CN109897202B - 大粒径琼脂糖微球及其制备方法 - Google Patents
大粒径琼脂糖微球及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109897202B CN109897202B CN201910198392.XA CN201910198392A CN109897202B CN 109897202 B CN109897202 B CN 109897202B CN 201910198392 A CN201910198392 A CN 201910198392A CN 109897202 B CN109897202 B CN 109897202B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- particle
- agarose microspheres
- size
- agarose
- temperature
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Landscapes
- Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
本发明公开了一种大粒径琼脂糖微球的制备方法,包括以下步骤:提供质量浓度为2%~12%的琼脂糖水溶液作为水相;提供溶有乳化剂的有机试剂作为油相;将所述水相滴加到油相中,搅拌以进行乳化;对乳化后的混合液进行降温固化,得到所述大粒径琼脂糖微球;其中,配置琼脂糖水溶液时,溶解温度为100℃~150℃,溶解时间为20min~250min;乳化剂为司班40、司班60、司班80、司班85、吐温20、吐温60与吐温80中的一种或两种以上的混合物;水相与油相体积比为1:2~1:10,搅拌的转速为50rpm~1000rpm,乳化温度为50℃~100℃。本发明还提供了由所述方法制备得到的大粒径琼脂糖微球。本发明的大粒径琼脂糖微球,其粒径范围为400μm~1000μm,具有很好的耐压、耐高温、耐高流速的性能。
Description
技术领域
本发明涉及高分子材料技术领域,具体涉及一种大粒径琼脂糖微球及其制备方法。
背景技术
天然多糖琼脂糖微球由于具有亲水性、多孔性、电中性、易衍生性等其他生物材料不可比拟的优点,以天然多糖琼脂糖为基体的层析分离填料被广泛的使用在各种大分子的分离及纯化当中。
目前使用的琼脂糖微球的粒径主要为90μm以及30μm左右,然而在血液净化、血液制品等领域,对大粒径琼脂糖微球有广泛的需求。随着这些领域市场的逐渐扩大,对大粒径琼脂糖微球的需求也越来越迫切。因此,开发出一种制备合适粒径的大粒径琼脂糖微球的技术很有意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种大粒径琼脂糖微球的制备方法,该方法能够制备得到粒径范围为400μm~1000μm的大粒径琼脂糖微球,具有很好的耐压、耐高温、耐高流速的性能。
随着琼脂糖微球粒径的增大,采用常规方法制备往往会出现乳化效果差、成球球形变形及粒径分布范围过宽等问题。为了解决上述技术问题,本发明优化水相处理方式,优选合适乳化剂、油相种类及配置比例,提供了一种大粒径琼脂糖微球的制备方法,包括以下步骤:
提供质量浓度为2%~12%的琼脂糖水溶液作为水相;
提供溶有乳化剂的有机溶剂作为油相;
将所述水相滴加到油相中,搅拌以进行乳化;
对乳化后的混合液进行降温固化,得到所述大粒径琼脂糖微球。
水相与油相比值影响成球的粒径分布以及成球效率,水相比例过高乳化效果差,难以成球,油相比例过高则最终成球粒径分布过于宽泛。乳化转速以及乳化温度直接关系到成球的粒径大小与分布,过低的乳化转速与温度会使成球粒径过大,而过高的乳化转速及温度会使成球粒径过小同时粒径分布过于宽泛。本发明中,所述水相与油相体积比为1:2~1:10,所述搅拌的转速为50rpm~1000rpm,所述乳化温度为50℃~100℃。
合适的处理条件关系到水相的粘度。灭菌温度过低、灭菌时间过短,水相溶解不充分或黏度过大;灭菌温度过高、灭菌时间过长,则琼脂糖断链过度,水相黏度过低。过大的黏度会造成乳化效果变差,最终成球粒径过大;过低的黏度会使成球粒径过低甚至于无法乳化成球。水相黏度的大小关系着乳化过程中乳化效果,成球难易,直接影响到最终成球的粒径及分布。常规处理方式所得的琼脂糖水相难以在较温和条件下制备具有良好表面相貌的合适粒径琼脂糖微球。本发明中,配置所述琼脂糖水溶液时,溶解温度为100℃~150℃,溶解时间为20min~250min。优选地,使用高温灭菌锅处理使琼脂糖溶解于水中。
