CN109908143B - 西奥罗尼在制备治疗急性髓系白血病药物的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物应用领域，尤其涉及西奥罗尼在制备治疗急性髓系白血病药物的新用途，所述新用途为西奥罗尼或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物在制备预防和/或治疗急性髓系白血病的药物中的用途。西奥罗尼通过Src/Fyn/p38和Erk/MEK信号通路抑制急性髓系白血病细胞生长、诱导其凋亡及集落形成。

Description

西奥罗尼在制备治疗急性髓系白血病药物的新用途

技术领域

本发明涉及药物应用领域，尤其涉及西奥罗尼在制备治疗急性髓系白血病药物的新用途。

背景技术

急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia,AML)是一种造血干祖细胞的恶性克隆增殖性疾病，具有高度的异质性，其特征是白血病细胞分化受阻，原始细胞大量增殖，从而导致贫血、血小板减少、感染及组织器官浸润等相关临床症状，目前AML治疗的主要手段是联合化疗及异基因造血干细胞移植(Short NJ,Rytting ME,Cortes JE，Acute myeloidleukaemia.[J].Lancet 2018 08 18；392(10147))(Short NJ,Rytting ME,Cortes JE，Acute myeloid leukaemia.[J]. Lancet 2018 08 18；392(10147))。

近年来，随着多药联合化疗剂量的改进、造血干细胞移植技术的进展及新型靶向药物的应用，AML整体疗效较前有所提高，但仍有相当一部分患者不可避免的出现原发耐药及复发，而一旦出现难治复发，预后很差。目前最新的美国SEER数据显示AML5年生存率仅为30％～40％，此外，联合化疗及异基因造血干细胞移植会导致严重的并发症，导致危及生命的感染、出血和GVHD，治疗相关死亡率较高，不少患者是死于化疗或移植的并发症而不是疾病本身。 AML新型靶向治疗药物的进展也比较慢，目前开发能够临床应用主要是FLT3 和IDH1/IGH2抑制剂，但仅适合40％AML患者，大部分AML患者仍缺乏安全有效的靶向治疗药物(Luppi M,Fabbiano F,Visani G,et al.Novel Agents for Acute MyeloidLeukemia.Cancers(Basel)2018Nov 09；10(11))。因此，AML的治疗已成为血液领域的一大难题，亟需探寻新的治疗方法。

Aurora B是属于Aurora激酶家族的成员，参与调控细胞的有丝***，研究发现Auror BAML高表达，研究发现Aurora B在AML中高表达与耐药和不良预后有关(Ikezoe T,Yang J,Nishioka C,et al.A novel treatment strategy targeting Aurora kinasesin acute myelogenous leukemia.[J].Mol.Cancer Ther.2007 Jun；6(6))。

西奥罗尼(CS2164)是靶向肿瘤微环境的新型三通路肿瘤抑制剂，主要通过抑制VEGFR2、Aurora B及CSF1R等通路发挥抗肿瘤的作用。前期研究显示其对多种实体瘤包括非小细胞肺癌、肝癌、结肠癌和淋巴瘤等具有杀伤作用，且I期临床试验结果显示良好的耐受性及毒副作用小，而关于西奥罗尼在急性髓系白血病中的应用尚未见相关报道。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供西奥罗尼的药物新用途。本发明为急性髓系白血病的治疗提供了一条新的途径和选择。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供西奥罗尼或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物在制备预防和/或治疗急性髓系白血病的药物中的用途。

根据本发明，所述药物抑制Src/Fyn/p38和Erk/MEK信号通路。

根据本发明，所述药物抑制VEGFR2的磷酸化水平。

根据本发明，所述药物抑制急性髓系白血病细胞增殖。

根据本发明，所述药物杀伤急性髓系白血病细胞。

本发明中，通过利用西奥罗尼(CS2164)对多种急性髓系白血病(AML) 细胞株及原代AML样品、动物体内成瘤实验的研究发现其具有杀伤AML细胞的作用，呈浓度及时间依赖性，其作用机制与通过抑制Src/Fyn/p38、Erk/MEK 信号通路及VEGFR2的磷酸化水平有关。

本发明中，发明人发现西奥罗尼的作用时间超过24h才具有明显的杀伤作用，而药物浓度在低于2μM时杀伤作用微弱，高于2μM时杀伤作用明显增强。

本发明中，所述药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体，所述载体包括药学领域常规的赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂和填充剂等。

用西奥罗尼或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物为活性成分制备的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液等多种形式，上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

第二方面，本发明提供一种预防和/或治疗急性髓系白血病的药物，其活性成分为西奥罗尼或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物。

根据本发明，所述药物抑制Src/Fyn/p38和Erk/MEK信号通路。

根据本发明，所述药物抑制VEGFR2的磷酸化水平。

根据本发明，所述药物抑制急性髓系白血病细胞增殖。

优选地，所述药物杀伤急性髓系白血病细胞。

优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料，所述辅料为赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂和填充剂中的任意一种或至少两种的组合。

