CN109912623B - 一种氧杂蒽酮类化合物、其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了氧杂蒽酮类化合物、其制备方法和应用，所述氧杂蒽酮类化合物从所述链霉菌Streptomyces caelestis aw99c的发酵液中分离得到；所述氧杂蒽酮类化合物可以在抗植物病原真菌方面应用，所述植物病原真菌包括：苹果腐烂菌、马铃薯干腐病菌、小麦赤霉菌、番茄灰霉菌、稻瘟病菌、苹果炭疽。本发明的化合物在抗植物病原真菌作为农用抗生素方面具有开发应用潜力。

Description

一种氧杂蒽酮类化合物、其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及本发明属于微生物农药技术领域，涉及氧杂蒽酮类化合物、、其制备方法和应用。

背景技术

微生物是天然产物的重要来源。目前，人们已从微生物的代谢产物中分离出上万种活性天然产物，这些微生物来源于不同的生物环境，如植物、动物、土壤及海底沉积物等。其中，放线菌属产生的次级代谢产物占35％以上，大约75％市售抗生素的原始分子结构骨架都来源于放线菌属，其中以开发程度较高的链霉菌属最为突出(Newman,D.；Cragg,G.Natural products as sources of new drugs over the 30years from 1981to2010.J.Nat.Prod.2012,75(3),311-35.)。而海洋链霉菌由于其特殊的生存环境，能够产生一些具有新颖结构类型的天然产物(Blunt,J.W.；Carroll,A.R.；Copp,B.R.；Davis,R.A.；Keyzers,R.A.；Prinsep,M.R.Marine natural products.Natural Product Reports2018,35(1),8-53.)。农用抗生素是指由微生物发酵产生、具有农药功能、用于农业上防治病虫草鼠等有害生物的次级代谢产物。目前广泛应用的许多重要农用抗生素都是从链霉菌属中分离得到的。

Citreamicins是由Carter等人在1989年从Micromonospora citrea的发酵液体中分离得到的(Carter,G.T.；Nietsche,J.A.；Williams,D.R.；Borders,D.B.Citreamicins,novel antibiotics from Micromonospora citrea:isolation,characterization,andstructure determination.J.Antibiot.1990,43(5),504-12.)，属于氧杂蒽酮类化合物。

多环氧杂蒽酮类抗生素是一类从微生物当中获取得来的重要天然产物，迄今为止共有30多种氧杂蒽酮抗生素被发现(李力,黄建忠.多环氧杂蒽酮类抗生素研究进展.中国抗生素杂志.2012,37(11):806-812.)。这类化合物含有成角度的骨架六元环及核心环xanthone，由于其特殊的化学结构，使得它具有多种多样的生物活性，如抗***(Hopp,D.C.；Milanowski,D.J.；Rhea,J.；Jacobsen,D.；Rabenstein,J.；Smith,C.；Romari,K.；Clarke,M.；Francis,L.；Irigoyen,M.Citreamicins with potent gram-positiveactivity.J.Nat.Prod.2008,71,2032–2035.)、抗细胞毒性等(Liu,L.L.；Xu,Y.；Han,Z.；Li,Y.X.；Lu,L.；Lai,P.Y.；Zhong,J.L.；Guo,X.R.；Zhang,X.X.；Qian,P.Y.Four newantibacterial xanthones from the marine-derived actinomycetes Streptomycescaelestis.Mar.Drugs 2012,10,2571-2583.)。研究发现，Citreamicin组分ε对革兰氏阳性致病菌包括耐甲氧葡萄球菌(MRSA)具有抑制作用(Peoples,A.J.；Zhang,Q.；Millett,W.P.；Rothfeder,M.T.；Pescatore,B.C.；Madden,A.A.；Ling,L.L.；Moore,C.M.Neocitreamicins I and II,novel antibiotics with activity againstmethicillin-resistant Staphylococcus aureus and vancomycin-resistantenterococci.J.Antibiot.2009,61,457–463.),同时，研究表明氧杂蒽酮类化合物能在细胞内产生氧自由基，从而诱导细胞凋亡(Liu,L.L.；He,L.S.；Xu,Y.；Han,Z.；Li,Y.X.；Zhong,J.L.；Guo,X.R.；Zhang,X.X.；Ko,K.M.；Qian,P.Y.,Caspase-3-dependentapoptosis of citreamicinε-induced HeLa cells is associated with reactiveoxygen species generation.Chem.Res.Toxicol.2013,26(7),1055-1063.)。