乳化剂的选择及比例配置对乳化效果及成球表面形貌有重要影响。选择合适的乳化剂能使乳化过程水相均匀而稳定的分散,从而获得完整的球形以及较好的表面形貌。通过优选的乳化剂选择与比例配置得到合适粒径琼脂糖微球,同时光镜检测具有良好的表面形貌。本发明中,所述乳化剂为司班40、司班60、司班80、司班85、吐温20、吐温60与吐温80中的一种或两种以上的混合物。
作为优选,所述有机溶剂为液体石蜡、正己烷与甲苯中一种或两种以上的混合物。有机溶剂的选择与比例配置对乳化效果及成球收率有重要影响。
作为优选,所述降温的速率调节为2~15℃/min或直接冰水浴降温,降温至10~20℃以下,保持1~2h。
作为优选,还包括使用乙醇、二氧六环、二甲亚砜、石油醚中一种或两种以上的混合物与水清洗所述大粒径琼脂糖微球的步骤。更优选的,得到的大粒径琼脂糖微球保存于20%的乙醇中。
作为优选,还包括对得到的大粒径琼脂糖微球进行交联的步骤。更优选的,所述交联具体为:将所述大粒径琼脂糖微球与有机试剂混合,在碱性条件下与交联剂发生交联反应。
作为优选,所述有机试剂为二甲亚砜、二氧六环与乙醇中一种或两种以上的混合物。更优选地,反应液中,所述有机试剂的浓度为20%~90%(即有机试剂与水的体积比)。过高的有机试剂浓度会影响微球的结构,过低的有机试剂浓度会减弱交联的效果。
作为优选,所述交联剂为环氧氯丙烷、戊二醛、1,4-丁二醇双缩水甘油醚,二溴丙醇和二乙烯砜中的一种或至少两种以上的混合物。更优选的,交联剂的使用量为所述大粒径琼脂糖微球质量的5%~80%。交联剂过多会造成琼脂糖微球团结等现象,且影响琼脂糖微球的后续衍生,过低的交联剂用量会影响琼脂糖微球的机械强度。
作为优选,在交联时加入碱性试剂使得反应液呈碱性。优选地,所述碱性试剂为氢氧化钠溶液。更优选的,所述氢氧化钠溶液的浓度为10%~80%(即氢氧化钠与水的质量百分比)。过低的碱液浓度会影响交联效率,过高的碱液浓度会对琼脂糖微球结构产生不良影响。更优选的,控制在4~50℃下发生进行交联反应。
本发明另一方面提供了由前述方法制备得到的大粒径琼脂糖微球,其粒径范围为400μm~1000μm。
本发明的有益效果:
采用本发明的制备方法可以获得大粒径琼脂糖微球,其粒径范围为400μm~1000μm,且粒径分布范围窄,成球效果好;经交联处理和高温灭菌处理后仍保持球形无变化。使用内径为1cm,柱高为10cm装柱,测量压力流速曲线,在90ml/min(6800cm/h)范围内随流速增大,柱压逐渐增大,有良好的线性关系。使用高温灭菌处理,在121℃,20min处理后光镜观察球形无变化。说明本发明所制备的大粒径琼脂糖微球具有很好的耐压、耐高温、耐高流速的性能。
附图说明
图1为实施例1制备的大粒径琼脂糖微球的粒径分布图;
图2为实施例1制备的大粒径琼脂糖微球的外观光镜照片;
图3为实施例1制备的大粒径琼脂糖微球交联后外观光镜照片;
图4为实施例1制备的大粒径琼脂糖微球高温灭菌后的外观光镜照片;
图5为实施例1制备的大粒径琼脂糖微球交联后的压力流速曲线;
图6为实施例2制备的大粒径琼脂糖微球的粒径分布图;
图7为实施例3制备的大粒径琼脂糖微球的粒径分布图;
图8为对比例1制备的大粒径琼脂糖微球的粒径分布图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明,以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施,但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1:液体石蜡体系500μm 4%琼脂糖微球制备与交联
准确称量32g琼脂糖粉末于800ml水中,放入高温灭菌锅中,设置温度105℃,时间60min。准确称量1.56g司班60与29.68g司班85于2400ml液体石蜡中,75℃下溶解,混合均匀。将水相高温灭菌后取出加入油相当中,温度保持75℃,转速调节为105rpm。乳化1h后降温固化,监测温度保持温度下降速率为2℃/min。降至10℃以下后保持温度,固化1h。固化结束后,依次使用石油醚、95%乙醇、纯净水反复清洗。最终储存在20%乙醇中。该实施例产品的粒径分布图如图1所示,其外观的光镜照片如图2所示。