第三方面，本发明提供西奥罗尼或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物在制备抑制急性髓系白血病细胞增殖的药物中的用途。

第四方面，本发明提供西奥罗尼或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物在制备诱导急性髓系白血病细胞凋亡的药物中的用途。

第五方面，本发明提供西奥罗尼或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物在制备抑制Src/Fyn/p38和Erk/MEK信号通路的药物中的用途。

第六方面，本发明提供西奥罗尼或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物在制备抑制VEGFR2的磷酸化水平的药物中的用途。

根据本发明，所述药物还包括药学上可接受的辅料，所述辅料为赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂和填充剂中的任意一种或至少两种的组合。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明通过体内和体外研究发现，西奥罗尼通过Src/Fyn/p38和 Erk/MEK信号通路抑制急性髓系白血病细胞生长、诱导其凋亡及集落形成；

(2)本发明通过原代细胞水平验证西奥罗尼具有杀伤AML细胞的作用，而对正常造血干细胞无明显毒性，说明本申请药物与化疗药物比较具有副作用小，安全性好，能够显著减少治疗相关并发症发生，具有较显著的应用前景。

附图说明

图1为西奥罗尼具有明显抑制AML细胞增殖：图1(A)和图1(B)分别显示用CCK8试剂盒检测西奥罗尼作用48h和72h后对多种AML细胞增殖抑制作用的结果；

图2为西奥罗尼具有明显抑制AML细胞增殖集落形成实验的结果：图2 (A)和图2(B)分别表示作用24h后西奥罗尼抑制Molm13细胞的集落形成的柱状图及典型的集落形成图；

图3为西奥罗尼诱导AML细胞株凋亡的作用结果：图3(A)和图3(B) 分别显示用Annexin V/PI双染法流式检测西奥罗尼作用48h和72h后对诱导多种AML细胞株凋亡的情况；

图4西奥罗尼诱导AML细胞株及原代细胞凋亡的作用结果：图4(A)和图4(B)分别表示作用48h后西奥罗尼对42例原代AML样品和10例正常造血干细胞(hematologic stemcell,HSC)杀伤作用的结果；

图5为西奥罗尼杀伤AML细胞的作用机制的探讨：图5(A)和图5(B) 为CS2164作用于U937和Molm13细胞24h后抑制VEGFR2的磷酸化水平及的 Src/Fyn/p38信号通路的表达水平；图5(C)和图5(D)为西奥罗尼作用于U937 和Molm13细胞24h后抑制Erk/MEK信号通路的表达水平；

图6为在体内西奥罗尼对AML细胞杀伤作用的研究：图6(A)为西奥罗尼抑制AML细胞的结果；图6(B)为西奥罗尼组小鼠皮下瘤重量与对照组的对比结果；图6(C)为西奥罗尼在体内对小鼠的作用。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。各实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另有说明，本说明书中使用的全部专业术语和科学用语的含义均与本发明所属技术领域的技术人员一般理解的含义相同。但如有冲突，以包含定义的本说明书为准。

实验材料：实验材料来源如下：

西奥罗尼由深圳微芯生物科技有限责任公司提供；

实验动物：购自于上海莱克。

实施例1研究西奥罗尼对AML细胞增株增殖抑制的作用

取2×10⁵对数生长期的AML细胞株(包括HL60,K562,Molm13,NB4,Thp1, U937,MV411,OCI-AML3)接种于24孔板，分别设置对照组、不同浓度西奥罗尼组(0.5，1，2，4，8，16μM)作用48h和72h后，应用CCK8试剂盒检测不同实验组AML细胞的增殖情况，其结果如图1和表1所示，具体如下：

表1西奥罗尼分别作用48h和72h后对多种AML细胞株增殖抑制作用的 IC50值

从图1(A)-图1(B)可以看出，随着西奥罗尼浓度的增加，AML细胞的存活率显著下降，从48h和72h的结果可以看出，随着时间的增加，AML细胞的存活率也下降，可见，西奥罗尼呈现时间及浓度依赖性；

从表1可以看出，西奥罗尼作用于48h和72h后抑制多种AML细胞增殖，且72h的IC50值低于48h的IC50值。实施例2通过集落形成实验(Colony formation unit,CFU)进一步验证西奥罗尼抑制AML细胞增殖的作用

本实施例中，验证西奥罗尼抑制AML细胞增殖作用，具体步骤如下：

1)取2×10⁵对数生长期的Molm13细胞接种于24孔板，设置对照组和西奥罗尼组(2，4μM)作用24h；

2)分别取对照组和西奥罗尼组(2，4μM)的Molm3细胞500个接种于甲基纤维素培养中，在37℃和5％CO₂湿度培养箱培养10天后用倒置显微镜计算集落单位数量。所有培养均在6孔板(复种3孔)，以大于50个细胞为集落，三复孔取平均值；

3)加500μl MTT试剂再培养4h后拍照，结果如图2所示。

从图2(A)-图2(B)可以看出，2μM浓度组的集落形成单位仅为对照组的61％，而4μM组的集落形成单位仅为对照组5％左右，提示西奥罗尼具有明显抑制AML细胞的集落形成能力，且呈浓度依赖性。

实施例3用Annexin V/PI双染法流式检测西奥罗尼诱导AML细胞的凋亡作用

取2×10⁵对数生长期的AML细胞株(包括HL60,K562,Molm13,NB4,Thp1, U937,MV411,OCI-AML3)接种于24孔板，分别设置对照组、不同浓度西奥罗尼组(1，2，4，8μM)作用48h和72h后，应用Annexin V/PI试剂盒检测不同实验组AML细胞的凋亡情况，结果如图3所示。

从图3(A)-图3(B)可以看出，西奥罗尼对多种AML细胞株具有不同程度的诱导凋亡的作用，呈时间和浓度依赖性。

实施例4从原代细胞水平验证西奥罗尼对AML细胞和正常造血干细胞的作用

临床病例标本的收集：收集初发或者难治复发AML患者骨髓标本和正常造血干细胞(HSC)，用淋巴细胞分离液提取单个核细胞。

用不同浓度西奥罗尼(0.5，1，2，4，8，16μM)处理原代AML细胞和正常HSC 48h后，Annexin V/PI法流式技术检测原代AML细胞和正常HSC的凋亡比例，结果如图4和表2所示，具体如下：

表2

从图4(A)-图4(B)可以看出，西奥罗尼对42例不同来源的原代AML 样本均有杀伤作用，且浓度越高凋亡比例越大，而其对10例来源于正常的造血干细胞无明显杀伤作用。

从表2可以看出，西奥罗尼对原代AML细胞的杀伤作用可能与伴有NPM1， ASXL1和TET2突变有关，同时髓外浸润也可能影响西奥罗尼的杀伤效果；而患者的白细胞计数、LDH水平、疾病状态及FLT3-ITD突变等因素并不影响 CS2164的杀伤效能。

实施例5运用WB(蛋白印迹)法研究西奥罗尼杀伤AML细胞的作用机制

取对数生长期的U937和Molm13细胞，分别设置0,0.5,1,2,4μM西奥罗尼组，作用24h后收细胞，然后提取蛋白用于蛋白印迹检测VEGFR2及其下游 Src/Fyn/p38和Erk/MEK信号通路的表达水平，结果如图5所示。

从图5可以看出，图5(A)和图5(C)显示西奥罗尼作用于U937细胞24h 后抑制VEGFR2的磷酸化水平及抑制Src/Fyn/p38和Erk/MEK信号通路的表达水平；图5(B)和图5(D)表明西奥罗尼作用于Molm13细胞24h后抑制VEGFR2 的磷酸化水平及抑制Src/Fyn/p38和Erk/MEK信号通路。

实施例6从动物水平验证西奥罗尼在体内具有杀伤AML的作用

1)采用AML细胞株(U937和Molm13)构建裸鼠荷瘤模型

SPF级裸鼠年龄4-6周大小，雌雄各半，对小鼠所有操作均在无菌层流室内进行。将U937或Molm13细胞悬浮于0.2ml含有0.5％FBS的培养基中(每 0.2ml中含有5×10⁶个细胞)，接种于小鼠右前肢皮下，待肿瘤体积长至 75-150mm³，可开始体内用药实验。

2)小鼠体内实验进一步验证西奥罗尼具有杀伤AML细胞(U937和 Molm13)的作用

分别设置对照组及西奥罗尼组(40mg/kg/d)，周一到周五给药，连续3周，每两天监测小鼠的体重及肿瘤的大小

3)用药结束后将小鼠直接安乐死，取瘤体用于计算重量及拍照，结果如图6所示。

从图6(A)可以看出，西奥罗尼抑制AML细胞(U937和Molm13)体内的生长；图6(B)可以看出西奥罗尼组小鼠皮下瘤重量明显轻于对照组，具有抑制瘤体生长的作用；图6(C)可以看出西奥罗尼在体内作用对小鼠无明显的毒副作用，并不改变小鼠的体重变化。

综上所述，本发明通过体内和体外研究发现，西奥罗尼通过抑制Src/Fyn/p38 和Erk/MEK信号通路及抑制VEGFR2的磷酸化水平杀伤急性髓系白血病细胞、诱导其凋亡及集落形成。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (7)

1.西奥罗尼或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗急性髓系白血病的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物抑制Src/Fyn/p38和Erk/MEK信号通路。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物抑制VEGFR2的磷酸化水平。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物抑制急性髓系白血病细胞增殖。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物杀伤急性髓系白血病细胞。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述辅料为稀释剂、调味剂、粘合剂和填充剂中的任意一种或至少两种的组合。

Images