CN109913201B - 基于黑磷的近红外二区荧光纳米探针及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于黑磷的近红外二区荧光纳米探针及其制备方法和应用，其制备方法包括以下步骤：将红磷或黑磷与球磨体混匀后球磨1‑200h，然后向其中加入疏水性配体，继续球磨1‑200h，得到表面修饰疏水配体的黑磷纳米颗粒；将所述表面修饰疏水配体的黑磷纳米颗粒与两亲性分子按质量比为1:100‑200溶于挥发性的有机溶剂，然后挥发除去有机溶剂，将得到的物质与水混匀后剧烈搅拌，得到水溶性的基于黑磷的近红外二区荧光纳米探针。该制备方法得到的近红外二区荧光纳米探针具有较强和较宽的荧光信号，可以实现多波长激发和多波长发射，在生物成像方面具有广阔的应用前景。

Description

基于黑磷的近红外二区荧光纳米探针及其制备和应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种基于黑磷的近红外二区荧光纳米探针及其制备和应用。

背景技术

黑磷作为一种新兴的二维半导体材料，其单层或者数层的纳米结构具有独特的光电性质 (高载流子迁移率、可调谐带隙、高开关率)和光热效应，在光电、能源储备和生物医药方面吸引了广泛的关注。在生物医学方面，由于磷作为一种生物机体和功能的基本元素，黑磷及其降解产物被认为具有优异的生物相容性。但是，黑磷纳米结构很容易与水和氧气作用而降解，从而影响其光学和电学性质及应用性能。因此如何通过表面修饰、提高其光学和电学性质及其应用性能已经成为研究的热点。目前表面修饰的方法有物理包覆(如采用PLGA(聚乳酸羟基乙酸)将黑磷量子点包覆)、共价键合(如将荧光染料共价偶联在黑磷纳米片表面)、配位键合(如通过有机金属钛与黑磷表面的磷原子配位)。这些方法均一定程度上提高了黑磷的稳定性。申请号为201510968976.2的中国专利公开了一种具有生物相容性的黑磷纳米颗粒及其制备方法和应用，采用水溶性的生物相容性分子修饰黑磷纳米颗粒，得到可以直接用于生物医学应用(如光声成像、光热治疗、光动力治疗等)的纳米颗粒。然而，由于采用水溶性的生物相容性分子修饰纳米颗粒，水分子和氧气极易与黑磷纳米颗粒表面的磷原子发生反应，影响其物理化学性质和使用性能。

黑磷纳米结构的可调谐带隙决定其具有可调的发光性质。由于其发光性质受周围环境(如水分子、氧气)影响，有关黑磷纳米颗粒溶液的荧光性质研究相对较少，尤其尚无其近红外二区荧光性质在生物医学领域的报道。相比于可见光和近红外一区荧光，近红外二区荧光具有较高的组织穿透深度、较高的信噪比、较低的组织散射等特点，使得近红外二区成像的灵敏度和对比度都较高，在影像诊断上具有巨大的应用潜力。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种基于黑磷的近红外二区荧光纳米探针及其制备和应用。本发明的探针制备方法具有操作简单，易于推广，产率高的特点，该方法制备得到的近红外二区荧光纳米探针具有较强和较宽的荧光信号，可以实现多波长激发和多波长发射，在生物成像方面具有广阔的应用前景。

本发明的第一个目的是提供一种基于黑磷的近红外二区荧光纳米探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)将红磷或黑磷与球磨体混匀后球磨1-200h(优选为10-20h)，然后向其中加入疏水性配体，继续球磨1-200h(优选为10-60h)，得到表面修饰疏水配体的黑磷纳米颗粒；所述红磷或黑磷与球磨体的质量比为1:1-500(优选为1:100-300)；红磷或黑磷与所述疏水性配体的质量比为1:1-20；

(2)将所述表面修饰疏水配体的黑磷纳米颗粒与两亲性分子溶于挥发性的有机溶剂，然后挥发除去有机溶剂，将得到的物质与水混匀后剧烈搅拌，得到水溶性的基于黑磷的近红外二区荧光纳米探针。

进一步地，在步骤(1)中，所述疏水性配体为长链烷基胺、长链烷基醇、环状芳香族类的胺、环状芳香族类的醇、胆固醇、豆固醇和以上物质的衍生物中的一种或几种。

优选地，疏水性配体为油胺或胆固醇。

在步骤(1)中，疏水性配体通过其功能基团与黑磷表面的磷酸根或磷原子化学作用。本发明通过改变黑磷纳米颗粒的表面修饰配体来调控其近红外二区荧光性质，使其具有较强的近红外二区荧光。