准确称量150g上述所得500μm 4%琼脂糖微球,加入300ml预先配置好的体积分数60%二氧六环水溶液,加入30ml环氧氯丙烷,25℃下150rpm搅拌1h,混合均匀。缓慢加入9ml质量分数为40%的NaOH溶液(含有质量分数2%的NaBH4),25℃,150rpm条件下反应4h。加入30ml环氧氯丙烷,混合1h后,缓慢加入9ml质量分数为40%的NaOH溶液(含有2%的NaBH4),升温至37℃,转速保持150rpm,反应16h。反应结束后依次用95%乙醇、纯净水反复清洗。最终储存在20%乙醇中。其外观的光镜照片如图3所示。
准确称取10g交联后500μm 4%琼脂糖微球,加入20ml纯净水,放入高温灭菌锅,设定温度为121℃,时间为20min。参见图3和图4,通过光镜观察,高温灭菌处理前后球形无变化。
使用1cm内径,20cm普通玻璃柱装柱,500μm 4%琼脂糖微球装柱至10cm高处。使用PPS-100蛋白层析仪器测定压力流速曲线,所得结果如图5所示。结果显示,在90ml/min(6800cm/h)范围内压力稳定。
实施例2:甲苯体系800μm 6%琼脂糖微球制备与交联
准确称量48g琼脂糖粉末于800ml水中,放入高温灭菌锅中,设置温度110℃,时间120min。准确称量5.2g司班60与90.8g司班80与2.5g吐温80于2400ml甲苯中,70℃下溶解,混合均匀。水相高温灭菌后取出加入油相当中,温度保持70℃,转速调节为150rpm。乳化1h后降温固化,直接冰水浴降温后保持温度,固化1h。固化结束后,依次使用95%乙醇、纯净水反复清洗。最终储存在20%乙醇中。该实例产品粒径分布图如图6所示。
准确称量150g上述所得800μm 6%琼脂糖微球,加入300ml预先配置好的体积分数60%二甲亚砜水溶液,加入30ml 1,4-丁二醇双缩水甘油醚,25℃下120rpm搅拌1h,混合均匀。缓慢加入9ml质量分数为50%的NaOH溶液(含有质量分数2%的NaBH4),25℃,120rpm条件下反应4h。加入30ml1,4-丁二醇双缩水甘油醚,混合1h后,缓慢加入9ml质量分数为40%的NaOH溶液(含有2%的NaBH4),升温至37℃,转速保持120rpm,反应16h。反应结束后依次用95%乙醇、纯净水反复清洗。最终储存在20%乙醇中。
准确称取10g交联后800μm 6%琼脂糖微球,加入20ml纯净水,放入高温灭菌锅,设定温度为121℃,时间为20min。光镜观察高温灭菌处理前后球形无变化。
使用1cm内径,20cm普通玻璃柱装柱,800μm 6%琼脂糖微球装柱至10cm高处。使用PPS-100蛋白层析仪器测定压力流速曲线。在90ml/min(6800cm/h)范围内压力稳定。
实施例3:液体石蜡体系500μm 6%琼脂糖微球制备与交联
准确称量48g琼脂糖粉末于800ml水中,放入高温灭菌锅中,设置温度115℃,时间60min。准确称量2.4g司班60与45.60g司班85于2400ml液体石蜡中,75℃下溶解,混合均匀。水相高温灭菌后取出加入油相当中,温度保持75℃,转速调节为150rpm。乳化1h后降温固化,监测温度保持温度下降速率为2℃/min。降至10℃以下后保持温度,固化1h。固化结束后,依次使用石油醚、95%乙醇、纯净水反复清洗。最终储存在20%乙醇中。该实例产品粒径分布图如图7所示。
准确称量150g上述所得500μm 6%琼脂糖微球,加入300ml预先配置好的体积分数60%二氧六环水溶液,加入30ml环氧氯丙烷,25℃下150rpm搅拌1h,混合均匀。缓慢加入9ml质量分数为40%的NaOH溶液(含有质量分数2%的NaBH4),25℃,150rpm条件下反应4h。加入30ml环氧氯丙烷,混合1h后,缓慢加入9ml质量分数为40%的NaOH溶液(含有2%的NaBH4),升温至37℃,转速保持150rpm,反应16h。反应结束后依次用95%乙醇、纯净水反复清洗。最终储存在20%乙醇中。
准确称取10g交联后500μm 6%琼脂糖微球,加入20ml纯净水,放入高温灭菌锅,设定温度为121℃,时间为20min。光镜观察高温灭菌处理前后球形无变化。
使用1cm内径,20cm普通玻璃柱装柱,500μm 6%琼脂糖微球装柱至10cm高处。使用PPS-100蛋白层析仪器测定压力流速曲线。在90ml/min(6800cm/h)范围内压力稳定。
对比例1:液体石蜡体系6%琼脂糖微球制备与交联(90μm)
