CN109913512A - 生物发酵生产长链二元酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物发酵生产长链二元酸的方法，发酵开始时或发酵过程中，菌体浓度达到OD620为50～200。本发明的生物发酵生产长链二元酸的方法，转化率高，生产强度高，具体良好的应用前景。

Description

生物发酵生产长链二元酸的方法

技术领域

本发明涉及生物发酵生产长链二元酸的方法。

背景技术

长链二元酸(Long chain dicarboxy acids)是指碳链中含有9个及以上碳原子的脂肪族二元酸(简称DCn)，包括饱和以及不饱和二元酸，是一类有着重要和广泛工业用途的精细化工产品，是化学工业中合成高级香料、高性能工程塑料、高温电介质、高档热熔胶、耐寒增塑剂、高级润滑油、高级油漆和涂料等的重要原料。

长链二元酸在自然界中并不存在，一般可以通过化学合成法和生物发酵法制备得到。化学合成方法合成路线长，反应条件严格，需要在高温高压条件下进行，并且对催化剂要求比较苛刻，因此在工业规模上，以化学法合成的长链二元酸品种较少，只有十二碳长链二元酸等少数品种。微生物发酵法兴起于70年代，其在石油化工领域有广泛的应用，在国内外受到普遍重视。目前长链二元酸的生产已逐步采用生物发酵法进行。

在长链二元酸的生物发酵法生产的研究中，我国在培育高产菌株、优化发酵工艺和建立分离提取方法等方面取得了突出成绩，但目前普遍存在的问题在于：长链二元酸发酵生产强度较低。例如：中国专利CN1928100A中DC12生产效率是1.3g/L·h，中国专利CN102115765A中十七碳二元酸的生产效率为1.13g/L·h，中国专利CN10225411A中混合二元酸的生产效率仅有0.92g/L·h。为提高生产强度，一般从重点研究菌种筛选和改良等方面进行了大量研究工作，例如：专利CN1233658A、CN1130685A、CN1162644A、CN1369464A、CN1092108A、CN1034579A、CN1046757A等。

目前，通过对发酵工艺的改变提高长链二元酸生产效率的报道并不多见。中国专利CN201410065873.0和CN201410067073.2针对长链二元酸发酵过程的特点，开发一种发酵与膜分离耦合生产长链二元酸的新技术。该技术利用膜工艺回流菌体并分离出已合成的高浓度二元酸，通过减少产物二元酸对其合成过程的抑制作用，来提高发酵过程的菌体密度，缩短发酵周期，提高合成二元酸的生产强度，采用膜分离回流菌体时，未被利用的正烷烃也同时返回至发酵过程，降低了二元酸提取过程烷烃分离的难度，上述两个方法的产酸量可以分别达到240g/L和250g/L，产酸速率分别大于1.5g/h·L和1.6g/h·L。但是，在上述基础上，对产酸速率和产酸量的更高的追求，是现有技术研究的动力。

发明内容

为了解决现有技术中生物法生产长链二元酸的工艺生产效率不够高且产酸量较低的问题，本发明提供一种生物发酵生产长链二元酸的方法，本发明的生物发酵生产长链二元酸的方法，转化率高，生产强度高，具体良好的应用前景。

一种生物发酵生产长链二元酸的方法，所述发酵开始时，或者，所述发酵过程中，菌体浓度达到OD₆₂₀为50～200，优选90～160。

以上针对上述技术方案的优选的技术方案做进一步说明。

本发明人在大量实践和理论分析的基础上，创造性的发现：菌体浓度是制约长链二元酸生产过程中转化过程的关键因素之一，特定的菌体浓度能够实现长链二元酸的高转化率和生产强度。本发明只需要在发酵开始时或者发酵过程中，实现上述菌体浓度即可，而对实现上述菌体浓度的方式和手段，不做任何限定。本领域技术人员均理解，只要实现了上述菌体浓度，不论采用怎样的方法，均在本发明的保护范围内。例如，本发明可以在菌体培养(生长阶段)与发酵过程(底物转化阶段)之间，增加菌体浓缩步骤，以此保证在发酵开始时或发酵过程中特定的菌体浓度，通过这样的方式，提高长链二元酸的转化率和生产强度。

本发明中，对菌体加入方式没有要求，只要保证在发酵开始时达到所述菌体浓度，或者，发酵过程中，达到所述菌体浓度即可。本发明的一个优选的技术方案，一次性加入菌体，再开始发酵，使发酵开始时菌体浓度达到OD₆₂₀为50～200；本发明的一个优选的技术方案，所述发酵过程中，分批加入菌体，使发酵过程中，菌体浓度达到OD₆₂₀为50～200。

本发明的一个优选的技术方案，所述发酵前，先进行菌体培养。所述发酵过程与菌体培养不连续进行。例如可以为：所述发酵过程与菌体培养分开进行，即：所述发酵在发酵罐中进行，所述菌体培养在种子培养罐中进行；或者，所述菌体培养和所述发酵在同一罐中进行，但所述但菌体培养后不直接进行发酵。

本发明的一个优选的技术方案，所述菌体经浓缩后，再加入发酵体系中。

本发明的一个优选的技术方案，在种子罐中进行所述菌体培养，将所述菌体培养，当菌体浓度达到OD₆₂₀为15～30时，将菌体浓缩，再加入发酵体系中。

本发明的一个优选的技术方案，所述菌体的浓缩倍数为2～40倍，优选5～30倍，进一步优选5～20倍。

本发明的一个优选的技术方案，所述浓缩的方法为离心分离、膜分离等。其中，所述离心分离采用全密封的离心机，离心力为2000G以上。所述膜分离使用微滤膜或超滤膜进行分离；当采用微滤膜分离时，所述微滤膜为孔径0.1～1μm的有机或无机膜，分离时的压力为0.01～0.2Mpa；当采用超滤膜分离时，所述超滤膜为膜截留分子量1～1,000KDa的有机或无机膜，分离时的压力为0.1～1.0Mpa。上述方法和参数，是发明人经过大量研发后的成果，在上述范围内，可以保证浓缩后的菌体仍然处在较为平稳的状态，可以直接进行之后的发酵工艺，并且产酸效率和速度较高。而大部分的浓缩操作，或者破坏了菌体的活性，或者虽然没有使菌体完全失活，但是影响菌体在之后的发酵工艺中状态，使发酵体系不能高速运行，产酸强度反而降低。

按照本领域常规，所述浓缩用的设备可视材质进行蒸汽、次氯酸钠洗涤灭菌。

本发明的一个优选的技术方案，在使用本发明菌株和生产工艺制备长链二元酸的实施过程中，微生物培养基包括碳源、氮源、无机盐、营养因子等。其中，碳源可以为假丝酵母可发酵性糖，包括但不限于葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等的一种或多种；氮源可以为有机氮和/或无机氮，有机氮包括但不限于酵母膏、蛋白胨、玉米浆中的一种或多种，无机氮包括但不限于尿素、硫酸铵、硝酸钾中的一种或多种；无机盐包括但不限于磷酸二氢钾、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、氯化铁、硫酸铜中的一种或多种；营养因子包括维生素B1、维生素B2，维生素C、生物素中的一种或多种。

本发明的一个优选的技术方案，所述发酵培养基包括：1～10g/L玉米浆液，1～10g/L酵母提取液，5～12g/L KH₂PO₄，0～3g/L氯化钠，4～12g/L硝酸钾，10～40g/L蔗糖和0.5～3g/L脲。所述发酵培养基用水与1N氢氧化钠溶液将pH调节至7.5～7.8。将所述发酵培养基在121℃下灭菌20min。尿素单独灭菌，110℃下灭菌15min，冷却后与灭过菌的其他成分混合，作为发酵培养基使用。

本发明的一个优选的技术方案，所述发酵培养基的添加量为发酵罐体积的80％以下，优选5～50％，更优选15～40％，最优选15～30％；由于本发明的对菌体浓度的特殊性要求，在发酵培养基的添加量方面，可以参考本领域常规添加量；而优选的添加量，比常规发酵培养基的添加量小，并且可以获得更好的转化率和长链二元酸生产强度等效果。

本发明对加入培养基的时间不做限定，只要按照本领域常规的培养基加入时机加入所述培养基，均可实现本发明的效果。为取得更好的转化效果，本发明的一个优选的技术方案，加入所述菌体前，加入发酵培养基；或者，加入所述菌体时，加入发酵培养基；或者，所述发酵过程中，加入发酵培养基。

本发明的一个优选的技术方案，所述发酵过程中，所述发酵培养基以连续或者间歇的方式补加。

本发明的一个优选的技术方案，所述菌种为热带假丝酵母(Candida Tropicalis)或清酒假丝酵母(Candida sake)。例如：可以为热带假丝酵母(Candida Tropicalis)(保藏号为CCTCCM203052)，或者热带假丝酵母(Candida Tropicalis)CATN145(保藏号为CCTCCM2011192)，或者清酒假丝酵母(Candida sake)CATH4013(保藏号为CCTCCM2011486)，或者清酒假丝酵母(Candida sake)CATH4014(保藏号为CCTCCM2011487)，或者清酒假丝酵母(Candida sake)CATH4012(保藏号为CCTCCM2011485)，或者清酒假丝酵母(Candidasake)CATH4016(保藏号为CCTCCM2011488)，或者清酒假丝酵母(Candida sake)CATH430(保藏号为CCTCCM2011489)。

本发明的一个优选的技术方案，所述发酵的底物包括C9～C18的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种；优选包括C11～C16的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种；更优选为C11、C12、C13、C15、C14或C16的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种。

本发明的一个优选的技术方案，所述发酵过程中，所述底物以连续或间歇的方式加入。

本发明的一个优选的技术方案，所述长链二元酸包括壬二酸、癸二酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸、十七碳二元酸、十八碳二元酸、或9-烯-十八碳二酸中的一种或多种。

本发明的一个优选的技术方案，所述发酵时的罐温为27～35℃。

本发明的一个优选的技术方案，所述发酵时的通风比为1∶1.0～0.2vvm。

本发明的一个优选的技术方案，所述发酵时的罐压为0.05～0.1Mpa。

本发明的一个优选的技术方案，所述发酵时的pH为7.0～8.5。

本发明的一个优选的技术方案，所述发酵时间为100～170h。

本发明的一个优选的技术方案，所述菌体培养可以在以下条件下进行：培养温度28～30℃；和/或，通风比0.3～0.6vvm；和/或，罐压为0.08～0.1MPa(表压)；和/或，培养时间12～36h。

本发明的一个优选的技术方案，所述菌体培养的培养基为水溶液培养基；优选地，所述菌体培养基包括：蔗糖10～30g/L、玉米浆1.5～10g/L、酵母提取液1～10g/L、磷酸二氢钾4～12g/L、尿素0.5～5g/L、烷烃0～30ml/L，所述菌体培养基用水制备，并灭菌。

因为本发明有效将菌体生长和底物转化阶段分离，因而培养基的差别、pH等的差异并不影响本发明的应用。

本发明的有益效果是：本发明的生物发酵生产长链二元酸的方法，转化率高，生产强度高；菌体分离浓缩过程不受二元酸、底物等影响，分离浓缩效率高；种子培养基中无机盐和可溶性有机物不会带入发酵体系，避免杂质带入后提取工艺，减少杂质对后提取工艺的影响，避免二元酸分离提纯困难的工程化难题；培养基使用量大幅度降低，减少物耗和环保压力；具体良好的应用前景。

具体实施方式

在本发明中，除非特别指出，在组分、反应条件、浓度等参数中使用“大约”来修正数值。因此在说明书和权利要求书中的数值参数是一个近似值，取决于本发明所期望的性能。至少，不应认为是对本发明权利要求保护的等同原则应用的限制。至少，每个参数的数值运用四舍五入，根据记载的有效数字的位数来确定。虽然在具体实施例中的数值尽可能做到准确，但是由于实验测试方法的***误差必然导致任何数据都会有一定的误差。

下面通过实施例对本发明进行详细说明，以使本发明的特征和优点更清楚。但应该指出，实施例用于理解本发明的构思，本发明的范围并不仅仅局限于本文中所列出的实施例。

如没有特别说明，本发明所述的浓度均为质量百分比浓度。

本发明中，测定培养液中的二元酸浓度，可以采用本领域技术人员熟知的技术，例如中国专利CN95117436.3公开的测定方法。具体来说，用盐酸溶液调节发酵液的pH到3.0，然后加100mL***用于萃取发酵液中的二元酸，再采用蒸发以去除***，得到二元酸粉末；将得到的二元酸粉末溶解在乙醇中，并用0.1mol/L的NaOH溶液滴定，最终得到发酵液中的二元酸滴定量。

实施例1

(1)取热带假丝酵母(保藏号CCTCCNO：M203052)的甘油管菌种，接种于装有液体培养基(蛋白胨10g/kg，酵母膏10g/kg，葡萄糖10g/kg，pH自然)的种子瓶中，31℃温度、300rpm摇床速度下摇床培养10～15小时；

(2)取上述摇瓶种子，接入装有种子培养基(水溶液培养基，包括：蔗糖20g/L、玉米浆6g/L、酵母提取液6g/L、磷酸二氢钾8g/L、尿素2.5g/L，灭菌)的种子罐中，于31℃培养；

(3)当菌种浓度为OD₆₂₀达到20时，采用膜分离浓缩菌体，膜分离采用孔径0.1～1μm的微滤膜，分离压力0.12Mpa，浓缩倍数为10倍；

(4)将浓缩菌体加入到发酵罐中，同时加入发酵罐体积25％的发酵培养基，加入烷烃，使得OD₆₂₀达到100，发酵；

发酵培养基包括：5g/L玉米浆液，4g/L酵母提取液，8g/L KH₂PO₄，1g/L氯化钠，7g/L硝酸钾，30g/L蔗糖和2.1g/L脲；

发酵在以下条件下进行：罐温：31.0±2.0℃，通风比：1∶0.5vvm，罐压：0.08Mpa，pH：7.5；发酵过程持续添加烷烃；发酵时间：135h。

DC12生产强度为1.52g/h·L，DC12平均浓度205.0g/L。

实施例2

(1)取热带假丝酵母(保藏号CCTCCNO：M203052)的甘油管菌种，接种于装有液体培养基(蛋白胨10g/kg，酵母膏5g/kg，葡萄糖10g/kg，pH自然)的种子瓶中，31℃温度、300rpm摇床速度下摇床培养10～15小时；

(2)取上述摇瓶种子，接入装有种子培养基(水溶液培养基，包括：蔗糖20g/L、玉米浆6g/L、酵母提取液6g/L、磷酸二氢钾8g/L、尿素2.5g/L，灭菌)的种子罐中，于31℃培养；

(3)当OD₆₂₀达到20时，采用膜分离浓缩菌体(第一次浓缩)，膜分离采用膜截留分子量1,000KDa的超滤膜，分离压力0.5Mpa，浓缩倍数为10倍；

(4)将浓缩菌体加入到发酵罐中，同时加入发酵罐体积25％的发酵培养基，加入烷烃，使得OD₆₂₀达到100；

(5)重复步骤(1)～(3)，进行第二次浓缩；

(6)发酵55h后将步骤(5)所得菌体加入发酵罐中，发酵；

发酵培养基包括：7g/L玉米浆液，5g/L酵母提取液，6g/L KH₂PO₄，1.2g/L氯化钠，6g/L硝酸钾，25g/L蔗糖和1.8g/L脲；

发酵在以下条件下进行：罐温：31.0℃，通风比：1∶0.8vvm，罐压：0.06Mpa，pH：7.8；发酵过程持续添加烷烃；发酵时间：119h。

DC12生产强度为2.07g/h·L，DC12平均浓度267.0g/L。

实施例3

(1)取热带假丝酵母(保藏号CCTCCM：2011192)的甘油管菌种，接种于装有液体培养基(蛋白胨10g/kg，酵母膏5g/kg，葡萄糖10g/kg，pH自然)的种子瓶中，32℃温度、300rpm摇床速度下摇床培养10～15小时；

(2)取上述摇瓶种子，接入装有种子培养基(水溶液培养基，包括：蔗糖20g/L、玉米浆6g/L、酵母提取液6g/L、磷酸二氢钾8g/L、尿素2.5g/L，灭菌)的种子罐中，于32℃培养；

(3)当OD₆₂₀达到20时，采用采用膜分离浓缩菌体(第一次浓缩)，膜分离采用孔径0.1～1μm的微滤膜，分离压力0.15Mpa，浓缩倍数为10倍；

(4)将浓缩菌体加入到发酵罐中，同时加入发酵罐体积25％的发酵培养基，加入烷烃，使得OD₆₂₀达到100；

(5)在第一次浓缩的轻相中，补加菌体和30％种子培养基重新进行种子培养，并按上述步骤浓缩菌体(第二次浓缩)；

(6)发酵55h后将步骤(5)加入发酵罐中，继续补加烷烃发酵，发酵；

发酵培养基包括：8g/LKH₂PO₄，1.5g/L氯化钠，8g/L硝酸钾，27g/L葡萄糖，0.3g/L柠檬酸，0.2g/LCaCl₂，ZnSO₄；

发酵在以下条件下进行：罐温：32.0℃，通风比：1∶0.6vvm，罐压：0.04Mpa，pH：8.0，发酵时间：120h。

DC12生产强度分别是2.01g/h·L，DC12平均浓度241.0g/L。

实施例4

(1)取清酒假丝酵母(Candida sake)CATH4014(保藏号为CCTCCM2011487)的甘油管菌种，接种于装有液体培养基(蛋白胨10g/kg，酵母膏5g/kg，葡萄糖10g/kg，pH自然)的种子瓶中，31℃温度、300rpm摇床速度下摇床培养10～15小时；

(2)取上述摇瓶种子，接入装有种子培养基(水溶液培养基，包括：蔗糖20g/L、玉米浆6g/L、酵母提取液6g/L、磷酸二氢钾8g/L、尿素2.5g/L，灭菌)的种子罐中，于31℃培养；

(3)当OD₆₂₀达到15时，采用膜分离浓缩菌体(第一次浓缩)，膜分离采用膜截留分子量1,000KDa的超滤膜，分离压力0.8Mpa，浓缩倍数为20倍；

(4)将浓缩菌体加入到发酵罐中，同时加入发酵罐体积30％的发酵培养基，加入烷烃，使得OD₆₂₀达到150，发酵；

发酵培养基包括：7g/L玉米浆液，5g/L酵母提取液，6g/L KH₂PO₄，1.2g/L氯化钠，6g/L硝酸钾，25g/L蔗糖和1.8g/L脲；

发酵在以下条件下进行：罐温：31.0℃，通风比：1∶0.8vvm，罐压：0.06Mpa，pH：7.8；发酵过程持续添加烷烃；发酵时间：119h。

DC12生产强度为1.67g/h·L，DC12平均浓度201.0g/L。

实施例5

(1)取清酒假丝酵母(Candida sake)CATH430(保藏号为CCTCCM2011489)的甘油管菌种，接种于装有液体培养基(蛋白胨10g/kg，酵母膏5g/kg，葡萄糖10g/kg，pH自然)的种子瓶中，31℃温度、300rpm摇床速度下摇床培养10～15小时；

(2)取上述摇瓶种子，接入装有种子培养基(水溶液培养基，包括：蔗糖20g/L、玉米浆6g/L、酵母提取液6g/L、磷酸二氢钾8g/L、尿素2.5g/L，灭菌)的种子罐中，于30℃培养；

(3)当OD₆₂₀达到30时，采用离心浓缩菌体(第一次浓缩)，离心力为2500G，浓缩倍数为20倍；

(4)将浓缩菌体加入到发酵罐中，同时加入发酵罐体积45％的发酵培养基，加入烷烃，使得OD₆₂₀达到150，发酵；

(5)重复步骤(1)～(3)，进行第二次浓缩；

(6)发酵65h后将步骤(5)所得菌体加入发酵罐中，发酵；

发酵培养基包括：7g/L玉米浆液，5g/L酵母提取液，6g/L KH₂PO₄，1.2g/L氯化钠，6g/L硝酸钾，25g/L蔗糖和1.8g/L脲；

发酵在以下条件下进行：罐温：31.0℃，通风比：1∶0.9vvm，罐压：0.07Mpa，pH：7.2；发酵过程持续添加烷烃；发酵时间：141h。

DC12生产强度为2.12g/h·L，DC12平均浓度259.0g/L。

对比例1

(1)取热带假丝酵母(保藏号CCTCCNO：M203052)的甘油管菌种，接种于装有液体培养基(蛋白胨10g/kg，酵母膏10g/kg，葡萄糖10g/kg，pH自然)的种子瓶中，31℃温度、300rpm摇床速度下摇床培养10～15小时；

(2)取上述摇瓶种子，接入装有种子培养基(水溶液培养基，包括：蔗糖20g/L、玉米浆6g/L、酵母提取液6g/L、磷酸二氢钾8g/L、尿素2.5g/L，灭菌)的种子罐中，于31℃培养；

(3)当菌种浓度为OD₆₂₀达到20时，将浓缩菌体加入到发酵罐中，同时加入发酵罐体积25％发酵培养基，加入烷烃，发酵；

发酵培养基包括：5g/L玉米浆液，4g/L酵母提取液，8g/L KH₂PO₄，1g/L氯化钠，7g/L硝酸钾，30g/L蔗糖和2.1g/L脲；

发酵在以下条件下进行：罐温：31.0±2.0℃，通风比：1∶0.5vvm，罐压：0.08Mpa，pH：7.5；发酵过程持续添加烷烃；发酵时间：135h。

DC12生产强度为1.15g/h·L，DC12平均浓度149.0g/L。

Claims (10)

1.生物发酵生产长链二元酸的方法，其特征在于：所述发酵开始时，或者，所述发酵过程中，菌体浓度达到OD₆₂₀为50～200，优选90～160。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述菌体经浓缩后，再加入发酵体系中。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：将所述菌体培养，当菌体浓度达到OD₆₂₀为15～30时，将菌体浓缩，再加入发酵体系中。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述菌体的浓缩倍数为2～40倍，优选5～30倍，进一步优选5～20倍。

5.如权利要求2-4任一项所述的方法，其特征在于：所述浓缩的方法为离心分离或膜分离；

其中，所述离心分离的离心力为2000G以上；所述膜分离使用微滤膜或超滤膜进行分离；当采用微滤膜分离时，所述微滤膜为孔径0.1～1μm的有机或无机膜，分离时的压力为0.01～0.2Mpa；当采用超滤膜分离时，所述超滤膜为膜截留分子量1～1,000KDa的有机或无机膜，分离时的压力为0.1～1.0Mpa。

6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基的添加量为发酵罐体积的80％以下，优选5～50％，更优选15～40％，最优选15～30％。

7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于：加入菌体前，加入所述发酵培养基；或者，加入所述菌体时，加入所述发酵培养基；或者，所述发酵过程中，加入所述发酵培养基；

和/或，所述发酵培养基以连续或者间歇的方式补加。

8.如权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于：所述菌种为热带假丝酵母(CandidaTropicalis)或清酒假丝酵母(Candida sake)。

9.如权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于：所述发酵的底物包括C9～C18的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种；优选包括C11～C16的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种；更优选为C11、C12、C13、C15、C14或C16的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种；

所述发酵过程中，所述烷烃以连续或间歇的方式加入；

和/或，所述长链二元酸包括壬二酸、癸二酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸、十七碳二元酸、十八碳二元酸、或9-烯-十八碳二酸中的一种或多种。

10.如权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于：所述发酵时的罐温为27～35℃；

和/或，所述发酵时的通风比为1∶1.0～0.2vvm；

和/或，所述发酵时的罐压为0.05～0.1Mpa；

和/或，所述发酵时的pH为7.0～8.5；

和/或，所述发酵时间为100～170h。