但是，发明人经过长期的研究发现，氧杂蒽酮类化合物还在其他领域具有较大应用价值。对其进行合理的提取、筛分、制备，并研究其新的应用，不但具有迫切的研究价值，也具有良好的经济效益和工业应用潜力，这正是本发明得以完成的动力所在和基础。

发明内容

为了克服上述所指出的现有技术的缺陷，本发明人对此进行了深入研究，在付出了大量创造性劳动后，从而完成了本发明。

具体而言，本发明所要解决的技术问题是：提供氧杂蒽酮类化合物、其制备方法和应用。

第一方面，本发明提供了一种氧杂蒽酮类化合物，所述氧杂蒽酮类化合物具有如下化学结构式：

在本发明中，作为一种优选的技术方案，所述氧杂蒽酮类化合物由链霉菌Streptomyces caelestis发酵产生；且链霉菌Streptomyces caelestis的GenBank编号为JX204833，菌株编号为aw99c。

在本发明中，作为一种优选的技术方案，所述氧杂蒽酮类化合物从所述链霉菌Streptomyces caelestis aw99c的发酵液中分离得到。

在本发明中，作为一种优选的技术方案，所述链霉菌Streptomyces caelestisaw99c的发酵液是由链霉菌Streptomyces caelestis aw99c于2wt％海盐SPY液体培养基培养得到的，培养温度为28℃，转速为130rpm，培养时间为5天。

在本发明中，作为一种优选的技术方案，所述氧杂蒽酮类化合物具有如下的理化性质为：

C₃₀H₂₅NO₁₁，红色结晶；

Mp:341.1-349.1℃；

[α]D20＝+59(c 0.025,acetone)；

UV(MeOH):λmax(logε)：206(3.98),244(3.92),287(3.89),358(3.60)nm；

IR(KBr):νmax＝3430,1627,1574,1405,1273cm^-1；

HRESIMS:m/z 576.1508[M+H]⁺(calcs for C₃₀H₂₅NO₁₁576.1506)。

第二方面，本发明提供了氧杂蒽酮类化合物的制备方法，包括将将链霉菌Streptomyces caelestis aw99c发酵产生的发酵液浓缩；将浓缩液依次经有机溶剂萃取和柱层析分离依次得到6个馏分，按馏分流出顺序编号为馏分A、馏分B……馏分F；馏分E再经过柱层析分离得到10个馏分，按馏分流出顺序编号为馏分E1、馏分E2…馏分E10，馏分E6经纯化得到所述氧杂蒽酮类化合物。

在本发明中，作为一种优选的技术方案，所述制备方法的步骤为：

(1)将发酵液过滤分离菌体和菌液；

(2)用适量甲醇：丙酮为的混合溶液浸没步骤(1)得到的菌体，并超声破壁，重复3次；菌体过滤去除菌体残渣，用旋转蒸发仪浓缩菌体浸提液，依次用石油醚和乙酸乙酯对菌体浸提液进行萃取、浓缩，得到菌体的乙酸乙酯相粗提物；

(3)将步骤(1)得到的菌液用旋转蒸发仪浓缩，用石油醚和乙酸乙酯进行萃取、浓缩，得到菌液的乙酸乙酯相粗提物，将菌体和菌液的乙酸乙酯相粗提物合并；

(4)用RP-18柱划段，用甲醇：水梯度洗脱，依次得到6个馏分A-F；

(5)馏分E通过凝胶柱LH-20得到馏分E1-E10；

(6)馏分E6再经半制备型HPLC进一步纯化，得到氧杂蒽酮类化合物。

第三方面，本发明提供了氧杂蒽酮类化合物在抗植物病原真菌方面的应用。

在本发明中，作为一种优选的技术方案，本发明提供了氧杂蒽酮类化合物抑制的植物病原真菌包括：苹果腐烂菌(Cytospora.sp.)、马铃薯干腐病菌(Fusarium solani)、小麦赤霉菌(Fusarium graminearum)、番茄灰霉菌(Botrytis cinerea)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、苹果炭疽(Colletotrichum gloeosporioides)。

第四方面，本发明提供了农用抗菌剂，包括如上所述的氧杂蒽酮类化合物，以及农药学上可接受的载体。

例如，当农用抗菌剂的剂型为乳油时，所述载体包括乳化剂等；当农用抗菌剂的剂型为粉剂时，所述载体可以采用硅藻土等。

尤其是本发明的农用抗菌剂中，1.56μM氧杂蒽酮类化合物时对苹果腐烂病菌有很强的抑制活性，3.12μM时对苹果炭疽病菌有抑制活性。

采用了上述技术方案后，本发明的有益效果是：

本发明的发明人经过长期反复的试验，筛选了Streptomyces caelestis作为合适的发酵菌株，并选择了合理的培育条件，使得菌株发酵得到发酵液，通过对发酵液进行特定步骤的处理，提取制备得到氧杂蒽酮类化合物。以上方法在现有的文献中未见公开，为发明人经过长期反复试验得出的最优化制备提取方案。

本发明的发明人也发现了氧杂蒽酮类化合物的新的应用，即在抗植物病原真菌方面的应用，基于该应用，利用所述的氧杂蒽酮类化合物可以制备得到农用抗菌剂，效果较好。本发明的化合物在抗植物病原真菌作为农用抗生素方面具有开发应用潜力。

附图说明

图1为馏分A-F的流出顺序示意图；

图2为馏分E1-E10的流出顺序示意图；

图3为氧杂蒽酮类化合物的氢谱图；

图4为氧杂蒽酮类化合物的碳谱图；

其中图1-2中的箭头表示流动相的流动方向，标号代表各个馏分的编号；

以下结合说明书附图和具体实施方式对本发明做具体说明。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明进一步说明。但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。

需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。

本发明氧杂蒽酮类化合物是从一株来源于红海底泥的链霉菌Streptomycescaelestis aw99c的发酵液中分离得到的。通过完整的16SrRNA基因序列分析，鉴定该菌株为Streptomyces caelestis，GenBank编号为JX204833，菌株编号为aw99c，菌种保藏于西北农林科技大学化学与药学院天然药物化学研究中心。

该链霉菌保藏及活化培养条件为：保藏菌种所用培养基为TSB斜面培养基。活化菌种：将菌种接种于TSB平皿中，于28℃活化3天，至平皿上长满菌落。TSB培养基配方：胰蛋白胨，1.5％；大豆蛋白胨，0.5％；氯化钠，0.5％；pH 7.2。

以下为氧杂蒽酮类化合物的制备方法。下述实施例的实验材料如下。

实验材料

培养基：2％海盐SPY培养基：可溶性淀粉，10g；蛋白胨，2g；酵母提取物，4g；海盐，20g；水，1L，pH 7.2。

试剂与仪器：常用有机溶剂：甲醇，乙酸乙酯，石油醚、丙酮等均为工业试剂，重蒸后使用。有机溶剂：色谱甲醇，色谱乙腈、DMSO等视实际使用情况使用分析纯或色谱纯试剂。以下除特殊说明外，试剂用量均为体积比。

常用仪器：旋光仪Rudolph AutopolⅢ型；高效液相色谱仪：Waters 1525；紫外光谱仪：Thermo Evolution-300型；核磁共振：Bruker AvanceⅢ500(以TMS为内标)；低分辨质谱仪：Thermo Fisher LTQ Fleet型；旋转蒸发仪：BüchiRotavapor R-101、R-3HB型；低温冷却液循环泵：DLSB-10/20型(郑州长城科工贸有限公司)；循环水式多用真空泵：SHB-Ⅲ型(郑州长城科工贸有限公司)；超净工作台：SW-OJ-2F型(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)；立式蒸汽灭菌器(上海***实业有限公司医疗设备厂)。柱层析硅胶(100-200目、200-300目及300-400目)及薄层层析硅胶(硅胶H)均为青岛海洋化工厂生产；液相色谱柱：Hypersil BDS 5μm C18(250×4.6and 250×10；Thermo)；羟丙基葡聚糖凝胶Sephadex LH-20和RP-C18反向硅胶均为Merck公司生产。

实施例1

链霉菌Streptomyces caelestis aw99c的发酵培养

链霉菌Streptomyces caelestis aw99c菌株活化方法：从甘油管中挑取H2S5菌丝体划线于TSB固体平板上，于28℃培养3天；挑取TSB平板上的H2S5单菌落于TSB液体培养基中，28℃，130rpm培养3天。TSB培养基配方：胰蛋白胨，1.5％；大豆蛋白胨，0.5％；氯化钠，0.5％；pH 7.2。

链霉菌Streptomyces caelestis aw99c菌株发酵培养条件：将活化好的aw99c的培养液按5％接种量接种于2％海盐SPY培养基中，28℃，130rpm培养3天，即为种子液。同样，按5％接种量，aw99c菌株种子液接种于装有200mL 2％海盐SPY培养基的500mL三角瓶中，28℃，130rpm培养5天。发酵体积为20L。2％海盐SPY培养基配方为：可溶性淀粉，10g；蛋白胨，2g；酵母提取物，4g；海盐，20g；水，1L，pH 7.2。