准确称量48g琼脂糖粉末于800ml水中,100℃水煮溶解120min。准确称量70g司班85于1500ml液体石蜡中,60℃下溶解,混合均匀。水相溶解后取出加入油相当中,温度保持60℃,转速调节为100rpm。乳化1h后降温固化。降至10℃以下后保持温度,固化1h。固化结束后,使用95%乙醇、纯净水反复清洗。最终储存在20%乙醇中。该实例产品粒径分布图如图8所示。
准确称量150g上述所得90μm 6%琼脂糖微球,加入800ml丙酮试剂,加入60ml环氧氯丙烷,10℃下100rpm搅拌1h,混合均匀。缓慢加入15ml质量分数为60%的NaOH溶液(含有质量分数2%的NaBH4),10℃,100rpm条件下反应4h。加入60ml环氧氯丙烷,混合1h后,缓慢加入15ml质量分数为60%的NaOH溶液(含有2%的NaBH4),升温至25℃,转速保持100rpm,反应16h。反应结束后依次用95%乙醇、纯净水反复清洗。最终储存在20%乙醇中。
准确称取10g交联后90μm 6%琼脂糖微球,加入20ml纯净水,放入高温灭菌锅,设定温度为121℃,时间为20min。光镜观察高温灭菌处理后微球部分溶解。
使用1cm内径,20cm普通玻璃柱装柱,90μm 6%琼脂糖微球装柱至10cm高处。使用PPS-100蛋白层析仪器测定压力流速曲线。在30ml/min(2300cm/h)范围内压力稳定。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例,本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换,均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (7)
1.一种大粒径琼脂糖微球的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
提供质量浓度为4% ~6%的琼脂糖水溶液作为水相;
提供溶有乳化剂的有机溶剂作为油相;
将所述水相滴加到所述油相中,搅拌以进行乳化;
对乳化后的混合液进行降温固化,得到粒径范围为400-1000μm的大粒径琼脂糖微球;
其中,配置所述琼脂糖水溶液时,溶解温度为105℃ ~ 115℃,溶解时间为60min ~120min;
所述乳化剂为司班40、司班60、司班80、司班85、吐温20、吐温60与吐温80中的一种或两种以上的混合物;
所述水相与油相体积比为1:2 ~ 1:3,所述搅拌的转速为105rpm ~ 150rpm,所述乳化温度为50℃ ~ 100℃;
所述有机溶剂选自液体石蜡、正己烷和甲苯中的一种或两种以上的混合物;
所述降温的速率调节为2 ~ 15℃/min或直接冰水浴降温,降温至10 ~ 20℃以下,保持1 ~ 2h。
2.如权利要求1所述的大粒径琼脂糖微球的制备方法,其特征在于,还包括使用乙醇、二氧六环、二甲亚砜、石油醚中一种或两种以上的混合物与水清洗所述大粒径琼脂糖微球的步骤。
3.如权利要求1所述的大粒径琼脂糖微球的制备方法,其特征在于,还包括将得到的大粒径琼脂糖微球与有机试剂混合,在碱性条件下与交联剂进行交联的步骤。
4.如权利要求3所述的大粒径琼脂糖微球的制备方法,其特征在于,所述有机试剂选自二甲亚砜、二氧六环与乙醇中一种或两种以上的混合物。
5. 如权利要求4所述的大粒径琼脂糖微球的制备方法,其特征在于,所述有机试剂的浓度为20% ~ 90%。
6.如权利要求3所述的大粒径琼脂糖微球的制备方法,其特征在于,所述交联剂选自环氧氯丙烷、戊二醛、1,4-丁二醇双缩水甘油醚、二溴丙醇和二乙烯砜中的一种或两种以上的混合物。
7. 如权利要求3所述的大粒径琼脂糖微球的制备方法,其特征在于,交联剂的使用量为所述大粒径琼脂糖微球质量的5% ~ 80%。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910198392.XA CN109897202B (zh) | 2019-03-15 | 2019-03-15 | 大粒径琼脂糖微球及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910198392.XA CN109897202B (zh) | 2019-03-15 | 2019-03-15 | 大粒径琼脂糖微球及其制备方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109897202A CN109897202A (zh) | 2019-06-18 |
CN109897202B true CN109897202B (zh) | 2022-04-01 |