进一步地，所述球磨体为球磨珠，所述球磨珠的粒径为0.3-50mm，球磨转速为500-2000r/min。

进一步地，在步骤(1)中，加入疏水性配体球磨1-200h后，还包括以下步骤：

将得到的产物在分散介质中超声分散，离心取上清液，向所述上清液中加入沉淀剂，然后收集沉淀物，得到所述表面修饰疏水配体的黑磷纳米颗粒。

进一步地，离心转速为500～5000r/min。

进一步地，所述分散介质为四氢呋喃、氯仿、环己烷、正庚烷和甲苯中的一种或几种。

进一步地，所述沉淀剂为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇、***、丙酮。

进一步地，在步骤(2)中，所述两亲性分子为脂质体、聚乙二醇化的磷脂、聚乙二醇- 聚乳酸和聚乙二醇-聚己内酯共聚物中的一种或几种。

进一步地，步骤(1)中的红磷或黑磷与步骤(2)中的两亲性分子的质量比为1:100-200。

进一步地，在步骤(2)中，将得到的物质与水混匀后还包括离心除去不溶物，然后透析去除两亲性分子和冷冻干燥的步骤。冷冻干燥后得到可长期储存的近红外二区荧光纳米探针粉末。

进一步地，离心转速为500-5000r/min，透析袋的截留分子量为8000-100,000Da。

本发明的第二个目的是提供一种采用上述制备方法所制备的基于黑磷的近红外二区荧光纳米探针，包括黑磷纳米颗粒，所述黑磷纳米颗粒表面修饰有疏水性配体，所述疏水性配体表面包裹有两亲性分子，所述基于黑磷的近红外二区荧光纳米探针的粒径为50-200nm，激发波长为800-1000nm，发射波长为900-1700nm。

本发明的第三个目的是要求保护基于黑磷的近红外二区荧光纳米探针在制备近红外二区荧光成像制剂中的应用。

本发明的近红外二区荧光纳米探针可以实现多波长激发，宽波长发射，实现近红外二区荧光成像。

本发明的近红外二区荧光纳米探针可实现近红外二区的活体荧光成像，可以通过口服或静脉注射方式输送到动物体内，然后在激光照射下，清晰显示动物的各个脏器和组织、解剖学结构特征，同时可用在激光照射下观察探针在体内的循环、分布、代谢等生理过程。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明提供的基于黑磷的近红外二区荧光纳米探针与表面配体之间具有很强的相互作用，使其具有良好的亲油性，再利用两亲性分子包覆在它们表面，得到一种化学稳定性和生物相容性较高的基于黑磷的纳米探针。本发明的基于黑磷的近红外二区荧光纳米探针可用于制备近红外二区荧光成像制剂，实现生物成像，在激光照射下，可以清晰显示动物的各个脏器组织、解剖学结构特征，以及探针在体内的循环、分布、代谢等生理过程。

本发明的探针制备方法具有操作简单，易于推广，产率高的特点。该方法制备得到的近红外二区荧光纳米探针具有较强和较宽的荧光信号，可以实现多波长激发和多波长发射，在生物成像方面具有广阔的应用前景。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1为本发明实施例1中原料红磷与产物黑磷的X-射线衍射图谱；

图2为本发明实施例2中表面修饰有油胺(OM)的黑磷纳米颗粒在四氢呋喃溶液中的粒径分布图；

图3为本发明实施例2中表面修饰有油胺(OM)的黑磷纳米颗粒的透射电镜图；

图4为本发明实施例2中表面修饰有油胺(OM)的黑磷纳米颗粒的氯仿/四氢呋喃溶液在808nm激光照射下近红外二区的荧光光谱图；

图5为本发明实施例3中制备的BP-OM@lipid-PEG纳米颗粒的水合粒径分布图；

图6为本发明实施例3中制备的BP-OM@lipid-PEG纳米颗粒的透射电镜图；

图7为本发明实施例3中制备的BP-OM@lipid-PEG纳米颗粒在808nm激光照射下近红外二区的荧光光谱图；

图8为本发明实施例4中表面修饰有胆固醇(Chol)的黑磷纳米颗粒在四氢呋喃溶液中的粒径分布图；

图9为本发明实施例4中表面修饰有胆固醇(Chol)的黑磷纳米颗粒的透射电镜图；

图10为本发明实施例4中表面修饰有胆固醇(Chol)的黑磷纳米颗粒的氯仿/四氢呋喃溶液在808nm激光照射下近红外二区的荧光光谱图；

图11为本发明实施例5中制备的BP-Chol@lipid-PEG纳米颗粒的水合粒径分布图；

图12为本发明实施例5中制备的BP-Chol@lipid-PEG纳米颗粒的透射电镜图；

图13为本发明实施例5中制备的BP-Chol@lipid-PEG纳米颗粒在808nm激光照射下近红外二区的荧光光谱图；

图14为本发明实施例5中采用相同功率密度的808nm和980nm激光对 BP-Chol@lipid-PEG纳米颗粒进行照射所采集到的近红外二区荧光光谱；

图15为采用实施例5中制备的BP-Chol@lipid-PEG纳米颗粒作为近红外二区探针，通过尾静脉将其注射到裸鼠体内，进行背部血管的近红外二区成像结果；

图16为本发明实施例7中小鼠口服BP-Chol@lipid-PEG纳米颗粒后，不同时间点采集的胃肠道近红外二区图像。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

称取1.00g红磷放入100mL不锈钢球磨罐中，加入不锈钢珠(红磷与球磨珠的质量比为1:150)密封，将球磨罐固定于球磨机内，然后以500r/min的转速球磨96h，得到黑磷纳米颗粒粉末。原料红磷(RP)与产物黑磷(BP)的X-射线衍射图谱(XRD)见图1。

实施例2

向实施例1制备的黑磷纳米颗粒粉末中加入4g油胺(分子量＝267Da)，继续球磨72h。所得产物分散于四氢呋喃，以1000r/min的转速离心，除去沉淀。加入适量乙醇作为沉淀剂使黑磷-油胺(BP-OM)纳米颗粒聚集形成不溶物，然后以5000r/min的转速离心5min，收集沉淀复溶于四氢呋喃。所得溶液再次以1000r/min的转速离心，取上清，即纯化后的BP-OM纳米颗粒。图2为BP-OM纳米颗粒在四氢呋喃中的粒径分布图，其平均粒径为21nm。图3 为BP-OM的透射电镜图，统计平均粒径为14nm。

将以上制备的BP-OM纳米颗粒溶液氯仿或四氢呋喃，取浓度均为50μg/mLBP-OM的氯仿或四氢呋喃溶液600μL，分别放置于石英四通微量样品池中，采用808nm激光照射，使用900nm滤光片在荧光光谱仪中分别记录它们的发射光谱。图4为BP-OM纳米颗粒在氯仿(CHCl₃)和四氢呋喃(THF)溶液中的发射光谱。

实施例3

将50mg磷脂-聚乙二醇(lipid-PEG)分子(PEG链段分子量为2000Da)分散于实施例2 制备的BP-OM纳米颗粒的四氢呋喃溶液，室温下待四氢呋喃完全挥发后，加入超纯水进行剧烈搅拌，搅拌时间为1min。然后以3000r/min的转速离心10min，除去不溶物，将所得上清液透析除去多余的lipid-PEG，透析袋的截留分子量为8000-100,000Da。冷冻干燥后得到可长期储存的OM和lipid-PEG双修饰的黑磷纳米颗粒粉末，将其命名为BP-OM@lipid-PEG纳米颗粒。图5为BP-OM@lipid-PEG纳米颗粒水溶液的水合粒径分布图，其平均水合粒径为120nm。图6为BP-OM@lipid-PEG纳米颗粒的透射电镜图，统计的平均粒径为70nm。

取50μg/mLBP-OM@lipid-PEG纳米颗粒的水溶液600μL放置于石英四通微量样品池中，采用808nm激光照射，使用900nm滤光片在荧光光谱仪中测量其发射光谱。图7为 BP-OM@lipid-PEG纳米颗粒的水溶液的发射光谱。

实施例4

向实施例1制备的黑磷纳米颗粒粉末中加入4g胆固醇(分子量＝387Da)，继续球磨72h。所得产物分散于四氢呋喃，以1000r/min的转速离心，除去沉淀。加入适量乙醇作为沉淀剂使黑磷-胆固醇(BP-Chol)纳米颗粒聚集形成不溶物，然后以5000r/min的转速离心5min，收集沉淀复溶于四氢呋喃。所得溶液再次以1000r/min的转速离心，将上层清液纯化后得到BP-Chol纳米颗粒。图8为BP-Chol纳米颗粒在四氢呋喃中的粒径分布图，其平均粒径为14nm。图9为BP-Chol纳米颗粒的透射电镜图，统计平均粒径为20nm。

将以上制备的BP-Chol纳米颗粒溶液氯仿或四氢呋喃，取浓度均为50μg/mLBP-Chol纳米颗粒的氯仿或四氢呋喃溶液，分别放置于石英四通微量样品池中，采用808nm激光照射，使用900nm滤光片在荧光光谱仪中测量其发射光谱。图10为BP-Chol的氯仿溶液(CHCl₃) 和四氢呋喃(THF)溶液的发射光谱。

实施例5

将50mg磷脂-聚乙二醇(lipid-PEG)分子(PEG链段分子量为2000Da)分散于实施例4 制备的BP-Chol纳米颗粒的四氢呋喃溶液，室温下待四氢呋喃完全挥发后，加入超纯水进行剧烈搅拌，搅拌时间为1min。然后以3000r/min的转速离心10min，除去不溶物，将所得上清液透析经除去多余的lipid-PEG。冷冻干燥后得到可长期储存的Chol和lipid-PEG双修饰的黑磷纳米颗粒粉末，将其命名为BP-Chol@lipid-PEG纳米颗粒。图11为BP-Chol@lipid-PEG 纳米颗粒的水合粒径分布图，其平均粒径为106nm。图12为BP-Chol@lipid-PEG纳米颗粒的透射电镜图，统计平均粒径为97nm。

取50μg/mLBP-Chol@lipid-PEG纳米颗粒的水溶液600μL放置于石英四通微量样品池中，采用808nm激光照射，使用900nm滤光片在荧光光谱仪中记录其发射光谱。图13为 BP-Chol@lipid-PEG纳米颗粒水溶液的发射光谱。

此外，取1mg/mLBP-Chol@lipid-PEG纳米颗粒的水溶液600μL放置于石英四通微量样品池中，分别采用相同功率密度的808nm激光和980nm激光对其进行照射。分别使用900nm滤光片和930nm滤光片在荧光光谱仪中记录其发射光谱。图14为BP-Chol@lipid-PEG纳米颗粒水溶液的发射光谱。

实施例6

将实施例5得到的BP-Chol@lipid-PEG纳米颗粒水溶液(1.3mg/mL)经尾静脉注射的方式输送到裸鼠体内，采用小动物近红外二区成像仪(808nm激光照射，1400nm滤光片)采集其背部血管的近红外二区荧光成像信号。从图15(ScaleBar＝5mm)可以看出，黑磷纳米颗粒具有良好的近红外二区荧光成像效果，可以用作近红外二区荧光成像探针。

实施例7

将实施例5得到的BP-Chol@lipid-PEG纳米颗粒水溶液(2mg/mL)采用口服的方式注入裸鼠体内，并在小动物近红外二区成像仪(808nm激光照射，1250nm滤光片)下，观测裸鼠的腹部成像信号，观测时间为30min。图16 a、b、c分别为30秒、5min、30min时间间隔采集的胃肠道的近红外二区图像，该图像清晰显示了裸鼠的胃、十二指肠、小肠和大肠的结构信息。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于黑磷的近红外二区荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将红磷或黑磷与球磨体混匀后球磨1-200h，然后向其中加入疏水性配体，继续球磨1-200h，得到表面修饰疏水配体的黑磷纳米颗粒；所述红磷或黑磷与球磨体的质量比为1:1-500；红磷或黑磷与所述疏水性配体的质量比为1:1-20；

(2)将所述表面修饰疏水配体的黑磷纳米颗粒与两亲性分子溶于有机溶剂，然后除去有机溶剂，将得到的物质与水混匀，得到所述基于黑磷的近红外二区荧光纳米探针。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述疏水性配体为长链烷基胺、长链烷基醇、胆固醇、豆固醇中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述球磨体为球磨珠，所述球磨珠的粒径为0.3-50mm，球磨转速为500-200r/min。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，加入疏水性配体球磨1-200h后，还包括以下步骤：

将得到的产物与分散介质混匀，离心取上清液，向所述上清液中加入沉淀剂，然后收集沉淀物，得到所述表面修饰疏水配体的黑磷纳米颗粒。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述分散介质为四氢呋喃、氯仿、环己烷、正庚烷和甲苯中的一种或几种。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述两亲性分子为脂质体、聚乙二醇化的磷脂、聚乙二醇-聚乳酸和聚乙二醇-聚己内酯共聚物中的一种或几种。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中的红磷或黑磷与步骤(2)中的两亲性分子的质量比为1:100-200。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，将得到的物质与水混匀后还包括离心除去不溶物，然后透析去除两亲性分子和冷冻干燥的步骤。

9.一种权利要求1-8中任一项所述的制备方法所制备的基于黑磷的近红外二区荧光纳米探针，其特征在于：包括黑磷纳米颗粒，所述黑磷纳米颗粒表面修饰有疏水性配体，所述疏水性配体表面包裹有两亲性分子，所述基于黑磷的近红外二区荧光纳米探针的粒径为50-200nm，激发波长为800-1000nm，发射波长为900-1700nm。

10.权利要求9所述的基于黑磷的近红外二区荧光纳米探针在制备近红外二区荧光成像制剂中的应用。

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