实施例2

化合物提取分离

将1.1中得到的发酵液浓缩后，依次经有机溶剂萃取和柱层析梯度洗脱处理得到馏分A-F。具体地，有机溶剂为石油醚和乙酸乙酯，层析柱为RP-18，梯度洗脱条件为甲醇-水(10％-100％)；馏分E再经凝胶柱LH-20(甲醇)洗脱后得到馏分E1-E10；馏分E6经半制备型HPLC纯化得到氧杂蒽酮类化合物。

更详细的说，实施例2的氧杂蒽酮化合物的提取方法包括:

将1.1中得到的20L发酵液用4层脱脂纱布过滤分离菌体和菌液。先用适量甲醇：丙酮为3:1(体积比)的混合溶液浸没菌体，并超声破壁，重复3次；然后用四层脱脂纱布过滤去除菌体残渣，并用旋转蒸发仪浓缩菌体浸提液；最后依次用石油醚和乙酸乙酯对菌体浸提液进行萃取、浓缩，得到菌体的乙酸乙酯相粗提物。将菌液先用旋转蒸发仪浓缩，用石油醚和乙酸乙酯进行萃取、浓缩，得到菌液的乙酸乙酯相粗提物。将菌体和菌液的乙酸乙酯相粗提物合并，用RP-18柱划段，用甲醇：水(10％→100％)梯度洗脱，依次得到6个馏分A-F(具体见图1)。馏分E通过凝胶柱LH-20(溶剂为甲醇)得到馏分E1-E10(具体见图2)。馏分E6再经半制备型HPLC(50％，乙腈-水，3mL/min)进一步纯化，得到氧杂蒽酮类化合物。

检测：所述氧杂蒽酮类化合物具有如下的理化性质为：

C₃₀H₂₅NO₁₁，红色结晶；

Mp:341.1-349.1℃；

[α]D20＝+59(c 0.025,acetone)；

UV(MeOH):λmax(logε)：206(3.98),244(3.92),287(3.89),358(3.60)nm；

IR(KBr):νmax＝3430,1627,1574,1405,1273cm^-1；

HRESIMS:m/z 576.1508[M+H]⁺(calcs for C₃₀H₂₅NO₁₁576.1506)。

实施例3

最小抑菌浓度测定

采用微量二倍稀释法对实施例2的氧杂蒽酮类化合物进行抗植物病原真菌的活性检测。

选取几株植物病原真菌(苹果腐烂菌(Cytospora.sp.)，马铃薯干腐病菌(Fusarium solani)，小麦赤霉菌(Fusariumgraminearum)，番茄灰霉菌(Botrytiscinerea)，稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)，苹果炭疽(Colletotrichumgloeosporioides))进行初步评价。菌株由本实验室保存。具体操作如下：

将活化后的供试菌株于PDB液体培养基中25℃培养96h，收集菌液，在光学显微镜下计数后稀释成一定浓度。将化合物氧杂蒽酮类化合物用DMSO溶解后配制成100mM的标准溶液，并进行梯度稀释，依次制得浓度为10mM、5mM、2.5mM、1.25mM、0.625m M、0.3125mM的化合物溶液。分别取稀释好的菌液和化合物溶液各2μL加入96孔板，用PDB培养基补足至每个孔200μL。以只加PDB培养基和菌液的孔作为空白对照，多菌灵代替化合物氧杂蒽酮类化合物作为阳性对照，每个处理重复三次。完成后将96孔板置于摇床上震荡10～15min后再移入25℃恒温培养箱，培养至48h，用酶标仪测定数据分析处理，确定其最小抑菌浓度。结果见表1。

表1氧杂蒽酮类化合物对六株植物病原真菌的MIC值

由结果可知，化合物氧杂蒽酮类化合物表现出了广谱的抗植物病原真菌活性，表明其在开发抗植物病原真菌的药物方面有很大的潜力和应用前景

应当理解，这些实施例的用途仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外，也应理解，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和/或变型，所有的这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的保护范围之内。

Claims (2)

1.氧杂蒽酮类化合物在抗植物病原真菌方面的应用，其特征在于：所述植物病原真菌包括：苹果腐烂菌、马铃薯干腐病菌、小麦赤霉菌、番茄灰霉菌、稻瘟病菌、苹果炭疽菌；

所述氧杂蒽酮类化合物具有如下化学结构式：

2.农用抗菌剂，其特征在于：包括氧杂蒽酮类化合物，以及农药学上可接受的载体，

所述氧杂蒽酮类化合物具有如下化学结构式：

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