Family
ID=66952695
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910198392.XA Active CN109897202B (zh) | 2019-03-15 | 2019-03-15 | 大粒径琼脂糖微球及其制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN109897202B (zh) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114160110B (zh) * | 2021-11-30 | 2023-02-10 | 广州康盛生物科技股份有限公司 | 一种预活化的多糖微球及其制备方法、应用 |
CN114191848B (zh) * | 2021-12-06 | 2022-12-30 | 武汉瑞法医疗器械有限公司 | 琼脂糖微球的清洗方法 |
CN114377626B (zh) * | 2021-12-29 | 2024-05-17 | 苏州百奥吉生物科技有限公司 | 一种新型复合多糖protein A磁珠及其制备方法 |
CN114539600B (zh) * | 2022-03-11 | 2023-09-01 | 苏州华诺生物科技有限公司 | 一种高耐压三级结构的琼脂糖微球及其制备方法 |
CN115044068A (zh) * | 2022-03-24 | 2022-09-13 | 苏州星谱生物科技有限公司 | 一种高强度琼脂糖微球的制备方法 |
CN115197479B (zh) * | 2022-06-17 | 2023-09-08 | 苏州百奥吉生物科技有限公司 | 一种粒径均一多糖微球及其制备方法 |
CN115779875B (zh) * | 2022-11-25 | 2024-01-30 | 广州康盛生物科技股份有限公司 | 一种多糖微球及其制备方法和一种吸附柱 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003103636A1 (en) * | 2002-06-05 | 2003-12-18 | Agresearch Limited | A novel drug dosing regimen |
CN102389755A (zh) * | 2011-08-02 | 2012-03-28 | 北京化工大学 | 一种琼脂凝胶微球的制备方法 |
CN103980519A (zh) * | 2014-05-27 | 2014-08-13 | 哈尔滨工业大学 | 一种磁性琼脂糖微球的制备方法 |
-
2019
- 2019-03-15 CN CN201910198392.XA patent/CN109897202B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003103636A1 (en) * | 2002-06-05 | 2003-12-18 | Agresearch Limited | A novel drug dosing regimen |
CN102389755A (zh) * | 2011-08-02 | 2012-03-28 | 北京化工大学 | 一种琼脂凝胶微球的制备方法 |
CN103980519A (zh) * | 2014-05-27 | 2014-08-13 | 哈尔滨工业大学 | 一种磁性琼脂糖微球的制备方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN109897202A (zh) | 2019-06-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109897202B (zh) | 大粒径琼脂糖微球及其制备方法 | |
US20160355662A1 (en) | Method for manufacturing porous cellulose particles and porous cellulose particles | |
US9487595B2 (en) | Method for producing porous cellulose beads | |
JP5691233B2 (ja) | 結晶性セルロースの溶解方法及び多孔性セルロースの製造方法 | |
US8137563B2 (en) | Preparation of polysaccharide beads | |
US5245024A (en) | Cellulose chromatography support | |
EP0631597A1 (en) | Super porous polysaccharide gels | |
CN107159070A (zh) | 自修复微胶囊及其制备方法、涂料、涂层与环氧树脂复合材料 | |
JP3601229B2 (ja) | 多孔性球状セルロース粒子 | |
CN110026138B (zh) | 多糖微球及其制备方法 | |
CN106432816B (zh) | 一种高流速多糖微球及其制备方法 | |
Zhao et al. | Manipulation of pore structure during manufacture of agarose microspheres for bioseparation | |
CN1160398C (zh) | 颗粒度均匀的高分子微球、针状微粒及成形方法 | |
CN114160110A (zh) | 一种预活化的多糖微球及其制备方法、应用 | |
US6590096B1 (en) | Process for the production of polysaccharide beads | |
EP0479906B1 (en) | Improved cellulose chromatography support | |
CN1185048C (zh) | 一种乳液法包覆高聚物凝胶微球的方法 | |
US20240207817A1 (en) | Agarose-cellulose nanocomposite porous gel microsphere, preparation method, and application | |
GB2573133A (en) | Separation matrix and method of separation | |
US20230234026A1 (en) | Cellulose porous gel microsphere with uniform particle size, preparation method and application | |
RU2731490C2 (ru) | Способ суспензионной полимеризации капель, распределенных в водной среде | |
WO2018186222A1 (ja) | 多孔質セルロースビーズおよび吸着体 | |
WO1993013937A1 (en) | Cellulose chromatographic supports and method | |
CN116272711A (zh) | 一种适用于大规模生产的低成本交联化琼脂糖微球的制备方法 | |
CN116532092A (zh) | 一种新型多核结构复合琼脂糖凝胶微球及其制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20191115 Address after: 215121 Room 713, NW-02 Building, No. 99 Jinjihu Avenue, Suzhou Industrial Park, Jiangsu Province Applicant after: Zhongkesen Glow Microsphere Technology (Suzhou) Co., Ltd. Applicant after: Ding Hui Biotechnology (Suzhou) Co., Ltd. Address before: 215121 Room 713, NW-02 Building, No. 99 Jinjihu Avenue, Suzhou Industrial Park, Jiangsu Province Applicant before: Zhongkesen Glow Microsphere Technology (Suzhou) Co., Ltd. |
|
TA01 | Transfer of patent application right | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |