根据前述项目中任一项的方法,其中,所述孵育步骤持续时间为30-36秒。
36.根据前述项目中任一项的方法,其中,所述孵育步骤持续时间为33秒。
37.根据前述项目中任一项的方法,其中,所述样本不是来自患有EDTA依赖性假性血小板减少症的患者。
38.根据前述项目中任一项的方法,其中,所述步骤b、c、e和任选地d在根据以下任何项目的装置中执行。
39.一种测定毛细血管血样中血小板计数的装置(100),包括:a.用于采样装置的接收器(1,19),其包含在样本采集时用EDTA进行抗凝血处理的毛细血管血液样本;b.稀释元件(8),用于在非裂解缓冲液中稀释所述样本;和c.检测器(14,17),用于测定来自所述稀释样本中的血小板计数;其特征在于,所述装置配置成使得在操作期间:i.在稀释元件(8)中以1:10至1:2000的稀释系数稀释样本;以及ii.将稀释的样本孵育至少23秒,然后在检测器(14,17)中对所述稀释样本进行血小板计数测定。
40.根据前述任一装置项的装置,其中,孵育持续时间为23-300s。
41.根据前述任一装置项的装置,其中,所述孵育持续时间为25-90秒。
42.根据前述任一装置项的装置,其中,所述孵育持续时间为27-60秒。
43.根据前述任一装置项的装置,其中,所述孵育持续时间为28-40秒。
44.根据前述任一装置项的装置,其中,所述孵育持续时间为30-36秒。
45.根据前述任一装置项的装置,其中,所述孵育持续时间为33秒。
46.根据前述任一装置项的装置,其中,所述稀释系数为1:30至1:1000。
47.根据前述任一装置项的装置,其中,所述稀释系数为1:50至1:450。
48.根据前述任一装置项的装置,其中,所述稀释系数为1:150至1:300。
49.根据前述任一装置项的装置,其中,所述稀释系数为1:200至1:250。
50.根据前述任一装置项中的装置,其中,所述稀释系数为1:225。
51.根据前述任一装置项的装置,包括第二和/或另一稀释元件(9,13,16),其在操作期间布置成在测定来自孵育样本的血小板计数之前使样本经受第二稀释步骤。
52.根据项目51的装置,其中,所述第二稀释步骤包括用1:50-1:1000的第二稀释系数稀释样本。
53.根据项目52的装置,其中,所述第二稀释步骤包括用1:100-1:300的第二稀释系数稀释样本。
54.根据项目53的装置,其中,所述第二稀释步骤包括用1:175-1:225的第二稀释系数稀释样本。
55.根据项目54的装置,其中,所述第二稀释步骤包括用1:200的第二稀释系数稀释样本。
56.根据前述任一装置项的装置,其中,所述采样装置是涂覆有EDTA的毛细管。
详细说明
通常,从毛细血管血液中测定血小板计数包含测定前的稀释步骤。此外,在使用集成仪器进行自动分析的情况下,稀释后的测定在尽可能短的时间内进行,不超过几秒钟,以优化仪器的产量。然而,除非将额外的试剂如氯喹盐加入稀释的样本中,否则这些仪器中使用的已知方案会由于血小板聚集导致血小板计数错误地偏低。
本发明人意外地发现,在进行血小板计数之前,通过在一定条件下短时间(23秒或更长)地孵育稀释的毛细血管血液样本,可以逆转毛细血管血液样本中血小板的难以解决的聚集问题(参见示例1-5)。
该发现提供了一种从毛细血管血液样本中进行血小板计数的方法,该方法可以提供更准确的结果,而无需任何其他试剂,例如氯喹盐。因此,现有的试剂和试剂盒可以在具有更准确结果的改进的方法中使用,这在许多环境中具有重要的实际意义。此外,在许多情况下,用于血小板计数的现有自动化集成装置可以通过简单的软件更新或其他微小修改适应更精确的方法,由此本发明的方法实施起来是成本有效的。
测定血小板计数的方法
在第一方面,本发明提供了一种用于确定毛细血管血液样本中血小板计数的方法,包括以下步骤:a.提供在样本采集时用EDTA进行了抗凝处理的毛细血管血液样本;b.在非裂解缓冲液中以1:10至1:2000的稀释系数稀释所述样本;c.在有效减少血小板聚集的量的EDTA存在下,将稀释的样本孵育至少23秒的持续时间;d.任选地,在测定来自孵育样本的血小板计数之前,在第二稀释步骤中稀释所述孵育样本;和e.从所述孵育样本中测定血小板计数。
毛细血管血液样本在样本采集时用EDTA进行抗凝血处理意味着在取样后立即使血液样本与EDTA接触,优选在小于1s内,更优选将样本采集到含EDTA的容器中。抗凝血剂处理必然意味着血液样本经受足以抑制凝聚的量的EDTA。提供的毛细血管血液样本可以是在涂覆有EDTA的采样装置中采集的血液样本,所述采样装置含有足以对样本具有凝聚抑制作用的量的EDTA。采样装置可以是涂覆有EDTA的毛细管。
非裂解缓冲液可以是缓冲的生理盐水溶液,例如磷酸盐缓冲盐水或HEPES缓冲盐水。可以使用许多不同的已知类型的缓冲液,只要它们不会以阻碍计数的程度来损坏或改变要计数的血小板。
根据本发明,使用用于血小板计数的自动化集成装置(100)(任选地包括对其他血液参数的读出),例如下面描述的第二方面的装置,进行稀释、孵育和测定步骤(b,c和e)以及任选的第二稀释步骤(d)(如果存在)。在集成装置中根据本发明增加用于孵育的额外延迟与传统设计原理相反,因为这样的装置通常被设计成在尽可能短的时间内执行分析以优化性能。还测试了在稀释步骤之前采集血液样本的涂覆有EDTA的毛细管的孵育(参见示例3中的表II)2分钟、6分钟和10分钟,与0分钟相比,即所有这4次孵育在稀释之前,然后遵循正常的分析周期。结果是血小板计数显示增加至6分钟然后稳定。因此,稀释前的孵育似乎能够得到与本发明方法类似的结果,但速度要慢得多。在未稀释的样本孵育6分钟后观察到的改善相当于稀释后仅孵育几秒钟。鉴于快速结果和高通量是非常需要的,与简单地在毛细管中孵育样本的选择相比,本发明的方法提供了显著的改进。
优选地,样本不是来自患有EDTA依赖性假性血小板减少症的患者,一种可以,例如使用卡那霉素,得到解决的罕见现象。
稀释和EDTA浓度
如上所述并在示例3和5下显示,血小板计数也可以通过在稀释发生之前的孵育来改善。然而,从时间性能的角度来看,这种效果要差得多,并且以1:45000的稀释度进行孵育根本无效。因此,孵育期间需要将孵育样本稀释到一定范围内(1:10至1:2000)以获得最佳结果。优选地,稀释系数是1:30至1:1000,更优选1:50至1:450,还更优选1:150至1:300,还更优选1:175至1:225,最优选1:225。
如示例4中所示,孵育必须在有效减少血小板聚集的量的EDTA存在下进行,以获得改善的结果。在每种特定情况下,什么构成有效的EDTA浓度取决于非裂解缓冲液中的其他组分,因为EDTA具有在溶液中结合二价金属阳离子的作用。Ca2+的结合因此降低游离Ca2+的浓度通常被认为是EDTA抗凝血作用的主要机制。虽然不希望受理论束缚,但理论上认为二价阳离子(特别是Ca2+)结合活性落后于观察到的孵育对血小板聚集的影响。与血小板聚集相关的几类细胞粘附分子,例如整联蛋白和钙粘蛋白是Ca2+依赖性的,因此由这种细胞粘附分子介导的聚集将被足以降低游离Ca2+水平的EDTA浓度抑制至低于某个阈值。
从上述推理可以明显看出,稀释剂中较高浓度的Ca2+离子意味着需要较高浓度的EDTA,以获得足够低浓度的游离Ca2+离子。因此,EDTA的有效量将取决于缓冲液中二价金属阳离子的浓度。如果存在也结合Ca2+的其他螯合剂,则所需的EDTA浓度降低。因此,鉴于缓冲液中存在的其他化合物,需要确定EDTA的有效浓度。对于本领域普通技术人员来说,根据本文的教导,确定当前环境的有效EDTA浓度是常规设计和实验的问题。
优选地,所述孵育在至少0.1mM的EDTA,更优选为至少0.2mM的EDTA,更优选为0.3mM的EDTA,还更优选为至少0.4mM的EDTA,最优选为至少0.5mM的EDTA存在下进行。
还优选地,所述孵育在0.2-4mM的EDTA,更优选为0.3-4mM的EDTA,更优选为0.3-0.7mM的EDTA存在下进行。所述孵育可以在0.1-5mM的EDTA,优选为0.2-4mM的EDTA,更优选为0.3-3mM的EDTA,更优选为0.3-2mM的EDTA,还更优选为0.3-1mM的EDTA,甚至更优选为为0.4-0.7mM的EDTA,更优选为0.4-0.6mM的EDTA,最优选为0.50-0.56mM的EDTA存在下进行。
孵育时间
在本文中,通过孵育意味着样本在稀释和EDTA浓度的适当有效限度内,而不管其他活动(例如混合)是否同时进行。
当在具体示例的框架中解释时,该原理被最好地理解,但是这不应被理解为限制本发明的范围。如表A中的非限制性方式所示,典型的自动血小板测定方法包括许多处理步骤,具有确定的持续时间。在表A中所示的情况下,将样本置于仪器(例如图9的仪器)中并开始分析过程。通过用稀释剂冲洗将待分析的样本移至稀释元件。冲洗步骤持续4秒,并且当在4秒内实现最终结果1:225时,可以假设在本发明的范围内实现第一稀释需要不到1秒。标准方法需要10秒的混合/孵育步骤以使第一稀释变得均匀。该孵育步骤是本发明方法中最直接的延长(参见表A)。孵育后,从第一次稀释中取出等分试样。在所示的情况下,等分试样去除的持续时间为3秒,并且在该步骤期间,样本仍然具有与第一稀释度相同的稀释系数,因此该步骤可以被认为是本发明方法的背景下的孵育的一部分。
然后将等分试样用稀释剂冲洗到计数室中,从而产生第二稀释液。由于冲洗持续时间为4秒且稀释系数为1:225,可以推断出最多需要1秒来稀释样本超过权利要求中规定的稀释系数。允许第二稀释混合并在检测器中进行细胞计数。因此,标准方法可以被认为是将样本在适当的稀释限度和本发明的EDTA浓度下孵育总共18秒,而比较显示的本发明方法导致总共33秒的孵育。
表A:血小板测定方法的说明性示例(关于合适装置的说明性图示,参见图9)
示例3在符合表A所示标准循环的仪器中进行。如示例3的表I所示,当5s的增加的时间延迟被加入到孵育步骤中时,可以看出血小板计数的显著改善。从15秒的增加延迟开始效果优于5秒,并且对于更长时间的孵育保持相同。似乎没有任何明确的上限,但是比必要的孵育时间更长的孵育期是不希望的,因为它们增加了分析时间并降低了产量。最佳孵育期似乎约为33秒,因为该孵育时间在最短时间内对血小板计数产生稳定、完全的影响。
因此,所述孵育步骤持续时间可以是23-300秒,优选为25-90秒,更优选为27-60秒,还更优选为28-40秒,还更优选为30-36秒,最优选为33秒。
可选的第二稀释步骤
出于实际原因,可能需要在孵育之后但在血小板计数测定之前进行第二稀释步骤。根据计数装置(检测器),可能需要额外的稀释以使测定可行。在表A中所示的情况下,存在以1:200稀释的第二稀释步骤,在测定血小板计数之前,产生1:45000的总稀释度。
第二稀释步骤可包括以1:50-1:1000,优选为1:100-1:300,更优选为1:175-1:225,最优选为1:200的第二稀释系数稀释样本。
测定血小板计数的装置
可以用来执行根据本发明第一方面的方法的现有设备在现有技术中是已知的并且是可商购获得的。
用于进行血细胞计数的绝大多数血液学装置使用具有两个稀释步骤的***。通过添加用于毛细血管血液样本的采样装置的接收器,可以容易地修改这样的***,并且该***被配置为执行本发明的第一方面的方法,例如,通过软件更新。
通常通过“库尔特原理”或“流式细胞术原理”实现细胞的检测。两者都是众所周知的方法,并且当测定血小板计数时,这两种方法都受到血小板聚集的影响。
下表列出了四个代表性的示例***,包括示例中使用的M系列M32***,使用不同的方法以集成和自动化的方式实现两步稀释和血小板计数。在本文教导的指导下,这里讨论的所有***都可以容易地被修改以执行如M系列M32***所例示的方法。
每种仪器中使用的用于测定红细胞和血小板的细胞计数的稀释元件和检测器以提炼的示意图概括(F6-9)显示。
附图6-9中的组件说明
1:用于采样装置的接收器,其包含毛细血管血液样本,该血液样本是真空采血管或微量采血器中包含的血液样本的血液入口。该组件还可以适于接收含有血液样本的毛细管,参见组件19。
2-5:用于移动、推动和拉动装置周围的血液样本和稀释剂的注射器。
6-7:用于稀释剂的容器。稀释剂是非溶解性缓冲溶液,含有用于本发明的有效量的EDTA。
8-9:用于使用非裂解缓冲溶液来稀释和混合血液样本的稀释元件。
10:用于打开或关闭装置的液体***中的通路的阀。
11:用于在进行其他操作,例如关闭阀门,的同时保持样本的元件。
12:用于在其周围流动的另一种液体的中间注射样本的注射器针头。
13:液力聚焦室,在后端包含一个端口,稀释剂以比通过注射器针头注入的样本更高的速率被推入该室。这会根据不同的流速稀释样本,并且通过层流,样本精确地聚焦在离开腔室的液体流的中心。该组分可视为第二稀释元件。
14:使用流式细胞仪设置的检测器,用于确定血小板的数量。流式细胞仪使用经由光学透明的流动通道通过焦点的细胞流的中间聚焦的激光。激光在通过激光焦点的细胞上散射,并且散射光强度和成分的不同角度的分析告诉我们通过焦点的细胞的数量和细胞的类型。
15:废物
16:用于使用非裂解缓冲溶液进行最终稀释和混合样本的另一稀释元件。
17:使用库尔特原理设置的检测器,其用于确定血小板的数量。库尔特原理采用通常直径为60-80μm的小孔和一侧的正电极和另一侧的负电极。悬浮在导电稀释剂中的样本被推过小孔,当电池通过时,可以测量电极之间通过的电流的变化。电阻的变化与细胞的大小成比例,并且知道细胞的大小,可以对细胞进行计数和分类。
18:剪切阀。这是一种旋转阀,其具有已知体积的通道,该通道可以连接到不同的入口和出口。剪切阀通过一组连接端口向通道填充血液,然后旋转,剪切特定体积并将该体积连接到另一组连接端口。
19:一种用于采样装置的接收器,其包含毛细血管血液样本,所述接收器是微量移液管适配器,用于接收在两端开口并具有特定体积的毛细血管血液的毛细管(详情参见US6284548B1)。用于利用来自血液入口的血液产生第一次稀释液的稀释剂可以通过常闭阀转移以使用毛细管中的血液代替。
100:用于血小板计数的集成装置,可选地具有其他血液参数的读数。
具有双浴槽的移液器***的原理示意图和血小板计数的操作(图6)
显示为血液入口1的接收器处于接收血液样本的位置。注射器2将特定体积的血液样本吸入血液入口1。接收器血液入口1在稀释元件8上移动。注射器3用稀释剂6将样本喷射到稀释元件8中以产生第一稀释液。将接收器血液入口1浸入稀释元件8中,并且注射器2将特定体积的第一稀释液抽入血液入口1。血液入口1在第二稀释元件9上移动。注射器3用稀释剂6将样本喷射到第二稀释元件9中以产生第二稀释液。打开阀10并且注射器4将第二次和最后的稀释液吸入第三稀释元件16中。阀10关闭,注射器4使用库尔特原理推动稀释液通过检测器17,以测定在最终作为废物15排出之前的血小板细胞计数。
带有一个浴槽的移液器***和流动注射原理示意图和血小板计数的操作(图7)
显示为血液入口1的接收器处于接收样本的位置。注射器2将特定体积的血液样本吸入接收器血液入口1。接收器血液入口1在稀释元件8上移动。注射器3将样本与稀释剂6一起喷射到稀释元件8中以产生第一稀释液。阀10打开,注射器4将第一稀释液吸入保持元件11。阀10关闭,注射器4将第一稀释液通过注射器针头12移动到液力聚焦室13中,同时注射器5将稀释剂7移动到液力聚焦室13中。来自注射器5的分配稀释剂的比例和来自注射器4的第一稀释液定义了样本的第二稀释液在通过流式细胞术原理推进检测器14时用于血小板细胞计数然后最终作为废物15被排出的比率。
具有两个浴槽的剪切阀***原理示意图和用于血小板计数的操作(图8)
剪切阀18连接显示为血液入口1和注射器2的接收器。注射器2通过接收器血液入口1将血液样本拉入剪切阀18中。剪切阀18连接稀释剂6和稀释元件8。注射器2稀释剂6和将剪切阀18中的血液推入稀释元件8中,产生第一稀释液。剪切阀18连接注射器2和稀释元件8。注射器2将第一稀释液拉入剪切阀18中。剪切阀18连接稀释剂6和稀释元件16。注射器2将稀释剂6和剪切阀18中的第一稀释液推入稀释元件16,产生第二次和最后的稀释液。剪切阀18连接接收器血液入口1和注射器2,从而关闭到稀释元件的路径。注射器3使用库尔特原理推动第二次和最后一次稀释液通过检测器17以测定最终作为废物15被喷射之前的血小板细胞计数。
配有微量移液器适配器的M系列M32M以及带有两个浴槽的剪切阀***的原理示意图和血小板计数操作(图9)
可以执行两种不同的稀释操作。
如果阀门10在整个操作过程中关闭,可以执行图8所述的程序。如果使用阀10将稀释剂通过微量移液管适配器转移,则可以执行以下程序。有关各个阶段的持续时间,请参阅上面的表A.
剪切阀18对所有连接都是封闭的。将具有血液样本的毛细管***接收器,微型移液管适配器19中。阀10打开,注射器2将稀释剂6推过阀10,并将接收器微量移液管适配器19中的血液推入稀释元件8,产生第一次稀释液。该装置可以配置成在该阶段进行本发明的孵育(参见表A)。阀10关闭。
从该位置开始,程序如图8所示,阀10关闭。剪切阀18连接注射器2和稀释元件8。注射器2将第一稀释液拉入剪切阀18中。剪切阀18连接稀释剂6和(第二)稀释元件16。注射器2将稀释剂6和剪切阀18中的第一稀释液推入稀释元件16,产生第二次和最后的稀释液。剪切阀18连接血液入口1和注射器2,关闭进出稀释元件的路径。注射器3使用库尔特原理推动第二次和最后一次稀释液通过检测器17以测定最终作为废物15被喷射之前的血小板细胞计数。
所有这些血液学装置可以用适配器代替第一次抽血步骤,或者使用并行适配器,如M系列M32M所示,用作包含毛细血管血液样本的采样装置的接收器。在样本采集时用EDTA进行抗凝处理。该适配器用于接收和稀释包含在两端开口的毛细管中的小的限定体积的血液样本(参见US6284548B1,以获得合适的适配器)。
因此,在第二方面,本发明提供了一种用于测定毛细血管血液样本中血小板计数的装置,包括:
a.用于采样装置的接收器(1,19),其包含在样本采集时用EDTA进行抗凝血处理的毛细血管血液样本;
b.稀释元件(8),其用于在非裂解缓冲液中稀释所述样本;
c.检测器(14,17),其用于测定所述稀释样本中的血小板计数;
其特征在于,所述装置被配置成使得在操作期间:
i.将样本以1:10至1:2000的稀释系数稀释在稀释元件(8)中;和
ii.在测定检测器(14,17)中的血小板计数之前,将稀释的样本孵育至少23秒的持续时间。
在操作期间,该装置可以配置成使得在操作期间的孵育在存在有效减少血小板聚集的量的EDTA的情况下进行。用于在操作期间在稀释元件(8)中稀释的非裂解缓冲液可具有EDTA浓度,从而产生如第一方面的公开内容所限定的有效EDTA浓度。
该设备可以具有如图9所示的物理配置,具有根据图1或表A的操作配置。
该装置可以配置成使得孵育持续时间为23-300s,优选为25-90s,更优选为27-60s,还更优选为28-40s,还更优选为30-36s,最优选为33s。
该装置可以配置成稀释系数为1:30至1:1000,优选为1:50至1:400,更优选为1:150至1:300,还更优选为1:200至1:250,最为优选为1:225。
该装置可包括第二和/或另一稀释元件(9,13,16),其在操作期间布置用于在从所述孵育样本中测定血小板计数之前,使样本经受第二和/或进一步的稀释步骤,例如如图6,7,8和9所示。
第二稀释步骤可包括以1:50-1:1000,优选为1:100-1:300,更优选为1:175-1:225,最优选为1:200的第二稀释系数稀释样本。
与本公开有关的一般方面
术语“包括”应解释为包括但不限于。本文引用的所有文献均通过引用整体并入本文。将本公开布置成具有标题和子标题的部分仅仅是为了提高易读性并且不应以任何方式解释为限制,特别地,该划分不以任何方式排除或限制在不同标题和副标题下彼此组合的特征。
示例
以下示例不限制本发明的范围。对于进一步的实验细节,技术人员将参考材料和方法部分。
示例1:延长的稀释后孵育时间改善了毛细血管血细胞计数
在产品开发过程中偶然发现,将第一次稀释步骤后的孵育时间增加15s,血小板计数似乎有所改善,更为接近使用静脉血样从相同个体获得的真实值。
在早期的数据集中(在图2中作为比较例给出),显然在绝大多数健康志愿者中,从毛细血管血液获得的血小板计数比从静脉血液获得的值低10-30%。在具有较高血小板计数的个体中,该效果似乎更明显(参见沿X轴的数据)。
偶然的发现促使发明人进行类似的实验,但增加了孵育的时间延迟。从图3中可以明显看出,增加的时间延迟使得毛细管测量结果更接近于从静脉样本获得的值。
图1说明了所使用的实际方案的流程。
示例2:改善的血小板计数是由于聚集减少
一些个体供体在毛细血管和静脉样本之间表现出显著差异,而其他供体则没有。来自未表现出毛细血管和静脉计数之间的差异的单个供体的颗粒计数的比较表明,增加的时间延迟不会显著改变颗粒频率计数的分布(图4)。
相反,在毛细血管和静脉计数之间存在较大差异的个体供体中,可以看出,在30-45fL范围内的颗粒计数通过增加的15秒时间延迟而急剧减少(图5)。从文献中已知在该范围内检测到血小板聚集体,因此可以得出结论,增加的时间延迟通过减少血小板聚集来提高血小板计数的准确性。
示例3:有效孵育时间
为了进一步探索该效果,测试了不同的添加时间延迟。从表I中的结果可以看出,可以通过添加5秒的延迟来辨别改进。对于延迟超过15秒的孵育时间,没有进一步的改善。
表I.不同孵育时间的影响。来自所有供体指尖样本的平均PLT值取样作为参考静脉样本的%
在另一个实验中,探索了混合的效果。增加的延迟设定为60秒,每15秒混合一次。结果(表II)表明与15秒的延迟相比没有进一步的改善。
表II:混合没有额外的影响。来自所有供体指尖样本的平均PLT值取样作为参考静脉样本的百分比(两种不同的Medonic仪器)
应该强调的是,将样本在毛细管中(即在稀释之前)孵育几分钟导致对PLT计数的类似但更慢的改善效果,如下表III所示。
表III来自10个供体的平均PLT值,其中,在第一次稀释发生之前测试了4个不同的孵育时间。
孵育时间(min) | 平均PLT |
0 | 202 |
2 | 212 |
6 | 228 |
10 | 225 |
这些结果描述了PLT如何随着时间的推移而改善,但速度比稀释后进行孵育的速度慢得多。达到可接受的PLT值所花费的时间在市场上不是最佳的或可接受的。
示例4:需要有效的EDTA浓度,取样时需要EDTA
由于***中使用的标准商业稀释剂含有少量EDTA(0.53mM),本发明人试验了较高的EDTA浓度是否会进一步改善结果(表IV)。
表IV:在标准的布尔EDTA塑料微毛细管中采集的样本,稀释剂中EDTA浓度不同(来自所有供体指尖样本的平均PLT值,以参比静脉样本的%表示)
应注意,一定量的EDTA与样本一起从毛细管中带走。“标准EDTA毛细管”用100μgK2EDTA涂覆并采集20μL血液。K2EDTA的摩尔质量为约368g/mol,因此毛细管含有约0.27μmol的EDTA。假设所有EDTA完全洗脱,毛细管中的浓度最大为13.5mM。
因此,1:225的标准稀释度最多为0.06mM毛细管衍生的EDTA。由于使用不含EDTA的稀释剂效率不高,可以得出结论,在目前的条件下,有效的EDTA浓度应高于该浓度。
测试***中使用的标准稀释缓冲液含有0.53mM的EDTA,并显示为有效量。即使孵育时间非常短(5s),3.1mM的额外EDTA似乎也没有产生任何进一步的益处。
在另一个实验中还注意到,当样本在含有3.1mM的EDTA的稀释剂中稀释至1:45000时,不存在对血小板计数的影响。在示例5中进一步研究稀释比的影响。
示例4:样本采集时抗凝剂存在的影响
为了比较,在未处理的毛细管中采集样本并进行血小板计数。有趣的是,即使在稀释剂中存在额外的EDTA,通过更长的孵育也没有改善血小板计数(表V)。在普通毛细血管中采集可能会对血小板聚集产生不可逆转的影响。
表V:没有EDTA的普通玻璃微毛细管表现不佳(所有供体指尖样本的平均PLT值占参考静脉样本的%)
稀释剂中的EDTA | 15+秒延迟 | 300+秒延迟 |
0 | 78,7% | |
0.53mM(标准),实验1 | 76,4% | |
0.53mM(标准),实验2 | 82,6% | 90,1% |
3.1mM | 77,6% |
在另一项测试中,普通毛细血管(无-EDTA)的结果比采用标准循环而没有延迟并使用EDTA毛细血管低7%。
示例5:有效稀释比
由于在1:45000稀释度不再有效果(参见示例3),并且在没有任何稀释的情况下也不产生效果,因此进行实验以比较不同的稀释比。请注意,出于实际原因,同一供体不能在同一场合以超过3次稀释进行测试。
如表VI所示,在1:50至1:450稀释的实验都是有效的。较低的稀释度(1:50至1:225)在扩散方面似乎比1:450略好,其中,效果似乎稍微不那么稳定。
表VI:稀释比率之间的比较
材料和方法
仪器和校准材料
Medonic M系列M32C SN100778,基于fw vl.3的实验性fw vl.3j5。
Medonic M系列M32S SN 100011,基于fw vl.3的实验fw vl.3j5。
Swelab Alfa Plus标准SN100779,基于fw vl.3的实验fw vl.3j5。
Boule Con-Diff普通批次#21605-72
Boule Con-Diff普通批次#21608-72
Boule Calibrator Lot#21606-34
毛细血管
Boule微毛细管,批号#15964507,有效期2019-02
不含EDTA的玻璃微毛细管,Gmbh+,批号#1902542
其他材料和试剂
K2-EDTA真空采血管批号#A15013WK
稀释剂批号#1606-599用于各种稀释剂-EDTA浓度研究
BD2.0mm采血针批号#N8R1259
毛细管采样程序
准备工作
·检查所有要使用的材料是否在手边。
·检查捐赠者椅子是否有扶手。
·用肥皂和清水洗手。
·用消毒酒精消毒双手,让双手在空气中晾干。
·戴防护手套、实验室外套和塑料围裙。
·确保捐赠者清楚程序。
程序
·选择手指,如果可能的话,选择中指或无名指。
·采样位置应位于手掌侧中指或无名指的最远端指骨的一侧。
·如果捐赠者的手是冷的,应该先使其暖和起来,捐赠者的手应该温暖和放松。
·用注射棉签消毒指尖。
·让酒精在空气中消散。
·最好使用接触激活的采血针,蓝色,高流量,BD诊断。
·在取样过程中向下转动供体手掌。
·将采血针稍微放在上面指示的位置并激活它。
·立即从手指上取下采血针,使血液自由流动。
·处理采血针。
·擦去第一滴血。
·等待更多血液,然后让微毛细管抽血而不触摸皮肤直到其被填满。
注意:切勿用力挤压手指,如果血液不流动,使手部进一步温暖并重复此过程。血小板测定程序
·按照用户手册中的说明确保仪器正常工作。
·小心擦去毛细管外部捕获的任何血液。
·从仪器支架上取下MPA适配器,将微型毛细管***其中。
·将适配器重新***仪器,将开始自动测量样本。
注意:有关仪器的完整说明,请参阅用户手册。
Claims (19)
1.一种测定毛细血管血液样本中血小板计数的方法,包括步骤:
a.提供毛细血管血液样本,所述毛细血管血液样本在样本采集时用EDTA进行过抗凝处理;
b.在非裂解缓冲液中以1:10至1:2000的稀释系数稀释所述样本;
c.在有效减少血小板聚集的量的EDTA存在下,将稀释的样本孵育23-300秒的持续时间,其中,EDTA的量为至少0.1mM;
d.任选地,在测定来自所述孵育样本的血小板计数之前,在第二稀释步骤中稀释所述孵育样本;以及
e.从所述孵育样本中测定血小板计数;
其中,步骤b、c、e和任选的d在用于血小板计数的集成装置(100)中进行。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所提供的毛细血管血液样本是在涂覆有EDTA的采样装置中采集的血液样本。
3.根据权利要求1所述的方法,其中,所述稀释系数为1:150至1:300。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,在从所述孵育样本中测定血小板计数之前,对所述孵育样本进行第二稀释步骤。
5.根据权利要求4所述的方法,其中,所述第二稀释步骤包括以1:100-1:300的第二稀释系数稀释所述样本。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其中,所述孵育在0.1-5mM的EDTA存在下进行。
7.根据权利要求4所述的方法,其中,所述孵育在0.1-5mM的EDTA存在下进行。
8.根据权利要求6所述的方法,其中,所述孵育在0.50-0.56mM的EDTA存在下进行。
9.根据前述权利要求1-3中任一项所述的方法,其中,所述孵育步骤持续时间为28-40秒。
10.根据前述权利要求4所述的方法,其中,所述孵育步骤持续时间为28-40秒。
11.根据前述权利要求1-3中任一项所述的方法,其中,所述样本不是来自患有EDTA依赖性假性血小板减少症的患者。
12.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其中,步骤b、c、e和任选的d在一种用于测定毛细血管血液样本中血小板计数的装置(100)中进行;其中,所述装置包括:
a.用于采样装置的接收器(1,19),其包含在样本采集时用EDTA进行抗凝血处理的毛细血管血液样本;
b.稀释元件(8),其用于在非裂解缓冲液中稀释所述样本;和
c.检测器(14,17),其用于测定所述稀释样本中的血小板计数;
其特征在于,所述装置被构造成使得在操作期间:
i.将样本以1:10至1:2000的稀释系数稀释在所述稀释元件(8)中;以及
ii.在从检测器(14,17)中的所述稀释样本中测定血小板计数之前,将所述稀释的样本孵育23-300秒。
13.一种用于测定毛细血管血液样本中血小板计数的装置(100),包括:
a.用于采样装置的接收器(1,19),其包含在样本采集时用EDTA进行抗凝血处理的毛细血管血液样本;
b.稀释元件(8),其用于在非裂解缓冲液中稀释所述样本;和
c.检测器(14,17),其用于测定所述稀释样本中的血小板计数;
其特征在于,所述装置被构造成使得在操作期间:
i.将样本以1:10至1:2000的稀释系数稀释在所述稀释元件(8)中;以及
ii.在从检测器(14,17)中的所述稀释样本中测定血小板计数之前,将所述稀释的样本孵育23-300秒。
14.根据权利要求13所述的装置,其中,所述孵育持续时间为28-40秒。
15.根据权利要求13-14中任一项所述的装置,其中,所述稀释系数为1:30至1:1000。
16.根据权利要求15所述的装置,其中,所述稀释系数为1:150至1:300。
17.根据权利要求13-14中任一项所述的装置,包括第二和/或另一稀释元件(9,13,16),其在操作期间,用于在测定所述孵育样本的血小板计数之前,使样本经受第二稀释步骤。
18.根据权利要求17所述的装置,其中,所述第二稀释步骤包括以1:100-1:300的第二稀释系数稀释所述样本。
19.根据权利要求13-14中任一项所述的装置,其中,所述采样装置是涂覆有EDTA的毛细管。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SE1651481 | 2016-11-11 | ||
SE1651481-2 | 2016-11-11 | ||
PCT/EP2017/077998 WO2018086974A1 (en) | 2016-11-11 | 2017-11-02 | Method and device for thrombocyte counting in capillary blood |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109923418A CN109923418A (zh) | 2019-06-21 |
CN109923418B true CN109923418B (zh) | 2020-12-11 |
Family
ID=60421739
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201780069467.3A Active CN109923418B (zh) | 2016-11-11 | 2017-11-02 | 用于毛细血管中血小板计数的方法和装置 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20200096530A1 (zh) |
EP (1) | EP3538887B1 (zh) |
JP (1) | JP7062649B2 (zh) |
CN (1) | CN109923418B (zh) |
ES (1) | ES2874180T3 (zh) |
WO (1) | WO2018086974A1 (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2020113527A1 (zh) * | 2018-12-06 | 2020-06-11 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 一种检测白细胞的方法、血液细胞分析仪及存储介质 |
GB2584775B (en) | 2019-03-28 | 2022-08-10 | Johnson Matthey Plc | Molecular sieve intergrowths of cha and aft having an "sfw-GME tail", methods of preparation and use |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP3510597B2 (ja) * | 2001-02-09 | 2004-03-29 | 俊逸 通木 | 血液分離装置及び血液検査方法 |
CN102778425A (zh) * | 2011-05-10 | 2012-11-14 | 株式会社堀场制作所 | 血细胞计数用试剂及血液分析方法 |
CN104931398A (zh) * | 2014-03-18 | 2015-09-23 | 日本光电工业株式会社 | 血液检查装置和血液检查方法 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE515423C2 (sv) | 1998-02-06 | 2001-07-30 | Boule Medical Ab | Förfarande och anordning för spädning av ett blodprov |
JP2005534895A (ja) * | 2002-06-11 | 2005-11-17 | ケムパック エイ/エス | 異なるタイプの白血球細胞の同時計数のための溶解試薬、カートリッジおよび自動電子細胞カウンタ |
US20060047221A1 (en) * | 2004-08-24 | 2006-03-02 | Honeywell International, Inc. | New method to reduce complete blood count variation of peripheral blood sample |
FR2945126B1 (fr) * | 2009-04-29 | 2019-11-01 | Commissariat A L'energie Atomique | Procede et appareil de comptage des thrombocytes |
WO2014159692A1 (en) * | 2013-03-13 | 2014-10-02 | Tahoe Institute for Rural Health Research, LLC | Portable blood count monitor |
-
2017
- 2017-11-02 WO PCT/EP2017/077998 patent/WO2018086974A1/en unknown
- 2017-11-02 US US16/468,631 patent/US20200096530A1/en not_active Abandoned
- 2017-11-02 JP JP2019520432A patent/JP7062649B2/ja active Active
- 2017-11-02 CN CN201780069467.3A patent/CN109923418B/zh active Active
- 2017-11-02 EP EP17801617.6A patent/EP3538887B1/en active Active
- 2017-11-02 ES ES17801617T patent/ES2874180T3/es active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP3510597B2 (ja) * | 2001-02-09 | 2004-03-29 | 俊逸 通木 | 血液分離装置及び血液検査方法 |
CN102778425A (zh) * | 2011-05-10 | 2012-11-14 | 株式会社堀场制作所 | 血细胞计数用试剂及血液分析方法 |
CN104931398A (zh) * | 2014-03-18 | 2015-09-23 | 日本光电工业株式会社 | 血液检查装置和血液检查方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
A microfluidic biochip for complete blood cell counts at the point-of-care;U. Hassan et al;《Technology (Singap World Sci)》;20151231;第3卷(第4期);正文第9页第3-4段,附图10 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2018086974A1 (en) | 2018-05-17 |
JP2020501114A (ja) | 2020-01-16 |
ES2874180T3 (es) | 2021-11-04 |
US20200096530A1 (en) | 2020-03-26 |
EP3538887B1 (en) | 2021-03-03 |
EP3538887A1 (en) | 2019-09-18 |
JP7062649B2 (ja) | 2022-05-06 |
CN109923418A (zh) | 2019-06-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP2685816B1 (en) | Systems and methods for autologous biological therapeutics | |
JP6596491B2 (ja) | 流体試料を撮像するためのシステム及び方法 | |
US20120214224A1 (en) | Flow based clinical analysis | |
EP3273217B1 (en) | Sample collection and separation device | |
CN111527406A (zh) | 一种用于流式细胞仪分析的淋巴细胞样品的制备方法 | |
CN109923418B (zh) | 用于毛细血管中血小板计数的方法和装置 | |
WO2011100595A2 (en) | Methods and devices for sample collection, treatment and dispensing | |
JP3523883B2 (ja) | 血液検査の実施方法 | |
Yu et al. | Enumeration of HPC in mobilized peripheral blood with the Sysmex SE9500 predicts final CD34+ cell yield in the apheresis collection | |
US20170023597A1 (en) | Blood condition analysis device, blood condition analysis system, blood condition analysis method, and blood condition analysis program for causing computer to implement the method | |
Cadamuro et al. | What´ s floating on my plasma? | |
Landt et al. | Interference in ionized calcium measurements by heparin salts | |
CN203535053U (zh) | 用于检测nk细胞活性的试剂盒 | |
Stephen et al. | Analytical comparison between microhematocrit and automated methods for packed cell volume (PCV) determination | |
US7727764B2 (en) | Non-isopycnic cell purification using percoll | |
Aryandi et al. | Analysis of differences in erythrocyte morphology in K3EDTA and Na2EDTA blood clots based on time sample storage | |
Li et al. | Effects of Different Kinds of Hand Sanitizers on Complete Blood Count and Leukocyte Differential Count. | |
CN114127535A (zh) | 一种细胞分析仪、基于阻抗法对白细胞进行分类的方法及计算机可读存储介质 | |
Ali | Effect of Storage at Temperature (4C) on Complete Blood Count Parameters | |
CN117629716A (zh) | 一种细胞固定液及细胞醛化方法 | |
Gray et al. | Is plasma the answer? An evaluation of BD Vacutainer Barricor to meet ED turnaround time requirements | |
MUNIR et al. | Comparison between branded CBC vials versus laboratory made vials | |
Pang et al. | Multianticoagulant Pseudothrombocytopenia in a Patient with Primary Carcinoma of the Liver with Hypersplenism. | |
Lis | Influence of method of venous blood collection on the blood cell count determination result | |
Kubiak et al. | The diagnostic pitfalls and challenges associated with basic hematological tests |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |